荧光探针PCR

荧光探针PCR（精选7篇）

荧光探针PCR 篇1

鹦鹉热嗜衣原体 (Chlamydophila psittaci, Cps) 是一类专性细胞内寄生的人兽共患病病原体, 能引起人和动物多种疾病, 对鸟类、家禽和家畜有很强的感染性, 可引起禽类的肺炎、气囊炎、输卵管炎及受精率降低和哺乳动物流产、死产等生殖系统障碍。

目前针对鹦鹉嗜热衣原体病的检测主要通过检测病原体是否存在来判断, 常用的有碘和Giemsa染色、免疫荧光法, 根据抗原抗体的酶联免疫技术以及灵敏度比较高的PCR技术。然而针对PCR反应, 目前主要体现在主要外膜蛋白 (MOMP) 基因、rRNA基因和内源性质粒[1]这三个目的片段。内源性质粒的敏感性和特异性高于MOMP基因、rRNA基因的检测, 能够检测敏感性达1 fg的质粒DNA, rRNA基因能够检测到10 fg的总DNA, MOMP基因的敏感性却为100 fg的总DNA, 为此我们建立基于Taq Man探针的Real time PCR技术, 针对MOMP基因中的omp A (major outer membrane protein A, omp A) 基因建立快速的、高灵敏的PCR检测试剂盒, 从而为鹦鹉嗜热衣原体感染检测提供强有力的技术保障。

1 材料和方法

1.1 菌株与细胞

阳性株鹦鹉嗜热衣原体SX5株 (牛源) 由中国农业科学研究院兰州兽医研究所分离保存;沙眼衣原体55Y120和肺炎衣原体AR39株由中国医学菌种保藏管理中心提供, Hela细胞为宁夏农林科学院畜禽疾病防治实验室保存。

1.2 样品制备

病例样品来自宁夏银川三个牛场 (A牛场n=164, B牛场n=115, C牛场n=97) , 分别采取疑似患病牛的血液样品以及对应的组织样本。鹦鹉嗜热衣原体的培养采用Hela细胞。将冻存的样品常温解冻后接种到培养状态良好的Hela细胞中, 同时接种阳性标准菌株鹦鹉嗜热衣原体 (牛源) SX5株作为阳性对照, 接种沙眼衣原体55Y120作为阴性对照, 5%CO2培养箱中37℃培养48~72 h, 最后收集细胞, 进行DNA的提取。鹦鹉嗜热衣原体DNA的提取按照UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行。

1.3 DNA提取

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取沙眼衣原体、肺炎衣原体、牛结核分枝杆菌、布鲁杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌和沙门菌的DNA和奶牛拭子的DNA (具体操作见试剂盒说明书) , 将提取后DNA置-70℃保存备用。

1.4 引物及探针设计

根据Gen Bank中牛鹦鹉嗜热衣原体主要外膜A蛋白omp A基因序列, 利用Primer 5.0软件设计引物, 上游序列为5'-GGCACCATGTGGGAAGGTGCT-TG-3', 下游序列为5'-GTCATTTGGAGAGGATCCT-GTG-3', 针对引物之间的基因片段利用Primer Express设计Taq MAN探针, 序列为5'-GCGCAG-GATACTACGGAGATTATG-3', 5'端标记FAM, 3'端标记NFQ-MGB, 扩增目标片段的长度为180 bp, 引物和探针由美国ABI公司合成和标记。

1.5 PCR与Real-Time PCR

PCR扩增采用Light Cycler (Roche) 4.8以及IQ5 (RD) 两台定量PCR扩增仪, 采用Ta KaRa试剂盒说明书提供的反应体系, Premix Ex TaqTM (Probe q PCR) 10.0μL, PCR Forward Primer (10μmol/L) 0.8μL, PCR Reverse Primer (10μmol/L) 0.8μL;Probe 1.0μL, 总DNA 2.0μL, dd H2O 5.4μL, 总体系20μL。反应条件为95℃预变性30 s;95℃5 s, 62℃20 s, 72℃20 s, 40个循环;最后37℃延伸20 min, 至反应结束。

1.6 灵敏性检测

将SX5株培养后提取DNA进行核酸定量检测, 采用10倍稀释法进行梯度稀释, 建立6个梯度, 最大DNA浓度为1μg, 最小DNA浓度为1 fg。按照前面所述PCR体系及条件用两台PCR仪分析。

1.7 特异性检测

阳性鹦鹉嗜热衣原体SX5株、沙眼衣原体55Y120株、肺炎衣原体AR39株、沙眼衣原体、肺炎衣原体、牛结核分枝杆菌、布鲁杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌和沙门菌同时采用1.4设计引物探针进行定量分析检测, 模板采用6个梯度, 最大DNA浓度为1μg, 最小DNA浓度为1 fg。

1.8 样品检测

对三个牛场流产的奶牛收集血液样本, 首先采用鹦鹉嗜热衣原体IHA诊断试剂盒 (由中国农业科学院兰州兽医研究所禽类中心研制) 进行初步诊断, 对阳性样品经行了Hela细胞的扩增培养, 提取DNA, 采用1 ng、100 fg、10 fg总DNA作为模板, 采用PCR和RT-QPCR分别进行血液和组织的检测, 3%琼脂糖凝胶检测结果, SPSS 18.0软件经行统计结果分析。

2 结果

2.1 敏感性检测

标准菌株总DNA经过稀释, 最大DNA浓度为1μg, 最小DNA浓度为1 fg, 每个样本3次重复, 结果见图1。结果显示1 fg的总DNA在两台仪器中都无扩增曲线, 说明最大灵敏度为总DNA 10 fg。两台仪器都显示出良好的标准曲线, IQ5仪器的相关系数R2=0.996, Light Cycler的相关系数R2=0.993, 溶解曲线峰值单一, IQ5仪器的Tm=74.3℃, Light Cycler的Tm=74.1℃。

2.2 特异性检测

对阳性鹦鹉嗜热衣原体SX5株、沙眼衣原体55Y120株、肺炎衣原体AR39株采用细胞培养分离, 提取总DNA, 并且进行梯度稀释, 采用Taq Man定量PCR上级分析, 结果显示阳性鹦鹉热衣原体10 fg以上的总DNA都显示出特异性扩增曲线, 并且溶解曲线单一, Tm=74.1℃, 见图1。沙眼衣原体、肺炎衣原体、肺炎衣原体、牛结核分枝杆菌、布鲁杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌和沙门菌均为典型阴性反应, 均未见特异性的荧光扩增曲线, 均无荧光值增长。结果表明, 所建立的鹦鹉嗜热衣原体Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有较强的特异性。

2.3 样品检测

针对三个牛场流产的奶牛样本, 采用鹦鹉嗜热衣原体IHA诊断试剂盒检测、PCR和RT-QPCR分别经行血液和组织的检测, 结果显示A牛场 (n=164) IHA检测阳性样本47例, 阳性率为28.66%, PCR检测阳性样本54例, 阳性率为32.93%, RT-QPCR检测阳性样本60例, 阳性率为36.59%;B牛场 (n=115) IHA检测阳性样本26例, 阳性率为22.61%, PCR检测阳性样本29例, 阳性率为25.22%, RT-QPCR检测阳性样本31例, 阳性率为26.96%;C牛场 (n=97) IHA检测阳性样本17例, 阳性率为17.53%, PCR检测阳性样本21例, 阳性率为21.65%, RT-QPCR检测阳性样本23例, 阳性率为23.71%。

