一氧化氮酶

一氧化氮酶（通用12篇）

一氧化氮酶 篇1

门脉高压(PHT)是肝硬化导致的最常见也是最复杂的症状之一,同时也是肝硬化导致死亡的最主要原因。许多临床和实验室数据表明酒精、非甾体类抗炎药物、缺血再灌注、胃黏膜损伤与修复都增加了胃黏膜损伤的敏感性[1,2]。现在人们已经逐渐接受了PHT导致局部血液量增加、外周血液循环抵抗降低而导致心输出量增加,因而被称之为高动力循环的观点[3,4,5]。胃黏膜的机能障碍被认为与PHT有关,而这些机能障碍被称为门脉高压性胃病。然而具体的失代偿机理现在仍不清楚。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

兔抗鼠COX-1单克隆抗体;兔抗鼠COX-2单克隆抗体;兔抗鼠Fas-L单克隆抗体;山羊抗小鼠LgG;5%BSA封闭液;SABC。以上试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2 动物及分组

雄性SD大鼠20只,体重220～250 g(山西医科大学实验动物中心提供)。随机分为两组。实验组:半结扎门静脉及左肾静脉组;对照组:单纯暴露游离门静脉组。

1.2 方法

1.2.1 建立门静脉高压大鼠模型

大鼠于术前12 h禁食,术前8 h禁饮。3%戊巴比妥钠针腹腔注射麻醉(0.1 mL/100 g BW)。实验组大鼠开腹后游离暴露门静脉主干后用7号钝性针头平行放置于门静脉干,用3-0丝线结扎后将钝性针头抽出,待门静脉结扎处部分充盈后轻轻结扎。然后暴露左肾上腺静脉然后结扎。

1.2.2 大鼠门静脉压力测量

于术后两周将所有大鼠麻醉后开腹,实验组大鼠用20号套管针穿刺肠系膜上静脉近端,退出针芯并将套管送入门静脉结扎远端,该处测得压力作为门静脉压;对照组则将套管针直接插入门静脉处测压,另一端接压力传感器(型号TSD104A),传感器将收集的压力信号转化为数字信号后输入计算机,采用MP2100型多道生理记录仪测定门静脉压力。

1.2.3 大鼠胃组织中COX-1、COX-2、Fas-L的表达

门静脉半结扎两周后处死大鼠,收集胃组织,甲醛固定,脱水,石蜡包埋,切片。用免疫组织化学的方法检测大鼠胃组织中COX-1、COX-2、Fas-L的表达情况。应用MIAS-2000型医学图像彩色分析系统测定胃组织中COX-1、COX-2、Fas-L的平均面积密度值,每张切片随机选取5个视野,取其均值转化为阳性单位。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 13.0统计软件处理。计量资料数据以均数±标准差表示,比较采用t检验,计数资料采用百分率表示,组间对比采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 门静脉压力的变化

门静脉半结扎两周后,实验组大鼠门静脉的压力为(28.25±2.89)cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa),对照组大鼠门静脉压力为(13.07±2.74)cm H2O,实验组压力明显高于对照组(P<0.05)。

2.2 胃组织中COX-1、COX-2、Fas-L的表达

胃组织中COX-1阳性表达于黏膜层,可见黄色产物,阳性细胞为胞浆内可见棕黄色颗粒,实验组COX-1表达强度较对照组明显减弱。胃组织中COX-2阳性表达于黏膜层,可见黄色产物,阳性细胞为胞浆内可见棕黄色颗粒,实验组COX-2表达强度较对照组无明显差别。胃组织中Fas-L阳性表达于黏膜层,可见棕黄色产物,阳性细胞为胞浆内可见棕黄色颗粒,实验组Fas-L表达强度较对照组明显增强。见表1。

注:对照组比较,*P<0.05

3 讨论

目前在认识PHT的过程中,前列腺素类(PGs)在其中所起的作用仍比较有争议。在人体试验中胃黏膜中的前列腺素水平显示出增加,降低,或并无差异,但动物试验中胃黏膜中前列腺素水平显示降低[6,7,8]。但无论是在动物模型还是人体试验中运用前列腺素抑制剂后,胃黏膜均呈现不同程度的损害。环氧合酶(COX)是花生四烯酸合成前列腺素和血栓素中的关键酶。目前至少存在3种环氧化酶。COX-1主要存在于胃肠道以及大多数组织中,COX-2更容易在炎症部位表达,而COX-3则是新一代抗炎镇痛药物的重要代表[9,10]。COX-1和COX-2在不同组织细胞中的作用有所不同,而对同一细胞在不同条件下其作用也不相同。COX-1与COX-2是否参与了门脉高压性胃病形成过程以及其形成的机理目前并不清楚。

通过本试验笔者证明了两步结扎法可以明显的使大鼠门静脉压力增高,且可诱导内脏血管阻塞和肠系膜静脉扩张。此外笔者发现门静脉高压大鼠模型中胃黏膜中COX-1表达降低而COX-2的表达并无明显异常,同时细胞凋亡因子Fas-L的表达水平明显增加。

TNF受体家族中凋亡因子Fas配体Fas-L除主要在活化的T淋巴细胞和自然杀伤细胞中表达外还出现在免疫豁免的部位。Fas作为细胞膜抗原主要介导细胞凋亡,具有抵抗Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡的作用。Suda等人克隆了Fas抗原配体(Fas-L),已产生出Fas-L单克隆抗体,发现Fas-L同样有促进细胞凋亡的作用。

由于COX-1和COX-2的不同表达方式导致了其不同的病理生理作用。目前认为COX-1源性酶催化生成的PGs参与了稳态反应,而COX-2源性酶催化生成的COX-2则参与了炎性以及癌变的病理过程。胃部的PG合成主要为COX-1源性。但是最近的研究发现COX-2源性PG在某种条件下可以参与胃黏膜的保护作用[11]。通过本研究发现PHT明显的抑制了COX-1在胃黏膜中的表达,但是并没有抑制COX-2的表达。试验数据表明PHT抑制了COX-1源性PGE2在胃黏膜的产生。而COX-1源性PGE2对胃黏膜具有保护作用,但其具体机制目前还不清楚。COX-2源性PGs被认为参与局部炎症反应,目前已被广泛接受,本实验数据表明门脉高压并没有造成明显的胃黏膜炎性反应。在胃组织中由于COX-1分布的特异性,也可能大量的COX-1源性PGE2的表达掩盖了COX-2源性PGs的作用。

总的来说,Fas-L的高表达说明门脉高压性胃肠病的形成过程中胃黏膜细胞的增殖作用减弱,同时存在促凋亡作用增强。由COX-1源性PGE2表达的降低导致胃黏膜防护机制减弱,也可能通过促进胃黏膜细胞凋亡及PGE2分泌紊乱引起的局部血管舒缩活性异常及体液调节失调后共同作用引起的内脏血管高动力实现。实验结果表明,门脉高压导致COX-1局部胃黏膜低表达可能通过凋亡途径参与了门脉高压胃病的形成过程,其具体机制目前还不清楚。而COX-2表达无差异表明炎症反应可能并没有参与门脉高压的形成过程,或者在其形成过程中不起主要作用。

一氧化氮酶 篇2

灌浆期高温对小麦剑叶抗氧化酶及膜脂过氧化的影响

采用人工气候室控温,研究弱筋小麦扬麦9号和中筋小麦扬麦12在灌浆最快时期(花后19～21 d)、温度(25℃、30℃、35℃、40℃)、大气相对湿度50%的条件下,对剑叶抗氧化酶及膜脂过氧化的影响.结果表明,随着温度升高,剑叶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性呈下降趋势,膜脂过氧化产物(MDA)含量呈上升趋势.高温胁迫对中筋小麦扬麦12 SOD、CAT活性的伤害大于弱筋小麦扬麦9号,对扬麦9号POD活性的`伤害大于扬麦12,扬麦12 MDA积累速率大于扬麦9号.高温胁迫导致千粒重下降.

作 者：刘萍 郭文善 浦汉春 封超年 朱新开 彭永欣 LIU Ping GUO Wen-shan PU Han-chun FENG Chao-nian ZHU Xin-kai PENG Yong-xin  作者单位：扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室/扬州大学小麦研究所,扬州,225009 刊 名：中国农业科学  ISTIC PKU英文刊名：SCIENTIA AGRICULTURA SINICA 年，卷(期)：2005 38(12) 分类号：S5 关键词：小麦   高温   灌浆期   抗氧化酶   膜脂过氧化   剑叶  

一氧化氮酶 篇3

摘 要：为了研究酶解时间、pH值及酶解产物分子质量大小对鳙鱼（Aristichthys nobilis）鱼肉蛋白酶解产物加工特性及抗氧化性的影响，本研究采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对鳙鱼鱼肉进行酶解，对其酶解产物进行加工特性和抗氧化性分析。结果表明：2 种蛋白酶酶解产物在pH 4条件下的溶解性和热稳定性均低于pH 7。其中，碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解产物分别在酶解4.0 h和1.0 h具有较优的溶解性及热稳定性。碱性蛋白酶酶解产物具有较优的亚铁离子螯合能力，而乳化性、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率及还原力则是风味蛋白酶酶解产物更优。酶解产物的加工特性及抗氧化性受蛋白酶种类、酶解时间、pH值及酶解产物分子质量大小的影响。

关键词：鳙鱼；鱼肉；酶解产物；加工特性；抗氧化性

鳙鱼（Aristichthys nobilis）又叫花鲢、胖头鱼，是中国四大家鱼之一，分布范围较广，具有较高的营养价值及经济价值[1]，但由于其肉质口感较差，土腥味严重，而且消费者更喜食鳙鱼头的一系列原因，造成了鳙鱼鱼身销量不佳的现状。因此，对鳙鱼肉进行再加工，提高其附加值是目前亟待解决的问题。动植物蛋白多肽链内部普遍存在着功能区，功能区中所蕴藏的生物活性肽在母体的蛋白质序列内不具生物活性，但是通过蛋白酶酶解后即可发挥特定的功能[2]。因此，近年来通过制备动植物蛋白酶解产物进而提高产品的营养价值和商业价值已然成为热点[3-5]。

目前，国内外对于利用生物酶解技术开发食源性生物活性肽已有大量报道[6-11]，对蛋白酶解产物功能的研究也有一定报道，主要包括加工特性（溶解性、热稳定性及乳化性等）及抗氧化性（（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、亚铁离子螯合能力及总还原力等）[12-16]。但对鳙鱼蛋白酶解产物的加工特性及抗氧化性尚未进行系统研究。因此，本实验采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶分别酶解鳙鱼鱼肉，对其酶解产物的加工特性及抗氧化性进行研究，以期为鱼肉蛋白的开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳙鱼购于北京市小月河农贸市场（质量

