EV71型

EV71型（精选8篇）

EV71型 篇1

手足口病是由肠道病毒引起的一种儿童急性传染病, 又名发疹性水泡性口腔炎。多发于5岁以下儿童, 可引起手、足、口腔等部位的疱疹, 少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症, 个别重症患儿如果病情发展快, 可导致死亡。引发该病的肠道病毒有20多种, 其中以柯萨奇病毒A16型 (Cox A16) 和肠道病毒71型 (EV71) 最为常见[1]。现将我院2012年4月至2012年6月150例手足口病 (EV71型) 病例的诊疗体会总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机抽取2012年4月~2012年6月在本院诊治的手足口病 (EV71型) 患儿150例 (4、5、6月份各50例) , 临床表现为轻至中度病例, 其中, 男82例 (54.67%) , 女68例 (45.33%) , 发病年龄3个月~5岁, 其中3~6个月6例 (4%) , 7~12个月63例 (42%) , 1~2岁59例 (39.33%) , 2~5岁22例 (14.67%) , 7个月~2岁占全部病例的81.33%。入院前病程<3 d, 发病以4~5月份多见。

1.2 诊断标准

全部诊断均符合2010年版手足口病诊疗指南的诊断标准[1]。所有患者入院即检测咽试子EV71病毒抗原、心肌酶谱、肝功能、肾功能, 部分予以血气分析检测;对心肌酶谱异常常规行心电图检查;肝功异常检测乙肝二对半;心肌酶谱、心电图及肝功ALT异常者, 皮疹消退后, 予以复查;仍异常者2周后再复查。

1.3 临床表现及实验室结果

全部病例以发热、皮疹为主。易惊43例, 多于发病1~2天后出现。入院当天发热1 4 1例, 其中<3 8.5℃9 2例, 38.5~40℃38例, >40℃11例。合并有呼吸系统表现52例 (34.67%) , 表现为鼻塞、流涕、咳嗽、气促。确诊支气管炎13例, 支气管肺炎合并轻度肺水肿39例。合并神经系统表现47例 (31.33%) , 表现为精神差、嗜睡、易惊、头痛、呕吐、烦燥、肢体抖动。合并有循环系统表现36例 (24%) , 表现为面色苍灰、皮肤花纹、四肢发凉、指 (跐) 发绀、出冷汗、毛细血管再充盈时间延长、心率增快、心音低钝、心律不齐、血压升高, 心肌酶谱异常、心电图改变。实验室检查:咽试子EV71抗原检测均为阳性, 外周血白细胞不等, 尿常规、血BUN检查未见异常。

1.4 治疗方法

给予甘露醇降颅压, 喜炎平、利巴韦林抗病毒、退热、补液, 调节水电解质酸碱平衡失调等。对持续高热、有脊髓受累表现或病情进展较快的病例可酌情应用丙种球蛋白。合并心力衰竭者给予米力农、多巴胺强心, 合并高血压者给予硝普钠降血压、生脉、营养心肌。有呼吸困难者给予呼吸机面罩加压辅助治疗, 烦躁者给予咪达唑仑镇静等[2]。适宜饮食, 加强营养。根据有无并发症做相应治疗。

2 结果

150例手足口病 (EV71) 患儿经治疗1~2 d后体温下降, 血压、心率降至正常;3~5d皮疹消退, 平均住院7d。心肌酶谱异常者38例 (占25.33%) , 其中肌酸激酶 (CK) >200 IU/L 21例 (17.2%) , 肌酸激酶同功酶 (CK-MB) >24 IU/L 31例 (25.4%) , CK-MB最高1例为854 IU/L, 乳酸脱氢酶 (LDH) >285 IU/L 17例 (13.9%) , 羟丁酸脱氢酶 (HBDH) >182 IU/L 13例 (10.7%) 。心电图示ST-T改变25例, 室性期前收缩1例。肝功能检测ALT增高者12例 (占8%) , 其中ALT 41~82 IU/L 7例, >82 IU/L 3例, 最高1例为128 IU/L, 肝功能异常者查乙肝二对半均为阴性。心肌酶谱、心电图及肝功ALT异常者在病情临床痊愈后1~2周复查, 结果显示全部患儿可随病情改善而渐恢复正常。

3 讨论

手足口病是由肠道病毒[以柯萨奇A组1 6型 (Cox A16) 、肠道病毒71型 (EV71) 多见]引起的急性传染病, 多发生于学龄前儿童, 尤以3岁以下年龄组发病率最高[1]。本组资料显示与传统报道一致。发病与此年龄段婴幼儿来自母体的抗体降至最低, 而自身的免疫系统发育尚不健全有关。病人和隐性感染者均为传染源, 主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径传播。大多数病例为轻型, 预后良好;少数病例 (尤其是小于3岁者) 病情进展迅速, 在发病1~5天左右出现脑膜炎、脑炎 (以脑干脑炎最为凶险) 、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等;极少数病例病情危重, 可致死亡;存活病例可留有后遗症[1]。本病目前尚无特效治疗, 注意卫生是预防本病的关键。做到“洗净手、喝开水、吃熟食、勤通风、晒衣被”。春夏季节是肠道病毒感染容易发生的季节, 要讲究环境卫生、食品卫生和个人卫生。做到不喝生水、不吃生冷食物, 饭前便后洗手, 保持室内空气流通。尽量不要带婴幼儿去人群密集场所。哺乳的母亲要勤洗澡、勤换衣服, 喂奶前要清洗奶头等。

参考文献

[1]中国卫生部《手足口病诊疗指南 (2010版) 》2010-04-20.

[2]中国卫生部《肠道病毒71型 (EV71) 感染重症病例临床救治专家共识 (2011版) 》2011-04-29.

EV71型 篇2

案

近期,我县出现肠道病毒71型感染(EV71)引发的手足口病疫情,个别地方出现少数患儿因中枢神经系统、呼吸系统和循环系统损害,经全力抢救无效死亡。为及时掌握我乡疫情动态并采取有效的防控措施，防止疫情扩散，降低发病率，切实保护广大群众尤其是儿童的身心健康，特制定本方案。

一、工作目标

通过全面落实以切断传播途径为主的综合性预防控制措施，预防、控制手足口病疫情的发生，大幅度降低发病率。

二、组织措施

（一）加强领导，健全组织。成立XX乡手足口病防控领导小组。组 长：XXX 副组长：XXX 成 员：XXX XXX XXX XXX 各村卫生所要切实加强组织领导，实行一把手负责制，成立手足口病防治工作组，把手足口病防控作为当前和今后一段时间的重要任务。

（二）严格实行防控工作责任制。为确保防治工作抓紧抓好，各医疗卫生单位按照职责和要求建立工作责任制，积极主动地落实各项工作。实行责任追究制，对防控工作不力造成疫情扩散，瞒报、漏报、谎报疫情，因不负责任造成病例死亡等情形的人员和单位，将追究当事人和单位负责人的责任，给予行政处罚直至追究刑事责任。

三、技术措施

（一）严格执行疫情报告管理制度。各医疗机构、疾病预防控制机构执行职务的医务人员均为责任报告人。卫生部已决定将手足口病列为《中华人民共和国传染病防治法》规定的丙类传染病进行管理，各医疗卫生单位要加强对手足口病的监测和报告，发现手足口病患者时，要按照《传染病信息报告管理规范》的要求，在传染病报告卡中“其他法定管理以及重点监测传染病”一栏中填报该病，于24小时内进行网络直报。如发生聚集性病例或重症病例先行电话报告，报告电话：XXXXXXXX。