针对所有样品进行RT-QPCR、PCR与IHA方法的敏感性与特异性检测, 显示RT-QPCR的敏感性达到了99.03% (102/103) , 特异性为95.60% (261/273) , 见表1。

注:+/+表示RT-QPCR阳性, PCR或IHA也为阳性;+/-表示RT-QPCR阳性, PCR或IHA为阴性;-/-表示RT-QPCR、PCR与IHA全为阴性;-/+表示RT-QPCR阴性, PCR或IHA为阳性。

3 讨论与小结

动物衣原体病 (Chlamydiosis) 是由各类衣原体感染哺乳动物、禽类所发生的一类十分重要的自然疫源性传染病[2]。鹦鹉嗜热衣原体对各种畜、禽及其他动物均有致病性, 针对奶牛养殖业, 通常使怀孕4~5个月的奶牛流产, 造成巨大的经济损失, 如果能早期快速诊断鹦鹉热衣原体, 对其的防控具有重要意义。

主要外膜蛋白 (MOMP) 是鹦鹉嗜热衣原体在感染宿主过程中的主要致病因子, 鹦鹉嗜热衣原体主要外膜蛋白A具有种属特异性和血清型特异性的抗原决定簇[3], 本研究选取的是衣原体omp A基因保守的序列, 设计了针对鹦鹉热衣原体种属的特异性引物和Taq Man MGB探针, 通过摸索选用了优化后的实时荧光定量PCR反应条件和扩增体系, 提高了检测的特异性和敏感性, 建立了Taq Man MGB探针法实时荧光定量PCR检测鹦鹉嗜热衣原体的方法, 并将其固相化集成快速检测试剂盒, 敏感性为10 fg的总DNA, 同时不与沙眼衣原体55Y120株、肺炎衣原体AR39株、肺炎衣原体、牛结核分枝杆菌、布鲁杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌和沙门菌发生交叉反应, 具有较强的特异性。实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于已经被广泛应用于临床诊断, 鹦鹉热衣原体的检测尚缺乏这方面的试剂盒, 因此笔者建立鹦鹉嗜热衣原体omp A基因的简单快速、准确经济、灵敏度高的TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR检测方法, 为鹦鹉嗜热衣原体感染的早期诊断提供强有力的技术支持, 对鹦鹉嗜热衣原体感染的防控具有重要意义。

摘要：为了建立特异、敏感、快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法, 针对支原体ompA基因的保守区设计特异性引物和探针, 建立鹦鹉热嗜衣原体TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法, 验证方法的特异性、敏感性和稳定性。并对来自宁夏地区三个规模化奶牛养殖场的376份流产奶牛样品利用鹦鹉热嗜衣原体IHA诊断试剂盒和TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR进行检测。结果表明:建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法敏感性为10 fg的总DNA, 是一种可靠、快速、灵敏的检测鹦鹉热嗜衣原体的方法, 并且成功应用于奶牛鹦鹉热嗜衣原体样本的检测。

关键词：鹦鹉热嗜衣原体,小沟结合物 (MGB) 探针,IHA,实时荧光定量PCR

参考文献

[1]GOSBELL I B, ROSS A D, TURNER I B.Chlamydia psittaci infection and reinfection in a veterinarian[J].Aust Vet J, 1999, 77 (8) :511–513.

[2]OSMAN K M, ALI H A, EIJAKEE J A, et al.Prevalence of chlamydophila psittaci Infections in the eyes of cattle, buffaloes, sheep and goats in contact with a human population[J].Transbound Emerg Dis, 2013, 60 (3) :245-251.

[3]SACHSE K, LAROUCAU K, HOTZEL H, et al.Genotyping of Chlamydophila psittaci using a new DNA microarray assay based on sequence analysis of ompA genes[J].Vet J, 2009, 181 (2) :145-150.

荧光探针PCR 篇2

1 材料

ASFV基因组DNA,从意大利撒丁岛动物疫病参考实验室获得; 伪狂犬病毒( PRV) 、猪细小病毒( PPV) 和猪圆环病毒2 型( PCV - 2) 的基因组DNA,以及经典猪瘟病毒( CSFV) 和猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV) 、猪流行性腹泻病毒( PEDV) 和猪流感病毒( SIV) 的c DNA,由天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心反刍动物检疫国家重点实验室保存。组织基因组提取试剂盒,购自天根生化科技有限公司; 克隆载体PCR2. 1,购自INVITROGEN公司;Ta KaRa TaqTM聚合酶、Premix Ex TaqTM( Probe q PCR) ,购自大连宝生物工程( 大连) 有限公司; 低温高速离心机( Eppendorf,5417R) 、荧光PCR仪( Rochi公司,Light Cycler480 ) ,由天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心反刍动物检疫国家重点实验室提供。

2 方法

2. 1 引物与探针的设计与合成

对从Gen Bank数据库( http: / /www. ncbi. nlm.nih. gov / ) 下载的ASFV CP530R基因序列进行同源性分析比较,选出高度保守且特异的区域,用Beacon Designer 7. 0 软件设计1 对特异引物和Taq Man -MGB探针,由上海英骏生物技术有限公司合成,5' 端用FAM标记,3'端用MGB标记,引物和探针序列见表1,预期扩增片段长度为73 bp。

2. 2 质粒标准对照的制备

根据ASFV CP530R基因序列设计、合成了4 条引物用于方法建立及评价的质粒标准对照,引物序列见表2。在50 μL的PCR扩增体系中,依次加入10 × Buffer( 含Mg Cl2) 5 μL,d NTPs( 2. 5 mmol /L)4 μL,Ta KaRa Taq聚合酶( 5. 0 U / μL ) 0. 2 μL,CP530R F1 ( 1 pmol / μL) 、CP530R R1 ( 1 pmol / μL) 、CP530R F2( 25 pmol / μL) 和CP530R R2( 25 pmol / μL)各1 μL,用dd H2O补足50 μL。PCR扩增反应参数为: 94 ℃ 预变性5 min; 94 ℃ 变性30 s,60 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸20 s,共35 个循环; 72 ℃ 延伸10 min。将扩增产物回收后与PCR2. 1 克隆载体连接,转化至E. coli DH5α 感受态细胞,挑取阳性克隆质粒进行测序鉴定。将正确插入CP530R基因扩增靶序列的阳性克隆质粒命名为PCR2. 1 - ASFV -CP530R,用核酸蛋白分析仪测定其浓度,然后按下列公式换算成拷贝数浓度为6. 1 × 1010copies / μL: 拷贝数浓度( copies/μL) = ( OD260值 × 50 × 稀释倍数 ×10- 8/ ( 324. 5 × 碱基数) × ( 6. 02 × 1023) 。

2. 3 实时荧光PCR反应的优化

用灭菌水将引物探针分别稀释为2 ~ 10 pmol/μL和1. 5 ~ 3. 5 pmol/μL,以6. 1 × 106copies / μL的PCR2. 1 - ASFV - CP530R为扩增模板,采用Premix Ex TaqTM( Probe q PCR) 试剂及推荐的25 μL反应体系及扩增条件,在荧光PCR仪上对不同浓度组合的引物和标记探针进行实时荧光PCR方阵筛选试验,以确定最适引物和探针使用浓度组合。在最适引物和标记探针的浓度下,对退火延伸温度在56 ~ 61 ℃范围内进行实时荧光PCR筛选试验,以确定荧光PCR最适扩增条件。

