4木聚糖酶

4木聚糖酶（精选7篇）

4木聚糖酶 篇1

β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶 (EC 3.2.1.73, 简称β-葡聚糖酶) 是一种高效、专一性水解β-葡聚糖的内切酶, 其水解的主要产物为三糖 (3-O-β-D-纤维二糖-D-葡萄糖) 和四糖 (3-O-β-D-纤维三糖-D-葡萄糖) 。β-葡聚糖是植物细胞壁的结构性非淀粉多糖, 是由β-1, 3和β-1, 4混合糖苷键连接成的β-D-葡聚糖, 它是大麦胚乳细胞壁的主要成分[1,2]。β-葡聚糖酶在工农业生产中有着广泛的应用, 可应用于酿造、饲料、食品等工业制造领域。例如:在啤酒酿造过程中, β-葡聚糖酶可降低麦汁粘度, 提高过滤速度[3]和产率, 改善啤酒的质量, 同时能增进啤酒口感和提高泡沫持久性;在饲料工业中也有着较广泛的应用, 饲料中添加β-葡聚糖酶以大大降低β-葡聚糖粘度, 从而改善麦类饲料的营养价值, 同时具有抑制有害微生物和维持动物肠道微生态平衡的作用, 并且能减少传统抗生素的使用量, 有利于改善动物对营养物质的吸收[4]。

国外学者从20世纪60年代开始对β-葡聚糖酶进行了广泛的研究, 已克隆和表达了不同来源的葡聚糖酶基因并得到广泛的应用。浸麻芽孢杆菌 (Bacillus macerans) 、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 、多粘芽孢杆菌 (Bacillus polymyxa) 等芽孢杆菌中均有内切β-葡聚糖酶的发现[6]。我国对β-葡聚糖酶的研究起步较晚但成果显著, 尤其在霉菌来源的β-葡聚糖酶的发酵生产方面的研究已接近世界水平。但是, 我们也注意到细菌来源的β-葡聚糖酶的研究相对不足[7]。目前, 对β-葡聚糖酶基因表达的研究主要是在大肠杆菌中进行, 而且得到的重组大肠杆菌酶活较低, 很少有在芽孢杆菌中表达的报道。到目前为止, 有关以B.amyloliquefaciens为宿主, 构建高效分泌生产β-葡聚糖酶的重组菌及其工业应用的研究尚未见报道。

本实验通过PCR方法, 以解淀粉芽孢杆菌 (CICIM B4801) 染色体为模板克隆β-葡聚糖酶基因 (bgl A) , 将该基因置于PQ启动子的下游, 构建了重组表达质粒p UB-PQ-GM-bgl A。将该重组质粒转化导入解淀粉芽孢杆菌 (CICIM B4801) 中, 筛选得到了能高效分泌表达β-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌, 并对该重组酶进行了初步的酶学性质分析。首次实现了β-葡聚糖酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌 (Escherichia coli) JM109, 解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) CICIM B4801, 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 1A717, 均由江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心 (http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn) 保藏。质粒p MD-PQ为本研究室前期研究获得, 含有人工启动子PQ, 可以引导外源基因在大肠杆菌或在芽孢杆菌中表达[8]。构建重组质粒所用的载体有:p MD18-T、p Lakr、p UB110, 均保存在E.coli JM109宿主中, 分别以氨苄青霉素、卡那霉素为抗性筛选标记。

1.1.2 试剂

实验中所用的各种DNA限制性内切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ、NcoⅠ均为Fermentas产品, 购自上海生物工程技术服务有限公司;T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶购自上海生物工程技术服务有限公司;分子量标准、卡那霉素、氨苄青霉素、四环素购自Fermentas公司;PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒均为Bio Dev-Tech公司产品;地衣多糖购自爱尔兰Megazyme公司;其他试剂药品均为国产或进口分析纯和生化试剂。

1.1.3 仪器

EDC-810型基因扩增仪 (东胜龙国际贸易有限公司) ;UV-2000型紫外可见分光光度计 (上海龙尼克仪器有限公司) ;Alpha Innotech凝胶成像系统 (美国Alpha Innotech公司) ;恒温金属浴 (杭州博日科技有限公司) 。

1.1.4 培养基

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌LB液体培养基:胰蛋白胨10g/L, 酵母浸提物5g/L, Na Cl 5g/L, 添加2.0%琼脂粉为LB固体培养基。需要时加入氨苄青霉素100μg/m L或卡那霉素15μg/m L用于重组大肠杆菌、重组枯草芽孢杆菌及重组解淀粉芽孢杆菌的筛选。解淀粉芽孢杆菌发酵培养基, 参考文献[9]配制。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽孢杆菌染色体DNA的提取

将解淀粉芽孢杆菌 (CICIM B4801) 划线于LB平板上, 37℃条件下培养24h, 刮取适量的菌体于500μL无菌水中, 振荡混匀, 采用CTAB法[10]提取染色体DNA。

1.2.2 β-1, 3-1, 4-葡聚酶基因的PCR扩增

根据Gen Bank Accession No.EU368224设计引物, 引物序列如下:

正向引物:AATTCCATGGATGTTTTATCGTATGAAACG

反向引物:AATTGGATCCTTATTTTTTTGTATAGCGCAC

PCR条件如下:96℃预变性50s, 94℃变性50s, 56℃退火2min, 72℃延伸1min 30s, 30个循环。

1.2.3 重组质粒p La-PQ-bgl A和p UB-PQ-bgl A的构建

重组表达质粒p La-PQ-bgl A的构建:将PCR扩增得到的bgl A基因与T载体p MD18-T连接, 转化大肠杆菌JM109, 筛选得到重组质粒p MD-bgl A。将重组质粒p MD-bgl A经NcoⅠ和Bam HⅠ双酶切后, 胶回收获得bgl A基因片段, 大小为0.8kb, 与经NcoⅠ和Bam HⅠ双酶切的表达载体p Lakr连接, 转化大肠杆菌JM109, 得到重组质粒p La-bgl A。将本实验室存有的质粒p MD-PQ经Eco RⅠ及NcoⅠ双酶切后, 胶回收得到含有PQ启动子及庆大霉素抗性 (Gmr) 的基因片段PQ-GM, 与同样经Eco RⅠ及NcoⅠ双酶切的重组质粒p La-bgl A连接后, 转化大肠杆菌JM109, 用庆大霉素抗性筛选含有PQ启动子的重组表达质粒p La-PQ-bgl A的重组菌。

重组表达质粒p UB-PQ-bgl A的构建:将已经构建好的重组表达质粒p La-PQ-bgl A, 经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后, 胶回收含有PQ启动子及庆大霉素抗性选择标记Gm的β-葡聚糖酶的基因片段PQ-bgl A, 大小约为1.9kb, 与经同样双酶切的载体p UB110连接, 将已构建好的含有β-葡聚糖酶基因的重组质粒p UB-PQ-bgl A用电转化方法[11]转入解淀粉芽孢杆菌中进行表达。用卡那霉素浓度为15μg/m L抗性LB平板筛选到含有重组质粒p UB-PQ-bgl A的重组菌。

1.2.4 β-葡聚糖酶酶活测定

接种含有β-葡聚糖酶基因的重组解淀粉芽孢杆菌单菌落于50m L LB培养基中, 37℃、200r/min培养12h后, 以10%的接种量转接至50m L发酵培养基中, 37℃、200r/min连续培养140h。将发酵液离心去掉菌体, 取上清液并且透析。透析后的发酵液稀释一定的倍数后, 以1%的地衣多糖为底物, 采用DNS法测定酶活[9,12]。β-葡聚糖酶酶活定义:1m L发酵液, 在55℃、p H 6.4的条件下, 每分钟分解地衣多糖生成1μmol葡萄糖为1个酶活单位 (U/m L) 。