（1 390±200）g，体长（44±1）cm）。活体运至实验室后敲击头部致死，迅速去鳞、头、内脏、骨，洗净后取肉（白肉），用高速匀浆机搅成肉糜。

碱性蛋白酶 北京奥博星生物技术有限责任公司；风味蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司；三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS）、DPPH、啡咯嗪 美国Sigma公司；其他试剂均为化学分析纯。

1.2 仪器与设备

UNICO-2700分光光度计 美国Unic公司；FE20梅特勒-托利多实验室pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FD-1PF冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司；TGL-16A台式高速冷冻离心机 上海安亭科技仪器厂；LM-125中空纤维超滤设备 北京旭邦膜设备有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物的制备

鳙鱼鱼糜+去离子水→混合调整蛋白质质量浓度至5 g/100 mL→95 ℃水浴10 min（灭内源性蛋白酶）→匀浆→分别添加碱性蛋白酶（pH 8.0，55 ℃）、风味蛋白酶（pH 7.0，50 ℃）→分别酶解0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h→95 ℃水浴10 min（灭酶）→3 600 r/min离心20 min→取上清液

处理1：上清液直接-60 ℃冷冻干燥；处理2：上清液→5 kD超滤分离→透过液3 kD超滤分离→各区分物浓缩→-60 ℃冷冻干燥

1.3.2 酶解产物加工特性的测定

溶解度的测定参考李雪等[17]的方法并稍作修改，酶解溶液pH值分别调节到4和7。热稳定性的测定参考Fujiwara等[18]的方法并稍作修改，酶解溶液pH值分别调节到4和7。乳化性的测定参考Pearce等[19]的方法。

1.3.3 酶解产物抗氧化性的测定

DPPH自由基清除能力测定参考Bougatef等[20]的方法。亚铁离子螯合力的测定参考Decker等[21]的方法。总还原力的测定参考Yildirim等[22]的方法。

2 结果与分析

2.1 鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物的加工特性

2.1.1 鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物溶解性

由图1可知，经碱性蛋白酶及风味蛋白酶处理的鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物在pH 4和pH 7两种条件下具有较好的溶解性，均高于60%。2 种蛋白酶解产物的溶解性在pH 7条件下较pH 4条件下高，即酶解产物在酸性条件下溶解性较小。李雪等[23]得到了相似的研究结果，经碱性蛋白酶酶解鲽鱼下脚料的酶解产物的溶解性在pH 7时较pH 4时高。此外，这一结果也与鳕鱼、鲅鱼等的研究结果类似[24]。在pH 7条件下碱性蛋白酶酶解4.0 h的酶解产物溶解度最高，达到71.82%。在pH 7条件下风味蛋白酶酶解1.0 h的酶解产物溶解度最高，达到74.29%。

2.1.2 鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物热稳定性

由图2可知，经碱性蛋白酶及风味蛋白酶处理的鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物在pH 7条件下的热稳定性均较pH 4条件下的高。风味蛋白酶酶解产物的热稳定性在酶解1.0 h为最高，达到72.31%（pH 4）和74.00%（pH 7）。而碱性蛋白酶酶解产物的热稳定性在酶解4.0 h为最高，达到72.98%（pH 4）和75.12%（pH 7）。热稳定性的研究结果同溶解性的结果有较好的一致性。

2.1.3 鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物乳化性

蛋白质分子的乳化性主要受其分子质量、疏水基团数量、弹性及分子结构所影响。一定程度的酶解可以使蛋白质溶解度增大，从而使鱼肉蛋白的乳化性得到有效提高，但如果酶解过度，小分子肽及氨基酸的含量增加过大，反而不利于乳化性的提高[25-26]。

由图3可知，随着酶解时间的延长，碱性蛋白酶酶解产物的乳化活性指数逐渐升高，酶解4.0 h时达到247.50 m2/g。风味蛋白酶酶解产物的乳化活性指数在前1.0 h酶解时，逐渐升高，酶解1.0 h时达到369.09 m2/g，之后稍有降低。

2.2鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物的抗氧化性

2.2.1 鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物亚铁离子螯合能力

由图4a可知，经碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解的鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物均具有较强的亚铁离子螯合能力。这可能是酶解过程中，蛋白质分子内部暴露出的羧基以及在氨基酸侧链中存在的酸性和碱性氨基酸残基的原因[27]。在不同酶解时间条件下，碱性蛋白酶酶解产物的亚铁离子螯合力均显著高于风味蛋白酶酶解产物

（P<0.05）。酶解0.5 h的碱性蛋白酶酶解产物的亚铁离子螯合力最高，为89.59%，之后随着酶解时间的延长逐渐降低，而风味蛋白酶则呈现波动变化，且在整个酶解过程中不存在显著性差异（P>0.05）。图4b为超滤所得的不同分子质量的酶解产物的亚铁离子螯合能力的差异，分子质量小于3 kD的酶解产物的亚铁离子螯合能力显著高于高分子质量的酶解产物，且碱性蛋白酶酶解产物亚铁离子螯合能力较风味蛋白酶酶解产物高，这与

图4a保持了较好的一致性。此外有研究表明，菜豆碱性蛋白酶酶解产物[28]及草鱼鱼肉木瓜蛋白酶酶解产物[29]均具有较强的亚铁离子螯合能力。

酶解产物亚铁离子螯合能力的影响

2.2.2 鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物DPPH自由基清除率

酶解产物DPPH自由基清除率的影响

DPPH自由基清除能力，指酶解产物能够抑制脂质过氧化反应，并起到降低羟自由基、烷自由基或过氧化自由基的浓度的作用[30]。由图5a可知，酶解0.5 h的碱性蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率最高，为50.23%。在0.5～1.5 h，碱性蛋白酶DPPH自由基清除率逐渐降低，随后至4.0 h，趋于平缓。而风味蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率则缓慢升高至2.0 h后趋于平缓，酶解3.0 h时达到最高为71.48%。不同酶解时间条件下，风味蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率均显著高于碱性蛋白酶酶解产物（P<0.05）。由图5b可知，实验中3 种分子质量酶解产物的DPPH自由基清除率差异不大，但风味蛋白酶酶解产物显著高于碱性蛋白酶酶解产物（P<0.05），这与图5a的结果相一致。有研究表明，酶解产物中疏水性氨基酸的含量影响酶解产物DPPH自由基清除率，疏水性氨基酸含量越高，DPPH自由基清除率越强[31]。因此推测，2 种酶解产物的DPPH自由基清除率有所差异是由于酶解体系及酶解产物中疏水性氨基酸含量不同。

2.2.3 鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物还原力

产物还原力的影响

由图6a可知，2 种酶解产物均具有一定的还原力。同DPPH自由基清除率结果相似，随着酶解时间延长，碱性蛋白酶酶解产物的还原力逐渐降低后趋于平缓；酶解0.5 h时，还原力最高。风味蛋白酶酶解产物的还原力显著高于碱性蛋白酶酶解产物（P<0.05），但同酶解时间关系不大。由图6b可知，不同分子质量大小的碱性蛋白酶酶解产物的还原力差异不大，而分子质量小于3 kD的风味蛋白酶酶解产物具有较优的还原力。

3 结 论

酶解时间、蛋白酶种类以及酶解产物分子质量大小是鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物的加工特性和抗氧化性的影响因素。碱性蛋白酶及风味蛋白酶酶解产物的溶解性及热稳定性分别在酶解4.0 h及酶解1.0 h时最优，2 种酶解产物pH 7条件下的溶解性和热稳定性均较pH 4条件下更好。风味蛋白酶酶解产物的乳化性优于碱性蛋白酶酶解产物的乳化性。

鳙鱼鱼肉碱性蛋白酶酶解产物具有较优的亚铁离子螯合能力，而风味蛋白酶酶解产物具有更好的DPPH自由基清除率及还原力。分子质量<3 kD的鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物的亚铁离子螯合能力显著高于高分子质量的酶解产物，而不同分子质量的酶解产物的DPPH自由基清除率差异不大。还需进一步的实验验证2 种蛋白酶酶解产物的加工特性及抗氧化性，例如将2 种蛋白酶酶解产物加入鱼糜中，通过测定过氧化物值、共轭二烯值等进行验证。此外，不同蛋白酶的添加、蛋白酶之间的复配添加对酶解产物加工特性及抗氧化性的影响有待研究。

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植物抗氧化酶系统研究进展 篇4

1 植物抗氧化酶系统主要因子

植物体内的抗氧化系统分为酶促清除系统和非酶促清除系统, 酶促清除系统主要是抗氧化酶类, 如超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 、过氧化氢酶 (catalase, CAT) 、抗坏血酸专一性过氧化物酶 (sascorbate peroxidase, APX) 、谷胱甘肽还原酶 (gutathione reductase, GR) 等主要抗氧化酶, 它们可以增强植物的抗逆性。

1.1 SOD

植物体内超氧化物歧化酶 (SOD) 在消除活性氧的过程中是第一个发挥作用的, 它将超氧阴离子自由基 (O2-) 催化成过氧化氢 (H2O2) 和分子氧 (O2) 。超氧化物歧化酶目前已发现有六大酶类基因:Cu-Zn SOD基因、Mn-SOD基因、Fe-SOD基因、Ni-SOD基因、Mn-Fe SOD基因和Fe-Zn SOD基因[2]。将烟草Mn-SOD转入苜蓿中, 转基因苜蓿的存活率显著高于未转基因对照, SOD转基因植株对强光也表现出较强的耐受性。从豌豆叶绿体中克隆Cu-SOD并将其转入烟草中, 结果表明阳性转基因植株SOD酶活性提高了3倍左右, 同时APX酶活性也随之升高3-4倍。

1.2 APX

过氧化氢 (H2O2) 会通过金属催化的Haber-Weiss反应生成高度活泼的羟基自由基 (·OH) 。羟基自由基的破坏性比超氧负离子强, 能氧化几乎所有的细胞组分, 并引起细胞的破坏。因此, 对所有的好氧生化过程, 及时清除H2O2和有机过氧化氢物质对于维持植物正常的生理功能很重要。APX利用As A为电子供体的H2O2的清除剂, 它的同工酶在细胞内定位于4个不同区域, 即叶绿体中的基质APX、类囊体膜APX、微体APX和胞质APX。在植物叶绿体和胞质中, 主要的H2O2清除系统被叫做抗坏血酸-谷胱甘肽 (As A-GSH) 循环, 其中最关键的酶是APX[3]。植物APX在基因工程方面的研究取得了较好的结果, 特别在耐旋光性和耐寒抗性上。在生理实验方面, Sato等人将水稻在5.C的低温处理7天, 然后移入42.C培养24h后, APX转录水平和活性均获得提高, 对冷害抵抗能力有着明显的加强[4]。