2. 4 标准曲线的绘制

用灭菌去离子水稀释质粒标准对照为6. 1 ×102~ 6. 1 × 109copies / μL,对不同稀释度的质粒标准对照模板在最适反应条件下进行PCR扩增。反应结束后以Ct值为横坐标、质粒标准对照DNA起始拷贝数浓度的对数为纵坐标绘制质粒标准对照曲线。

2. 5 敏感性试验、重复性试验和特异性试验

将质粒标准对照做10 倍系列稀释,每个浓度取1 μL作为模板,按优化的反应条件进行实时荧光PCR试验,确定该方法检测质粒标准对照的最低拷贝数; 选取5 个浓度( 6. 1 × 103~ 6. 1 ×107copies / μL) 的质粒标准对照为模板,按优化的反应条件分别进行2 个平行样品的4 次重复实时荧光PCR试验,以确定该方法的可重复性; 以ASFV、PRV、PPV和PCV - 2 的DNA以及CSFV、PRRSV、PEDV和SIV的c DNA为模板,按优化的反应条件进行实时荧光PCR试验,同时设阴性对照,以确定该方法的特异性。

2. 6 实际样本的检测

对2012—2014 年保存的126 头份进口猪的血清样品和38 份进口猪肉样品,用组织基因组DNA提取试剂盒按操作说明书提取DNA,然后采用本试验建立的实时PCR方法进行ASFV核酸检测,以评价该方法的适用性。

3 结果与分析

3. 1 引物及探针的保守性分析结果

用DNAMAN软件对设计的引物及探针序列与Gen Bank数据库公布的全部14 条ASFV CP530R基因序列进行了比对,结果见图1。

图1 ASFV CP530R基因扩增靶序列的比对及引物和探针的位置Fig.1 Alignments of the amplified target sequences of ASFV CP530R genes and the locations of primers and probes

由图1 可见,上游引物仅有2 个序列( AY261363. 1. SEQ和AY261366. 1. SEQ) 的中间位置出现1 个C /T碱基的替换,下游引物中仅有1 个序列( AY261364. 1. SEQ) 的中间位置出现1 个C /T碱基的替换,而探针序列完全保守,表明本研究设计的针对ASFV CP530R基因的引物和探针序列具有很高的保守性。

3. 2 实时荧光PCR反应的优化结果

试验以6. 1 × 107copies / μL的质粒标准对照为扩增模板,通过对不同使用浓度组合的引物和标记探针进行实时荧光PCR方阵筛选试验以及对退火延伸温度的筛选试验,确定的实时最适荧光PCR扩增条件为: 在25 μL反应体系中,依次加入2 × Premix Ex TaqTM( Probe q PCR ) 12. 5 μL,CP530R - F( 7. 5 pmol/μL) 、CP530R - R ( 7. 5 pmol/μL ) 和CP530R - P( 2. 5 pmol / μL) 各1 μL,6. 1 × 107/ μL的PCR2. 1 - ASFV - CP530R质粒模板1 μL,用纯水补足25 μL。反应参数为95 ℃ 2 min; 95 ℃ 10 s,56 ℃10 s,60 ℃ 30 s,共40 个循环。在每次循环60 ℃ 退火结束前采集FAM通道荧光信号,在该优化的实时荧光PCR条件下,可获得良好的典型扩增曲线,见图2。

图2质粒标准对照(6.1×107copies·μL-1)的实时荧光PCR动力学曲线Fig.2 The Real-time fluorescence PCR kinetic curve of the plasmid standard control(6.1×107copies·μL-1)

3. 3 标准曲线

以6. 1 × 101~ 6. 1 × 109copies / μL的质粒标准对照为扩增模板,按优化后的反应条件进行实时荧光RT - PCR反应,扩增曲线见图3A; 以起始模板浓度的对数为x轴,Ct值为y轴绘制成的标准曲线见图3B。Ct值与质粒标准对照拷贝数之间的线性关系表达式为y = - 3. 449x + 38. 10,相关系数( R2) 为0. 999,呈现良好的线性关系。

3. 4 敏感性试验结果

按优化后的反应条件对不同稀释度( 6. 1 × 101~6. 1 × 109copies / μL) 的质粒标准对照DNA进行实时荧光PCR反应,结果表明,该方法最低可检出61 个拷贝数的质粒标准对照DNA分子。

3. 5 重复性试验结果

选取5 个浓度( 6. 1 × 103~ 6. 1 × 107copies / μL)的质粒标准对照DNA为模板,按优化的荧光定量PCR反应条件进行双样品4 次重复试验,每个稀释度样本检测的Ct值及其计算出的平均值( x ± sd) 及变异系数( CV) 见表3。

由表3 可见,这5 个浓度质粒标准对照4 次重复试验的Ct值变异系数均小于2. 0% ,表明本试验所建立的实时荧光PCR检测体系稳定,具有良好的重复性。

图3质粒标准对照(6.1×101~6.1×109copies·μL-1)的实时荧光PCR扩增曲线(A)和标准曲线(B)Fig.3 The Real-time fluorescence PCR amplification curves and standard curves of the plasmid standard control(6.1×101~6.1×109copies·μL-1)

图4 ASFV的荧光定量PCR检测的特异性试验结果Fig.4 The results of specficity test of real-time PCR fluorescence assay for ASFV

3.6特异性试验结果

见图4。

由图4 可知,仅ASFV的DNA出现典型的扩增曲线,而PRV、PPV和PCV - 2 的DNA以及CSFV、PRRSV、PEDV和SIV的c DNA均无扩增曲线出现,表明该方法检测ASFV核酸有良好的特异性。

3.7临床样本检测结果

见表4。

份

由表4 可知,126 头份进口猪的血清样品和38份进口猪肉样品的ASFV核酸检测结果均为阴性,表明该方法可用于猪血清样本和猪肉样本中ASFV核酸的检测。

4 讨论

ASF是一种对养猪业危害巨大的病毒性疫病,已引起世界各主要养猪国家及地区的高度重视。由于本病缺乏用于防制的有效疫苗,在ASF流行的国家及地区,对疑似发病猪进行ASF快速而准确的诊断,是及时采取措施控制本病、减少经济损失的重要前提。在无ASF疫情国家及地区,对可能携带ASFV的野猪和软蜱的流行病学监测以及对来自风险国家及地区的活猪和猪制品ASFV的检测,是防控ASFV传入的重要措施。因此,建立快速、敏感和特异的ASFV检测方法可为ASFV的防控工作提供有力的技术手段。