1.2.5 β-葡聚糖酶酶学性质的研究

1.2.5. 1 β-葡聚糖酶的最适反应温度及其温度稳定性

酶的最适反应温度:调节恒温水浴, 分别在不同温度 (40℃、45℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃) 、p H 6.4的条件下测定透析后酶液的酶活, 以最高酶活为100%, 其他温度条件下的酶活占最高酶活的百分数即为酶在该温度条件下的相对酶活。

温度对酶稳定性的影响:取0.5m L透析后的酶液分别在40℃、45℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃下保温30min后, 立即取出放置冰上迅速冷却30min, 在55℃、p H 6.4的条件下测残余酶活力, 以未经过温度处理的酶液的酶活为100%。

1.2.5. 2 β-葡聚糖酶的最适反应p H值及其p H稳定性

酶的最适反应p H值:透析后的酶液用不同p H值 (4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5) 的缓冲液一定的倍数后, 在55℃的条件下测定酶活, 以酶活力最高者的酶活为100%, 其他p H值条件下的酶活站最高酶活的百分数为酶在该p H值条件下的相对酶活。

酶的pH稳定性:取0.5mL透析后的酶液, 分别加入0.5mL的pH3.0~6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pH 6.0~8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液, 4℃下放置60min, 然后用p H 6.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释, 55℃条件下测残余酶活力, 以未经过缓冲液处理的酶液的酶活为100%。

1.2.5. 3 表达产物SDS-PAGE蛋白电泳

含有重组质粒p UB-PQ-bgl A的重组解淀粉芽孢杆菌经过摇瓶发酵后, 取发酵上清液进行SDS-PAGE电泳, 以不含重组质粒的原始解淀粉芽孢杆菌菌株 (CICIM B4801) 的发酵上清液为对照, 进行SDS-PAGE电泳, 具体方法参照文献[13]进行。

2 结果与分析

2.1 重组质粒p UB-p Q-bgl A的构建

根据Gen Bank Accession No.EU368224中已知解淀粉芽孢杆菌的β-葡聚糖酶基因设计引物, 以解淀粉芽孢杆菌CICIM B4801的染色体DNA为模板, 经过PCR扩增得到约为0.8kb的DNA片段, 与预期大小基本一致, 测序结果经比对后与已报道的序列完全一致。将经过PCR扩增得到的β-葡聚糖酶基因 (bgl A) 和来源于p MD-PQ的PQ启动子体外重组并克隆入载体p Lakr及p UB110中, 构建获得了重组表达质粒p UB-PQ-bgl A, 重组质粒构建过程如图1所示。重组质粒p La-PQ-bgl A经酶切鉴定的结果为:p Lakr大小约为3.0kb, PQ-GM大小约为1.1kb, bgl A基因片段大小约为0.8kb, 与预期大小相符, 表明得到了正确的重组质粒。重组质粒p UB-PQ-bgl A经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后的鉴定结果为:p UB110大小约为3.8kb, PQ-bgl A大小约为1.9kb, 与预期大小相符, 表明得到了正确的重组质粒。

2.2 重组菌的构建与鉴定

2.2.1 重组质粒p UB-PQ-bgl S在解淀粉芽孢杆菌中表达

重组质粒p UB-PQ-bgl A用电转化方法转入解淀粉芽孢杆菌中进行表达。将后培养的菌体涂布浓度为15μg/m L卡那霉素抗性LB平板, 筛选得到两个转化子。提取转化子的质粒, 经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后的葡聚糖凝胶电泳鉴定结果有两条条带, 分别为3.8kb和1.9kb, 分别与载体p UB110及基因片段PQ-bgl A的大小相符, 表明得到了正确的重组菌。

2.2.2 表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳

SDS-PAGE蛋白电泳分析表明, 含有重组表达质粒p UB-PQ-bgl A的重组解淀粉芽孢杆菌产生的胞外蛋白有两条明显的条带, 如图7所示, 其中大小约为27k Da的条带与预测的β-葡聚糖酶的相对分子量基本一致, 蛋白表达量明显高于原始菌株。

2.3 重组菌发酵试验

接种重组解淀粉芽孢杆菌单菌落于50 m L LB培养基中, 37℃、200r/min培养12h后, 以10%的接种量转接至50 m L发酵培养基中, 37℃、200r/min连续培养140h。将发酵液离心去掉菌体, 取上清液并且透析。透析后的发酵液稀释一定的倍数后, 以1%的地衣多糖为底物, 采用DNS法测定酶活。重组菌在发酵82h时达到了最高酶活, 为1 515.7U/m L, 是原始菌株酶活的11.84倍。生长曲线及酶活曲线分别如图3、图4所示。由图4可知, 在相同条件下, 重组解淀粉芽孢杆菌的产酶量较原始菌株有很大的提高。

M:protein marker;1, B.amyloliquefaciens (p UB-PQ-GM-bgl A) ;2, B.amyloliquefaciens (CICIM B4801) .

2.4 β-葡聚糖酶酶学性质的研究

2.4.1 β-葡聚糖酶最适反应温度及其温度稳定性

按照1.2.4的方法测定β-葡聚糖酶在40℃~80℃温度条件下的相对酶活, 得到温度-相对酶活曲线, 如图3所示。β-葡聚糖酶的最适反应温度为55℃, 随着温度的升高酶活力迅速下降。

β-葡聚糖酶的温度稳定性结果如图5所示。β-葡聚糖酶经过40℃~55℃恒温处理30min后, 酶活力保持稳定, 经过60℃以上恒温处理30min后大量失活, 经过80℃恒温处理30min后已经完全失活。

2.4.2 β-葡聚糖酶最适反应p H值及其p H稳定性

在p H值4.0~7.5的缓冲液中, 按照1.2.4的方法测定β-葡聚糖酶的酶活, 得到p H-相对酶活曲线, 如图4所示。β-葡聚糖酶在p H值5.5~6.5之间酶活力较高, 其最适反应p H值为6.5。

β-葡聚糖酶的p H稳定性结果如图6所示。β-葡聚糖酶在p H6.0~6.5条件下处理60min后, 酶活力保持稳定, 在过酸或过碱的条件下基本上完全失活。

3 讨论

β-葡聚糖酶是专一性水解β-葡聚糖的水解酶, 在啤酒生产和饲料工业中有很高的应用价值。在国内, 主要是将来自芽孢杆菌的β-葡聚糖酶基因转入大肠杆菌中进行表达[14,15]。2005年, 吕文平等[16]将地衣芽孢杆菌中的β-葡聚糖酶基因导入大肠杆菌中表达, 最高总酶活为67.34U/m L;2006年, Da Teng等[17]采用p ET28a (+) 载体表达地衣芽孢杆菌的β-葡聚糖酶基因, 产生了较高的酶活, 对大麦β-葡聚糖底物的总酶活为1 286U/m L;2009年, 李永仙等[18]采用p ET28a (+) 质粒克隆表达了淀粉液化芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens) 的β-葡聚糖酶基因, 得到的大肠杆菌重组菌对大麦-β-葡聚糖底物的总酶活达到了1 883.3±45.8 U/m L, 其胞外酶活最高可达到总酶活的87.7%。2010年, 文凤云等[19]克隆了多粘芽孢杆菌CP7的β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶基因并在大肠杆菌中进行了高效表达。大肠杆菌需要经过诱导才能有效实现外源基因的表达, 且胞外分泌能力低, 不适合工业生产的需要。国内尚未有在解淀粉芽孢杆菌中表达β-葡聚糖酶的报道。在国外, 有关β-葡聚糖酶基因在芽孢杆菌中表达的报道很少, 而且存在产酶量低的问题。2003年, Ji-Yeon Kim[20]将来自于环状芽孢杆菌的β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶基因 (bgl BC1) 在枯草芽孢杆菌中进行了高效表达, 其最高酶活只达到了8.5 U/m L。发酵条件的优化使得解淀粉芽孢杆菌的大规模应用具备了客观条件[21], 且具有较强的胞外蛋白分泌能力, 是蛋白酶、淀粉酶、β-糖苷酶等一些主要酶制剂的理想生产菌株[22]。选择解淀粉芽孢杆菌作为宿主菌有利于实现β-葡聚糖酶基因的高效表达。