（二）加大疫情监测工作力度，做到及时发现、及时报告。乡卫生院要深入各村级医疗单位开展病例主动搜索，及时掌握疫情动态。出现手足口病疫情聚集的村组,必须启动每日疫情报告制度。针对手足口病高发人群为儿童，乡卫生院要加强对托幼机构、学校等重点地区和人群的疫情监测和管理，并督促托幼机构、学校严格按照《学校和托幼机构传染病疫情报告工作规范（试行）》开展病例监测工作。

（三）做好流行病学调查。乡卫生院如发现手足口病报告病例数明显增多、病例呈聚集性分布、重症病例比例较多或出现死亡病例时，要及时配合县疾病预防控制中心进行流行病学调查，掌握病人的发病情况、危险暴露因素及密切接触者的情况等资料。深入分析疫情的分布和流行特点，随时掌握疫情动态。对聚集性病例、重症病例按《江西省手足口病预防控制指南（试行）》中标本采集要求进行采样，送省疾控中心检测。

（四）疫情处理。根据流行病学调查信息，将患者生活、学习或工作地点作为处理重点。

1、对患者实行隔离治疗，严格管理传染源。乡卫生院在辖区发生疫情后应及时设立专门诊室接诊发热和疱疹病例。县第一人民医院作为手足口病重症病例救治定点医院，如发现手足口病重症病例，应及时转诊县第一人民医院住院治疗。

乡卫生院及各村卫生所要加强环境消毒和污物的安全处理，杜绝院内感染；患者的接触人员要做好个人卫生及个人防护，强化洗消措施；对居家治疗的病人，接诊医生要告知尽量减少与他人接触的机会和保持个人良好的卫生习惯，由乡、村防保人员具体指导落实隔离措施和周边区域的消毒处理措施；患者的密切接触者可居家医学观察，一旦出现类似症状及时到医疗机构治疗。

2、医疗单位要按照《江西省手足口病（EV71感染）诊疗处臵意见》，积极救治病人，要不断总结交流诊治经验，提高临床救治水平，避免死亡病例的发生，同时，积极配合疾控部门做好流行病学调查、消毒隔离和各种标本采集工作。严格按照《医院感染管理规范》和《消毒管理办法》等有关要求，做好重点科室、重点病房的消毒防护工作，避免院内交叉感染，保障医务人员及其他患者就医安全。同时加强医院产房、儿科病房的消毒，防止新生儿、婴幼儿院内感染而导致严重后果。

3、采取有效措施，保护易感人群。乡卫生院应会同教育部门加大对托幼机构、中小学校的管理力度，认真落实晨检制度，对发现的病人及疑似病人要及早隔离、治疗。认真落实《消毒管理办法》的有关规定，对患儿的粪便、呼吸道分泌物及可能受污染的物品（衣物、被褥、餐饮具、玩具等）要随时进行消毒。必要时依法暂时关闭病例所在的学校、托幼机构及其他幼儿聚集场所，以保护易感儿童。

4、认真落实消毒处理措施，切断传播途径。如有疫情发生，要及时组织开展爱国卫生运动，对垃圾、粪便、污水及时清运消毒，整治卫生环境；对于患者的用品、衣物、呕吐物、排泄物及其容器等用含氯消毒剂进行消毒。严格保护生活饮用水源，尤其对于农村地区集中供水的村庄，要整治水源地周围环境，采取保护措施，严防水源污染。做好学校、托幼机构的食堂、卫生间、教室等的消毒处理。保持教室和寝室等活动场所通风换气。

5、开展健康教育，提高群众防病知识水平。乡卫生院和各村卫生所以广播、宣传栏、宣传单等各种宣传形式，介绍手足口病的防病知识，告诫家长流行季节不要带儿童到人群聚集的公共场所，避免与患儿接触；纠正儿童不良卫生习惯，对儿童玩具、餐具、衣物、用品要经常消毒，家长要注意孩子的个人卫生，引导孩子养成良好的卫生习惯，做到“洗净手、喝开水、吃熟食、勤通风、晒衣被”等。

（五）强化培训，提高业务素质。乡卫生院要组织本单位职工和辖区乡村医生开展手足口病防治技术培训，提高技术水平。一是开展预防控制技术培训，提高疾控队伍的流调、采样、检测、监测和消毒等疫情处臵技术水平，确保防控措施落实到位。二是开展诊疗技术培训，加强对医务人员手足口病的诊断、治疗、隔离消毒等知识的培训，使临床医生特别是乡村医生尽快熟悉手足口病的诊疗技术，确保做到早发现、早诊断、早报告、早隔离、早治疗。

（六）加强卫生监督检查，确保防控工作措施落实到位。

1、手足口病防控领导小组要加强对医疗机构手足口病防治工作的督导检查，同时会同有关部门对辖区内学校、托幼机构的手足口病防治工作开展联合检查，促进各项防控措施的落实。

2、配合县卫生监督所采取切实有效的措施，加强对餐饮业、食堂、生活饮用水的监督检查。餐饮业单位要进一步落实原料进货索证和验收制度，严把原料采购关，严格遵守食品加工操作规范，确保食品安全。严格餐具、用具的清洗消毒，确保餐具等公共用具的消毒效果。

四、保障措施

（一）人员保障。乡卫生院要加强防控队伍的专业技术建设，做好队伍的日常管理，保证人员稳定。

EV71型 篇3

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取我院2008年1月~2012年12月收治的EV71型手足口病重症患者50例,年龄4个月~12岁,平均5.1±2.3岁;其中男28例,女22例。随机将这些患者分为试验组和对照组各25例,比较两组患者的一般资料,差异没有统计学意义(P>0.05),具有一定的可比性。

1.2 入选标准

患者年龄3个月~14岁;为夏秋季突然出现咽痛、发热、吞咽困难等症状;出现咽充血;咽弓和软腭以及悬雍垂黏膜见数十个灰白色的疱疹,直径1~3mm,周围出现红晕症状,在发病1~2d之后出现溃疡。病变部位没有出现在齿根和颊黏膜等,手足部位出现皮疹,出现局部淋巴结,但没有肿大现象。

1.3 排除标准

出现下呼吸道感染;合并细菌感染;心肾肝不全;在1w之内使用过抗病毒药物;有其他出疹性疾病;对此药物具有过敏反应。

1.4 方法

对照组进行一般退热治疗,并让患者多喝白开水[2]。试验组在对照组治疗基础上,使用口服利巴韦林(湖南千金湘江药业股份有限公司,批准文号:国药准字H20044779)50mg/包;10~15mg/(kg·d),疗程为1w。

1.5 疗效评价标准

显效:治疗1w后,体温恢复到正常,食欲得到好转,咽峡部的疱疹明显缩小,没有出现溃疡,手足处的皮疹减少[3]。有效:2w治疗后,体温恢复到正常,咽峡部的疱疹缩小,没有发生溃疡,手足部位的皮疹减少或消退。无效:治疗2w后,体温仍为异常,临床症状加重。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计和分析。计量资料采用均数±标准差(±s)表示。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异显著,具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床症状和体征消退时间