国内外已建立的多种检测ASFV方法中,HAD试验对高效价的ASFV可在24 h内得到准确的检测结果,但对于一个阴性结果的判定至少需要6 d的时间,对某些低毒力ASFV的检测结果HAD试验往往呈阴性[12,13],不适合快速检测的要求。IF和ELISA试验检测ASFV抗原,虽具备快速、准确的特点,但对于亚急性感染和慢性感染猪的低ASFV载量样本缺乏足够的敏感性,易出现假阴性结果[9]。此外,目前世界动物卫生组织( OIE) 规定涉及ASFV活毒的HAD、IF和ELISA等试验操作应在生物安全三级实验室条件下进行,实时荧光PCR方法对灭活样品仅需在生物安全二级实验室条件下即可进行,特别适用于急性感染早期动物组织样本、急性感染恢复期、低毒力或中等毒力感染家猪以及持续性感染的野猪和软蜱组织样本中ASFV核酸的检测。由于ASFV是一种基因组长为170 ~ 193 kb、含有151 ~ 165 个ORF的单分子线状双链DNA病毒,近年来国内外基于VP72、9GL、TopoisomeraseⅡ、P54 和K205R基因建立了多种PCR和实时荧光PCR方法[5,6,7,8]。CP530R基因是ASFV在感染细胞内晚期高效表达的一种编码合成PP62 前体的基因,该PP62 前体蛋白参与ASFV的衣壳组装和成熟过程[11]。本试验基于CP204L基因序列设计合成了1 对特异性强且序列高度保守的引物与探针,通过优化反应条件建立了一种检测ASFV核酸的实时荧光PCR方法,结果表明,该方法仅与ASFV的DNA发生特异性扩增反应,不与PRV、PPV、PCV - 2、CSFV、PRRSV、PEDV和SIV等发生交叉反应,具有良好的特异性。用该方法定量检测ASFV CP530R基因的质粒标准对照,在6. 1 × 102~6. 1 × 109copies / μL范围内Ct值与起始模板拷贝数之间呈现良好的线性关系,最低可检测到61 个拷贝的质粒标准对照。本研究采用该方法对164 份样本进行ASFV检测,从样品DNA提取到报告检测结果的整个试验过程可在3 h内完成,具有特异、敏感、快速和高通量的特点,为我国预防ASFV的传入和流行病学监测提供了一种实用而准确的检测方法。

荧光探针PCR 篇3

1实验部分

1.1试剂

氯化镉 CdCl2·2.5H2O(分子量228.35)经重结晶纯化,重庆东方试剂厂生产;硫化钠 Na2S·9H2O (分子量240.18),汕头市西陇化工厂有限公司生产;巯基乙酸(分子量92.12),成都市科龙化工试剂厂;氢氧化钠(分子量40.00),重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂;实验用水均为二次蒸馏水。

1.2仪器

HITACHI F-4500型荧光分光光度计;磁力搅拌器(85-2C),巩义市英峪予华仪器厂;YQY-07氧气减压器,重庆市万州气体厂;电子天平(型号:FA1104N),上海精密科学仪器有限公司;移液枪,BIOHIT百德实验室仪器(苏州)有限公司。

1.3储备液的配制

(1)氯化镉储备液的制备

称取氯化镉0.2283g,用水溶解后,移入500mL的容量瓶,用水稀释至标线,摇匀。

(2)硫化钠制备

称取0.1610g的硫化钠,用水溶解后,移入500mL的容量瓶,用水稀释至标线,摇匀。

(3)氢氧化钠的制备

称取氢氧化钠1.0000g,用水溶解后,移入50mL的容量瓶,用水稀释至标线,摇匀。

(4)巯基乙酸储备液的制备

在巯基乙酸溶液中,用移液枪移取100μL再加入10mL的蒸馏水中,摇匀。

(5)氯化镉标准使用液的制备

吸取50mL氯化镉储备液于100mL的容量瓶中,再吸取770μL的巯基乙酸储备液并加入100mL的容量瓶中。

1.4硫化镉量子点的合成[5]

(1)从氯化镉标准使用液中用移液管吸取50mL放入小烧杯中,用氢氧化钠配置液调节其pH值为10,摇匀,取25mL放入试剂管中。重复以上的实验,配置溶液pH分别为11、12分别装入试剂管中。

(2)将pH值10、11、12的溶液分别放入三口瓶中,控制反应温度分别为10℃、20℃、50℃,再放在磁力搅拌器通入半个小时的N2,并同时进行搅拌。在通气期间,从硫化钠制备液中吸取25mL放入小烧杯中,再分别吸取两次,同上。半个小时之后,向pH为10、11、12的溶液中分别滴入25mL的硫化钠,滴毕。在无氧条件下搅拌过夜,溶液由无色变为黄绿色,

2.5量子点材料的光谱测定

取合成的量子点材料1.0mL溶液,将其稀释10倍后进行荧光测量。激发波长335nm,发射波长范围420～600nm,狭缝均为10nm。

3结果与讨论

3.1反应温度对合成材料光学性质的影响

从图1,图2和图3可以看出在控制酸度反应条件一致的条件,温度对于合成材料具有影响。不管是在pH=10还是11或是12条件下,高温对于合成材料的光学性质是不利的。在pH 10和11的条件下,室温(20℃)合成的材料的发光性能不如10℃,但是在低酸度条件,即pH=12的条件下,室温和低温合成材料的性能差异不大。同时,我们还看到,不过是在什么酸度条件下,高温都会使的最大发射峰的位置发生红移,说明提高温度能够使得纳米材料的聚集程度变大[6,7]。

3.2反应酸度对合成材料光学性质的影响

从图4,图5和图6可以看出在控制温度反应条件一致的条件,酸度对于合成材料具有不同影响。在同一温度条件下,最大发射峰波动不大,同一温度pH=10,11,12条件下不会影响纳米粒子的大小。在低温条件下,酸度对材料的合成基本没有影响。在20℃条件下时,酸度越低对于合成材料的光学性质越有利,而在50℃条件下,对于酸度的变化不规律,pH为12时发光性质最好。

4结论

本文用巯基乙酸修饰合成了硫化镉量子点材料,考察了温度和酸度对于合成材料的光学影响。研究结果表明pH 10和低温条件有利于合成高发光性质的材料,对于加强量子点材料的合成机理研究具有积极意义。同时可能通过对条件影响的研究,进一步构建纳米材料在生物学和化学的应用范围。

摘要：荧光量子点作为一种新型的生物标记物,CdS纳米团簇可以发射较强的对人眼较敏感的黄色荧光,可以作为荧光探针。溶液在无氧条件下,通入氮气,以巯基乙酸为稳定剂,水溶液通过调节pH,再经过12小时的搅拌,合成由巯基乙酸修饰的CdS纳米团簇。通过在不同的pH和温度下合成,得到其最适合的pH为10,随着温度的降低其荧光强度增强。