1.3 CAT

在植物体内, CAT为单功能、四聚体的含亚铁血红素的蛋白, 它位于微体中, 其重要功能是在叶中除去光呼吸时的过氧化氢[5]。由于过氧化氢酶的辅基本身是光敏剂, 因而无论是可见光还是紫外光都可以使CAT失活, 但是Engel等人发现了对光不敏感的CAT[6]。CAT基因过量表达, 可以增加植物体在强光照时的呼吸速率, 转基因植物效果更明显。在病毒诱导烟草细胞凋亡的试验中, 发现细胞质抗坏血酸CAT活性下降, 据此认为细胞清除过氧化氢能力下降, 导致过氧化氢的积累, 最终诱发细胞凋亡过程[7]。因此, CAT活性的增强和含量的提高, 有利于提高对过氧化氢的控制能力, 从而延缓或者组织细胞凋亡的产生。

1.4 GR

在植物细胞中, GR是抗氧化酶系统中一种关键酶, GR的活性会随着盐浓度、温度的升高等环境的胁迫迅速升高。它主要存在于叶绿体基质中, 与抗坏血酸过氧化物酶在细胞质中形成抗坏血酸-谷胱甘肽循环, 其对细胞避免毒害和环境胁迫有着重要及关键作用。在叶绿体GR基因的表达提高叶片中还原型谷胱甘肽的相对含量, 而还原型谷胱甘肽在清除活性氧中起重要作用。对植物来说, 逆境胁迫如干旱、极端温度、盐害及百草枯、氧化剂、大气污染 (如O3, 、SO2) 都能导致氧胁迫, 在这种不利环境中, 植物体内的GR活性提高将会对植物抗逆性的增强起到积极作用[8]。

2 抗氧化酶各项指标的毒性响应研究

植物在长期的进化过程中产生了多种抵抗毒害的防御机制, 毒性胁迫与其它形式的氧化胁迫相似, 能导致大量的活性氧自由基产生, 自由基对植物细胞膜有一定的伤害作用, 植物抗氧化酶系统可以有效地清理这些有害自由基进行自我保护, 以减轻危害。

2.1 陆生植物抗氧化酶毒性响应研究进展

陆生植物体类抗氧化酶受到自身因素的影响和外界环境条件的影响, 会有不同的反应情况。对小麦和玉米进行水分胁迫的实验表明, 胁迫强度增大后, 小麦体内的H2O2和含量较玉米中高, 细胞受到的损伤程度较大, GR含量比玉米中低, SOD、POD、CAT活性也略比玉米根中低。自然条件下玉米和花生的实验中可以看出:中午时、玉米在自然条件下叶片中SOD活性与花生相近, 早上和下午都高于花生;玉米的POD活性也明显高于花生[9]。研究者选择大麦作为实验材料, 在施用百草枯后, 嫩叶SOD和POD耐受度较老叶强, 7天叶龄的叶片SOD活性在百草枯试剂浓度增大到100 mg/L时出现下降, 14天叶龄的叶片在百草枯浓度仅50 mg/L就出现了下降, 嫩叶的POD活性在百草枯浓度为300 n M/L时还未出现下降, 老叶在100 n M/L时就出现了下降[10]。可见, 陆生植物抗氧化酶在应对毒性胁迫时表征十分复杂, 并不具有简单清晰的规律。

2.2 水生植物抗氧化酶毒性响应研究进展

当前, 水生植物抗氧化酶毒性响应研究是学科关注的重点, 然而其结果却并不明朗。有人用不同浓度As3+处理伊乐藻, 处理初期SOD活性随着培养时间的延长呈上升趋势, 至第4天时达最高值, 随后开始下降。处理呈现先升后降, 培养至第8天后, 活性曲线迅速降低。POD的活性和SOD具有相同毒性反应[11]。而有人在研究氨氮对轮叶黑藻的胁迫时, 却发现随着氨氮浓度的增加和培养时间的演唱, 植物体内SOD呈递增态势。如此矛盾的结论就造成了认识上的混乱, 使科学认知抗氧化酶毒性响应产生了困难。

3 结语

3.1植物抗氧化酶互相协同作用, 共同组建防御系统抵抗毒害作用和环境胁迫。

3.2对植物抗氧化酶系统的研究, 将向分子水平和基因水平发展。随着基因芯片, 基因敲除以及基因图谱技术的进步与发展, 抗氧化酶基因将被全面认识。

3.3有关抗氧化酶的毒性响应研究, 虽然研究领域广, 但实验结果复杂, 实验现象相互矛盾的地方很多。对于抗氧化酶的研究还是局限于活性的强弱上, 没有具体深入到酶活性受各种因素的影响的研究上去, 这将是未来研究植物抗氧化酶毒性研究的需要结局的一个重要问题。

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一氧化氮酶 篇5

采用荧光差显(fluorescent differential display,FDD)技术,比较分析了干旱处理与未处理水稻叶片及根中的mRNA表达,并利用H.A.Yellow-PAGE(含0.1% H.A.Yellow)再分离与大矩阵(macroarray)筛选相结合的方法,发现1个与拟南芥NADPH氧化还原酶高度相似(96%)的差异片段.该基因的.cDNA全长为1423 bp,编码一个具有345个氨基酸残基的多肽.在正常情况下该基因表达量很低,而在干旱处理中高表达.讨论了干旱胁迫下NADPH氧化还原酶基因的可能功能.

作 者：陈静 姜华 万佳 高晓玲 王平荣 席江 徐正君 CHEN Jing JIANG Hua WAN Jia GAO Xiao-ling WANG Ping-rong XI Jiang XU Zheng-jun 作者单位：陈静,万佳,高晓玲,王平荣,席江,CHEN Jing,WAN Jia,GAO Xiao-ling,WANG Ping-rong,XI Jiang(四川农业大学,水稻研究所,四川,温江,611130)

姜华,徐正君,JIANG Hua,XU Zheng-jun(四川农业大学,水稻研究所,四川,温江,611130;四川农业大学,作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室,四川,雅安,625014)

一氧化氮酶 篇6

关键词：玉米；外源NO；叶片；保水能力；抗氧化酶

中图分类号： S513.01 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0082-03

一氧化氮（NO）是植物体内重要的气体自由基分子，诸多研究显示NO参与了植物生长发育的许多过程，如植物抗逆反应[1]、根生长、叶扩展[2]、侧根形成[3]、种子萌发[4]以及细胞凋亡[5]等。但是，NO与其他植物激素相似，在调节植物生长过程中的作用具有浓度效应，低浓度一般促进生长，高浓度则抑制生长，这在小麦、棉花和水稻等植物中已得到证明[6-8]。且大量试验报道以100 μmol/L的SNP调控植物生长发育效果最佳[6，9]，但是与浓度更低的NO相比在玉米幼苗中调控效果如何尚无报道。

干旱胁迫是制约玉米生长的重要非生物胁迫因素之一[10]，可导致植物叶绿素降解[11]、细胞ROS积累[12]、质膜透性改变[13]、破坏光合作用[14]，并抑制生长[15]。关于外源NO能够提高小麦等作物抗逆适应能力的报道较多[5]，但在玉米苗期通过外源NO预处理达到提高其抗旱性的研究尚未报道。因此，本试验选用郑单958为材料，通过研究0～200 μmol/L 不同浓度外源NO供体（硝普钠）对玉米幼苗叶片保水能力及抗氧化酶活性的影响，以期为化控预防抗旱技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和方法

试验于2013年在河南农业大学进行，以郑单958为材料，精选均匀、饱满、无病虫害玉米种子，在2% NaClO中消毒10 min，灭菌蒸馏水冲净后浸种8 h，放置在28 ℃培养箱中发芽，3 d后选取萌发一致的种子在1/2 Hogland营养液中水培，昼夜光照为12 h/12 h，昼夜温度为（25±2） ℃/（20±2） ℃，玉米长至1叶1心时喷施4个不同浓度（10、50、100、200 μmol/L）的SNP溶液（NO供体硝普钠）处理，每隔24 h处理1次，以叶面有水滴流下为标准，以清水处理（CK）为对照。至玉米长至三叶一心期，取顶部全展叶片，进行丙二醛含量、叶绿素含量、抗氧化酶活性测定，另取相同部位叶片称取鲜质量后放入清水中饱和吸水6 h后测定叶片的水分含量，每处理重复3次，每重复种植20株。SNP溶液现配现用。

1.2 测定指标和方法

离体叶片相对含水量（RWC）的测量：采用饱和称质量法[16]测定，每隔1h称质量1次，共24次，最后烘干称取干质量。RWC=（初始鲜质量-干质量）/（饱和鲜质量-干质量）×100%。

叶绿素含量测量方法参照赵世杰等的方法[17]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的测定采用氮蓝四唑（NBT）还原法[18]，以抑制NBT光化还原50%的酶量为一个酶活性单位；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性测定采用愈创木酚法比色法[19]，以μmol/（min·g）表示POD活性；过氧化氢酶（catalas，CAT）活性测定采用紫外吸收法[20]，以U/（min·g）表示CAT活性；丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥显色法测定[21]。

1.3 数据统计

数据采用Microsoft Excel软件进行绘图，用SAS统计软件进行统计分析，用Duncans新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 外源NO对玉米幼苗叶片相对含水量和MDA含量的影响

叶片相对含水量随着时间变化逐渐降低，但是SNP预处理的玉米幼苗叶片相对含水量在23 h内均高于对照（图1-A）。在10～100 μmol/L SNP浓度范围内，随着SNP浓度增加，叶片的相对含水量越高，尤其在处理后23 h时处理之间叶片相对含水量差异最大，10、50、100、200 μmol/L SNP分别比对照的叶片含水量提高1.5%、6.2%、9.8%、8.6%。以上结果表明，低浓度SNP能提高玉米幼苗叶片的相对含水量，以100 μmol/L SNP处理效果最佳。

叶片MDA含量随着SNP濃度升高呈先降低后增加趋势（图1-B）。SNP浓度为50 μmol/L时幼苗体内MDA水平与对照相比降低12.8%；SNP浓度为100 μmol/L时，MDA含量降至最低；SNP浓度为200 μmol/L时MDA含量反而升高，且与对照相比差异不明显。这些结果表明适宜的SNP浓度处理可缓解膜脂过氧化程度，保持细胞膜的稳定性。

2.2 外源NO对玉米幼苗叶片叶绿素含量的影响

由表1可见，叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的含量随着SNP浓度的升高呈先增后降的趋势，在SNP浓度为 100 μmol/L 时，叶片叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的含量与对照相比均差异显著。随着SNP浓度进一步增加（即至200 μmol/L），叶绿素含量出现降低的趋势。当处理浓度为10、50、100、200 μmol/L时，叶绿素a含量分别比对照增加了5.16%、10.44%、23.31%、10.12%，叶绿素b含量比对照增加了18.65%、37.68%、27.34%、16.38%，叶绿素b的增加幅度要大于叶绿素a，可能是由于SNP对叶绿素b的影响大于叶绿素a。以上研究结果表明各处理均能提高玉米幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的含量，增强叶片的光合能力，且当SNP浓度为100 μmol/L时效果最好。