见表1。

注:经t检验,试验组与对照组相比,P<0.05,具有统计学意义

2.2 两组患者治疗效果比较

见表2。

2.3 不良反应

两组患者没有出现明显的不良反应,对照组1例患者出现腹泻,一段时间后,症状消失。

注:与对照组相比,χ2=4.153,P=0.042<0.05

3 讨论

手足口病是一种临床自限性的发疹性传染病[4]。目前还没有特效的治疗方法,一般采用利巴韦林等药物进行抗病毒治疗,这些药物发生的不良反应比较少,具有非常好的治疗效果。还具有抑制细菌和抗病毒以及增强患者免疫功能的作用,能有效地控制呼吸道等病毒的感染。口感偏甜,能较好溶于水,使用非常方便。

由EV71感染引起的手足口病重症发病急,对其治疗的困难非常大,患者发生死亡的几率非常大。因此,引起了相关部门的重视,要提供一定的资金进行治疗,支持当地医院的运作,要实行不放弃治疗的原则,进而保障儿童的身心健康。

对EV71型手足口病重症患者给予利巴韦林进行治疗,效果显著,缩短了患者的治疗时间,减轻了患者的痛苦,减少了社会以及家庭的压力和负担,提高了患者的生活质量,安全、副作用少,值得在临床上进行推广和使用。

参考文献

[1]吴寰宇,郑雅旭,毛盛华,等.上海市手足口病重症病例发病危险因素研究[J].环境与职业医学,2011,28(5):257-261.

[2]张克春,林达云,李苑,等.2009~2010年深圳市宝安区手足口病重症及死亡病例流行病学分析[J].中华疾病控制杂志,2011,15(7):579-581.

[3]尤爱国,康锴,王海峰,等.2010年河南省手足口病重症病例高发原因分析[J].河南预防医学杂志,2011,22(6):410-412.

EV71型 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及标本来源

RD细胞,来源于人横纹肌肉瘤细胞,为本科室保存。标本为2010年儿科门诊疑似手足口病患儿咽试子20份。

1.1.2 试剂

DMEM培养液为GIBCO产品,胎牛血清为杭州四季青产品,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成,病毒RNA提取试剂盒(QIAGEN)。

1.2 方法

1.2.1 咽拭子标本的处理

咽拭子要在标本运输(保存)液中充分搅动(至少40下),以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等,用于病毒分离时,需要冻融一次(防止多次冻融),使细胞破裂,释放病毒颗粒。然后在4℃条件下,10 000 rpm离心20min,用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染,须用滤器过滤除菌。

1.2.2 核酸提取

严格按说明书进行操作,并设阴阳性对照。

1.2.3 病毒分离

将咽部分泌物标本接种于RD细胞,RD细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养传代至长满细胞瓶的80%时,接种咽试子浸出液1m L,37℃吸附1h,吸去吸附液,加入3ml含5%胎牛血清的DMEM,置36℃5%CO2培养箱培养,每天观察细胞生长状态,如果无CPE,则盲传3代,至出现90%CPE时,收集病毒,如无CPE时,则判断为阴性。

1.2.4 RT-PCR EV71特异引物

EV71-S(上游):5`-GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC-3`;EV71-A(下游):5`-ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC-3`,扩增产物226bp。反应条件:42℃反转录,45min,95℃预变性3min,95℃变性20s,45℃退火25s,72℃延伸30s,32个循环,72℃延伸10min。电泳:取PCR产物5μL,用2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色(含EB 0.5μg/m L),100V电泳30min,紫外灯下观察,在相应位置可见清晰条带为阳性。

2 结果

2.1 病毒分离

从20份咽试子标本中成功分离到9份阳性标本,阳性率为45%,大多为RD细胞盲传至3代才出现CPE,细胞出现细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加。

2.2 R T-PCR结果

20份咽试子标本直接用RT-PCR扩增,阳性6份。病毒分离后再用RT-PCR扩增,阳性14份。在226bp处出现目的条带。(图1)

3 讨论

EV71病毒是1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿患者的粪便标本中分离出来的[3],由于高度嗜神经性,更容易累及神经系统及导致危重症。此后,全世界很多国家和地区报道了EV71的流行情况,其中有3次大的流行,部分患儿有严重的中枢神经系统感染。Mc Minn等[4]对EV71的VP1基因进行了序列分析,发现属于同一亚型(C2)的分离株中,表现手足口病的分离株第170位氨基酸为丙氨酸(alanine),而具神经毒性的分离株的第170位氨基酸是缬氨酸(valine)。EV71的VP1蛋白的第170位氨基酸是非常保守的,她的改变可能导致病毒与受体结合能力下降,从而使其毒力发生根本的改变。近年来中国周边地区相继暴发了EV71病毒的大规模流行并出现了散发病例,提示该病毒在亚洲的流行有上升趋势。流行病学资料表明,不同地区不同症状的EV71病毒性疾病的暴发可能与毒株间的差异等因素有关。

目前EV71的常规诊断方法为病毒分离培养、中和抗体检测以及免疫组织化学法。细胞培养分离病毒,常用猴肾细胞系、人胚肺细胞系、人横纹肌肉瘤细胞、非洲绿猴肾细胞等分离培养EV71。中和抗体检测缺乏大量临床验证是否与其他肠道病毒存在交叉反应,无法作为常规检测。这些方法费时、费力,无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。RT-PCR技术克服了以上缺点,已成为EV71快速诊断的重要手段[5]。本研究表明,先对患儿标本进行核酸检测,再进行病毒的分离鉴定,是对手足口病患儿诊断的行之有效的方法,在今后的科研和工作中可以大规模推广使用。病毒分离和RT-PCR方法联合应用可以提高肠道病毒EV71的检出率,RT-PCR方法可以满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。

摘要：目的 了解手足口病患儿感染EV71的情况,为科学防治疾病提供依据。方法 采集手足口病患儿的咽拭子标本,接种于RD细胞,出现致细胞病变效应(CPE),运用RT-PCR方法,EV71引物检测样本和细胞培养物上清。结果 标本直接用RT-PCR扩增,阳性率为30%(6/20),细胞培养后出现CPE的阳性率为45%(9/20),培养后经RT-PCR扩增阳性率为70%(14/20)。结论 病毒分离和RT-PCR方法联合应用可以提高肠道病毒EV71的检出率,RT-PCR方法可以满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。

关键词：手足口病,肠道病毒EV,病毒分离

参考文献

[1]Shih SR,Li YS,Chiou CC,et al.Expression of capsid(correction ofcaspid)protein VP1 for use as antigen for the diagnosis of enterovirus 71infection[J].J Med Virol,2000,61(2):228-234.

[2]Wang S M.Clinical spectrum of enterovirus 71 infection in children insouthern Taiwan,with an emphasis on neurological complications[J].Clin Infect Dis,1999,29(1):184-190.

[3]Schmidt NJ,Lennette EH,Ho HH.An apparently new enterovirus isolatedfrom patients with disease of the central nervous system[J].J Infect Dis,1974,129(3):304-309.

[4]Mc Minn P C.Neurological manifestation of enterovirus 71 infection inchildren during a hand-foot-and-mouth disease outbreak in westernAustralia[J].Clin Infect Dis,2001,32(15):236-242.

