RBP4（精选4篇）
RBP4 篇1
摘要：[目的]对贵州黑山羊和黔北麻羊进行RBP4基因多态位点的筛选,为从分子水平探究RBP4基因对动物繁殖性能的调控机制提供理论依据。[方法]采用DNA混池结合直接测序法分析RBP4基因外显子4在贵州黑山羊和黔北麻羊中的单核苷酸多态性,利用生物信息学软件分析SNP位点对RBP4基因mRNA二级结构的影响。[结果]RBP4基因外显子4在贵州黑山羊和黔北麻羊中均存在4-T214C突变位点,且为同义突变。生物信息学分析结果表明,外显子4-T214C突变导致RBP4基因mRNA二级结构发生变化,自由能降低,结构稳定性增大。[结论]在贵州黑山羊和黔北麻羊中检测到RBP4基因外显子4的1个SNP位点,该突变位点影响了RBP4基因mRNA的二级结构。
关键词：黑山羊,黔北麻羊,RBP4,SNPs,生物信息学
视黄醇结合蛋白(retinol binding protein,RBP)属于疏水小分子结合蛋白家族成员之一[1],是动物体内一类将维生素A从肝脏转运至靶组织的特异运载蛋白,在协助维生素A进行储存和转运等方面有着相当重要的作用。研究发现RBP主要由RBP1、RBP2、RBP3和RBP4四种结构形式来发挥其生理作用。RBP4是由RBP失去C末端的精氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-亮氨酸残基后的195个残基构成,分别定位于人、小鼠、猪的10q24、19号和14q25-26染色体区[2,3]。国内外研究证明,视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4,RBP4)基因在结合、转运视黄醇及其衍生物、视觉循环和胚胎发育等过程中发挥了重要作用[4],在猪的妊娠关键时期表达,显著影响产仔数[5,6],是孕体产生的主要蛋白质之一。此外,RBP4的功能障碍会造成维生素A在储存、转运、分布及代谢中的异常,进而影响动物骨组织的生长、分化,繁殖及胚胎发育[7]。目前,关于RBP4基因的研究主要集中在其对动物繁殖性能的影响,且发育孕体中子宫内膜及子宫肌膜中RBP4基因的大量表达也说明视黄醇的转运是胚胎发育所必需的条件之一[8]。但RBP4基因的研究对象主要是猪,在羊上的报道相对较少,在贵州黑山羊和黔北麻羊上的研究更是未见报道。鉴于此,笔者以贵州黑山羊和黔北麻羊为研究对象,以RBP4为候选基因,通过构建DNA池结合直接测序法分析RBP4基因外显子4的单核苷酸多态性,并进行生物信息学分析,旨在研究RBP4基因对贵州山羊的繁殖性能的影响,为开展贵州山羊品种选种选育提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
实验用103只黑山羊和105只黔北麻羊分别来自贵州省赫章县黑山羊中心产区和习水县黔北麻羊中心产区。每个个体颈静脉采血10 ml于抗凝管中,用冰盒带回实验室,-80℃保存备用。
1.1.2 试剂
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;2×Es Taq MasterMix、琼脂糖、Goldview染料、DL 1000 DNA Marker等均购自鼎国生物工程技术有限公司;dd H2O、0.5×TAE缓冲液等为实验室自制。
1.1.3 仪器设备
PCR扩增仪(C1000 TouchTM,美国BIO-RAD公司);凝胶成像分析系统(Universal HoodⅡ,美国BIO-RAD公司);凝胶成相系统(Universal HoodⅡ,美国BIO-RAD公司);电泳仪(Power PacTMHV Power Supply,美国BIO-RAD公司);超微量紫外分光光度仪(NANODROP 2000,美国Thermo Fisher公司);4℃冰箱(HYC-360,中国海尔);微量移液器(eppendorf,德国艾本德公司);震荡混匀器(VOR-TEX-GENIE2,美国Scientific Industries公司);高速冷冻离心机(Heraeus Multifuge X1R,美国Thermo Fisher公司)。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取
按照全血基因组提取试剂盒说明书对血液样品中的基因组DNA进行提取,用1%浓度的琼脂糖凝胶水平电泳和紫外分光光度计检测提取样品的纯度和浓度,用超纯水调整全部个体终浓度为100 ng/μL,各取3μL等量混合分别构建黑山羊和黔北麻羊DNA池,贮存于-20℃冰箱。
1.2.2 特异性引物设计、合成和PCR扩增
参考NCBI上山羊RBP4基因的DNA全基因组序列(Gen Bank登录号:NC_022318.1),利用在线软件Primer-BLAST设计RBP4基因外显子4的特异性引物。上游引物:ATGGTCTCCTGCTTCCTAA下游引物:GGTTCCCCTGTTTTCTTCT,引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