2.3 外源NO对玉米幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

由图2可知，随着SNP浓度升高，SOD、POD、CAT活性表现先增后降的趋势，各处理均优于对照，浓度为100 μmol/L时活性增加最明显，与其他处理相比差异均达到显著水平。浓度为200 μmol/L时，叶片CAT活性与10、50 μmol/L时相比也显著提高（图2-A），SOD活性较100 μmol/L SNP处理显著降低，且与50 μmol/L处理间差异不显著（图2-B）。POD活性低于其他浓度处理（图2-C）。

上述研究结果表明，SNP处理能增强玉米幼苗叶片SOD、POD、CAT酶的活性，进而提高玉米叶片的抗氧化能力，其中SOD和CAT酶活性受SNP处理影响较大，适宜的SNP浓度处理能够显著提高玉米叶片的抗氧化能力，清除细胞内过多的活性氧自由基，使之维持在正常水平，从而保护膜结构稳定。浓度为100 μmol/L时效果最好。

3 讨论

植物叶片失水时，不饱和脂肪酸在自由基的作用下，发生膜脂过氧化，膜脂过氧化会引起膜中蛋白质交联、聚合及类脂变化，使膜上孔隙变大，通透性增加，离子大量外泄导致细胞代谢紊乱，严重时导致植物死亡[22]。叶片相对含水量变化可准确反映叶片失水速率[23]。García-Mata等研究发现SNP可以提高小麦叶片含水量[24-25]。陈银萍等认为SNP处理可提高玉米幼苗叶片的相对含水量，减缓叶片的失水速率，显著抑制水分胁迫下玉米幼苗叶片膜脂过氧化的发生[26]。本试验研究结果表明，各浓度SNP处理不同程度降低玉米叶片中MDA含量，100 μmol/L时效果最佳，显著缓解了膜脂过氧化程度，保持细胞膜的稳定性，延缓了玉米叶片的水分散失，提高叶片的保水能力。

SOD、POD、CAT是植物细胞内重要的酶促抗氧化体系[27-29]，共同直接或间接消除活性氧和自由基对细胞膜系统的损害，维持正常的活性氧和自由基水平[30]。前人研究表明，玉米抗旱性与超氧化物歧化酶等保护酶活性成显著正相關，抗旱性强的玉米品种POD、CAT、SOD等保护酶活性较高[31]。本试验结果表明，10～200 μmol/L SNP浓度范围内玉米幼苗叶片SOD、POD、CAT酶的活性呈先增后降趋势，100 μmol/L 时清除活性氧自由基、降低膜脂过氧化水平效果最佳。低浓度SNP作为抗氧化剂和ROS相互作用，上调抗氧化酶的基因表达或酶活性，调节ROS水平[32]。蒋明义等证实渗透胁迫下叶绿素的降解主要与活性氧的氧化损伤有关[33]。本研究结果表明施加外源SNP能提高玉米幼苗叶片的叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的含量，这和吴雪霞等的研究结果[34]一致。叶绿素在植物体内处于不断更新的状态，NO作为一种重要的生物活性分子，可能是抑制了叶绿素酶的活性或者激活了叶绿素生物合成过程中的某些酶类，进而减少叶绿素的分解，促进叶绿素的合成。

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一氧化氮酶 篇7

2.7% (4/146) 的急性淋巴细胞白血病原始细胞苏丹黑B染色阳性[1], 即该染色诊断急性非淋巴细胞白血病的特异性不如过氧化物酶 (POX) 染色。故有必要对影响POX染色灵敏度的有关因素进行细致研究, 努力提高POX染色灵敏度, 甚至有可能减少部分急性粒细胞白血病未分化型 (M1) 误诊为急性髓系白血病微分化型 (M0) 。

1 材料与方法

1.1 一般资料

急性粒细胞白血病未分化型 (M1) 、急性粒细胞白血病部分分化型 (M2) 、急性粒-单核细胞白血病 (M4) 、急性单核细胞白血病 (M5) 等患者23例。

1.2 方法

试剂配制及操作方法按照文献[2,3]进行。取每例患者骨髓片4张, 均滴加复方联苯胺溶液8滴, 于室温20℃分别作用 (固定) 15s、30s、60s[2,3]及120s[3], 再加入等量的过氧化氢溶液并混匀, 于20℃作用8min;自来水冲洗;Wright染液复染。原粒细胞或原始细胞阳性程度判断按文献[2]进行, 并计算积分。

1.2 统计学方法

用PEMS 3.1统计软件分析。对积分结果进行双因素方差分析及LSD-t检验。

2 结果

15s组POX染色积分均数最低, 60s组最高 (表1) 。F处理=8.592 8, P=0.000 1;F配伍=97.854 1, P=0.000 0, 即不同固定时间及不同患者之间差异有统计学意义。LSD-t检验示15s组与60s组比较, t=4.412 9, P=0.000 0;30s组与60s组比较, t=0.906 8, P=0.367 8;120s组与60s组比较, t=0.129 5, P=0.897 3。

3 讨论

15s组积分均数最低, 30s组稍低, 推测95%乙醇固定时间太短, 酶抑制剂乙醇挥发减少, 加入过氧化氢溶液后乙醇所占比例增加, 对POX的抑制作用增强;也可能固定时间太短, 原始细胞的细胞膜结构保持相对完整, 不利于联苯胺、亚硝基铁氰化钠、过氧化氢等穿透细胞膜。故应避免滴加复方联苯胺溶液后短暂固定就加入等量过氧化氢溶液。60s组积分均数最高, 120s组积分均数稍降低, 推测固定时间延长, 酶蛋白变性失活程度增加, 加入过氧化氢溶液后复活稍慢, POX染色灵敏度会有所降低。10例患者固定60s积分最高, 9例患者固定120s积分最高, 5例患者固定30s积分最高, 推测白血病原粒细胞属病态细胞, 不同患者表达的POX结构可以不同, 对固定剂乙醇的耐受性或抑制敏感性不一样;也可能骨髓片厚薄、骨髓有核细胞增生程度、细胞膜结构成分等不同导致最佳固定时间不同。常规滴加复方联苯胺溶液固定60s进行POX染色[2], 如计数后发现原始细胞阳性率接近3%的患者, 可再次取患者骨髓片2张, 分别用复方联苯胺溶液固定30s、120s进行POX染色[2], 并计数阳性率, 取最高值为准, 有助于诊断POX染色阳性率稍高于3%的M1。

注:未缓解 (NR) ;黑体数字为同一患者最高积分。

总之, POX染色常规固定60s为宜, 避免固定时间少于30s;对POX染色阳性率接近3%的患者, 另取2张骨髓片分别固定30s、120s进行POX染色, 有可能减少M1误诊为M0。

参考文献

[1]NGAN M, CHIEN K, LEE S.Sudan black B positivity in acutelymphoblastic leukemia[J].Mod Pathol, 1992, 5 (1) :68-70.

[2]李家增, 王鸿利, 韩忠朝.血液实验学[M].上海:上海科学技术出版社, 1997:64-65.

一氧化氮酶 篇8

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

32只健康昆明小鼠,雌性,体重20~25 g,由武汉大学医学院实验动物中心提供。随机分为对照组(假手术组)和CLP组,每组16只。其中模型制备后6 h处死6只,12 h处死10只。

1.2 小鼠败血症模型制备

参考文献[1]方法建立败血症动物模型。小鼠术前禁食12 h,腹腔注射质量分数为7%的水合氯醛350mg/kg麻醉。于左下腹作长约1.0~1.5 cm切口,游离肠系膜和盲肠,4号丝线在距盲肠盲端2/3长度处环行结扎,12号针在距盲端1 cm处贯通穿刺,挤出粪便少许,将肠系膜和盲肠回纳入腹腔。逐层缝合关腹。术后立即皮下注射生理盐水3 m L/100 g,以补充术中液体丢失:同时每只小鼠肌肉注射青霉素2×104u以预防切口感染。术后小鼠自由进食饮水。对照组仅做开腹、盲肠游离及关腹术,其余同CLP组。

1.3 病理学检查

CLP后6 h取肝和肺组织。一部分石蜡包埋切片,经HE染色后在普通光学显微镜下观察:另一部分4℃下以2.5%戊二醛溶液固定24 h,再以1%锇酸固定1.5 h,脱水包埋制备透射电镜切片,在H-600型透射电镜(日本Hitachi公司)下观察肝和肺组织的超微结构变化。

1.4 MDA含量和S OD活性的测定

CLP后12 h取约0.5 g肝和肺组织制备匀浆。分别采用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法测定组织中的MDA含量和SOD活性。试剂盒购于南京建成生物工程研究所。测量仪器为UV-1601分光光度计(日本Sanyo公司)。

1.5 i NOS mRNA表达的检测

采用原位杂交法检测肝和肺组织的i NOS m R-NA表达。取CLP后12 h的新鲜肝和肺组织,经含1/1 000 DEPC水的4%多聚甲醛4℃下固定6 h后,常规脱水、石蜡包埋、切片。i NOS m RNA原位杂交试剂盒购于武汉博士德生物公司。经地高辛标记的i NOS寡核苷酸探针序列为:5'-GGAAAAGGACATT AACAACAACGTGGAGAA-3'、5'-GACCAGAGGACC CAGAGACAAGCCCACCCC-3'、5'-CTTCCAGCTCAA GAGCCAGAAACGTTATCA-3'。主要操作步骤如下:(1)切片常规脱蜡至水,充分水化;(2)3%过氧化酶阻断溶液室温下孵育10 min;(3)胃蛋白酶37℃消化30min;(4)含1/1 000 DEPC水的1%多聚甲醛/0.1 M PBS(pH7.2)室温固定10 min;(5)20μL预杂交液,38℃恒温箱内孵育3 h;(6)加入20μL含地高辛标记的i NOS寡核苷酸探针杂交液后,专用盖玻片覆盖,置于湿盒内,38℃恒温箱内过夜;(7)37℃下2×SSC洗涤5 min×2次,0.5×SSC洗涤15 min×1次,0.2×SSC洗涤15 min×1次;(8)滴加封闭液37℃下30 min;(9)生物素化小鼠抗地高辛抗体37℃下孵育60 min;(10)生物素化过氧化物酶溶液,37℃下孵育20min;11 DAB镜下显色,苏木素复染,脱水透明,中性树胶封片。每批染色均用缓冲液代替探针杂交液作为空白对照,用RNase 37℃消化1 h作为阴性对照,以随试剂盒所附阳性片作为阳性对照。