EV71型 篇5

1 资料与方法

1.1 临床资料

我院收治的138例手足口病重症患儿咽拭子均分离出EV71病毒。其中男90例, 女48例, 男女之比为1.875∶1;年龄6个月～1岁20例, 1～2岁80例, 2～3岁38例。住重症监护病房的平均天数5d, 病情稳定后转入普通病房。138例患儿均符合《肠道病毒71型感染重症病例临床救治专家共识 (2011年版) 》中重症病例的诊断标准。其中56例精神差、嗜睡、易惊、头痛﹑呕吐﹑烦躁、急性肢体无力、肢体抖动、颈项强直等脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样综合征、脑脊髓炎症状体征;82例除有不同程度的上述症状外, 还表现为心率、呼吸增快, 出冷汗、皮肤花纹、四肢发凉、血压升高、血糖升高﹑外周白细胞数增高、心脏射血分数异常。此期病例属于手足口病重症病例危重型。及时发现上述表现并正确治疗, 是降低病死率的关键。

1.2 方法

掌握EV71感染重症病例的临床特征及高危因素;密切观察病情变化, 及时反馈患者信息, 积极配合救治, 做好用药护理及对症护理。

2 结果

本组138例均经过积极地救治, 病情稳定后转出重症监护病房, 治愈出院。

3 重症病例早期识别

EV71感染重症患儿诊疗关键在于及时准确地甄别确认第2期、第3期。下列几种情况可能发展为重症病例危重型: (1) 持续高热:体温 (腋温) 大于39℃, 常规退热效果不佳。 (2) 神经系统表现:出现精神萎靡、呕吐、易惊、肢体抖动、无力、站立或坐立不稳等, 极个别病例出现食欲亢进。 (3) 呼吸异常:呼吸增快减慢或节律不整。若安静状态下呼吸频率超过30～40次/min (按年龄) , 需警惕神经源性肺水肿。 (4) 循环功能障碍:出冷汗、四肢发凉、皮肤花纹、心率增快 (大于140～150次/min, 按年龄) 、血压升高、毛细血管再充盈时间延长 (大于2s) 。 (5) 外周血WBC计数升高:外周血WBC超过15×109/L, 除外其他感染因素。 (6) 血糖升高:出现应激性高血糖, 血糖大于8.3mmol/L。

4 护理

4.1 一般护理

4.1.1 做好消毒隔离, 防止交叉感染。

EV71病毒对紫外线、干燥敏感, 因此, 病室空气保持相对干燥, 紫外线消毒1/d次, 通风2次/d, 早、晚各1次, 每次30min。床头桌、凳子, 患儿的用具、玩具用500mg/L的含氯消毒液擦拭;拖把专用, 使用后用 1 000mg/L 含氯消毒剂浸泡消毒;医护人员在诊疗、护理每位患儿后用液体皂流动水认真洗手或快速手消毒剂揉搓作用1～3min, 严格无菌操作, 严防交叉感染。患儿的分泌物和排泄物可用2 000mg/L含氯消毒剂浸泡, 搅匀放置120min后再倒入厕所, 厕所用含氯消毒液喷洒2次/d。

4.1.2 口腔护理:

口腔护理不仅可以使患儿保持口腔清洁、舒适, 而且能防止和治疗口腔炎症, 防止吸入性肺炎[1]。口腔护理2～3次/d, 减少细菌定植, 对口腔溃疡大的患儿可在口腔护理后将利巴韦林液直接涂于患处, 以减轻疼痛, 促进溃疡早日愈合。

4.1.3 皮肤护理。

患儿衣服、被褥保持清洁, 衣着要宽大、舒适、柔软, 床铺平整干燥, 减少对皮肤的各种刺激。对于手足及臀部皮疹要保持皮肤清洁, 剪短指甲, 防止水泡破裂感染, 已破皮疹局部可涂阿昔洛韦软膏或炉甘石洗剂。

4.2 对症护理

4.2.1 高热护理。

由于重症患儿多为中枢性高热, 可用冰袋或冰帽持续物理降温, 将冰袋放于患儿枕部, 每2h更换1次, 即使体温降至正常, 仍可继续使用, 低温可使脑细胞代谢减慢, 减少氧耗, 但要做好防护, 防止患儿冻伤皮肤。

4.2.2 颅内高压护理。

保持患儿绝对安静, 避免躁动、剧烈咳嗽, 检查和治疗尽可能集中进行, 护理患儿时动作要轻柔, 不要猛力转动患儿头部和翻身, 将肩部抬高15°～30°, 保持中立位, 有利于颅内血液回流降低颅内压, 但脑疝时应平卧位[2]。头部放置冰帽或冰袋, 低温使脑部血管收缩, 可降低颅内压。

4.2.3 呕吐护理。

将患儿头部偏向一侧, 保持呼吸道通畅, 及时清除口腔内分泌物, 防止误吸。密切观察并记录呕吐物的性质、量及颜色, 防止窒息的发生。

4.2.4 呼吸机辅助呼吸的护理。

(1) 气管插管的护理:用胶布妥善固定气管插管, 准确记录气管插管的深度及导管的刻度, 并进行床头拍片以了解气管插管的准确位置。每班交接气管插管的位置, 勤听呼吸音, 听胃部是否有气过水声, 观察双侧胸廓运动是否对称, 结合呼吸机反馈参数, 早期判断插管是否脱出或滑入右侧气管, 及时发现异常情况及时处理。 (2) 气囊护理:气囊充盈能密闭气道, 固定套管;充盈过度会增加气囊的损耗和局部压迫, 气囊压力不足, 则易导致漏气, 使口鼻分泌物流入气道加重病情。以此, 压力应维持在25～30cmH2O (1cmH2O=0.098kPa) 。 (3) 头部位置调换:每2～3h将头、颈位置一致性转换, 一般为仰卧、左转、右转交替选择[3]。目的是改变人工气管与气管黏膜的接触面, 防止某个部位压迫时间过长所致的损伤。 (4) 气道湿化:除呼吸机的湿化罐加湿外, 还可根据分泌物的黏稠度, 向人工气道内直接滴入无菌生理盐水;分泌物黏稠时, 可增加滴入的次数和量;分泌物稀薄时则减少滴入的次数和量。 (5) 吸痰护理:当气道压力增高报警, 床旁听到痰鸣音, 氧分压或氧饱和度下降等吸痰指征出现时, 在病情许可的情况下, 应按以下的步骤操作, 首先肺部听诊, 确定是否有痰及初步判断痰液的黏稠度, 向气道内注入适量的无菌生理盐水, 勤翻身、拍背、吸痰, 以提高吸痰效果。吸痰时应严格无菌操作, 选择合适的吸痰管, 内径约为人工气管内径的1/2, 将吸痰管插至最深处后上提1～2cm, 开放负压, 充分吸痰, 每次吸痰时间10～15s。吸痰时应遵循气管插管-口腔-鼻腔的吸痰顺序。

4.3 病情观察

所有重症患儿均实施持续心电监护和血氧饱和度监测, 密切观察体温、心率、心律、呼吸、血压、意识和瞳孔的变化, 尤其患儿有发生肺水肿的危险因素存在时, 如:年龄<3岁、高血糖、白细胞增高和急性迟缓性瘫痪时更应进行严密监护。当患儿突然出现心率增快、呼吸急促、面色苍白、发绀、高血压或低血压、四肢抖动或四肢阵挛样抽搐、口唇紫绀、四肢发凉等都是病情变化, 将要发生肺水肿的危险信号, 应立即通知医生, 给予吸氧、湿化瓶内加入30%酒精, 保持呼吸道通畅, 建立两路静脉通道, 监测呼吸、心率、血压和血氧饱和度, 防止致命性肺水肿、肺出血的发生。并做好上机准备, 尽早气管插管, 必要时使用正压机械通气辅助呼吸。