关键词：量子点,CdS,温度,荧光探针,pH

参考文献

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荧光探针PCR 篇4

在肿瘤频发的今天,能够准确构建肿瘤诊断体系对整个肿瘤的治疗过程十分重要,在肿瘤研究和确立最佳治疗方案中不可或缺。传统治疗[1]中临床信息主要来源于对肿瘤细胞的形态学观察及组织学研究,该法虽然已应用于实际病例的诊断中,但仍存在很多局限性。如肿瘤细胞虽然形态各异,但有很多病理学特征相似的肿瘤细胞,传统的方法很难区分这些肿瘤细胞,可能会导致误诊,给肿瘤的临床治疗造成了很大的困难。荧光成像技术出现后,因其高灵敏度、高稳定性、成本低廉等优点得到了国内外学者的广泛关注,其核心技术———荧光探针[2]更是研究的重点,且已在光学、生物医学等学科中有重要应用。肿瘤的发生多由基因突变引起,相比于正常细胞,肿瘤细胞的生理特点和形态特征发生明显变化,特别是在分子水平上,例如遗传基因和蛋白质组发生了变化。往往肿瘤细胞能够合成一些正常细胞内不存在或者含量很低的蛋白质(肿瘤标志物),而这些特征反过来为科研工作者所利用,发展了诸如肿瘤标志物检测、肿瘤DNA适体检测等新颖而高效的肿瘤细胞识别检测手段。这些新的方法技术中肿瘤细胞荧光成像探针的研究成为了近年来的研究热点,肿瘤细胞的研究和癌症的临床诊断都离不开荧光成像技术,该技术的核心内容就是需要赋予荧光成像探针特异识别的能力。近年来一种 被称为DNA适体的特异性识别分子成为了这方面研究的新宠儿,DNA适体[3~6]以其高特异性、高亲和力、无毒、分子量小等优点,自出现后发展迅速,已广泛应用于基础研究、药物开发和临床诊断等领域,其发展势头大有盖过抗原/抗体检测方法的趋势,而实际上DNA适体法不但具备抗原/抗体法的所有优点,而且其分子可设计性、可组装性、灵活多变的功能化特点都是抗原/抗体法不可比拟的,因此,近年来DNA适体也被广泛地应用到肿瘤细胞的荧光成像探针的研究中。各种具有特异性的荧光探针陆续被报道,这些探针将荧光物质标记在抗体或DNA适体上,使探针得以特异性地结合到相应靶标肿瘤细胞上,从而实现荧光显微镜下直接观察和检测。在类似的荧光成像检测过程中,背景荧光干扰、光效应等因素都会影响观察结果,从而引起灵敏度降低或者假阳性结果,故荧光成像探针的特异性和荧光信号强度对于荧光探针来说是十分重要的性能指标,提升这两方面的指标是荧光成像探针研究中的重点工作之一。本工作利用技术上比较成熟的荧光纳米材料,如量子点[7,8]等,将之与DNA自组装技 术结合起来,经过DNA有序组装、DNA适体功能化,形成新颖的具有高荧光强度、高特异性的肿瘤细胞荧光成像探针。

本研究以聚苯乙烯纳米微球为载体,利用DNA自组装技术和DNA适体特异性识别技术,组装了一种超分子DNA-CdTe量子点纳米线,并成功制备了具有较高荧光强度的复合纳米粒子荧光成像探针,该探针可以用于肿瘤细胞的特异性识别及荧光成像检测,具有识别反应迅速、高特异性和荧光信号强度高的特点。

1材料与方法

1.1试剂及仪器

1试剂:1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐、硼氢化钠、三(2-甲酰乙基)膦酸盐酸、羟基琥珀硫亚氨(Sigma-Aldrich公司);氯化镉、碲粉(国药化学试剂公司);修饰了羧基的聚苯乙烯纳米微球,(天津市倍思乐色谱技术开发中心)。试剂均为分析纯。所需DNA序列购于北京赛百盛生物科技有限公司,序列信息见表1。

2仪器:高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);扫描电子显微镜和透射电子显微镜(日本HITACHI);激光共聚焦显微镜(德国莱卡公司)气浴恒温振荡器(金坛市医疗仪器厂)。

1.2细胞培养

将人体B淋巴瘤细胞 (Ramos细胞)在RPMI1640培养基中培养,并添加10%的胎牛血清和100U·mL-1青霉素-链霉素双抗溶液。孵育器条件设置为95%空气及5% CO2,温度保持在37℃。进行实验时,首先取细胞培养液2.0mL,于高速冷冻离心机中离心5min,转速为3000rpm·min-1,以除去多余营养物质,加入适量10 mmol·L-1,pH为7.4的PBS(0.1mmol·L-1Ca2+,0.1mmol·L-1Mg2+)缓冲溶液进行离心洗涤,重复2次,最后将细胞分散于1mLPBS溶液中。将细胞溶液置于4℃下备用。

1.3制备水溶性的 CdTe量子点

首先将80mg碲粉和50 mg硼氢化钠置于试管并混合均匀,向试管中通入高纯氮气一段时间,以保证试管中的空气排出干净,然后加入2 mL二次蒸馏水,室温下反应约8h,观察到溶液颜色为深紫色,即得到中间体碲氢化钠。向三口烧瓶中加入63mL水和36mg的氯化镉,通氮气30min后快速加入33μL的巯基丙酸,在搅拌通氮气的状态下滴加氢氧化钠(0.2mol·L-1)溶液至溶液白色浑浊后又再次变澄清,继续通氮气排氧约30min。随即迅速加入碲氢化钠前驱体溶液250μL,氮气保护下加热回流8h,即可得到亮黄色的CdTe量子点胶体溶液。

1.4制备 DNA-CdTe量子点

100μL10mmol·L-1的三(2-甲酰乙基)膦酸盐酸溶液加入到DNAS6溶液中,室温下反应1h后加入适量CdTe量子点溶液,置于气浴恒温震荡器中气浴震荡12h。加入醋酸盐缓冲溶液老化处理24h,于冷冻离 心机中离 心洗涤2次,转速为10000rpm·min-1,取下层沉淀分散到1.2mL10mmol·L-1pH为7.4的PBS缓冲溶液中,于4℃避光保存。

1.5制备复合型纳米粒子荧光探针

首先用20μL10 mmol·L-1pH为6.8的咪唑缓冲溶液活化羧基修饰了的聚苯乙烯微球 (100μL)2h,随后取混合液100μL加入到DNAS1溶液中,气浴震荡24h后离心3 min,转速为3000rpm·min-1,重复离心2次,最后分散在适量PBS溶液中。继续加入DNAS2、S3、S4、S5,退火处理(升温到70℃然后程序降温至18℃,每10min降低5℃)后加入DNAS7,于室温(18℃)下进行杂交反应,2h后停止。加 入1.4步骤中制 备好的DNAS6-CdTe量子点,在气浴振荡器中(25℃)反应24h,低速离心洗涤,重复2次,沉淀分散在200μLPBS溶液中,即得所需复合型纳米荧光探针。

1.6荧光探针用于肿瘤细胞荧光成像

取20μL上述荧光探针加入到Ramos细胞溶液中,在37℃下避光孵育30min,取适量的样品制备样片,并置于激光共聚焦显微镜下观察检测。

2结果与讨论

2.1复合型纳米荧光探针的构建

如今,对于肿瘤细胞的研究正在从形态学过渡到分子学上,对于肿瘤细胞识别的研究更是得到了广泛的关注,DNA适体的出现对分子学上研究肿瘤细胞做出了很大贡献。核酸适体是可以折叠成确定三维结构,并且可与目标分子特异性结合的一种较短的单链寡 聚核苷酸 序列,多为单链DNA或者RNA。当目标分子存在时,DNA适体可以与其特异性结合,空间构型发生改变,形成稳定的结构。随着对适体认识程度的加深,发现DNA适体具有稳定性好、分子量小、易于定点标记、无毒等优点,不但具备抗体的所有特点,且可以进行分子设计和组装,故被广泛用作识别分子,对基础研究、药物开发等领域的进步起 了巨大的 推动作用。 本实验选 用了Ramos细胞的DNA适体,故合成的复合型纳米粒子荧光探针可以特异性识别Ramos细胞。