本研究通过基因扩增获得解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶编码基因并构建表达载体, 再转化入解淀粉芽孢杆菌, 获得重组菌, 首次实现了β-葡聚糖酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达。由于重组质粒PQ-bgl A的导入, 使解淀粉芽孢杆菌中β-葡聚糖酶的表达量较原始菌株有了很大的提高。摇瓶发酵试验表明, 该重组菌在发酵培养基中的β-葡聚糖酶的胞外最高酶活达到1 515.7U/m L, 是解淀粉芽孢杆菌CICIM B4801酶活的11.84倍。据此为目前所报道的最高水平的β-葡聚糖酶发酵水平。

4木聚糖酶 篇2

本研究以三嵌段共聚合物P123为模板剂,合成了纯硅SBA-15 介孔分子筛[2]。 然后以3-氨丙基三乙氧基硅烷为有机硅源,通过表面硅烷化反应将氨丙基锚接于介孔分子筛表面。利用反相悬浮交联法,以液体石蜡为分散介质,成功制备了Fe3O4壳聚糖磁性微球(MCS),利用壳聚糖(CS)分子链上丰富的易于进行化学修饰的羟基和氨基多种功能团,成功的将Fe3O4壳聚糖磁性微球接枝到硅烷化SBA-15上,从而制备了Fe3O4壳聚糖磁性微球接枝SBA-15介孔分子筛催化剂,该催化剂可作为磁导向给药系统[3,4],在临床治疗等领域有着广泛的应用前景。

1 实验部分

1.1 药品及仪器

FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O,NH3.H2O,壳聚糖(CS),36%的乙酸,液体石蜡,Span-80,P123,甲醛溶液,戊二醛溶液,石油醚、无水乙醇,正硅酸乙酯,硅烷化试剂 KH-550。聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜,Nicolet公司的Nexus 670型智能傅里叶红外光谱仪。

1.2 实验思路及机理

首先用氨丙基三乙氧基硅烷对SBA-15分子筛的表面进行修饰,氨丙基三乙氧基硅烷中的三乙氧基通过与SBA-15表面的Si-OH缩合将活性基团氨丙基引入进分子筛表面。利用修饰后SBA-15分子筛以及Fe3O4壳聚糖磁性微球表面上的丰富的氨基通过与戊二醛进行交联反应,从而达到将Fe3O4壳聚糖磁性微球接枝到SBA-15上的目的。

1.3 方法及步骤

1.3.1 Fe3O4纳米颗粒的制备

Fe3O4纳米颗粒采用化学共沉淀法制备。将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O,(摩尔比为2∶1)溶于水后加入三颈瓶中,使总铁离子浓度为0.3mol/L。氮气保护下加入NH3.H2O形成沉淀。同时剧烈搅拌,维持pH为10,于80℃下反应30min,分离固相经水洗至中性后再用乙醇洗涤,于70℃下真空干燥24h,研磨即得Fe3O4纳米颗粒。

1.3.2 Fe3O4磁性微球的制备方法[5,6]

将上述制备出的Fe3O4磁性微粒0.5g加至500mL三口烧瓶中,加入1.5%的CS溶液(用3%乙酸溶液配制)50mL,液体石蜡75mL,乙酸乙酯10mL,Span80 0.5mL,在40℃下维持pH 9.0不变,并充分搅拌反应10min后,再加入甲醛10mL,调pH至5.0。40℃下进一步反应0.5h,然后加入3mL戊二醛,再调pH至9.0,升温到60℃维持反应2h,过滤,用双蒸水充分洗涤后再用乙醇抽提洗涤2h,60℃下真空干燥,轻研成流动性粉末,得最终产物。

1.3.3 分子筛的制备

以P123作为模板剂,在45℃下,将8.0g P123溶于240mL盐酸中,待完全溶解后加入17.0g正硅酸乙酯(TEOS),将所得溶胶继续搅拌24h,随后转入有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,在100℃下晶化48h,过滤干燥得到SBA-15原粉。将SBA-15原粉在540℃下焙烧6h以完全去除模板剂,得到的样品记为SBA-15。

1.3.4 分子筛的硅烷化[7,8]

将1.0 g SBA-15样品在100℃下真空干燥4h,然后分散于100mL无水乙醇中,加入2.65mL(过量)3-丙胺基三乙氧基硅烷(APTES,由AlfaAesar公司提供),在78℃的条件下回流搅拌24h。将样品过滤,用无水乙醇反复洗涤,在烘箱中100℃干燥过夜,得到硅烷化SBA-15介孔分子筛的样品记为AP-SBA-15。

1.3.5 硅烷化SBA-15介孔分子筛接枝乙二醛活化壳聚糖

称取0.405 g Fe3O4磁性微球 (2.5mmol) ,加入10mL 1mol/ L HAc 溶液,1.0 g 硅烷化SBA-15介孔分子筛的样品,2mol/ L NaAc 溶液,0.29g 戊二醛,用水稀释至100mL ,室温反应1h ,升温至40℃,反应10h 后,过滤清洗,干燥,称重。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4壳聚糖磁性微球的红外光谱分析

图1是采用Nicolet公司的Nexus 670型智能傅里叶红外光谱仪检测Fe3O4壳聚糖磁性微球的红外光谱图,谱图在549cm-1处的吸收峰表明磁性微球中存在Fe3O4中的Fe-O 键,而1651、1590、1318和1375cm-1处吸收峰分别为壳聚糖的酰胺Ⅰ带、Ⅱ带、Ⅲ带和-CH3对称伸缩振动特征峰。2922cm-1处的费米共振峰可以肯定Fe3O4壳聚糖磁性微球还有未反应的醛基。

2.2 硅烷化介孔分子筛的红外光谱分析

图2为SBA-15 的FT-IR谱图.从图中可以看出在3429cm-1处存在典型的Si-OH伸缩振动峰,1080cm-1处出现Si-O-Si不对称伸缩振动峰,同时在466cm-1处出现Si-O-Si对称伸缩振动峰。这是典型的SBA-15骨架的特征峰[9]。图3为氨丙基三乙氧基硅烷化后的SBA-15 的FT-IR谱图,从图中可以看出,该谱图除了保持典型的SBA-15骨架的特征峰以外,在2934处有微弱的亚甲基C-H不对称伸缩振动峰,在2856cm-1处有微弱的亚甲基C-H对称伸缩振动峰,这应该是来自于氨丙基三乙氧基硅烷的亚甲基,在1606cm-1处有微弱的N-H面内弯曲振动峰,在830cm-1处有微弱的N-H面外弯曲振动峰,这表明氨丙基被成功地引入了SBA-15 表面。同时在3429cm-1处的Si-OH 的振动吸收峰,在功能化后明显减弱,也说明由于功能化后大量的硅羟基被氨丙基功能基团取代。