PCR反应体系:基因组DNA混池1μl,10 pmol/μl上、下游引物各1μl,2×Taq PCR Master Mix试剂10μl,双蒸水7μl。
PCR扩增程序:95℃预变性3 min,95℃变性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸30 s,34个循环,72℃终延伸5 min,4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳将目的产物的特异性检测,凝胶成像系统记录结果,将特异性好的PCR产物进行双向测序,测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。利用DNAStar软件结合BLAST进行测序结果的校正比对和SNPs分析。
1.2.3 RBP4基因序列分析和等位基因频率估算
用DNAStar软件的Seq Man程序对PCR产物测序峰图进行拼接比对,BLAST分析确定存在的单核苷酸多态性。利用MWSnap中标尺测量测序峰图中突变位点处各等位基因的相应峰高,根据峰高比值,利用以下公式估算等位基因频率[9]。
公式中Ai表示某多态位点等位基因频率,Ba和Bb分别代表测序图上其SNP等位基因a、b峰高。
1.2.4 RBP4基因的生物信息学分析
利用http://www.genebee.msu.su/services/rna2_reduced.htmlmRNA二级结构在线预测软件对RBP4基因突变前后DNA序列对应的mRNA二级结构变化进行预测。
2 结果与分析
2.1 黑山羊和黔北麻羊血液DNA的提取
提取的血液DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,在凝胶成像仪上观察到完整清晰的条带,经紫外分光光度计检测发现OD260/OD280在1.6~1.8之间,表明提取的DNA效果较好,可直接用于后续实验。
2.2 PCR扩增产物检测
根据设计的特异性引物以基因组DNA池为模板,扩增RBP4基因外显子4片段。取5μL PCR扩增产物加样于1%琼脂糖凝胶中,110 V电压,电泳30 min观察结果(如图1)。由图可见目的条带清晰无拖尾,特异性良好,片段长度430 bp与预期的相符,可直接用于进行测序。
注:1~4:贵州黑山羊基因组DNA;5~8:黔北麻羊基因组DNA。Note:1-4,Genomic DNA of Guizhou Black goat;5-8,Genomic DNA of Qianbei Ma goat.
2.3 PCR产物的SNPs分析
对贵州黑山羊和黔北麻羊RBP4基因的测序结果表明在RBP4基因第214位点处存在T→C的突变(以RBP4基因第4外显子第1位为+1位计)如图2,将其命名为exon4-T214C,进一步分析发现T214C为同义突变,未引起编码氨基酸的变化。
2.4 SNPs等位基因频率估算
利用MWSnap软件中的标尺对2个山羊品种中RBP4基因外显子4-T214C位点存在的等位基因进行峰高测量,并由等位基因频率估算公式估算各等位基因频率(表1)。由表1可见,两个山羊品种均存在4-T214C突变,且突变前后等位基因频率有所差异,但均以C为优势等位基因。
注:M:DM1000 Marker;GB:贵州黑山羊;QM:黔北麻羊。Note:M:DM1000 Marker;GB:Guizhou Black goat;QM:Qianbei Ma goat.
注:GB:贵州黑山羊;QM:黔北麻羊。Note:GB:Guizhou Black goat;QM:Qianbei Ma goat.
2.5 RBP4基因mRNA二级结构分析
对exon4-T214C突变进行mRNA的结构变化预测,结果见图3。由图可知,外显子4中存在的T214C突变引起编码mRNA的二级结构发生改变。经分析表明,当exon4-T214C位点碱基为T时,mRNA二级结构自由能为-170.5 k J/mol,当exon4-T214C位点碱基为C时其mRNA二级结构自由能为-174.2 k J/mol,突变引起RBP4基因mRNA二级结构自由能降低,结构稳定性增大。
注:A为外显子4-T214C位点为T时RBP4基因mRNA二级结构;B为外显子4-T214C位点为C时RBP4基因mRNA的二级结构。Note:A represented the mRNA secondary structure of RBP4 gene in which 4-T214C site was T;B represented the mRNA secondary structure of RBP4gene in which 4-T214C site was C.