结果判定参照MATTERN等[2]的方法,根据细胞染色强度和染色细胞所占面积两者积分之和来判定。染色强度积分为:不染色=0,轻度染色=1,中度染色=2,强染色=3;染色面积积分为:无细胞染色=0,<25%细胞染色=1,25%~50%细胞染色=2,>50%细胞染色=3。若两者积分之和>2,则为i NOS m RNA表达阳性,≤2则为阴性。每例标本观察3个视野,取其平均值。结果的判定由两位不知分组情况的病理医师进行。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行分析。MDA、SOD和i NOS m RNA积分值以均数±标准差表示,两组间比较采用成组t检验。i NOS m RNA表达率的比较采用χ2检验。P<0.05为差别有显著性。

2 结果

2.1 病理学变化

2.1.1 肝组织

光镜下可见CLP组肝脏门管区局灶性脓肿,细胞点状坏死,空泡样脂肪变性,肝血窦扩张,肝细胞肿胀,中性粒细胞贴附于血管壁(见图1)。电镜下对照组肝细胞核膜清晰,线粒体和溶酶体结构正常,内质网成群分布于核周,糖原丰富。CLP组可见凋亡的肝细胞,大量异染色质边集凝聚成块,核孔增宽。线粒体水肿,滑面内质网扩张,脂滴及溶酶体增多(见图2)。

肝血窦扩张,肝细胞肿胀,中性粒细胞贴附于血管壁

肝细胞凋亡,大量异染色质边集凝聚成块,核孔增宽,线粒体水肿,滑面内质网扩张,脂滴及溶酶体增多

2.1.2 肺组织

光镜下可见CLP组部分肺泡上皮细胞肿胀,肺泡隔增宽,肺间质充血水肿,中性粒细胞弥漫性浸润,肺泡腔变小,部分区域肺萎缩,肺泡腔内大量炎性渗出和红细胞。毛细血管内皮细胞肿胀,毛细血管及肺泡基膜疏松、增宽,毛细血管明显扩张、充血,微血栓形成(见图3)。电镜下CLP组肺泡上皮细胞肿胀,Ⅱ型细胞板层小体排空现象明显,形成大空泡。多数线粒体膜断裂、解体、嵴粒溶解以及线粒体空泡化(见图4)。

部分肺泡上皮细胞肿胀,肺泡隔增宽,肺间质充血、水肿及炎性细胞浸润,毛细血管内皮细胞肿胀,毛细血管扩张充血,微血栓形成

肺泡上皮细胞肿胀,Ⅱ型细胞板层小体排空现象明显,形成大空泡。线粒体膜断裂、解体、嵴粒溶解以及线粒体空泡化

2.2 肝和肺组织MDA含量和S OD活性的比较

CLP组肝和肺组织MDA的含量均较对照组明显升高,SOD的活性均较对照组明显降低,差异具有显著性(P<0.05或0.01)。见表1。

2.3 肝、肺组织i NOS mRNA的表达

阳性杂交信号主要呈浅黄色至深棕黄色,表达部位在胞浆。对照组肝组织表达呈弱阳性,阳性杂交信号零星散在分布。CLP组肝组织表达呈强阳性,阳性杂交信号几乎遍布整个视野(见图5)。CLP组肝组织i NOS m RNA的阳性表达率(90%)明显高于对照组(0%,P<0.01)。肺组织内阳性杂交信号主要位于肺间质和肺泡内,以巨噬细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞等表达为主(见图6)。CLP组肺组织i NOS m RNA的阳性表达率(100%)明显高于对照组(10%,P<0.01)。并且,CLP组小鼠肝和肺组织i NOS m RNA的表达积分均明显高于对照组(P<0.01)。见表2。

注:1)CLP组与对照组比较,P<0.05;2)CLP组与对照组比较,P<0.01

胞浆内可见呈浅黄色至深棕黄色的阳性杂交信号

胞浆内可见呈棕褐色的阳性杂交信号

注:覮与对照组比较,P<0.01

3 讨论

细菌释放的内毒素是败血症发生的始动因素,而内毒素进入体内,激活多种炎症细胞或效应细胞后释放大量的炎症介质和细胞因子,进而诱导全身炎症反应综合征,引起肺、肝、肾和心脏等多个器官的损害,是多器官功能障碍发生发展的主要病理生理机制[3]。

氧化应激介导的组织损伤在败血症发病机制中的作用日益受到关注。机体处于氧化应激时,直接或间接产生的活性氧对全身炎症反应的发生起着重要作用[4]。氧自由基所引起的脂质过氧化对机体组织细胞造成严重的破坏和损伤。脂质过氧化可导致生物膜上的受体、酶、离子通道等出现功能障碍,甚至引起细胞死亡。MDA是机体氧自由基代谢中产生的脂质过氧化终产物,它的含量高低可以反映脂质过氧化的程度[5]。SOD是广泛存在于机体细胞内的一种酶,能催化超氧阴离子自由基产生歧化反应,是体内最为重要的自由基清除剂,它的活性与败血症/感染性休克以及多器官功能障碍时组织损伤的严重程度相关联[6]。

本研究发现,与对照组相比,CLP小鼠肝和肺组织中MDA的含量明显升高而SOD的活性明显降低,说明败血症时机体脂质过氧化产物增多,氧化应激反应增强,氧自由基参与了重要脏器的病理损伤过程。

在内毒素引起的病理改变中,内皮细胞及内皮衍生性舒张因子NO在败血症的发生发展中发挥重要作用。NO是生物体内一种重要的信号分子,过量的NO参与败血症/感染性休克和多脏器功能障碍的发生发展[7]。内毒素的主要成分脂多糖可诱导i NOS过度表达,NO大量生成,使血管对活性物质的反应性发生改变,造成血管功能失调,加重多脏器功能损害。

NO及其氧化产物的生成,能损伤肺泡Ⅱ型细胞表面磷脂及蛋白,抑制表面活性物质的合成,促进肺组织的炎性渗出及肺泡的损伤[8]。此外,NO与氧自由基结合,生成另一种强氧化剂-超氧化亚硝基阴离子(ONOO-),具有很强的细胞毒性,可使许多重要的蛋白质或酶失活,影响细胞代谢,破坏线粒体结构,使DNA链断裂,从而造成组织器官损伤和细胞坏死等[9]。

i NOS是NO合成的关键酶。败血症/感染性休克时,各种细胞因子和内毒素可在转录水平促进巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及各器官组织细胞表达和转录i NOS,诱导机体产生过量的NO[10]。研究[11]证实,在氧化应激造成的肝损伤中,肝细胞的i NOS表达增强,其催化生成的NO可抑制肝细胞内白蛋白的合成和酶的活性,造成肝细胞损伤,并且i NOS的表达与肝细胞的坏死程度成正相关。

本研究证实,在CLP造成的腹腔感染败血症动物模型中,肝和肺组织i NOS m RNA的表达信号增强,组织损伤严重。

抑制组织器官中i NOS的异常高表达,可以减少NO的生成和释放,改善重要脏器的病理损害。OKAMOTO等[12]报道,注入选择性i NOS抑制剂可减轻CLP所致的急性肺损伤和微血管渗漏。研究[13]表明,内毒素处理后的i NOS基因敲除小鼠,其肺部炎性改变较对照组明显减轻,中性粒细胞聚集和细胞因子的表达水平也显著降低。

一氧化氮酶 篇9

研究发现, 鳄鱼血具有抗菌、抗病毒、抗癌等功能[10,11,12], 而关于鳄鱼血蛋白酶解产物的开发研究却很少有报道。本文运用木瓜蛋白酶将鳄鱼血浆蛋白和血球蛋白进行酶解, 并测定其酶解产物的抗氧化和ACE抑制能力, 为鳄鱼血蛋白酶解产物功能的充分开发和利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料、试剂和仪器

鳄鱼血浆和血球 (广西盟展鳄鱼科技开发有限公司) ;血管紧张素转化酶 (ACE) 、马尿酸、马尿酰-组胺酰-亮氨酸 (HHL) 、DPPH (1, 1-二苯基2-三硝基苯肼) 、啡咯嗪 (Sigma公司) ;木瓜蛋白酶 (广西南宁庞博生物工程有限公司) ;三氯化铁、氯化亚铁、铁氰化钾、硫酸亚铁 (国药集团化学试剂有限公司) ;AY220型电子分析天平 (日本岛津公司) ;LC3000高效液相色谱仪 (北京创新通恒有限公司) ;DSHZ-300多用途恒温振荡器 (江苏太仓市实验设备厂) ;UNICO-2700分光光度计 (美国UNIC公司) ;FE20科特勒-托利多实验室pH计 (梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司) ;TGL-16C高速台式离心机 (上海安亭科技仪器厂) ;恒温水浴锅 (北京市长风仪器仪表有限公司) ;FD-1PF冷冻干燥机 (北京德天佑科技发展有限公司) 。

1.2试验方法

1.2.1原料处理方法

将鳄鱼血浆和血球冷冻干燥, 制成血浆蛋白粉和血球蛋白粉, 之后采用木瓜蛋白酶 (8×105U/g) 进行酶解, 酶与底物比为1:50, 反应温度和时间为37℃、1 h, 之后冷冻干燥备用。

1.2.2亚铁离子螯合能力的测定

根据Kong等[13]的方法并加以改进。将1 mL蛋白酶解液与3.7 mL无水乙醇和0.1 mL 2 mmol/L的氯化亚铁溶液混合, 加入0.2 mL 5 mmol/L的啡咯嗪溶液启动反应, 室温静置10 min后, 在波长562 nm处检测吸光度[13]。

式中:F—亚铁离子螯合率, %;A样品, 562、A对照, 562分别表示样品反应液和对照溶液在562 nm下的吸光度, A。

1.2.3清除ABTS自由基能力的测定

参照Re等[14]的方法并稍作改进。将17 mg过硫酸钾溶于26 mL的双蒸水中, 取上述过硫酸钾溶液2.6 mL, 加入10 mg ABTS, 配制成ABTS母液, 暗处放置12~16 h后, 取上述母液0.8 mL, 用0.2 M磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 稀释至在734 nm下读数为0.70±0.02。取不同浓度的样品溶液0.04 mL与4 mL稀释后的ABTS溶液混合震荡30 s后避光放置6 min, 在734 nm下检测其吸光值, 吸光值越小代表自由基清除能力越强。空白用蒸馏水代替样品。

清除DPPH自由基能力计算公式如下:

式中:I—ABTS自由基的 清除率, %;A样品, 734、A对照, 734分别表示样品反应液和对照溶液在734 nm下的吸光度, A。

1.2.4清除DPPH自由基能力的测定

根据张尊听等[15]的方法, 并加以改进。将1.50 mL酶解产物溶解液与等量的99.5%的乙醇混匀, 加入0.375 mL的DPPH乙醇溶液 (0.02%, w/w) 震荡混匀, 室温下暗室反应60 min后在517 nm处测定其吸光度, 吸光度越小表示自由基清除能力越强[15]。