4.4 用药护理

高危患儿应建立双静脉通道, 一条通道静滴甘露醇、人血白蛋白、丙种球蛋白、 甲基强的松龙等特殊药物;另一条通道静滴常规药物。

(1) 高渗脱水剂:①20%甘露醇0.5～1.0g/ (kg·次) , q4～8h, 20～30min快速静脉注射。选择粗大的静脉置留置针, 经常观察穿刺部位有无红、肿、热、痛等静脉炎表现, 防止甘露醇外渗引起皮肤坏死。②10%甘油果糖0.5～1.0/ (kg·次) q 4～8h快速静脉滴注。危重病例可采用以上两药交替使用, 3～4h使用1次。

(2) 糖皮质激素有助于抑制炎症反应, 能降低微血管的通透性, 稳定细胞膜并恢复钠泵功能, 防止或减弱自由基引起的脂质氧化反应。糖皮质激素有助于减轻环EV71感染所致的脑水肿和肺水肿。甲基泼尼松龙1～2mg/ (kg·d) , 氢化可的松3～5mg/ (kg·d) , 地塞米松0.2～0.5mg/ (kg·d) 。因可引起高血糖、血压升高、消化道溃疡、兴奋等症状, 因此应用时应注意监测血糖、血压的变化, 观察有无兴奋性及消化道出血等症状。

(3) 静脉丙种球蛋白的应用:能有效抑制炎症, 对中枢神经系统的感染有一定疗效, 滴入时间不能少于4h, 应用微量泵匀速滴入。

(4) 血管活性药物使用:①第3期:此期血流动力学常是高动力高阻力, 表现为皮肤花纹、四肢发凉, 但并非真正休克状态, 以使用扩血管药物为主。常用米力农注射液:负荷量50～75μg/kg, 维持量0.25～0.75μg/ (kg·min) , 一般使用不超过72h。可用酚妥拉明1～20μg/ (kg·min) , 或硝普钠0.5～5μg/ (kg·min) , 一般由小剂量开始逐渐增加剂量, 逐渐调整至合适剂量。②第4期:治疗同第3期。如血压下降, 低于同年龄正常下限, 停用血管扩张剂, 可使用正性肌力及升压药物。可给予多巴胺 (5～15μg/kg·min) 、多巴酚丁胺 (2～20μg/kg·min) 、肾上腺素 (0.05～2μg/kg·min) 、去甲肾上腺素 (0.05～2μg/kg·min) 等。儿茶酚胺类药物应从低剂量开始, 以能维持接近正常血压的最小剂量为佳。

EV71感染的手足口病多发于学龄前儿童, 尤以3岁以下年龄组发生率最高[4]。EV71感染的重症手足口病患儿可并发脑炎、神经源性肺水肿, 病情进展迅速, 病死率高。护理人员应重点观察患儿神经系统症状和体征、面色变化和末梢循环状态;加强体温、心率、呼吸、血压的监测, 力争在神经系统受累阶段给予药物干预和心肺功能支持, 做好相关并发症积极有效的护理, 提高患儿的治愈率。

参考文献

[1]李华, 杜俊兰.口腔护理临床研究进展 (J) .护理研究, 2009, 23 (1B) :104-105.

[2]崔焱.儿科护理学 (M) .第4版.北京:人民卫生出版社, 2006:308.

[3]宋志芳.现代呼吸机治疗学 (M) .第2版.北京:人民军医出版社, 2008:246.

EV71型 篇6

1 临床表现

1.1 一般病例表现

急性起病, 发热, 口腔粘膜出现散在疱疹, 手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹, 疱疹周围有炎性红晕, 疱内液体较少。可伴有咳嗽、流涕、食欲不振、恶心、呕吐、头痛等症状。部分病例仅表现为皮疹或疱疹性咽峡炎。预后良好, 无后遗症。

1.2 重症病例表现

少数病例 (尤其是小于3岁者) 可出现脑炎、脑脊髓炎、脑膜炎、肺水肿、循环衰竭等。 (1) 神经系统:精神差、嗜睡、头痛、呕吐、易惊、肢体抖动、无力或瘫痪;查体可见脑膜刺激症、腱反射减弱或消失;危重病例可表现为频繁抽搐、昏迷、脑水肿、脑疝。 (2) 呼吸系统:呼吸浅促、困难, 呼吸节律改变、口唇紫绀、口吐白色、粉红色或血性泡沫液 (痰) ;肺部可闻及痰鸣音或湿罗音。 (3) 循环系统:面色苍白、心率增快或缓慢、脉搏浅速、减弱甚至消失、四肢发凉、指 (趾) 发绀、血压升高或下降。

2 实验室检查

末梢血白细胞:一般病例白细胞计数正常, 重症病例白细胞计数可明显升高;血生化检查:部分病例可有轻度ALT、AST、CK-MB升高, 重症病例血糖可升高;脑脊液检查:外观清亮, 压力增高, 白细胞增多 (危重病例多核细胞可多于单核细胞) , 蛋白正常或轻度增多, 糖和氯化物正常;病原学检查:特异性EV71核酸阳性或分离到EV71病毒;血清学检查:特异性EV71抗体检测阳性。

3 物理学检查

(1) 胸片:可表现为双肺纹理增多, 网格状、点片状、大片状阴影, 部分病例以单侧为著, 快速进展为双侧大片阴影; (2) 磁共振:以脑干、脊髓灰质损害为主; (3) 脑电图:部分病例可表现为弥漫性慢波, 少数可出现棘 (尖) 慢波; (4) 心电图:无特异性改变。可见窦性心动过速或过缓, ST-T改变。

4 临床诊断

4.1 诊断依据

在流行季节发病, 常见于学龄前儿童, 婴幼儿多见。以发热、手、足、口、臀部出现斑丘疹、疱疹为主要表现, 可伴有上呼吸道感染症状。部分病例仅表现为手、足、臀部皮疹或疱疹性咽峡炎。重症病例可出现神经系统受累、呼吸及循环衰竭等表现, 实验室检查可有末梢血白细胞增高、血糖增高及脑脊液改变, 脑电图、核磁共振、胸部X线检查可有异常。

4.2 确诊依据

在临床诊断基础上, EV71核酸检测阳性、分离出EV71病毒或EV71Ig M抗体检测阳性, EV71Ig G抗体4倍以上增高或由阴性转为阳性。

5 鉴别诊断

5.1 口蹄疫

由口蹄疫病毒引起, 目前有7个血清型、65个亚型。主要侵犯猪、牛、马等家畜。对人虽然可致病, 但不敏感。一般发生于畜牧区, 成人牧民多见, 四季均有。口腔粘膜疹易融合成较大溃疡, 手背及指、趾间有疹子, 有痒痛感。

5.2 疱疹性口炎

四季均可发病, 以散在为主。一般无皮疹, 偶尔在下腹部可出现疱疹。

5.3 疱疹性咽颊炎

可由Cox A组病毒引起, 病变在口腔后部, 如扁桃体、软腭、悬雍垂, 很少累及颊粘膜、舌、龈。不典型、散在性HFMD很难与出疹发热性疾病鉴别, 须做病原学及血清检查。