2.3Fe3O4壳聚糖磁性微球接枝硅烷化SBA-15介孔分子筛的红外及XRD谱图分析

图4、图5、图6分别是Fe3O4壳聚糖磁性微球接枝氨丙基三乙氧基硅烷化SBA-15的FT-IR谱图,广角和小角度XRD谱图。从图6可以看出,样品在2θ约1.0°处的强衍射峰归属于SBA - 15介孔分子筛(100)晶面的特征衍射峰,且对应于SBA-15介孔分子筛的(110)和(200)晶面的次级特征衍射峰峰强度略有减弱,说明磁性微球接枝氨丙基三乙氧基硅烷化SBA-15后,试样的结晶度和介孔分子筛的有序六方介孔结构的有序性有所下降。这是由于功能化后,孔道中填入了有机物,同时有部分介孔结构的坍塌,导致峰强度降低。同时从图4可以看出该样品在3420cm-1、1080cm-1 、451cm-1处也出现了SBA-15介孔分子筛的红外特征峰,并且在1670cm-1处出现了C=N 的特征吸收峰,这表明戊二醛的醛基与壳聚糖氨基发生了交联反应。而根据图5中样品在 2θ=30°、15°、43°、53°、57°和63°处Fe3O4的6 个特征峰(分别对应于(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面)。进一步说明Fe3O4壳聚糖磁性微球接枝在硅烷化SBA-15介孔分子筛上。

3 结论

以具有较高比表面积和有序六方介孔结构的SBA-15介孔分子筛作载体,通过对SBA-15的表面进行改性,利用壳聚糖分子链上丰富的易于进行化学修饰的羟基和氨基多种功能团,成功的将Fe3O4壳聚糖磁性微球接枝到硅烷化SBA-15上。

参考文献

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4木聚糖酶 篇3

1 材料和方法

1.1 菌种

带有目的基因Xyn B重组质粒的菌种为吉林农业科技学院实验室保藏。

1.2 试剂

蛋白质分子量标准 (14.3-97.2k Da) 购自Takara公司;胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxoid公司;其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 目的蛋白的表达

本实验选取重组质粒p ET 28a-xyn B, 在E.coli BL 21进行表达。取保存的工程菌50μl, 接种于5 ml LB培养基中, 37ºC振荡培养过夜;次日取1%菌液接种到含kam的LB培养基中, 继续振荡培养至OD600为0.8加入IPTG, 25ºC振荡培养12~16 h, 离心收集菌体。

1.3.2 粗酶液的制备

将收集的菌体用10倍缓冲液 (w/v) 重悬, 超声破碎15 min (3 s×3 s) ;12000 rpm离心20 min分别收集上清和沉淀。15%的SDS-PAGE电泳检测, 确定目的蛋白表达情况。

1.3.3 重组酶Xyn B的纯化

载有目的基因的大肠杆菌在粗酶液制备时采用缓冲液重悬。使用镍亲和层析酶液进行分离和纯化。具体方法为:镍柱中加入10倍柱体积的水, 流干后加入10倍体积缓冲液平衡。加入粗酶液, 重复挂柱3次, 挂柱后加入10倍体积缓冲液冲洗杂蛋白, 进行梯度洗脱, 收集目的蛋白流出液, 于4ºC透析过夜除去样品中的咪唑, 得到纯化的样品。

1.3.4 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度

首先制作标准曲线:取1 ml Bradford试剂, 分别加入不同量的蛋白标准液, 去离子水充分混匀, 室温反应5 min测吸光度, 以A595为纵坐标, 标准蛋白含量 (mg/ml) 为横坐标。标准曲线绘制完成后, 测定样品蛋白浓度。

1.3.5 重组酶Xyn B性质测定

经纯化的重组木聚糖酶Xyn B采用DNS法测定其酶学性质。绘制标准曲线后根据酶浓度适当调整反应体系所加酶量进行反应, 反应结束后立即放入冰水浴中;加入DNS试剂到反应液中, 沸水浴5min后, 冷水冷却后进行吸光度测定, 根据标准曲线计算反应体系中产生产物的浓度。

1.3.6 重组酶Xyn B的序列分析及结构预测

将Xyn B的氨基酸序列递交至http://swissmodel.expasy.org/tools/进行Xyn B氨基酸序列分析及结构预测。

2 结果与讨论

将培养后收集的菌体经过超声破碎离心所得上清即为粗酶液。此时, 所得样品经过镍柱进行纯化, 即可得到纯酶样品, 纯化蛋白浓度为4mg/ml, 大小与预测的理论分子量相同。样品经过SDS-PAGE电泳鉴定, 结果如图1, 已达到电泳纯。通过DNS法对该酶进行酶学性质表征, 当反应条件为50ºC, p H 6.5时该酶具有最大活力。经生物学软件预测该酶等电点为4.82, 其氨基酸序列与Genbank中其他微生物来源的木聚糖酶一级结构进行比较, 同源性最高达到了67.8%, 蛋白三维结构模型如图2所示, 组成典型β桶状结构。

摘要：木聚糖酶作为一类重要的木糖苷键水解酶对水解半纤维素有着重要的作用。本研究利用大肠杆菌BL21将木聚糖酶XynB的进行高效表达, 重组酶蛋白经诱导表达和破胞后纯化, 达到电泳纯化, 其大小与预测理论值相符。

4木聚糖酶 篇4

有关两种酶的产酶菌株的文献很多, 对木聚糖酶产生菌的报导主要集中在真菌中的黑曲霉属 (Aspergillus) 和里氏木霉 (Trichoderma reesei) ;细菌中的芽孢杆菌属 (Bacillus) 和转入大肠杆菌 (E.coli) 工程菌中的海栖热孢菌 (Thermotoga maritima) , 而对康宁木霉 (Trichoderma koningii) 产木聚糖酶的报导很少。本研究试图采用改变碳源种类、碳源浓度、碳氮比大小及分批添加碳源和氮源的方法来提高康宁木霉 (Trichoderma koningii) 选择性地合成木聚糖酶的可行性。

(一) 材料与方法

1. 菌种:

产酶菌为康宁木霉, 购于中国工业微生物菌种保藏中心, CICC编号:40505。

2. 化学试剂:

酵母抽提物:购于oxoid公司;桦木木聚糖, 羧甲基纤维素钠:购于sigma公司;其余试剂均为国产分析纯

3. 甘蔗渣粗木聚糖:

100g的甘蔗渣, 加浓度10%的氢氧化钠1.5L, 放入灭菌锅120℃蒸煮60min。冷却后过滤, 滤液用6 mol/L HC1调节至pH4.5。静置12h后离心 (4000r/min, 20min) 得沉淀A。向上清液加3倍体积的工业酒精, 静置12h后离心 (4000r/min, 20min) 得沉淀, 水洗沉淀, 离心 (4000r/min, 20min) 得沉淀B。将A、B沉淀混合并于40℃烘干后备用。

4. 培养基和培养方法:

(1) PDA斜面:4℃条件下用于保存菌种; (2) 摇瓶种子培养基:葡萄糖20g, 酵母抽提物10g, 水1000 mL, pH自然; (3) 摇瓶产酶培养基:碳源若干, (NH4) 2SO4 (氮源) , KH2PO4 1g, MgSO4-7H2O 0.5g, 水1000 mL, 初始pH4.0; (4) 培养方法:将PDA斜面菌种接种一环入50 mL摇瓶种子培养基, 28～30℃, 150r/min摇床培养24h后移取10mL转接入100 mL摇瓶产酶培养基, 28～30℃, 150r/min摇床培养72h。