清除DPPH自由基能力计算公式如下:

式中:J—DPPH自由基清除率, %;A样品, 517、A对照, 517分别表示样品反应液和对照溶液在517 nm下的吸光度, A。

1.2.5还原能力的测定

参照Bougatef等[16]还原能力的测定方法并稍作改动。取1 mL样液, 加入2.5 mL的磷酸缓冲液 (0.22 mol/L, pH 6.6) 和2.5 mL铁氰化钾溶液 (5%, w/w) , 混匀, 在50℃保温20 min后加入2.5 mL三氯乙酸 (10%, w/w) , 混合后, 以3000 r/min离心10 min, 取上清液2.5 mL, 加入0.5 mL三氯化铁 (1%, w/w) , 然后在700 nm波长处测定吸光度A值[16]。A越大, 则样品的还原能力越强。

1.2.6体外ACE抑制率的检测方法

按照表1中实验方法, 将HHL和样品加入试验组离心管, HHL和磷酸盐缓冲液 (pH 8.3, 0.2M) 加入对照组离心管, 两组均在37℃的摇床上预热10 min (加热5 min后, 预热ACE 5 min) , 之后均加入0.05 U/mL的ACE, 在37℃的摇床上温育30 min, 结束后加入125μL 1 M HCL , 在37℃的摇床上再温育30 S, 最后用HPLC在228 nm下进行测定分析。

注:对照组中用10 μ L 磷酸盐缓冲液代替样品反应液。

计算公式为:

K= (M-N) /M×100 (4)

式中:K—ACE抑制率, %;M—对照组中马尿酸的峰面积, (Um A·S) ;N为添加ACE抑制剂组中马尿酸的峰面积, (Um A·S) 。

统计分析

所有数据均采用Microsoft Excel计算标准偏差, SPSS软件对数据进行单因素方差分析, 两两比较采用LSD法, 本试验的数据以Means±SD表示。

2结果与分析

2.1鳄鱼血蛋白酶解产物的抗氧化结果分析

2.1.1亚铁离子螯合率

抗氧化剂主要是通过螯合金属离子、作为供氢体或供电子体清除游离基及促进过氧化物的分解等几种机制完成抗氧化作用[17]。由图1可知, 当浓度<3 mg/mL时, 鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物的亚铁离子的螯合能力随其浓度的提高而显著增加, 当浓度≥3 mg/mL时, 两种蛋白酶解产物对亚铁离子的螯合力变化不明显。鳄鱼血浆蛋白和血球蛋白酶解产物亚铁离子螯合能力的IC50值分别为0.51 mg/mL和0.88 mg/mL。在浓度0~5 mg/mL范围内, 两种蛋白酶解产物的亚铁离子螯合能力的差异性均不显著 (P>0.05) 。两种酶解产物具有较好的亚铁离子螯合能力, 这可能与鳄鱼血蛋白在酶解的过程中, 从蛋白分子的内部暴露出来的羧基及在氨基酸侧链的氨基酸残基有关[18]。

注:相同字母表示不同蛋白酶解产物之间差异性不显著 (P>0.05)

2.1.2清除ABTS自由基的能力

如图2所示, 两种蛋白酶解产物清除ABTS自由基能力随蛋白浓度的升高而增强, 体现了很好的量效关系。在0~5 mg/mL的浓度范围内, 血球蛋白酶解产物清除ABTS自由基的能力均强于血浆蛋白酶解产物, 且在浓度为1 mg/mL时, 血浆和血球蛋白酶解产物清除ABTS自由基能力的差异性极显著 (P<0.01) 。本试验表明了运用木瓜蛋白酶酶解鳄鱼血蛋白粉的酶解产物具有较强抗氧化性, 能有效的清除体外的ABTS自由基。

注:不同字母表示不同蛋白酶解产物之间差异性显著 (P>0.05)

2.1.3清除DPPH自由基的能力

如图3所示, 鳄鱼血浆蛋白酶解产物清除DPPH自由基的能力在0~5 mg/mL的浓度范围内随着蛋白浓度的增加而升高, 当浓度>4 mg/mL时, 其清除能力变化不明显。鳄鱼血球蛋白酶解产物在0~4 mg/mL浓度范围内, 清除能力逐渐升高, 在4 mg/mL处达到最大抑制率后, 其清除能力随浓度升高而降低。运用木瓜蛋白酶酶解的鲢鱼鱼肉蛋白酶解产物对DPPH自由基的清除能力低于20%[19], 鳄鱼血蛋白酶解产物相对鲢鱼鱼肉蛋白酶解产物清除DPPH自由基的能力更强。

注:相同字母表示不同蛋白酶解产物之间差异性不显著 (P>0.05)

2.1.4还原力

鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物的还原力如图4所示。在0~20 mg/mL的浓度范围内均表现出较强的还原力。牟雪娇等[20]通过优化工艺条件制备的鸡血蛋白抗氧化肽的最强还原力为98.4, 低于鳄鱼血浆蛋白和血球蛋白酶解产物的最佳还原力。鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物还原力的IC50值分别为4.512 mg/mL和4.303 mg/mL, 两者差异性不显著 (P>0.05) 。

注:相同字母表示不同蛋白酶解产物之间差异性不显著 (P>0.05)

2.2鳄鱼血酶解产物ACE的抑制结果分析

鳄鱼血浆和血球蛋白的酶解产物的ACE抑制率如图5所示, 两种酶解产物对ACE都存在一定的抑制率。对于血浆蛋白酶解产物, 随着蛋白浓度的提高, ACE的抑制率呈现上升的趋势, 当蛋白浓度达到10 mg/mL时, 其抑制率达到最大, 为75.56%。此后, 随蛋白浓度增大时, 其ACE抑制率随着浓度的增大而减小。血球蛋白酶解产物的ACE抑制率变化趋势与血浆蛋白酶解产物的变化相似。鳄鱼血浆和血球蛋白的酶解产物对ACE抑制率在浓度为2.5 mg/mL、15 mg/mL、20mg/mL时, 两者存在极显著差异 (P<0.01) 。相对于血浆蛋白酶解产物, 血球蛋白酶解产物的ACE抑制率较好, 而且最大抑制率可达到86.42%, 高于猪血红蛋白81.1%[21]的抑制率。研究发现猪血红蛋白水解液经大孔树脂和葡聚糖凝胶初步分离后, 其ACE抑制活性具有明显提高[22]。因此, 可通过进一步的实验提高鳄鱼血蛋白酶解产物的ACE抑制力。

注:**表示不同蛋白酶解产物之间差异性极显著 (P<0.01)

3结论

鳄鱼血经酶解之后既有良好的亚铁离子螯合能力、还原能力及ABTS和DPPH自由清除能力, 又表现出良好的ACE抑制活性。此外, 鳄鱼血球蛋白酶解产物的ACE抑制力优于鳄鱼血浆蛋白酶解产物。以血液蛋白作为原材料制备多肽具有很大的优越性, 其具有分子量小、活性强、易吸收的特点。基于以上的功能和特点, 鳄鱼血将有望开发成天然抗氧化剂和功能性食品。

摘要：研究了鳄鱼血蛋白酶解产物的抗氧化特性和对血管紧张素转化酶 (ACE) 的抑制活性。利用木瓜蛋白酶酶解鳄鱼血浆蛋白和血球蛋白, 用分光光度法测定了酶解产物的抗氧化能力和用高效液相色谱 (HPLC) 测定其ACE的抑制率。结果显示:鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物的亚铁离子螯合能力差异性不显著 (P>0.05) ;在05 mg/mL的浓度范围内, 血球蛋白酶解产物清除ABTS自由基的能力大于血浆蛋白酶解产物, 且在浓度为1 mg/mL时, 两者清除ABTS自由基的能力差异性极显著 (P<0.01) ;血浆蛋白酶解产物清除DPPH自由基的能力在05 mg/mL的浓度范围内随着蛋白浓度的增加而升高, 血球蛋白酶解产物在蛋白浓度为4 mg/mL处达到最大清除率, 之后下降;在020 mg/mL的浓度范围内, 两种酶解产物的还原力随着蛋白浓度的提高显著升高, 但两者还原力的差异性不显著 (P>0.05) ;鳄鱼血浆和血球蛋白酶解产物对ACE具有良好的抑制力, 其最大抑制率可分别达到75.56%和86.42%。研究表明, 鳄鱼血蛋白酶解产物在体外具有抗氧化和抑制ACE的活性。

一氧化氮酶 篇10

植物细胞保护酶特别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等在植物的抗逆性中具有非常重要的作用。研究SO2对植物细胞保护酶的影响,可以为植物抗逆性品种的选育提供理论指导和试验依据。本研究以小麦为材料,研究SO2熏气处理对小麦幼苗细胞中SOD、POD、CAT等酶活性的影响,探讨小麦细胞保护酶与小麦的抗逆性之间的关系,为小麦抗SO2机理研究及耐SO2小麦品种的培育提供初步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为邯7086小麦种子,购自山东省临沂市农资城。

1.2 方法

1.2.1幼苗培养

挑选籽粒饱满的小麦种子种植在塑料花盆(直径约18cm)中,每个花盆中分装等量的土壤,尽可能多播一些种子,以备选择生长状况一样的幼苗进行试验。每次试验都设置对照组和试验组,重复3次,种植后置于温室中常规栽培管理,待其生长至20cm时供试验用。

1.2.2熏气装置及SO2气体的获得

采用简易自制密闭式熏气装置,用塑料布将一纸箱内侧密封。纸箱大小:110cm×60cm×30cm,可同时对两盆小麦幼苗进行熏气。根据熏气装置的体积大小和硫燃烧的反应式:S+ O2→SO2,计算出所用硫粉末的量。用电炉将瓷质小盘加热到一定温度,然后将称量好的硫粉末倒入瓷盘中,连同称量纸一起燃烧。

1.2.3 SO2熏气浓度的确定

先进行预试验,通过点燃不同量的升华硫粉,产生不同浓度的SO2气体,分别熏气处理小麦幼苗2h,1d后观察小麦幼苗伤害情况,选择使小麦幼苗伤害症状比较明显且浓度较低的SO2浓度作为正式试验所用的SO2浓度。经过比较,最后确定SO2的处理浓度为50mg·m-3。