5.4 幼儿急疹

本病特点是突发高烧, 一般持续4d左右, 然后全身出现粉红色斑点样皮疹, 多分布在头部和躯干部, 可持续4d左右, 伴有咳嗽、颈部淋巴结肿胀、耳痛等症状。

5.5 水痘

本病潜伏期为14~15d左右。起病急, 轻、中度发热且出现皮疹, 皮疹先发于头皮、躯干受压部分, 呈向心性分布, 可有发热、头痛、全身倦怠等前驱症状。

5.6 风疹

通常于发热1~2d后出现皮疹, 皮疹先从面颈部开始, 在24h蔓延到全身。皮疹初为稀疏的红色斑丘疹, 以后面部及四肢皮疹可以融合, 类似麻疹。出疹第2天开始, 面部及四肢皮疹可变成针尖样红点, 如猩红热样皮疹。皮疹一般在3d内迅速消退, 留下较浅色素沉着。病人口腔粘膜光滑, 无充血及粘膜斑, 耳后、枕部淋巴结肿大, 伴轻度压痛。

6 结语

本病主要诊断依据: (1) 好发于夏秋季节; (2) 以儿童为主要发病对象, 常在婴幼儿集聚的场所发生, 呈流行趋势; (3) 临床主要表现为初起发热, 白细胞总数轻度升高, 继之口腔、手、足等部位粘膜、皮肤出现斑丘疹及疱疹样损害; (4) 病程经过较短, 多在1周内痊愈。根据上述临床特征, 在大规模流行时, 诊断不困难。但散在发生时, 须与口蹄疫、疱疹性咽颊炎、风疹、幼儿急疹、水痘等鉴别。预防本病传播流行主要是及时发现并隔离患儿, 对被污染的日常用品、食具、玩具等进行彻底消毒, 切断传播途径, 并做好环境卫生、食品卫生和个人卫生, 同时加强疫情报告。在疾病流行期间家长应尽量少带患儿到人口密集的公共场所, 以减少被感染的机会, 同时提高监测敏感性, 加强幼儿园预防保健工作, 控制疾病的流行。

摘要：肠道病毒 (EV71) 感染多发生于学龄前儿童, 尤以3岁以下年龄组发病率最高。可引起手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹, 个别患者可引起脑炎、脑脊髓炎、脑膜炎、肺水肿、循环衰竭等。传染源为现症患者和隐性感染者, 主要通过人群消化道、呼吸道和分泌物密切接触等途径传播。

关键词：肠道病毒 (EV71) ,传染病

参考文献

[1]史俊南.现代口腔内科学[M].北京:高等教育出版社, 2000:550～551.

[2]顾友梅.小儿传染病学[M].北京:人民卫生出版社, 1991:54.

EV71型 篇7

关键词：Vero细胞,槐定碱,抑制,EV71病毒

1 概述

手足口病(Hand,footandmouthdisease,HFMD)是一种常见的病毒性传染病,易感人群多为学龄前儿童,尤以3岁以下发病率最高[1]。肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)可感染T淋巴细胞、人血管内皮细胞和神经细胞,触发细胞凋亡[2~4],引起持续高热,导致中枢神经系统疾病及并发症[5],致残和死亡率较高[6],是造成HMFD疾病的主要病原体[7]。因此引起全球广泛关注。

EV71是单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科肠道病毒属A组[8]。该病毒侵染细胞时,首先与细胞上的受体(CD55等)结合,吸附在细胞膜上并脱去蛋白质衣壳,其RNA基因组进入细胞,并立即进行蛋白的翻译加工,产生成为新的衣壳蛋白;同时在病毒RNA聚合酶的作用下生成负链RNA,再以负链RNA为模板生成新的正链RNA;在感染晚期组装形成子代病毒,裂解细胞释放出病毒颗粒[9],并进一步感染相邻细胞。感染EV7l后1-2h,细胞自身的大分子合成迅速停止,染色质边缘化;感染3h后,胞质空泡化,病毒蛋白质合成开始;4h后质膜通透性增大;6h后病毒在胞质内合成;10h后细胞裂解,病毒颗粒释放。细胞裂解时出现的细胞形态学改变,称致细胞病变效应(CPE)。典型的细胞CPE表现为细胞圆缩,分散,胞浆内颗粒增加,折光性增强,直至细胞从培养板上脱落,细胞漂起。温度、p H、宿主细胞、感染的多样性等因素都会影响病毒的感染和复制。

目前,在抗EV71病毒药物的研发聚焦于利用现有的抗病毒药物、设计抗病毒药物的衍生物和筛选新的抗病毒药物等方面。Chem等发现吡唑啉[3,4-d]嘧啶类物质在低浓度下对EV71有抑制作用[10]。Liu等发现I型干扰素可能对控制EV71感染起重要作用[11]。Sim等用针对EV71基因组的小干扰RNAr(si RNA)作用于病毒,可显著减轻体外培养的EV71感染细胞病变[12]。Tan等发现一种化学合成的短发卡样RNA(sh RNA)可显著抑制培养细胞内EV71的复制[13]。但这些成果大多停留在实验室阶段,能否应用于临床尚有待研究。

槐定碱(Sophoridine)是苦豆子、苦参的主要活性成分之一,可增强正常小鼠巨噬细胞功能,并促进脾脏免疫细胞增殖[21]。在一定剂量范围内,槐定碱能剂量依赖性地抑制巨噬细胞经LPS刺激产生TNF-α,这可能是其抗炎、免疫调节作用的机制之一[14]。江西中医药大学李雪梅组独立研制成功了抗癌新药槐定碱及其制剂“盐酸槐定碱注射液”,获国家一类化学新药证书和生产证书,获江西省2007年度科学技术进步奖一等奖(据江西中医药大学新闻,http://news.j xutcm.edu.cn/info/1002/14917.htm)。本研究以EV71敏感的Vero细胞为模型,研究槐定碱是否具有抗EV71病毒的作用,探讨其临床应用的可行性,为寻找治疗手足口病的新药物提供线索。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

Vero细胞购自中科院生物化学与细胞生物学研究所;EV71病毒株由邯郸市疾病预防与控制中心惠赠;DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;槐定碱购自苏州宝泽堂医药有限公司;Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司;Trizol Reagent购自Takara公司;c DNA反转录试剂盒购自TOYOBA公司;EV71和18s PCR引物由上海捷瑞生物技术服务有限公司合成,其序列见表1。

2.2 实验方法

2.2.1 Vero细胞的培养与计数方法

取液氮冻存的Vero细胞管,置于42℃水浴中迅速解冻,低速离心后吸出上清液,用完全培养液(DMEM培养基中加入1%青霉素和链霉素,10%FBS)吹起后移入细胞培养瓶或培养板中,在CO2浓度5%、37℃条件下培养12h,吸出原培养液,PBS冲洗3次;加入等量新鲜培养液继续培养,观察细胞的生长状态。当细胞汇合率达90%左右时,吸出原培养液,用D-Hanks缓冲液冲洗3次,加入2.5%胰蛋白酶-EDTA,37℃消化2min,轻轻吹打使细胞脱离培养瓶壁,加入等量完全培养液终止消化,于800~1000rpm下离心5min;吸去上清液,加入5m L完全培养液,使细胞悬浮并充分分散,平均分装到2-3个新的细胞培养瓶中,补充培养液至适量体积,在37℃、5%CO2条件下进行传代培养。采用血球计数板计数法计数细胞,细胞浓度=四大格中的细胞总数×稀释倍数/4。