5. 分析方法

将摇瓶产酶培养基发酵液离心 (6000r/min, 20min) , 取上清液 (上清液即为粗酶液) DNS法测木聚糖酶活:0.2 mL经适当稀释的酶液和1.8 mL用pH4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的1% (w/v) 桦木木聚糖悬浮液混合, 于50℃下保温30 min, 加入3mL DNS试剂, 沸水浴中加热5 min, 用冰水迅速冷却, 定容到25 mL, 于540 nm波长测定OD值。同时以100℃灭活的粗酶液作对照。

木聚糖酶酶活单位定义为上述条件下每分钟每毫升酶液水解木聚糖产生的木糖的物质的量 (μmol) 为一个酶活力单位 (U) 。

纤维素酶的测定参照国标法。纤维素酶酶活单位定义为37℃、pH5.5条件下每分钟从浓度为4mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位 (U) 。

(二) 结果与分析

1. 碳源类型对木聚糖酶选择性合成的影响

真菌木聚糖酶是诱导酶, 在微生物生长过程中作碳源的物质同时又是诱导物或诱导物的主要来源。一般认为纯木聚糖是诱导木聚糖酶合成最好的诱导物, 但研究发现乳糖诱导木聚糖酶合成的能力比纯木聚糖更强, 结果见表1。

产酶条件:碳源浓度10 g/L, 氮源浓度10 g/L。

从表1中可看出, 纯木聚糖可专一地诱导木聚糖酶的合成, 而含纤维素的碳源诱导合成的木聚糖酶中含有纤维素酶, 且纤维素含量愈高产生的纤维素酶愈多。由于甘蔗渣粗木聚糖含纤维素很少, 故以之作碳源产生的木聚糖酶中纤维素酶活相对较低, 两种酶活的比值为13.4;而羧甲基纤维CMC中纤维素含量高, 用作碳源时两种酶活的比值仅为1.1, 可见碳源类型影响木聚糖酶的选择性合成。虽然乳糖作碳源产生的木聚糖酶酶活最高, 但是以甘蔗渣粗木聚糖作碳源可以更好的研究菌株产木聚糖酶和纤维素酶的关系, 所以往下的实验中均以甘蔗渣粗木聚糖作碳源进行分析。

2. 碳源浓度对木聚糖酶选择性合成的影响

表2是以甘蔗渣粗木聚糖为碳源、不同碳源浓度下产酶的部分结果。从表2可以看出, 随着碳源浓度的增大, 木聚糖酶活和纤维素酶活均有提高, 但纤维素酶活提高的幅度更大, 因而两种酶活的比值下降。当碳源浓度由5 g/L提高到20g/L时, 两种酶活的比值由17.0下降到6.9, 因此, 维持低碳源浓度发酵有利于提高木聚糖酶选择性合成的程度。

产酶条件:碳源:甘蔗渣粗木聚糖;碳源浓度:氮源浓度=2∶1。

微生物首先产生木聚糖酶分解易利用的木聚糖, 由于培养基中甘蔗渣粗木聚糖浓度低, 微生物生长缓慢, 生物量少, 生成的木聚糖酶和纤维素酶都少。随着碳源浓度的提高, 微生物迅速生长, 生成的木聚糖酶和纤维素酶也就多。碳源浓度高, 微生物生长快, 木聚糖消耗也快, 估计菌株产木聚糖酶的量与培养基中游离存在的诱导物多少有关, 因而碳源浓度的提高对木聚糖酶活提高的幅度影响不大。而随着粗木聚糖带入的纤维素物质的增多, 诱导产生的纤维素酶增加, 导致两种酶活的比值下降。

3. 碳氮比对木聚糖酶选择性合成的影响

由于甘蔗渣粗木聚糖所含碳源的种类和数量不十分明确, 因而不能准确的确定碳氮比, 但是可以把甘蔗渣粗木聚糖和 (NH4) 2SO4的质量比近似的看作碳氮比, 由此来观察碳氮比变化对产酶结果的影响, 见表3。

产酶条件:碳源:甘蔗渣粗木聚糖浓度=10 g/L。

由表3数据可看出, 当碳氮源质量比由1:1增大到10∶1时, 两种酶活的比值从9.7提高到43.4, 即木聚糖酶选择性合成的程度提高。同时可以看出, 木聚糖酶的合成存在一个较适的碳氮比条件, 当碳氮源质量比为5∶1时木聚糖酶活高达216.7 U/mL, 此时纤维素酶活为10.1U/mL, 两种酶活的比值为21.5, 进一步提高或降低碳氮源质量比, 木聚糖酶活反而下降。而纤维素酶活随着碳氮比的升高呈下降趋势。在碳源浓度一定的条件下, 提高碳氮比, 也就是降低氮源浓度。碳氮比低, 氮源充足, 微生物生长快, 代谢功能强, 木聚糖消耗快, 故产生的木聚糖酶不多;至产酶后期, 由于主要靠利用剩余的难分解的纤维素维持生长, 所以会产生一定量的纤维素酶。而随着碳氮比升高, 氮源浓度低、消耗快, 成为生长限制因子, 微生物生长缓慢, 代谢功能相对较弱, 导致木聚糖酶的合成也有所减少;同时由于极少利用难分解的纤维素物质, 故产生的纤维素酶也少。

4. 低纤维素酶活的木聚糖酶选择性合成的调控

纯木聚糖可诱导康宁木霉专一地合成木聚糖酶, 但纯木聚糖制备成本高, 无工业应用价值;乳糖可诱导高产木聚糖酶, 但纤维素酶产量也高, 发酵后还需进行复杂的提纯工序, 因而诱导物 (也是碳源) 应采用可简单、经济地从植物纤维中分离出的粗木聚糖。但如前所示, 以粗木聚糖做碳源时, 即使在低碳源浓度条件下产生的木聚糖酶中仍含有一定量的纤维素酶, 为了提高两种酶活的比值, 实现低纤维素酶活的木聚糖酶的生产目的, 一方面要进一步促进木聚糖酶的合成, 提高其活力;另一方面要尽可能抑制纤维素酶的合成。前面的研究表明, 以甘蔗渣粗木聚糖为碳源, 在低碳源浓度、高碳氮比条件下木聚糖酶选择性合成的程度提高。图1是以甘蔗渣粗木聚糖为碳源, 总碳源浓度为10g/L时分批添加碳源和氮源的产酶历程, 在整个产酶过程控制培养基中的碳源浓度在5 g/L以下, 碳氮源质量比在10∶1以上。

如图1所示, 产酶初期基本检测不到纤维素酶活, 但是有明显的木聚糖酶产生, 说明微生物在生长初期仅以易分解的木聚糖作碳源。第2天后开始有少量纤维素酶产生, 而木聚糖酶活逐步提高;至第4天纤维素酶活微量下降, 而木聚糖酶活仍继续升高。整个过程中纤维素酶活维持在8 U/mL以下, 而木聚糖酶活最高达310.6 U/mL, 此时纤维素酶活为7U/mL, 两种酶活的比值为44.4。由此可以看 (下转第71页) (上接第104页) 出, 在发酵过程中通过对碳氮源进行限制性控制, 不但可以限制纤维素酶的合成, 而且可以延长木聚糖酶的产酶时间, 提高酶活, 从而提升木聚糖酶选择性合成的程度, 这与刘超纲[7]等的研究结果接近。