实验中选择聚苯乙烯微球作为主体,在其表面进行了一系列的修饰工作。DNAS1中含有氨基,可与羧基化的聚苯乙烯微球发生共价结合。DNAS1又能与其他DNA组成的重复单元进行自组装。该重复单元中 含有DNAS2、S3、S4、S5这五种序列,其中DNAS2和S5为回文序列,能够进行反向杂交,DNAS3和S4是连接序列,将回文序列首尾连接起来。DNAS3和S4还可以结合DNAS6,一个重复单元可连接四条DNAS6链,DNAS6端头巯基[9]可结合CdTe量子点,故一个重复单元即可包含四个量子点。最后加入的DNAS7不仅是终止序列,还是可特异性识别Ramos细胞的DNA适体,既可以终止线性组装,还赋予该荧光探针特异识别的能力,使得探针可特异性识别出相应的靶细胞,在激光共聚焦显微镜下有较强的荧光性质。

2.2荧光成像探针的表征

对未经修饰的聚苯乙烯微球采用透射电子显微镜进行了表征,结果见图1。聚苯乙烯微球直径约为500nm,近乎圆形,表面光滑,从中心到边界衬度逐渐降低,符合球状物的透射电镜特征。图2为纳米线探针的原子力显微镜图,从图中可以观察到簇状的纳米线探针,说明纳米线制备成功,达到了我们预期的目的。

2.3荧光探针用于 Ramos细胞荧光成像

选用Ramos细胞作为研究对象,取200μL培育好的Ramos细胞,加入荧光探针于室温下孵育1h,制成样片后置于激光共聚焦显微镜下观察。由图3(a)图中可以看出,细胞呈亮黄色,说明荧光探针可以很好地结合到细胞的表面上,并且荧光强度较强,表明荧光探针中加入的适体链DNAS7赋予了探针特 异性识别 能力,使得探针 可以结合 到Ramos细胞的表面。荧光探针上携带的CdTe量子点给予靶细胞很强的荧光特性,使得靶细胞在荧光显微镜下很容易被检测到。表明设计的荧光探针达到了预期的目的,为肿瘤细胞的快速检测和追踪提供了理论依据。图3(b)为荧光探 针特异性 实验。将荧光探针加入到Ramos细胞与人急性淋巴白血病细胞的混合液中,孵育1h,制成标本于激光共聚焦微镜下观测,从图3(b)双通道(光学和荧光)显微镜图像中可以明显看出,Ramos细胞具有强烈的荧光信号,显示出明显的黄色荧光,而人急性淋巴白血病细胞则没有荧光信号,在图3(b)中显示为圆形灰斑,说明该探针具有特异选择的能力。

3结论

荧光探针PCR 篇5

氟(F)化物是我国农村的主要大气污染物之一,对农业生产及农村生态环境的影响比较明显[10]。因而微量或痕量F离子的检测尤为重要,目前微量检测方法主要为高效液相色谱法,但其检测过程较为复杂,繁琐。本方法采用 ATRP,将荧光单体与水溶性单体丙烯酸低聚乙二醇酯(OEGMA)共聚,得到水溶性无规共聚物P(OEGMA-co-NBDAE),并研究了该荧光聚合物对F离子的荧光淬灭现象,研究表明这是一种较为便捷的检测F离子浓度的方法。

1实验部分

1.1试剂和仪器

4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并口恶唑(NBD-Cl)、OEGMA(甲基丙烯酰胺低聚乙二醇酯)、铜盐(CuBr、CuCl)2-溴异丁酸乙酯(t-EBiB)为化学纯;乙醇胺、乙腈、丙烯酰氯、异丙醇、石油醚、无水乙醚、四氢呋喃(THF)、柱层析硅胶均为分析纯;CuBr经酸洗、醇洗、干燥后使用。

Unity Inova 400MHz型 NMR核磁共振仪,美国瓦里安公司,溶剂为CDCl3;XRF-1800型X射线荧光光谱仪,日本岛津,以DMF为溶剂,室温下测试;Waters1515型凝胶色谱仪(GPC),美国Waters公司,柱温为30℃;UV2 3150型分光光度仪,日本岛津公司,以DMF为溶剂,室温下测试;Nicolet6700型傅立叶红外光谱仪,美国Thermo Nicolet。

1.2荧光单体NBDAE的合成

4-(2-羟乙基胺)-7-硝基-2,1,3-苯并口恶唑(NBD-OH)的合成(参照相关文献[9,11])的方法。在装有40mL乙腈的100mL圆底烧瓶中加入NBD-Cl(400mg,3.01mmol),溶解。过量的乙醇胺(1mL,16.56mmol)溶于10mL乙腈中,然后在搅拌的情况下缓慢加入。室温下反应30min。反应结束后,减压旋转蒸发除去溶剂,浓缩物通过硅胶柱除去杂质,洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(V/V=19∶1)。从而得到棕黄色的产物(NBD-NH(CH2)2OH)(360mg,yield 75%)。将产物溶于120mL乙腈中,加入250mL圆底烧瓶中。过量的丙烯酰氯(8mL,100mmol)溶于30mL乙腈中,缓慢滴加的方式加入剧烈搅拌的圆底烧瓶中。滴加完毕,反应在78℃下回流6h。反应结束,减压旋转蒸发除去乙腈。用饱和NaHCO3溶液洗涤3遍,以完全除去过量未反应的丙烯酰氯(遇水即形成丙烯酸)。然后通过硅胶层析柱分离出产物(NBDAE),二氯甲烷作为洗脱剂,减压旋转蒸发除去二氯甲烷,得到橙黄色粉末状产物(NBDAE,320mg,yield 70.9%)。其反应见式1。

1.3水溶性荧光共聚合物P(OEGMA-co-NBDAE)的合成

在完全干燥的10mL封管中依次加入:干净并干燥的搅拌子,NBDAE(3.06mg,0.011mmol),2,2′-bpy(16.56mg,0.106mmol),OEGMA475(2.5g,5.263mmol),t-EBiB(10.34mg,0.053mmol),溶剂异丙醇(与单体等质量)。采取冷冻-抽真空-解冻循环3次的方式除去氧气。循环3次后,称取CuBr(7.61mg,0.053mmol),加入封管中,继续抽真空10min,然后用酒精喷灯封管。封管完成后,恢复至室温,等封管内物质完全解冻并均匀澄清后,放入已设定好温度的油浴锅内开始反应。原料的摩尔比(nOEGMA∶nNBDAE∶nt-EBiB∶nCuBr∶n2,2′-bpy)为100∶0.2∶1∶1∶2)。 反应预定时间(8h)后,从油浴锅中取出封管,放入液氮中冷冻。冷冻至固体后,破管,恢复至室温,剧烈搅拌,使管内物质暴露于空气中,从而终止反应。