3 讨论
近年来,国内外对RBP4基因多态性及其与繁殖性状的关联性开展了诸多研究,且发现该基因多态性对繁殖性状的影响在不同品种(系)间存在差异,表明RBP4基因可能是影响动物产仔数的主效基因。刘璐等[10]利用PCR-RFLP技术检测到在大白猪、长白猪和杜洛克猪中均存在RBP4基因外显子4的MspⅠ酶切位点多态性,且发现BB基因型对长白猪繁殖性能的影响要优于AB基因型。昌文林等[11]研究发现RBP4基因的G1223C突变位点与大白猪和湖南黑猪母猪的产羔性状显著相关(P<0.05)。朱吉等[4]以湖南黑猪为研究对象,采用PCR-RFLP方法检测到其RBP4基因存在AA、AB和BB 3种基因型,基因效应分析发现A等位基因可能是湖南黑猪繁殖性能的有利等位基因,这与于雷等[12]关于AA型为约克夏公猪优势基因型,A等位基因可能与配种母猪产仔数、产活仔数呈正相关的推测相符,但与罗仍卓么对北京黑猪繁殖性能的研究结果不同[13];Marantidis A等[14]利用PCR-RFLP技术对400头大白猪×长白猪母猪的RBP4基因的多态性进行检测,并进一步分析了RBP4基因与母猪主要繁殖性状间的关联性,发现AA基因型对猪的繁殖性能存在影响,与AB、BB基因型相比更有利于增加母猪窝产仔数;Lee DG等[15]发现RBP4蛋白优势表达于多羔组,表明RBP4蛋白与猪的繁殖力相关。王立辛等[16]采用PCR-RFLP方法在长白、大白和杜洛克3个猪群内检测到AA、AB和BB 3种基因型,且单基因分析表明各基因型对3个品种总产仔数的影响均不显著,与刘璐对这三个品种的研究结果基本相符;何庆玲等[17]对苏姜猪RBP4基因的多态性研究发现,在苏姜五世代母猪中均存在多态性,且合并基因型对繁殖性状的效应显著(P<0.05);龙石太等[18]克隆了川中黑山羊RBP4基因的c DNA序列,其编码区长为606 bp,编码201个氨基酸;白俊艳等[19]检测到大尾寒羊和小尾寒羊中B等位基因的频率分别为0.791和0.920,而A等位基因频率分别为0.209和0.080,但未发现AA基因型,这与本研究在贵州黑山羊和黔北麻羊中检测到的RBP4基因的等位基因频率基本相符;但肖礼华等[20]在黔北麻羊、内蒙古白绒山羊、关中奶山羊3个山羊品种的RBP4基因部分CDS区和3’UTR中并未发现突变位点,这与本研究的结果不符;此外对RBP4基因单核苷酸多态性与小尾寒羊高繁殖力的关系研究发现,RBP4基因对小尾寒羊的第一胎产羔数、第二胎产羔数有显著影响[21]。此外,王怀禹等[22]指出RBP4基因对雄性动物的繁殖性能也有一定的影响。综上研究结果,可知RBP4基因对动物的繁殖性能有着重要的作用。
本研究以贵州黑山羊和黔北麻羊为研究对象,首次在其RBP4基因外显子4上发现了T214C突变,进一步分析发现该突变为同义突变,并未引起编码氨基酸的改变。但有研究者报道沉默突变可影响体内蛋白的折叠和功能,以及基因的表达和表现型[23,24]。等位基因频率估算发现,C等位基因频率显著高于T等位基因,为优势等位基因,推测携带等位基因A的黔北麻羊或黑山羊个体更有利于在贵州地区生存或提高生产性能而被选留。结合生物信息学分析发现,突变前后mRNA的二级结构发生改变,突变后自由能下降,结构稳定性增加。RBP4基因mRNA二级结构的改变,会进一步导致其蛋白质结构的改变,而蛋白质的空间结构在很大程度上决定了其生物学功能,故RBP4基因生物功能可能受到影响。但由于本研究样本含量不是很大,检测的基因位点数量较少,所获得的结论只是初步的,故针对本研究在贵州黑山羊和黔北麻羊中发现的exon4-T214C突变位点对山羊繁殖性能和RBP4基因蛋白质生物学功能的具体影响,还需进一步扩大品种和样本数量对多态位点与产羔性能之间的相关性进行研究,以期进一步探索RBP4基因对山羊产羔数的影响机制,为贵州地方山羊品种的开发利用及遗传资源的保护提供科学依据。
RBP4 篇2
本实验以大白猪、长白猪、杜洛克猪、山西瘦肉型猪新品系(SD-III系)、大汉梅猪为试验动物,选取RBP4为候选基因,用PCR-RFLP方法对其进行了多态性研究并分析了其在各群体中的遗传特性,旨在为育种和保种工作提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样本来源。
大白猪49头母猪、长白猪62头母猪、杜洛克猪58头母猪、SD-III系猪56头母猪,均来自长治种猪场;大汉梅猪51头母猪,来自太原畜牧兽医研究所。
1.1.2 主要试剂。
Taq DNA Po Lymerase和d NTPs:上海生工生物技术发展有限公司。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取。