(三) 结论

康宁木霉是工业上生产纤维素酶常用的一种真菌, 但其同时具有很强的合成木聚糖酶的能力。它在以纤维素物质为底物时可同时产生纤维素酶和木聚糖酶, 尽管两种酶的合成调控机制尚不很清楚, 但许多实验事实证明两种酶的合成受不同的基因调控, 在适当条件下可选择性地诱导木聚糖酶的合成, 而纤维素酶的合成受到抑制。选择性合成程度与碳源的类型、浓度、碳氮比大小有关。低纤维素污染的碳源是选择性合成低纤维素酶活的木聚糖酶的前提;在发酵过程中维持较低的碳源浓度和较高的碳氮比, 可以提高木聚糖酶选择性合成的程度。以甘蔗渣粗木聚糖为碳源, 采用分批添加碳源和氮源的方式, 控制发酵过程中碳源浓度在5 g/L以下, 碳氮源质量比在10∶1以上, 培养5天后产生的木聚糖酶活和纤维素酶活分别为310.6 U/mL和7 U/mL, 两种酶活的比值为44.4。

参考文献

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[3]王雪鹏.半纤维素制备方法的改进及其应用[J].无锡轻工大学学报, 2003, 22 (6) :85-88.

[4]费笛波.饲用木聚糖酶活性测定方法的研究[J].浙江农业学报, 2004, 16 (2) :53-58.

4木聚糖酶 篇5

菠萝泛菌 (Pantoea ananatis) 在分类学上属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae) 的泛菌属 (Pantoea) 。一些菠萝泛菌菌株是植物病原菌, 因此, 国内外对于菠萝泛菌的研究报道大多聚焦于其病害防治的研究和分子生物学基础研究[3,4,5]。对于利用16S r DNA进行该菌系统分类研究也有报道[6]。有研究人员在P.ananatis ATCC 43072中克隆到编码4-木糖醇脱氢酶基因xdh的795bp开放阅读框[7]。文献显示, 目前没有对菠萝泛菌木聚糖酶的研究报道。本文对菠萝泛菌的木聚糖酶进行了克隆和原核表达研究, 为开发新型木聚糖酶及其在工业生产中的应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

产木聚糖酶的菠萝泛菌P.ananatis Y1、大肠杆菌E.coli DH5α和BL21以及质粒p ET258由作者实验室保存。

1.1.2 试剂

蛋白胨、酵母粉、Na Cl、琼脂粉等分析纯生化试剂和PCR反应试剂、限制性内切酶、 (NdeⅠ和XhoⅠ) 、DNA marker、蛋白预染marker等试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司。p GM-T克隆试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司。T4-DNA连接酶、胶回收试剂盒购自NEB公司。镍离子螯合树脂购自Novagen公司。

1.1.3 培养基

1L液体LB培养基包含:蛋白胨10g, 酵母粉5g, Na Cl 10g。1L固体培养基还需加琼脂粉12g。高压灭菌备用。

1.2 方法

1.2.1 菌株Y1总DNA提取

提取菌株Y1总DNA[8], 作为PCR反应模板, 取2μL电泳检测DNA质量及浓度。

1.2.2 木聚糖酶基因xyn B的克隆

根据细菌木聚糖酶基因的同源性, 用Primer premier 5.0软件设计PCR引物[9,10,11]:F1:GAGCATATGAATACTGAAA TCATT AAT和R1:ATCTCGAGGGTTTTTGCCCTGAGCCA。引物F 1中含有NdeⅠ酶切位点, 引物R1中含有XhoⅠ酶切位点。PCR反应的扩增条件是:94℃5min;94℃30s, 54℃30s, 72℃90s, 5个循环;94℃30s, 60℃30s, 72℃90s, 25个循;72℃10 min。利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 使用胶回收试剂盒回收目的基因条带。

1.2.3 重组质粒和基因工程菌的构建

将目的基因与p GM-T载体连接, 转化DH5α感受态细胞, 挑选白色转化子, 提取质粒, 通过NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定质粒。将检测过的质粒p GM-Txyn B送生物公司测序。用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切质粒, 经过琼脂糖凝胶电泳分离获得切割下的xyn B基因。同时, 用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切质粒p ET258, 将其与切割下的xyn B基因相连接, 构建成重组表达质粒p ETxyn B。采用Ca Cl2化学转化法, 将质粒p ETxyn B转化E.coli BL21 (DE3) 感受态细胞, 构建表达重组木聚糖酶的菌株p ETxyn B/BL21 (DE3) 。

1.2.4 重组木聚糖酶基因的诱导表达

将重组菌株在含30μg/m L卡纳青霉素的液体LB培养基中37℃摇起。再转接到20m L LB液体培养基中培养至OD600为0.5时, 加入0.1mmol/L的IPTG开始诱导重组木聚糖酶基因的表达。诱导3h后取样, 做SDS-PAGE蛋白电泳分析。

1.2.5 重组木聚糖酶蛋白的纯化与分析

使用保持蛋白活性的方法回收重组木聚糖酶, 具体步骤是:以13 000r/min离心1min沉淀诱导后的5m L菌液, 弃上清, 向沉淀中加入1m L裂解液 (含10 mmol/L imidazole和1mg/m L溶菌酶) , 放置冰水浴中30 min, 缓慢融化完全;将裂解液在4℃、13 000r/min离心20min, 取上清, 加入有镍离子螯合树脂的离心管中, 使带有His标签的重组蛋白结合到柱子上;以6 000r/min离心1min, 弃上清回收镍离子螯合树脂;向结合蛋白的螯合树脂中加入4m L清洗液, 清洗柱子;加入洗脱液将结合的重组木聚糖酶从螯合树脂上洗脱下来, 放入浓缩管中浓缩。

采用SDS-PAGE方法检测浓缩木聚糖酶的纯度, 剩下的木聚糖酶加入等体积灭菌高纯甘油, 放-80℃保存备用。参考相关文献[12], 用等电聚焦实验分析含His-tag的重组木聚糖酶Xyn B的等电点p I。

参考相关文献[13, 14], 用燕麦木聚糖作为底物测定重组木聚糖酶的活性, 具体测定方法是:向4支试管分别加入0.5m L木聚糖底物, 与待测酶液一起恒温水浴预热5min;在1~3号试管中加入0.5m L待测酶液, 在恒温水浴中反应20min后, 向4支试管中分别加入1.5m L DNS溶液, 并向4号试管中加入0.5m L酶液, 振荡混匀;将4个试管放置沸水浴5min后, 快速冷却到室温, 用蒸馏水定容至5.0m L;以4号试管为对照, 在波长540nm处测定1~3号试管溶液的吸光度值, 计算酶活大小。1个酶活性单位 (U) 定义为, 在一定条件下, 每min分解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量。

酶活力计算公式:

2 结果与分析

2.1 菠萝泛菌基因组DNA提取与木聚糖酶基因xyn B的扩增

通过细菌裂解和酚、氯仿抽提的方法, 成果提取获得菠萝泛菌基因组DNA。以基因组DNA为模板, 使用引物F1和R1, 扩增获得木聚糖酶基因xyn B, 长度略小于1 000bp, 与预期大小933bp一致 (图1, X泳道) 。

2.2 重组质粒双酶切检测

利用引物F1和R1扩增出的木聚糖酶基因xyn B连接到p GM-T上, 构建成质粒p GM-Txyn B。经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切质粒p GM-Txyn B, 检测质粒连接情况。结果显示, 双酶切后, 成功切出一条大小约900bp的目的条带和一条约3kb的p GM-T载体 (图2泳道2) 。