后处理主要包括过硅胶柱除去铜盐(四氢呋喃作为洗脱剂),在石油醚中正相沉淀。得到黄色透明的油状产物P(OEGMA-co-NBDAE)。反应见式2,反应结果见表1。

2结果与讨论

2.1荧光单体NBDAE的合成

以4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并口恶唑(NBD-Cl)为原料,通过两步反应合成了荧光单体4-(2-丙烯酸胺乙基酯)-7-硝基-2,1,3-苯并口恶唑(NBDAE)。由NBDAE的1H-NMR谱图(400 MHz,CDCl3)测定表明:δ(ppm):8.49(1H,d),6.64(1H,br),6.49(1H,d),6.27(1H,d),6.15(1H,dd),5.94(1H,d),4.55(1H,t),3.85(1H,m),由此可以证明得到了预期结构的荧光单体NBDAE。

2.2水溶性荧光共聚物P(OEGMA-co-NBDAE)的合成

采用ATRP法,改变聚合反应温度,得到具有分子量梯度的水溶性荧光聚合物P(OEGMA-co-NBDAE)。

图1为P(OEGMA-co-NBDAE)的GPC谱图。由图1和表1可以看出:在相对较低的温度下,所制备的产物单分散性较好(PDI(a)=1.20;PDI(b)=1.26);曲线b有非常弱的左肩峰,可能是由于体系黏度随着反应的进行而增大,增长链间的偶合几率增大,导致少量的高分子量聚合物出现。当温度较高时,所得的聚合物分子量较大但GPC谱图较宽,且出现较明显的偶合峰。这可能是由于低聚的OEGMA的分子量较大,温度升高时,容易发生分子间链转移,破坏了ATRP活性聚合过程中休眠种与活性种之间的可逆平衡。当温度继续增高时,明显出现双峰现象,而且分子量非常大,已不表现出活性聚合的基本特征。可能是由于很高温度下增长链间转移明显,破坏了ATRP聚合过程中活性种与休眠种之间建立的可逆动态平衡所造成的。

图2是P(OEGMA-co-NBDAE)-1#的1H-NMR图谱,各种氢对应的化学位移在图中已标出。在氢谱中没有发现染料分子NBDAE的特征化学位移,可能由于NBDAE荧光单体在聚合时用量很少(0.2%单体的摩尔量)。由于引发剂端基特征峰化学位移和POEGMA的特征化学位移重叠,未能够从氢谱计算出准确的聚合度。

2.3P(OEGMA-co-NBDAE)的UV-Vis分析

图3为P(OEGMA-co-NBDAE)水溶液的UV-Vis光谱及吸光度比率变化图。由图3(A)可知:所得的聚合物与荧光单体NBDAE相似,在460nm左右有很强的吸收。由图3(B)可知,NBDAE和OEGMA共聚后,对NBDAE的吸收性质影响非常小,可以推知将荧光物质单体化并共聚在此聚合物上并不改变其UV-Vis吸收性能。

2.4P(OEGMA-co-NBDAE)的荧光性能

图4给出了不同浓度TBAF(四丁基氟化胺)存在时P(OEGMA-co-NBDAE)-1#的荧光光谱。图中插图给出了聚合物516nm处的荧光强度比率随TBAF浓度的变化曲线。聚合物的最大荧光激发波长在520nm与相关文献[11]报道的NBDAE的最大荧光激发波长基本一致,一方面说明了聚合物具有很好的荧光性能,同时可知共聚合物并未改变荧光单体的最大荧光激发波长。结合插图可知,随F离子浓度的增大,聚合物的荧光强度不断降低,当F离子浓度低于50μL/cm2时,聚合物荧光强度对F离子浓度有很高的灵敏度;当F离子浓度增至100μL/cm2时,聚合物的荧光强度为初始(未加F离子)强度的0.035倍,几乎完全淬灭。

3结论

通过原子转移自由基聚合,成功制备了结构明确的含低聚物OEGMA的荧光性聚合物P(OEGMA-co-NBDAE),该聚合具有较窄的分子量分布和良好的水溶性。同时该聚合物对F离子具有荧光淬灭现象,随F离子浓度的增大,聚合物的荧光强度不断降低,当F离子浓度低于50μL/cm2时,聚合物荧光强度对F离子浓度有很高的灵敏度;当F离子浓度增至100μL/cm2时,聚合物的荧光强度为初始(未加F离子)强度的0.035倍,几乎完全淬灭。这种对F离子的荧光淬灭现象为检测微量或痕量F离子浓度提供了依据,并可拓展到水溶性荧光传感器的制备。

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荧光探针PCR 篇6

吖啶酮衍生物对金属离子有较好的识别效果, 能够实现对Cr3+的专一识别, 所以设计、合成新型的荧光探针有着十分重要的意义。

近年来, 由于铬化合物在不锈钢加工、印染、化工等行业中的广泛使用, 使不同形态的铬释放到环境中, 造成了人类生存环境中的铬污染, 因此寻求对Cr3+简单快捷的识别方法非常重要。荧光分子探针具有原料廉价易得, 高灵敏度、抗干扰能力强、反应时间短等优点, 因而在许多科学领域得到了广泛的应用[1~4]。

本文以邻氨基苯甲醚和邻氯苯甲酸为原料, 通过两步反应合成了吖啶酮衍生物, 并对Cr3+的识别进行了研究。

二、实验部分

(一) 试剂与仪器。试剂:无水乙醇, 铜粉, N-N二甲基甲酰胺, PPA, 邻氯苯甲酸, 无水碳酸钾, 邻胺苯甲醚。仪器:柱色谱硅胶 (200~300 mesh) , 荧光分光光度计 (南京顺泰科技有限公司) , 荧光离子探针 (上海力晶科学仪器有限公司) , 傅里叶红外光谱仪 (ALPHA-T型) 。

(二) 邻- (N-邻甲氧苯基) 苯甲酸的合成。首先参照文献[5~6]将6.24g邻氯苯甲酸、7.44g邻胺苯甲醚、2.76g无水碳酸钾、250mg铜粉加入圆底烧瓶中, 加入DMF40mL, 加热回流过夜, 停止反应、冷却、抽滤, 滤液用盐酸酸化, 静置后有大量沉淀析出。抽滤, 滤饼用大量的水洗涤后干燥。重结晶后得到邻- (N-邻甲氧基苯基) 苯甲酸纯品。

(三) 4-甲氧基吖啶酮纯品的合成。将120多克的多聚磷酸倒入三口烧瓶中, 加热至100℃, 称取2.13g邻- (N-邻甲氧基苯基) 苯甲酸, 加入三口烧瓶当中, 反应2小时后, 停止反应[7]。将沸水倒入反应液中并不停地搅拌, 此时有大量黄色沉淀生成, 加入NaOH溶液调节pH为7~8后冷却抽滤, 用热水洗涤滤饼后干燥。用无水乙醇重结晶得到4-甲氧基吖啶酮纯品。

三、探针性质的研究

(一) 选择性实验。溶液的配制:称取0.095g 4-甲氧基吖啶酮于50mL的容量瓶中, 加入DMF使其溶解, 用DMF定容至50mL, 采用同样的方法以去离子水为溶剂依次配制Hg2+, Fe3+, Na+, Cu2+, Mg2+, Co2+, Ni2+, K+, Al3+, Cr3+, Ca2+离子的氯酸盐溶液。