1.2.4材料处理及酶液提取

当小麦幼苗生长至约20cm时进行SO2熏气处理,试验组用50mg·m-3的SO2熏气处理2h,对照组不做任何处理,分别于SO2熏气处理完成后0、1、2、3、4、5d取叶片提取酶液供试验用。重复3 次。采用文献[3]的方法提取酶液。 将酶提取液分移至1.5mL离心管,每管200μL,于-20℃冰箱保存。1.2.5 测定项目及方法CAT活性采用文献[4]的方法测定。以消耗H2O2μmol·(min-1·g-1FW)为单位表示CAT活性。POD活性采用愈创木酚法进行测定[5]。比色波长为470nm。POD活性以△A470·(min-1·g-1FW)为单位表示。SOD活性根据文献[6]的方法测定,采用抑制NBT光化还原的百分数或用抑制NBT光化还原50%为一个酶活性单位。材料处理与酶活性测定均重复3次,取平均值作为酶的活性,用Excel作图分析酶活性的动态变化。

2 结果与分析

2.1 SO2处理对小麦幼苗CAT活性的影响

从图1可以看出,用50mg·m-3SO2对实验组小麦幼苗进行熏气处理后,小麦叶片细胞中的CAT活性是下降的。第一次取样(即刚熏气处理后0h取样)CAT活性的下降幅度最大,当去除SO2气体后,实验组的CAT活性逐渐恢复,到第4天后,实验组的CAT活性基本接近对照组。在取样时间内,实验组的CAT活性明显低于对照组。由此可见,用50mg·m-3SO2熏气处理,可使小麦幼苗中CAT的活性降低,当去除SO2气体后,CAT的活性又逐渐恢复,直到接近对照组。CAT活性的高低可能与小麦对SO2胁迫的抗性有关。

2.2 SO2处理对小麦幼苗POD活性的影响

从图2可以看出,用50mg·m-3SO2对实验组小麦幼苗进行熏气处理后,小麦叶片细胞中POD的活性是升高的。在几次取样时间内,实验组的POD活性一直明显高于对照组,在去除SO2气体后,实验组的POD活性也逐渐恢复,到第5天时,实验组的POD活性基本接近对照组,但仍然高于对照组。由此可见,用50mg·m-3SO2熏气处理,可使小麦幼苗中POD的活性升高。POD活性的高低可能也与小麦对SO2的抗性有关。

2.3 SO2处理对小麦幼苗SOD活性的影响

从图3可以看出,用50mg·m-3SO2对实验组小麦幼苗进行熏气处理后,小麦叶片细胞中SOD的活性是降低的。在几次取样时间内,实验组的SOD活性都低于对照组。SOD活性的高低可能也与小麦对SO2胁迫的抗性有关。

3 结论与讨论

植物的抗性机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。在植物抵御各种逆境的过程中,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等细胞保护酶起着举足轻重的作用,它们能维持植物体内活性氧的动态平衡,阻止膜脂过氧化,减轻对细胞的伤害[7]。这些酶活性的高低是衡量植物抗逆性的重要指标之一。

CAT在维持植物体内活性氧代谢平衡中起着重要的作用[8],是植物细胞中重要的抗氧化酶之一,CAT酶活性随SO2浓度的增大而降低,抗性强的植物增减比率明显低于敏感植物。如杨明明等的研究认为在SO2胁迫条件下小麦种子的CAT活性随着胁迫时间的延长先迅速上升而后下降[9]。在本试验中,用50mg·m-3的SO2熏气处理后,小麦幼苗叶片细胞中的CAT活性下降。当去除SO2气体后,小麦幼苗叶片细胞中CAT活性又逐渐恢复到正常水平。CAT活性大小的变化可能与小麦对SO2的抗性有一定的关系,是小麦对SO2抗性的重要机制之一。

POD是一种重要的抗氧化酶,普遍存在于植物体中,它在植物的生长发育过程中会有明显的变化,对各种环境条件的反应也非常敏感。植物受到SO2胁迫时,体内的POD酶活性与SO2浓度间呈正相关[10],抗性强的植物POD酶活性上升速率明显高于敏感植物。如李振国等[11]观察到SO2熏气对小麦过氧化物酶活性有促进作用;宋旸等[12]的研究表明,经SO2处理后,小麦品种的幼苗根和叶片中的POD活性均高于对照组。这与本试验的结果是一致的。 在本试验中,用50mg·m-3的SO2熏气处理后,小麦幼苗叶片细胞中的POD活性是升高的,当去除SO2气体后,POD的活性也逐渐恢复到原来的水平。POD活性的高低可能也与小麦对SO2的抗性有一定的关系。

SOD也是一种重要的抗氧化剂,在各种生物中广泛存在,可以催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢[13]。生物体内低浓度的超氧化物阴离子自由基是维持生命活动所必需的,但浓度过高时,可引起机体组织细胞氧化损伤,甚至死亡[14]。郝林等[2]的研究表明,当通入10 和40μl·L-1SO2时,小麦叶片中超氧阴离子自由基含量递增,超氧化物歧化酶(SOD)活性降低。王学府等[15]认为,当植株叶片出现明显可见的伤害症状后,即当SO2超过某一阈值时,SOD酶活性与SO2浓度间呈负相关,植物出现伤害症状。在本实验中,50mg·m-3的SO2熏气浓度已经使小麦幼苗出现明显的伤害症状,所以用50 mg·m-3的SO2熏气处理后,小麦幼苗叶片细胞中SOD的活性降低,这与前人的实验结果是一致的。同时也表明了SOD活性的高低可能也与小麦对SO2胁迫的抗性有关。

总之,植物在接触致害剂量的污染后,体内会发生一系列生理生化变化,以适应生存环境,植物体内的抗氧化酶和很多代谢过程都会受到或多或少的影响[16]。SOD、POD和CAT是植物细胞中最重要的抗氧化酶,植物只有依靠这些抗氧化酶相互协调,共同作用,才能清除机体内的活性氧,减轻对细胞的伤害,从而维持正常的生命活动。

摘要：为探讨SO2对小麦幼苗主要细胞保护酶的影响,现采用酶活性测定技术,测定了SO2熏气处理后小麦幼苗体内过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等酶活性的变化。结果表明:用50mg·m-3的SO2熏气处理后,小麦幼苗叶片细胞中CAT和SOD的活性下降,POD的活性升高。因此,50mg·m-3的SO2熏气处理对小麦不同细胞保护酶的影响是不同的,细胞保护酶活性的高低在SO2对小麦的伤害和小麦对SO2的抗性中可能具有重要的作用。

一氧化氮酶 篇11

关键词：中华绒螯蟹；抗氧化剂；抗氧化酶；养殖环境

活性氧（ROA）的产生是需氧生物生命活动过程中的代谢产物及其衍生的含氧物质[1]。分子如过氧化氢（H2O2），超氧阴离子（O2-·）和氢氧自由基（HO·） 通过氧化代谢途径对能源的产生形成非常有效的副作用。在哺乳动物中，据估计，几乎1%～4%的总耗氧量（OC）转换成O2-·及H2O2[2]。产生的活性氧，必须被阻止或分解，以避免氧化损伤几种高分子物质（蛋白质，脂类和DNA），这任务由抗氧化系统完成[3]。机体内的抗氧化体系包括抗氧化酶体系和抗氧化物质体系，通过清除活性氧及其自由基、分解过氧化产物，阻断过氧化链和除去起催化作用的金属离子这三个途径来保持体内自由基的动态平衡[4]。

器官组织中的总抗氧化能力是反映机体抗氧化作用的重要指标之一，而超氧化物歧化酶（SOD）作为机体关键性抗氧化酶，对生物体体内氧化与抗氧化平衡起着重要的作用。此酶可催化超氧阴离子自由基（O2-·）发生歧化反应，从而保护机体免受自由基的侵害。丙二醛（MDA）是由自由基与生物膜中的脂类发生过氧化反应，形成的氧化终产物，是膜脂过氧化最重要的产物之一，可通过MDA的量了解膜脂过氧化程度，间接反映膜系统受损程度。过氧化氢酶（CAT）可分解化学性质最活泼的活性氧氢氧自由基（HO·），后者几乎可以与细胞内的一切有机物进行反应，并且反应速率快、对细胞损害极大，因此对CAT的测定就有其重要意义。谷胱甘肽-S转移酶（GST）是一组多功能的同工酶，具有解毒的作用，亦有清除自由基的作用。

总抗氧化能力和上述抗氧化物质的研究在人、高等动物和植物中已有较多报道[5-7]，而在甲壳动物中研究较少。中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），俗称河蟹，是一类淡水养殖甲壳动物，具有重要的经济价值。在养殖过程中，由于水体污染、低温、低盐和其它环境因子的变化，会使其体内自由基水平不断变化，从而需要体内抗氧化体系的不断作用，来维持体内自由基的动态平衡。本实验研究了不同养殖环境中的中华绒螯蟹组织抗氧化剂水平和抗氧化酶活力，以期为中华绒螯蟹的健康养殖提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验用中华绒螯蟹采于湖北牛山湖和牛山池塘两采样点，每点10只，选择体色鲜亮，无病无伤，附肢齐全的蟹用于实验。

在采样的同时对牛山湖和牛山池塘两处水质进行了简单的测定，从表1可以看出，牛山湖与牛山池塘水质差异并不显著。

1.2样品制备

1.2.1 取材 从每个采样点随机抽取5只河蟹，分别取每只蟹的鳃、肝胰脏，置于-78 ℃冰箱保存。

1.2.2 器官组织匀浆 保存的器官组织用电子天平称取，加入9倍生理盐水进行冰浴匀浆，在4 ℃，3 500 r/min条件下离心10 min，取上清液备用。

1.3 测定方法

采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行蛋白含量的测定，具体方法参照试剂盒说明，单位为g/L。蛋白含量的测定为其它生理生化指标的计算提供依据。

总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-S转移酶（GST）、过氧化氢酶（CAT）的测定方法按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明进行测定。

组织匀浆中T-AOC单位定义：在37 ℃时，每毫克组织蛋白每分钟使反应体系吸光度（OD）值增加0.01时，记为一个总抗氧化能力单位，单位为U/mg蛋白。SOD活力单位定义：在每毫升反应液中，每毫克组织蛋白使SOD抑制率达50%时所对应的SOD值为一个SOD活力单位，单位为U/mg蛋白。MDA单位为nmol/mg蛋白。GST活力单位定义：在37 ℃时，每分钟每毫克组织蛋白扣除非酶促反应，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为一个活力单位，单位为U/mg蛋白。CAT单位定义：每克组织蛋白中过氧化氢酶（CAT）每分钟分解吸光度为0.50～0.55的底物中的过氧化氢相对量为一个过氧化氢酶的活力单位，单位为U/g蛋白。

1.4 数据处理

试验数据通过STATISTCA（Version6.0）统计软件进行处理分析，采用独立性t检验的方法进行差异性分析。

2 实验结果与分析

2.1 中华绒螯蟹肝胰脏中各项生理指标的测定

从表2可以看出不同养殖环境中，中华绒螯蟹肝胰脏中的各项抗氧化指标有一定的差异。统计分析表明，中华绒螯蟹肝胰脏中的T-AOC、SOD、GST、CAT均无显著性差异（P>0.05），而MDA表现出显著性差异（P<0.05）。