2.3 重组木聚糖酶基因xyn B的诱导表达情况

利用0.1mmol/L的IPTG诱导菌株p ETxyn B/BL21 (DE3) 重组木聚糖酶基因的表达, 诱导3h后取样, 做SDS-PAGE蛋白电泳分析。结果显示, 经过IPTG的诱导, 菌株p ETxyn B/BL21 (DE3) 表达出了重组木聚糖酶, 重组菌表达的酶蛋白量占到其蛋白总量的65%左右, 产量较高 (图3) 。

M:DNA Marker;X:xyn B。

M1, M2:Marker;1:未切割;2:双酶切, 箭头指示xyn B。

M:Marker;S:诱导后样品;C:诱导前对照。

2.4 重组酶的纯化和性质

成功纯化出目的蛋白, 纯度达样品中总蛋白的95%以上 (图4) 。纯化后的重组木聚糖酶的分子量大约为34k Da, 用等电聚焦实验分析含His-tag的重组木聚糖酶Xyn B, 确定其等电点为7.3。

M:Marker;箭头指示目的蛋白。

木聚糖酶的酶学性质研究显示, 重组木聚糖酶最适p H为6, 在p H 5~7时具有较高的酶活性;在50~60℃时, 酶活性较高, 在60℃时酶活性最高。在60℃和p H 6时, 纯化后的重组酶活性可达到432U/mg。

3 讨论

利用基因工程技术构建高效木聚糖酶生产菌株是推动木聚糖酶工业化应用的基础, 国内外都开展了相关研究[12,13]。本文利用DNA重组技术构建了一株表达菠萝泛菌木聚糖酶的重组菌株, 利用诱导表达和保持蛋白活性的方法, 成功获得具有活性的重组木聚糖酶Xyn B。由于微生物具有生态适应多样性和生理特征多样性, 因此来源于不同微生物的木聚糖酶的组成和性质也就各异。研究显示[15], 来源于真菌的木聚糖酶一般在酸性环境下具有较高的催化活性, 它们的最适p H常常在4.0~6.0之间, 属于酸性木聚糖酶, 而来源于细菌、放线菌等微生物类群的木聚糖酶的最适p H一般是中性或碱性条件。对于一些极端适应环境的微生物来说, 其产生的木聚糖酶的活性条件一般与生存环境的特征相关。本文来源于一株菠萝泛菌的重组木聚糖酶, 在50~60℃和p H 5~7时, 都有较高的酶活性, 具有在食品与化学工业的潜在应用价值。本文为细菌来源的木聚糖酶晶体结构和催化分子机理等进一步的研究提供了基础。

摘要：目的:克隆、表达菠萝泛菌 (Pantoea ananatis) 木聚糖酶基因。方法:以菠萝泛菌Y1菌株基因组DNA为模板, 通过PCR方法获得该菌木聚糖酶基因XynB, 将该基因与pET表达载体连接, 转化E.coli BL21 (DE3) 菌株, 构建表达重组木聚糖酶的菌株pETxynB/BL21 (DE3) 。结果:采用0.1mmol/L的IPTG诱导重组菌株, 3h后表达出大量的重组木聚糖酶。采用保持蛋白活性的方法回收获得纯度大于95%的重组木聚糖酶。等电聚焦实验分析纯化后的重组木聚糖酶XynB等电点为7.3。该重组酶在60℃、pH 6时相对酶活性最高。结论:该文为菠萝泛菌木聚糖酶的进一步开发提供了研究基础。

4木聚糖酶 篇6

疏棉状嗜热丝孢菌是一种嗜热真菌,产生的木聚糖酶在高温和碱性条件稳定,降解产物中单糖含量很少[3]。该酶在原产菌中的表达需要木糖等诱导剂,但是嗜热真菌培养比较困难,产酶周期长且酶系复杂。在原核系统中重组表达的产量很低,不能满足应用要求[4]。该试验尝试采用大肠杆菌中的优势密码子,以引物拼接的方式合成基因,利用p ET-20b载体在16℃下实现木聚糖酶在大肠杆菌中高效表达。

1 材料和方法

1.1 引物设计

根据Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌DSM 5826木聚糖酶A基因序列,在不改变氨基酸的前提下使用优势密码子,设计14条引物合成基因xyn A,相邻引物末端有互补区域以利于引物退火延伸(图1)。

1.2 引物片断的拼接

参照美国Promega公司的Altered SitesⅡProtocol的方法,将14条引物混合磷酸化,产物75℃变性后,以大约1℃/min的速度缓慢降温至45℃退火,再迅速降至22℃终止退火。加入DNA聚合酶和连接酶,37℃下延伸和补平。

1.3 目的基因xyn A的克隆

设计上下游引物C1和C2,Eco RⅠ和HindⅢ酶切位点分别为黑体所示:C1:CCCGAATTCATG CAGACCACCCCGA AC;C2:CCCAAGCTTTTAGCCAACGTCAGCAACAG[2]。以拼接产物为模板,Ex-taq DNA聚合酶巢式PCR扩增基因。反应条件:95℃5 min;94℃30 s,57℃30 s,72℃60 s,循环29次;72℃10 min。产物回收后双酶切插入质粒p UC19位点。

1.4 重组表达质粒的构建和表达

以测序正确的质粒p UC19-xyn A为模板,设计合成引物C3和C4(黑体所示分别为NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点):C3:CCCCATATGCAGACCACCCCGAAC;C4:CCCCTCGAGTTA GCCAACGTCAGCA ACAG,以Probest DNA聚合酶进行扩增,条件同1.3。产物回收后双酶切插入质粒p ET-20b相应位点。将重组质粒p ET-20b-xyn A转入大肠杆菌JM109,接种于含100μg/m L氨苄青霉素的LB培养液中,37℃振荡过夜后转接培养至OD600达0.6,加入IPTG至终浓度0.8 mol/L,分别在37、16℃下继续培养12 h,每隔2 h收集菌液。

1.5 酶活测定

木聚糖酶活性的测定是以燕麦木聚糖为底物,利用对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色[2,5]。

2 结果与分析

2.1 基因的合成及重组表达质粒的构建

巢氏PCR法扩增出588 bp的片断(图2a),与设计基因序列一致。以p UC19-xyn A为模板PCR获得目的基因,构建重组表达质粒p ET-20b-xyn A,酶切结果与预期一致(图2b)。

2.2 木聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达

重组表达质粒转化大肠杆菌JM109,37℃诱导2 h酶活达到最大值3.99 U/m L,其后逐渐下降,菌液浓度在诱导4 h时达到最大值;16℃诱导10 h酶活性达到最大值42.05 U/m L,菌液浓度缓慢增大,12 h达到最大值(图3)。

注:a为巢氏PCR结果,1为DL2000标样,2为PCR产物;b为重组质粒结果,1为DL2000标样,2为NdeⅠ和XhoⅠ酶切产物,3为单酶切产物,4为λ-Eco T14Ⅰdigest DNA marker。

注:重组菌诱导后分别在37℃和16℃下振荡培养12 h,每隔2 h取样,检测酶活和细胞浓度。

收集诱导10 h时菌液破碎细胞,SDS-PAGE结果表明,重组菌产生约23 k Da的特异条带,与预期蛋白相对分子量一致[2]。16℃诱导产生的重组酶在全细胞总蛋白中占比47%,比例比37℃诱导时高,但多数重组酶以不溶性的形式存在,复性处理可以重新检测到木聚糖酶活性(图4)。