化合物4-甲氧基吖啶酮 (1×10-5mol/L, 溶剂分别为无水乙腈、DMF、乙醇) 在与Hg2+, Fe3+, Na+, Cu2+, Mg2+, Co2+, Ni2+, K+, Al3+, Cr3+Ca2+等离子以相同浓度混合后, 以激发波长为397nm、乙腈为溶剂时, 可得到荧光发射光谱图如图1所示, 从图中可以看出, Cu2+, Co2+, Ni2+对荧光基团有一定的猝灭作用, 除了Cr3+以外, 其他金属阳离子对4-甲氧基吖啶酮的荧光强度的影响微乎其微[8], Cr3+在365nm处有明显的荧光增强现象。从图中可以发现激发波长大约在365nm左右时, Cr3+对化合物4-甲氧基吖啶酮的荧光强度的影响达到最大值, 4-甲氧基吖啶酮的识别基团与Cr3+的特异性结合。然而其他一些金属阳离子不仅不能和化合物4-甲氧基吖啶酮的识别基团发生有效地结合, 还使得化合物4-甲氧基吖啶酮的荧光基团得以破坏, 导致荧光强度下降。

(二) 荧光滴定实验。如图2所示。固定397nm激发波长的条件下, 加入0~1.0当量的Cr3+, 发射峰随着Cr3+的逐渐加入而呈现增大的趋势, 当加入的Cr3+的当量超过1.0时, 发射峰不再增大即化合物4-甲氧基吖啶酮的荧光强度不再增大[9], 4-甲氧基吖啶酮与金属Cr3+的配合反应已经接近完全, 继续增大Cr3+的当量浓度, 化合物4-甲氧基吖啶酮的荧光强度基本保持在一定的强度。所以化合物与金属应该是1:1的关系配位。从图中可以观察到, 随着Cr3+的量逐渐增加, 荧光强度也逐渐增大, 当Cr3+加入到与4-甲氧基吖啶酮等量时, 荧光强度达到最大。通过线性拟合得到化合物Cr3+与4-甲氧基吖啶酮的配合比为1:1, 在浓度0.1×10-5~1×10-5mol/L的范围内, 体系的荧光强度△F与Cr3+的浓度呈现良好的线性关系, 线性拟合系数为0.92524。回归方程Y=208.56247X+1108.15468。

四、结果与讨论

本文以邻氨基苯甲醚和邻氯苯甲酸为原料设计、合成了一种吖啶酮衍生物 (4-甲氧基吖啶酮) , 该化合物对Cr3+具有高度的选择性识别作用, 该化合物有望用于环境检测和生命体内监测Cr3+, 研究吖啶酮衍生物荧光探针对Cr3+的识别对人类生存和发展具有重要意义。

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荧光探针PCR 篇7

随着应用范围越来越广泛, 罗丹明类阳离子探针的研究发展迅速且受到了更多的重视。本文通过对罗丹明类化合物母体结构的修饰, 设计了一条较为新颖的合成路线。以罗丹明6G为原料与乙二胺反应得到相应化合物, 再与苯硫异氰酸酯在甲苯中反应得到目标化合物, 形成具有酞胺螺环状的结构, 即为本次试验的目标产物。

2实验部分

(1) 罗丹明类Fe3+探针的合成

1实验仪器。WRS-1B数字熔点仪:上海精密科学仪器有限公司;循环水式多用真空泵 (SHB-ⅢS) :郑州长城科工贸有限公司;集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S:郑州长城科工贸有限公司;电子调温电热套 (98-1-B型) :天津市泰斯特仪器有限公司;多功能磁力搅拌器 (HJ-5) :江苏金坛市佳美仪器有限公司;电子天平 (JY12001) :塞多利斯科学仪器 (北京) 有限公司;玻璃仪器气流烘干器 (C型) :郑州长城科工贸有限公司。

2其他玻璃仪器。圆底烧瓶 (500ml、100ml、50ml、250ml) , 量筒 (100ml、50ml、10ml) , 烧杯 (1000ml、100ml、250ml、150ml、50ml) , 锥形瓶 (500ml、250ml、100ml) 直冷凝管, 分液漏斗 (500ml) , 布氏漏斗, 抽滤瓶, 常压漏斗, 表面皿, 玻璃棒, 滤纸, PH广泛试纸, 搅拌磁子, 乳胶管, 胶头滴管, 药匙, 铁架, 铁架台, 毛细管, 长玻璃管。

3实验试剂。罗丹明B、苯甲酰氯、甲苯、乙二胺、三乙胺、乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、盐酸、氢氧化钠、硫氰酸钾等均为分析纯。

4中间体Rh1的合成实验步骤。

a.准确称取罗丹明6G 1g (2.09mmol) , 溶于20ml甲醇中, 搅拌状态下加入乙二胺0.67ml (10.05mmol) 。b.加热回流约3h, 待溶液呈亮黄色, 停止回流加热, 此过程中随时进行薄层色谱跟踪以确定反应完全。c.冷却至室温, 抽滤后用30ml去离子水洗, 得到大约0.6g粗产品。d.采用乙腈做溶剂, 进行重结晶, 然后趁热过滤。自然冷却, 抽滤, 晾干, 得到产品0.37g。

(2) 阳离子的识别研究1实验仪器。微型移液管、F-4500荧光分光光度计 (日本日立公司) 、PB-20 (PB-S) 型精密酸度计等。2实验试剂。Hg2+等16种阳离子试剂、HEPES、甲醇等。3HEPES缓冲溶液及阳离子溶液的配制实验步骤。a.HEPES (摩尔质量为238.3) 取其固体1.192g溶于500ml的容量瓶中, 用甲醇:水=3∶1的溶剂定容。b.用已经配好的10%的Na OH溶液和p H测试仪将HEPES溶液的p H调节到7.4, 得到浓度为0.01M的HEPES缓冲溶液。c.将16种阳离子 (Hg2+、Fe3+、Cd2+、Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Ce3+、Sr2+、Pb2+、Ag+、Mn2+、Fe2+、K+、Na+、Mg2+) 溶液均配制成浓度为20m M的溶液。

3实验结论

本文设计的合成罗丹明结构Fe3+荧光探针化合物的路线是一种在罗丹明母体上引入特定的基团以实现罗丹明荧光探针的特殊功能的方法。该方法具有更好的选择性和生物亲和性且操作简单, 合成步骤少, 时间短等优点。

由罗丹明6G等合成的具有罗丹明类母环的阳离子受体与金属离子分别作用, 由此得出该配合物的选择性, 即对Fe3+离子的选择性。说明在罗丹明母体上引入了适当的基团, 达到了对罗丹明类化合物母体结构的修饰。然后使该配合物与不同浓度的Fe3+离子溶液分别作用, 得出在Fe3+离子较高浓度下 (50eq) 有明显的荧光强度, 可裸眼检测。

在乙二胺与三价铁离子和受体混合溶液所得出的荧光光谱中, 乙二胺的加入使荧光强度发生明显的变化, 裸眼可检测。从而该试验证明受体分子识别三价铁离子的过程是可逆的。

摘要：荧光分子探针具有诸如最高可达单分子检测的高灵敏度、能够实现开关操作、对亚微粒具有可视的亚纳米空间分辨能力和亚毫秒时间分辨能力、原位检测 (荧光成像技术) 以及利用光纤进行远距离检测等众多优点。

关键词：荧光分子探针,罗丹明类染料,Fe3+

参考文献

[1]张丽珠.罗丹明染料的合成及作为离子探针的应用研究[D].博士学位论文, 2007.