2.2.2 EV71病毒的培养、检测和TCID50测定

EV7l病毒株用无血清DMEM进行10倍比梯度稀释;接种于96孔板中的Vero细胞(5×103/孔)生长至90%左右(约10h)时,加入不同稀释度的EV71病毒稀释液50μL,每个梯度重复8孔,以未加病毒的细胞作为阴性对照。于37℃,5%CO2条件下培养7d,期间连续观察细胞病变,统计细胞完全病变的孔数。按Behrens-Karber公式计算病毒滴度TCID50:log TCID50=L-d(S-0.5),其中:L=实验中使用的最低稀释度的log值;D=稀释梯度的log值;S=出现CPE的细胞孔所占的比例之和。

当CPE达75%以上时收取病毒裂解液,提取病毒RNA,用RT-PCR法检测。反应体积为20μL,反应条件为95℃预变性3min;95℃变性20s,45℃退火25s,72℃延伸30s,30个循环;后72℃延伸10min;目的片段预期长度为226bp。以18s RNA作为内标,反应条件为94℃预变性5min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环;后72℃延伸10min。反应结束后,取10μLPCR反应产物,1%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。

2.2.3 槐定碱的细胞毒性检测

接种Vero细胞(1×105个/m L)于96孔板,每孔100μl,培养24h,吸去原培养液,加入含有不同浓度槐定碱(0.015、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2mg/m L)的维持培养液,以未加化合物组的培养细胞组为阴性对照,以DMEM培养液为空白对照。每个浓度3复孔。各组均在37℃、5%CO2条件下孵育48h后,去除培养液,加入DMSO150μL,轻轻震荡以溶解结晶,用酶标仪测定490nm处吸光度值(A490),计算细胞存活率(%)。

2.2.4 槐定碱在不同侵染时期的抗病毒作用

接种Vero细胞于96孔板(1×105个/m L,每孔100μl)中,培养24h后分为6组。组Ⅰ:加入病毒,同时加入槐定碱(0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg/m L)。并据本组数据计算槐定碱对于EV71病毒的半抑制浓度(IC50);组Ⅱ:将病毒与槐定碱混合后于37℃作用2h,随后重悬病毒加入96孔板中;组Ⅲ:加入病毒并吸附2h后,吸去病毒液并加入槐定碱;组Ⅳ:用槐定碱预处理细胞2h后,加入病毒;组Ⅴ:空白对照组(不做任何添加);组Ⅵ:阴性对照组(加入病毒,不加药物处理)。各组细胞继续培养48h后吸尽培养液,每孔加入5mg/m L的MTT溶液10μl,37℃下继续孵育4h,小心去除培养液,参照2.2.3测定其A490,计算细胞存活率(%)。除组Ⅰ外各组的毒量均按IC50加入,每浓度重复3孔。

2.2.5 槐定碱对病毒吸附、穿入及RNA复制的抑制实验

参照2.2.4的方法细胞培养24h后分为三组:组Ⅶ:置于4℃预冷1h,加入EV71病毒,随即加入含有槐定碱(浓度同2.2.4)的维持培养液,4℃静置孵育3h,弃去全部培养液,用PBS冲洗3次以去除尚未吸附的病毒,加入完全培养液;组Ⅷ:将96孔板在4℃预冷1h并加入病毒,继续静置3h,随即加入含有不同浓度槐定碱(浓度同2.2.3)的维持培养液,置于37℃培养,使病毒最大限度穿入细胞。每10min为间隔,以p H11的PBS冲洗细胞以终止病毒穿入,随后立即加入p H3的PBS冲洗细胞以中和碱性PBS,加入完全培养液;组Ⅸ:处理与2.2.4中组Ⅳ相同。空白对照和阴性对照组与2.3.4相同。各组均继续培养48h,第Ⅶ、Ⅷ两组参照2.2.3用MTT法测定A490,计算细胞存活率;第Ⅸ组用RT-PCR法半定量检测EV71病毒RNA(参照2.2.2),每个浓度重复3孔。

2.2.6 数据处理

数据均用Graphpad Prism5.0软件处理。并用单因素方差分析法进行统计和误差分析。

3 结果与分析

3.1 EV71病毒引起的细胞病变及病毒检测结果

正常Vero细胞的形态如图1(A)所示,EV71病毒感染引发的细胞CPE反应如图1(B)所示,病毒基因组RT-PCR结果如图1(C)所示。被病毒感染的细胞表现为圆缩、分散、胞浆内颗粒增加、折光性增强、从培养板上脱落漂起等征状。经PCR扩增得到了EV71病毒特有的226bp条带。用Behrens-Karber法计算出该病毒株的TCID50值为1×10-4.25/100μL,即病毒液稀释104.25倍后,每孔添加100μl可引起50%的细胞产生CPE反应。即病毒滴度为1×105.25TCID50/m L,在此滴度下Vero细胞被病毒感染48h后可完全漂浮。

A:正常Vero细胞;B:EV71病毒感染的Vero细胞;C:病毒基因组RT-PCR检测结果,白色箭头所示为目的条带。1:dd H2O;2:感染EV71病毒的Vero细胞;3:正常Vero细胞;4:500bp DNA marker。

3.2 槐定碱对于Vero细胞的毒性

由图2可见:细胞存活率随着槐定碱浓度的增加逐渐降低,说明槐定碱具有一定的细胞毒性。浓度低于31.25μg/m L时,对Vero细胞损伤较小(~10%);浓度达到2mg/m L时仍有约10%细胞存活。计算出槐定碱对于Vero细胞的CC50为1.414mg/m L。

3.3 槐定碱不同处理对EV71病毒的抑制作用

槐定碱对EV71病毒感染后细胞CPE反应的抑制作用参如图3(A~C)所示。在感染的不同时期给药(第Ⅰ~Ⅳ组)对病毒抑制(对细胞保护)的检测结果参如图3(D~G)所示(N=3)。

注:A~C:槐定碱抑制细胞CPE反应的显微图像(40×)。A:Vero细胞;B:感染病毒的Vero细胞(阴性对照);C:感染病毒的Vero细胞中加入1 mg/m L槐定碱(实验组)。D~G:槐定碱不同处理对病毒的抑制作用。D(组Ⅰ):感染时加入槐定碱对病毒的抑制作用;E(组Ⅱ):槐定碱处理病毒后加入细胞培养体系;F(组Ⅲ):病毒感染后槐定碱的抑制作用;G(组Ⅳ):槐定碱预处理细胞对病毒的抑制作用(*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001)。图3(D)显示:同时加入EV71病毒和31.25μg/m L的槐定碱可能够有效抑制EV71病毒造成的细胞损伤,明显缓解细胞的CPE反应(p<0.001),且具有明显的药物浓度依赖性。图3-E显示:槐定碱对于EV71病毒具有直接杀灭或抑制其感染的功能,但各浓度差异不大;由图3-F可知:槐定碱对病毒感染后的细胞无明显保护作用;由图3-G可知:用该药物预处理细胞可有效抑制病毒感染,具有明显的药物浓度依赖性。

3.4 槐定碱对EV71病毒吸附、穿入和复制的抑制作用

病毒危害细胞的过程大致可以分为吸附、穿入和复制。图4-A(组Ⅶ)显示:31.25μg/m L的槐定碱对于病毒吸附即具有较好的抑制作用(p<0.001),且抑制作用与浓度正相关。图4-B(组Ⅷ)显示槐定碱对病毒穿入的抑制作用较弱。图4-B(组Ⅸ)显示:较低浓度槐定碱(62.5μg/m L)对于病毒RNA复制即具有明显的抑制作用,其抑制作用与浓度正相关。