2.3 重组木聚糖酶的酶活性质

粗酶在60℃稳定性很高,温育6 h后仍有80%的相对活性,70℃下失活很快。在60℃下温育30 min,粗酶在p H值5.0~8.0的范围内均比较稳定,相对活性均保持在80%以上,在p H值4.5以下的环境很不稳定[2]。水解木聚糖的产物主要为木二糖、木三糖、木四糖以及其他聚合度的低聚糖[2],没有木糖,说明酶的水解方式没有变化。

3 讨论

外源基因在大肠杆菌中表达水平受多因素影响,如启动子、载体、基因的高级结构及密码子偏好等。产自疏棉状嗜热丝孢菌的木聚糖酶A的成熟蛋白共有196个氨基酸,其中31个氨基酸是由大肠杆菌中稀有密码子编码,前10个氨基酸中4个由稀有密码子编码,此外,R58是由最稀有的密码子AGA编码,AGA已经被证明会阻碍蛋白正常表达[2,6];L105和R117分别由CUA和CGA编码,是大肠杆菌中第二稀有密码子对[2]。为避免密码子偏好影响木聚糖酶重组表达,该研究通过基因合成改造木聚糖酶A基因序列。

注:1为蛋白分子量标准;2为JM109(p ET-20b)诱导总蛋白;3为重组菌(p ET-20b-xyn A)37℃诱导上清蛋白;4为重组菌37℃诱导总蛋白;5为重组菌16℃诱导上清蛋白;6为重组菌16℃诱导总蛋白。

该研究实现了重组酶的高水平表达,但多数以包涵体的形式表达,仅有部分有活性。已有多种方法解决蛋白过量表达时出现的包涵体问题,包括共表达分子伴侣、降低表达温度、分泌到胞外培养基或周质空间等[7]。研究发现,16℃下酶蛋白表达水平和酶活性均有较大提高,可能是较低温度下酶稳定性更好,仍有多数酶蛋白以包涵体形式存在。研究认为包涵体形成可能是该木聚糖酶自身氨基酸序列的缘故,折叠时不能迅速被大肠杆菌识别,导致翻译的多肽链集聚形成包涵体。有研究报道,氨基酸突变能增加重组蛋白的可溶性[8],后续研究可在这方面进行尝试。

参考文献

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[2]殷尔康.疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A在大肠杆菌中的高效表达[D].南京:南京师范大学,2007.

[3]GOMES J,GOMES I,KREINER W,et al.Production of high levelxylanase by a wild strain of Thermomyces lanuginosus using beechwoodxylan[J].J Biotechnol,1993,30(3):283-297.

[4]SCHLACHER A,HOLZMANN K,HAYN M,et al.Cloning and characte-rization of the gene for the thermostable xylanase XynA from Thermom-yces lanuginosus[J].J Biotechnol,1996,49(1-3):211-218.

[5]LEVER M.A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates[J].Anal Biochem,1972,47(1):273-279.

[6]HU X,SHI Q,YANG T,et al.Specific replacement of consecutive AGGcodons results in high-level expression of human cardiac troponin T inEscherichia coli[J].Protein Exp Purif,1996,7(3):289-293.

[7]CHOI J H,LEE S Y.Secretory and extracellular production of recombin-ant proteins using Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2004,64(5):625-635.

4木聚糖酶 篇7

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

取自呼和浩特郊区的土壤中。

1.1.2 培养基

筛选培养基为加入0.5%木聚糖的LB固体培养基。发酵培养基为0.5%木聚糖LB液体培养基。

1.1.3 木聚糖的提取

将玉米芯粉碎后用4%Na OH室温浸泡过夜, 抽滤取滤液, 用HCl调至p H为4.5, 加等体积乙醇, 离心得沉淀, 于45℃下烘干备用。

1.1.4 试剂

所用试剂皆为化学纯或生物纯。所用稀土Er Cl3为自备, 将稀土Er2O3与1∶1的盐酸按摩尔比1∶6混合, 搅拌使其溶解, 所得溶液在沸水浴上加热蒸发至干, 置于干燥器中至恒重, 即可制备出Er Cl3·6H2O稀土氯化物。

1.2 方法

1.2.1 菌种筛选

在含有0.5%木聚糖的LB固体培养基能够长出透明圈的菌落即为产木聚糖酶的菌株, 经划线分离, 挑取单菌落保存鉴定。

1.2.2 菌种培养及稀土诱变

将配好的含0.5%木聚糖的液体LB培养基灭菌后接入产木聚糖酶的菌株, 5%的接种量, 装液量为50m L (250m L三角瓶) 在36℃、160r/min培养条件下摇床培养。培养8h后加入1×10-3mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L的稀土Er Cl3水溶液时, 以不加稀土的菌液作为对照组, 于36℃、160r/min培养, 间隔一定时间取样测OD600, 72h后停止培养。将菌液以6 000r/min离心5min, 取上清液即为粗酶液, 测定木聚糖酶活性, 每组三个平行样。

1.2.3 Er3+对木聚糖酶的直接作用

在对照组的粗酶液中直接加入相同浓度的Er Cl3水溶液, 静置2h, 测定酶活。

1.3 木聚糖酶酶活的测定

以0.5%的木聚糖为底物溶液 (p H为6.0) , 加入待测酶液在50℃反应30min后, 加入DNS试剂沸水浴中保温显色5min后, 540nm的波长下测其吸光度 (OD=) 值。酶活定义:1m L粗酶液在p H为6.0、50℃下每分钟分解木聚糖产生1μg木糖为一个酶活单位。

2 结果与讨论

2.1 产木聚糖酶的枯草杆菌的筛选

筛选有木聚糖透明圈的菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌, 命名为Bacillus subtilis QSH4。枯草杆菌是目前应用较多潜力较大的一族革兰氏阳性细菌, 可以分泌多种有用产物, 在工业上长期被用于生产蛋白酶及淀粉酶等。

2.2 Er3+对生长的影响

加入稀土离子后对枯草杆菌的生长曲线见图1。从图1可以看出, 在对数期早期加入不同浓度的稀土Er3+对生长仅有微弱促进作用。稀土离子对生物生长也具有“高抑低促”的现象, 但是本实验中选择的浓度及稀土种类对枯草杆菌的生长基本没有影响。

2.3 Er3+对木聚糖酶的直接作用

将不同浓度的稀土离子加入到木聚糖酶的溶液中见图2, 1×10-3mol/L的Er3+对于木聚糖酶有轻微的抑制作用, 其余三个浓度的稀土离子也没有明显的促进作用。本次所用的稀土离子对于木聚糖酶作用不明显。

2.4 Er3+对枯草杆菌产酶的影响

加入四个浓度的Er3+后, 对酶活的影响见图3。从图3可以看出, 加入1×10-3mol/L的稀土离子后, 对酶活有抑制作用, 而1×10-4~1×10-6mol/L浓度的稀土离子对木聚糖酶活有促进作用, 相比对照组酶活4.15U/m L, 1×10-5mol/L的促进效果最好, 酶活达到8.39U/m L提高达102.2%。

3 结论

在生长早期加入1×10-4~1×10-6mol/L的稀土Er3+对枯草杆菌产木聚糖酶活有促进作用, 酶活提高达102.2%。但是稀土离子对枯草杆菌生长及木聚糖酶没有直接的影响, 具体机理需进一步研究。

参考文献

[1]邱并生.耐碱性木聚糖酶[J].微生物学通报, 2013, 40 (5) :904.

[2]常英, 张冬艳, 胡建华, 等.Er Cl3作用下枯草杆菌所产α-淀粉酶的温度、pH性质[J].兰州理工大学学报, 2009, 350 (6) :76-78.