2.2 中华绒螯蟹鳃中各项生理指标的测定

从表3可以看出不同养殖环境中，中华绒螯蟹鳃中的各项抗氧化指标有一定的差异。统计分析表明，中华绒螯蟹鳃中的T-AOC、SOD、GST均无显著性差异（P>0.05），而MDA、CAT表现出显著性差异（P<0.05）。

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3 讨论

SOD是生物体内清除自由基的首要物质，可催化超氧阴离子发生歧化反应从而保护机体免受伤害，所以机体内SOD活性反映组织器官的抗氧化能力[4]。自由基对机体的攻击力很强，它最易破坏生物膜中的脂类物质引发脂质过氧化反应[8-9]，而MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此MDA的高低可以间接反应出机体受到自由基攻击的损伤程度[10]。CAT可催化H2O2分解无害的氧和水，而H2O2是由SOD清除O2-·所产生的，所以CAT是生物体内抗氧化体系的关键酶之一[11]。GST是生物体内主要的抗氧化酶，在保护细胞膜免受过氧化损伤中具有特殊而重要的意义，其活力大小可体现出活性氧自由基的积累和对细胞膜损伤的程度[12]。T-AOC可反映机体自由基代谢状态和机体抗氧化系统的工作能力，由于T-AOC具有很强的代表性，所以是机体反映体内组织抗氧化功能的一个良好指标[13]。

实验结果表明，不同环境中，所测定的中华绒螯蟹组织抗氧化水平和抗氧化酶活力不同，其中T-AOC、SOD、GST无显著性差异（P>0.05），其原因可能是由于环境因素差异不大造成的。而且健康的机体其抗氧化水平维持在一定范围内，也不容易出现显著性差异。在中华绒螯蟹肝胰脏和鳃中各项生理指标的测定显示MDA表现出显著性差异（P<0.05）。牛山池塘中中华绒螯蟹组织中MDA含量高于牛山湖中华绒螯蟹组织中MDA含量，说明牛山池塘中中华绒螯蟹组织中脂质过氧化的程度高、机体细胞损伤大，这可能是由于其他抗氧化酶活性低造成的，而测定结果刚好反映出这点。由于MDA含量受环境等诸多因素的影响，本实验无法确定出哪一种具体的因素造成MDA表现出显著性差异，尚需更加深入的研究和比较。

许多外国学者研究证明自由基是造成衰老的重要因素之一[14]。随着年龄的增长，机体清除自由基的能力降低，脂质过氧化物（LPO）增加[15]。丙二醛（MDA）由氧化物酶分解LPO产生，可与磷脂酰乙醇胺交联在细胞内合成脂褐素沉淀，使细胞老化[16]。而Vc、VE是可以降低LPO脂质过氧化反应的天然抗氧化剂[17]。所以MDA表现出的显著性差异可能和环境或饵料中的Vc、VE等抗氧化物质的差异有关。

CAT活性测定在鳃中表现出显著性差异，而在干胰脏中却没有表现，这可能是与不同组织的组成和功能的不同有关。鳃呼吸过程中产生的大量超氧阴离子自由基主要靠SOD清除[18]，而SOD清除过量的O2-·所带来的过量的H2O2需要CAT消除，出现的显著性差异也可能是个体呼吸系统差异或损伤造成的。刘晓玲等研究表明CAT活性在饲料中添加Vc后有所降低，机体内H2O2水平受到Vc的调节和影响[19]。说明非酶促反应体系对酶促反应体系的活性有所影响，所以CAT表现出的显著性差异可能受到环境中抗氧化物质因素的影响。

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Abstract：This paper studied the effect of the different farming environment on the total antioxidant capacity （TAC）， Malondialdehyde （MDA） content， catalase （CAT）， superoxide dismutase Superoxide dismutase （SOD）， glutathione-S-transferase （GST） activity in hepatopancreas and gill of Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis）. The results showed that between two culture sites with the different environment， the Chinese mitten crab stem and gills in the pancreas MDA content was significantly different （P<0.05）， respectively： hepatopancreas： 8.74 ± 3.37 （Niushan Lake）， 18.28 ± 5.45 （Niushan pond）； Gill： 2.31 ± 0.41 （Niushan Lake）， 3.46 ± 0.80 （Niushan pond）. In the determination of the Chinese mitten crab gill CAT activity was significantly different （P<0.05）， respectively： 453.24 ± 143.97 （Niushan Lake）， 231.16 ± 49.05 （Niushan pond）. However， other physiological and biochemical indicators there were no significant difference. Note different culture environment on the Chinese mitten crab in a significant impact on MDA， the MDA can be of value to choose the suitable breeding environment.

Key words：Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis）； Antioxidants； Antioxidant enzymes； Rearing environment

一氧化氮酶 篇12

针对安庆沿江湿地水陆交错带优势物种风车草开展抗硝酸盐胁迫研究, 可以为安庆沿江湿地富营养化水体生态保护与修复提供科学依据[1]。

1 实验材料和方法

1.1 植物材料培养

试验植物风车草采自安庆沿江湿地石门湖, 在湿地土壤中培养至株高10~15cm时挖出, 剪去枯叶、烂叶、烂根, 用去离子水冲洗[2]。在聚苯乙烯泡沫板 (长0.5m, 宽0.25m, 厚5cm) 均匀打孔12个, 直径4cm, 相邻两孔之间间距约15cm, 风车草栽种时用海绵将植株固定于孔内。

1.2 硝酸盐处理

试验设置5个不同浓度的硝酸盐溶液处理, 每个处理为4盆, 每盆12株。采用霍格兰基础营养液, 添加KNO3配置成硝酸盐浓度分别为0 (CK) 、2.0mg/L (A) 、4.0mg/L (B) 、6.0mg/L (C) 、8.0mg/L (D) 处理溶液, 每10d更换一次处理溶液, 并取样。

1.3 过氧化氢 (H2O2) 、超氧化物歧化酶活性 (SOD) 、过氧化物酶 (POD) 及过氧化氢酶 (CAT) 含量的测定

粗酶液提取:称取风车草幼根1g, 加入50mmol/L磷酸缓冲液 (p H7.8) 及少量石英砂, 于研钵中冰浴条件下研磨成匀浆, 4℃10000rpm, 离心15min, 取上清作为供试酶液, 冰浴中保存, 用于SOD、POD、CAT活性测定。

1.4 数据处理

本实验所有数据均采用Microsoft Excel2003软件进行处理, 应用软件对数据进行单因素方差分析 (One-Way ANO-VA) , 包括不同硝态氮浓度处理与对照间的差异显著性分析。平均值用Duncan法进行比较, P<0.05表示显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同硝态氮浓度处理对风车草叶片H2O2含量的影响

本研究采用二甲酚橙法测定风车草根中的H2O2含量, 随着溶液中硝态氮浓度的升高, 风车草根叶片中的H2O2含量呈显著上升趋势。处理10d后, 两者中H2O2含量分别达到对照的1.9和3.2倍。随着处理时间的延长, 6.0mg硝酸盐处理的风车草叶片内H2O2含量不断增加, 到第50天处理结束时达到峰值, 为对照的3.7倍, 说明随着处理时间的增加, 高浓度的硝态氮会持续对风车草造成胁迫, 严重影响其正常生长。

2.2 不同硝态氮浓度处理对风车草抗氧化酶活性的影响

2.2.1 超氧化物歧化酶活性 (SOD)

图3中对照CK和2.0mgmmol L-1处理的SOD活性都比较低。而4.0mg、6.0mg、8.0mg处理的中的SOD显著高于对照, 且前20d处理4.0mg、6.0mg、8.0mg L-1处理的SOD活性都呈现先疾后缓的上升趋势, 以处理6.0mgmmo L-1活性最高, 直到第30天达到最大值。从第20后, 除6.0mg处理组外的其他处理组SOD活性开始小幅下降。8.0mg L-1处理组20d后开始SOD活性就急剧下降, 第30d其酶活性已低于对照组, 第50天下降趋势更明显。结果表明:硝态氮浓度在0~6.0mgmmol L-1浓度范围内的硝酸盐处理下, 风车草叶片中SOD活性会随着处理浓度的升高而增加。

2.2.2 过氧化物酶活性 (CAT)

如图4所示, 0~6.0mg L-1硝酸盐处理下, 风车草叶片中CAT活性差异明显。这表明在4.0mg L-1浓度的硝酸盐处理下, 风车草并没有受到硝态氮的胁迫, 当硝态氮的浓度提高提高到6.0mg的时候, CAT活性最高, 此时, 风车草已经受到硝态氮的胁迫。

3 结论

本研究表明, 不同强度的硝酸盐对风车草植株生长影响差异显著:2.0mg/L硝酸盐处理组较对照组相应抗氧化酶活性变化最小, 为实验组中最适宜风车草生长的硝酸盐环境。4.0mg/L硝酸盐处理组风车草植株能正常生长, 但相应抗氧化酶 (CAT、SOD) 活性变化剧烈, 表明4.0mg/L硝酸盐已对风车草形成胁迫, 过氧化氢 (H2O2) 测定结果进一步证明, 长期低浓度硝酸盐胁迫对植株造成一定损伤。6.0mg/L及以上浓度硝酸盐胁迫下风车草植株抗氧化酶活性升而后降, 表明随着胁迫程度的增加, 植物自身抗氧化酶体系已无法通过升高酶活抵抗处界硝酸盐胁迫。本实验中风车草在2.0mg/L硝酸盐胁迫状态下能够正常生长, 并通过自身抗氧化酶系统抵抗硝酸盐胁迫, 可以进一步研究其作为沿江湿地轻度富营养化水体生物修复与治理的物种的可行性。

摘要：本文分析了安庆沿江湿地优势风车草在不同氮素 (硝酸盐) 水平处理下的生理特性及抗氧化酶系统活性。结果表明, 不同浓度的硝酸盐水平对风车草植株生长影响差异显著:2.0mg/L硝酸盐为实验组中最适宜风车草生长的硝酸盐环境;6.0mg/L硝酸盐已对风车草形成胁迫, 处理组抗氧化酶 (CAT、POD) 活性变化剧烈;6.0mg/L及以上浓度硝酸盐胁迫下风车草抗氧化酶活性升而后降, 植物自身抗氧化酶体系已无法通过升高酶活抵抗处界硝酸盐胁迫。

关键词：硝酸盐,胁迫,风车草,生理响应

参考文献

[1]胡克玲, 陶鸿, 汪季涛, 等.不同氮素水平对苋菜硝酸盐累积和营养品质的影响[J].中国农学通报, 2006, 22 (11) .