注:A:槐定碱对EV71病毒吸附的抑制作用(N=3);B:槐定碱对EV71病毒穿入的抑制作用(N=3)。C:不同浓度槐定碱作用后EV71病毒RNART-PCR检测结果,图中槐定碱浓度单位为μg/ml(单因素方差分析,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

4 讨论与结论

Vero细胞是非洲绿猴肾细胞,对EV71病毒感染较为敏感,以成为病毒学研究的常用细胞体系。我们选用体外培养的Vero细胞体系,探究了槐定碱抗EV71病毒的作用,并对其抗EV71病毒的机制进行了初步探讨。尽管培养细胞体系中的实验结果与临床还有相当距离,但也为该药物的临床应用提供了有益的线索。

中药及其提取物的抗EV71病毒已有许多相关研究,见表2。本研究发现:槐定碱可有效抑制EV71病毒对Vero细胞的感染,其IC50值为0.35mg/m L,该值优于丹参提取液的IC50值。而槐定碱对于Vero细胞的半致死浓度(CC50值)为1.346mg/m L,远高于IC50值,说明该药物细胞毒性较低,而安全性较高。

EV71病毒感染细胞大致包括病毒吸附、脱衣壳、病毒遗传物质进入细胞(穿入)、病毒RNA复制、衣壳蛋白合成和病毒组装等关键步骤。这些关键的步骤都可成为抗病毒化合物研究的作用靶点[22]。本研究主要就病毒吸附、穿入及复制三个方面初步探究了槐定碱抑制EV71病毒对Vero细胞感染的机制。结果表明:低浓度(31.25μg/m L)的槐定碱即可抑制EV71病毒的吸附,而较高浓度(62.5μg/m L以上)的槐定碱还可以抑制病毒RNA的复制。刘晓玲等的研究表明:槐定碱等苦参系列生物碱可有效抑制柯萨奇B3病毒(CVB3)所致的Vero细胞和大鼠原代心肌细胞病变抑制作用、病毒繁殖抑制反应[23]。我们的结果与刘晓玲等的研究结果能够相互印证。

EV71型 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月～2014年9月我院门诊收治320例重症手足口病患儿，入院后根据病史、临床表现，结合相关辅助检查均符合《手足口病诊治指南（2010年）》中相关诊断标准，明确诊断为重症手足口病[3]。其中男220例，女100例；年龄1～13(3.3±0.8）岁。排除标准：排除合并有其它严重疾病患儿；排除有严重心肺肝肾功能障碍患儿；排除非重症手足口病患儿。

1.2 方法

1.2.1 样本采集与检测

采用专用棉签采集患儿咽拭子标本进行检测，提出病毒核酸，用中山大学达安基因公司生产核酸检测试剂盒检测，采用Stratagen Mx 3000P PCR扩增仪扩增病毒核酸，全自动实时毛细管电泳系统分析PCR产物，纯化PCR产物后进行测序。

1.2.2 基因序列测定

用BioEdit软件对下载成功的EV71病毒基因序列进行编辑，获得891bpEV71病毒基因全长，将获得基因与下载基因进行对比分析。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 18.0统计学软件进行处理。计量资料采用±s表示，行t检验；计数资料采用例表示，行χ2检验。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EV71、Cox16病毒检出阳性例数

320例重症手足口病患儿检出EV71阳性173例，阳性率为54.06%，检出Cox16阳性为30例，阳性率为9.38%,EV71阳性检出率明显高于Cox16阳性检出率，比较有统计学意义（P<0.05）。

2.2 EV71、Cox16在不同年龄阶段分布情况

EV71、Cox16阳性检出在2～3岁儿童中最多，EV71、Cox16阳性检出率在不同年龄患儿中基本相同。见表1。

2.3 EV71、Cox16在不同性别分布情况

EV71、Cox16阳性检出男性明显多于女性，比较有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 病原学分析

对核苷酸序列进行分析，发现EV71病毒在进化树聚于四簇，来源相同，具有较高的亲缘性，参照山东、北京、广东等地发现EV71流行病毒以C4a基因型为主。

3 讨论

手足口病流行周期为数年，每年可在小部分地区发生流行，通过密切接触可导致传染，感染危险因素有机体抵抗力差、年龄小等[4]。临床表现有发热、皮肤疱疹、口腔黏膜溃疡，其中以皮肤黏膜损害为主[5]。研究指出，部分患儿可出现神经系统症状，如脊髓灰质炎病毒、脑膜炎样症状，临床诊断应充分鉴别[6]。手足口病流行病毒主要为EV71病毒和Cox16病毒，研究指出，近年来EV71病毒流行趋势有所上升[7,8]。不同病毒感染可导致不同临床症状出现，正确掌握流行病毒种类，对临床进行预防、经验性治疗有重要意义。

本次研究320例重症手足口病患儿采用咽拭子标本检查病毒种类，得出EV71阳性173例，阳性率为54.06%，检出Cox16阳性为30例，阳性率为9.38%,EV71阳性检出率明显高于Cox16阳性检出率，比较有统计学意义（P<0.05）。在重症手足口病患儿中以EV71病毒感染为主，同时可以反应出本次研究，甚至本地区以EV71病毒流行为主。有学者对北京市手足口病患者进行分析，得出2007年～2010年同样为EV71病毒流行为主，另发现非肠道病毒感染率逐年增高[9,10]。本次研究将检出阳性患儿根据年龄进行分布，得出2～3儿童EV71和Cox16阳性检出率最高。分析得出2～3岁儿童正脱离母体所传承免疫力保护，而自身免疫系统正在发育阶段，免疫力低下为感染重要因素[11]。临床中预防重点人群应为免疫力低下的人群，特别2～3岁儿童应重点预防。本次研究同样将检出阳性患儿根据性别分布情况进行研究，得出男性患儿阳性检出率明显高于女性。分析原因为男性儿童较女性活泼，在活动过程中增加接触机率，增加感染率[12]。研究表明，危重手足口病发展迅速，可导致发生循环、神经、呼吸系统损伤，严重可导致死亡[13]。本次研究未对患儿进行随访，未能将患儿预后进行分析，今后临床研究工作中可将不同病毒感染对患儿预后影响作相关研究分析。本次研究对EV71病毒行核酸提取，分析基因种类，通过与多组基因比较得出EV71变异较小，不同簇亲缘性较高，主要以C4a基因型流行。

综上所述，手足口重症病EV71检出情况明显高于Cox16，易感2～3岁男性儿童，流行基因为C4a，未发生显著变异，临床应有针对性进行预防和控制。

摘要：选取320例重症手足口病患儿为研究对象,采用咽拭子荧光定量RT-PCR检测EV71病毒和柯萨奇A组16型病毒(Cox16),分析两种病毒检出率及在患儿性别、年龄中分布情况,并对EV71基因进行种系分析。结果 EV71阳性检出率为54.06%(173/320),Cox16阳性检出率为9.38%(30/320),EV71阳性检出率明显高于Cox16,比较有统计学意义(P<0.05);EV71、Cox16阳性患儿在23岁患儿中构成比最高,男性对于女性;EV71病毒变异较小,主要以C4a基因型流行为主。导致重症手足口病病毒多位EV71病毒,23岁儿童中易感染,男性多于女性,EV71病毒变异较小,主要以C4a基因型流行为主。