用酚-氯仿抽提法从母猪耳组织样中提取基因组DNA,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度,用紫外分光光度计法估计含量,用TE稀释DNA样品至50ng/μL。
1.2.2 引物设计。
采用Rothdchi Ld等发表的引物[2],覆盖区域片段长度为550bp,由大连宝生物公司合成。序列如下:
超纯水溶解至浓度为10μmol/L,4℃保存。
1.2.3 PCR反应体系及条件。
反应体系:10×buffer2.5μL,1.5μL Mg2+,2.0μL d NTP,0.2μL引物,模板DNA 50ng,Taq DNA聚合酶0.2μL,超纯水补至25μL。反应条件:93℃预变性4min,93℃变性30s,72℃退火45s,72℃延伸5min,40个循环。
1.2.4 PCR产物的基因分型。
PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,照像。
1.2.5 扩增产物的RFLP检测。
酶切体系20μL,1U Msp I,1×Buffer,1×Act BSA,10μL的PCR产物,加水至20μL。分装到盛有PCR产物的PCR管中再次混匀,离心管用封口膜封住,经短暂离心后,置于加样平板上37℃水浴过夜。
1.2.6 基因型的判定。
酶切产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分离,统计基因型。
1.3 数据统计
用POPGENE 1.31计算基因频率、基因型频率、多态信息含量、有效等位基因数、群体杂合度和Hardy-Weinberg平衡检验,方法见刘桂琼等(2004)[3]。
2 结果和分析
2.1 PCR产物的电泳结果
2.2 PCR-RFLP结果
用Msp I酶切消化后120V恒压电泳检测后在凝胶上显示3种带型,分别是AA基因型(190bp,154bp,136bp),BB基因型(190bp,136bp,125bp)和AB基因型(190bp,154bp,136bp,125bp)。如图2所示。
泳道5、7、9:AB基因型;泳道2、3、4:AA基因型;泳道1、6、8、10:BB基因型
2.3 猪RBP4的基因频率和基因型频率
5个品种中,AA、AB、BB三种基因型也都存在。A等位基因占优势,在各群体中的分布情况是大白>SD-III>大汉梅>长白>杜洛克。从基因型分布来看,在大汉梅猪AB型个体所占比例最高为0.490,SD-III猪BB型个体所占比例最低为0.179。(见表1)
2.4 RBP4基因遗传特性的分析
5个群体的遗传变异程度相差不大,在多态信息含量(PIC)方面,所测猪种均处于中度多态(PIC>0.5,为高度多态;0.25
3 讨论
本试验所检测的RBP4基因位点上,在大白猪、长白猪、杜洛克猪、SD-III系猪、大汉梅猪中都检测到了A、B两种等位基因。等位基因频率分布不均匀,A基因频率高,相对应的B基因的频率低。一般来讲,群体中频率最高的等位基因是该物种最原始、保守的,其余的等位基因是进化过程中由该等位基因突变造成的。经x2适合性检验表明,杜洛克猪显著的偏离了Hardy-Weinberg平衡状态,这可能是样本含量太小,由样本所计算得到的基因频率不足以反映种群的实际情况。从群体遗传多态性角度分析,如果PIC高,等位基因数目多,杂合度大,表明该群体在该位点的遗传变异高,有较大的选择余地,可以利用该位点进行与生长性状相关的标记辅助选择。Bostein等提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量(Po Lymorphic information content PIC)指标。根据本研究的结果,5个猪品种表现为中度多态(0.5>PIC>0.25)。本试验没有发现高度多态位点,这一方面可能与所选择的基因位点相当保守有关,另一方面可能与所采用PCR-RFLP有关,其检测出的等位基因数目比较少。
信息之窗
8月起乳制品进口将实施自动进口许可管理
我国将从8月1日起对鲜奶、奶粉和乳清进口进行密切监督,要求进口商定期报告上述产品的进口信息。
根据《关于对鲜奶、奶粉和乳清实施自动进口许可管理的公告》,自2009年8月1日起对鲜奶、奶粉和乳清实行进口报告管理。
商务部委托中国食品土畜进出口商会负责上述产品进口报告信息的收集、整理、汇总、分析和核对等日常工作。进口鲜奶、奶粉和乳清的对外贸易经营者,应向中国食品土畜进出口商会备案,并将备案登记表抄报注册地省级及计划单列市地方商务主管部门,在京的国有资产监督管理委员会监管企业直接抄报商务部。(本刊辑)
参考文献
[1]梁学颖,徐琪寿.视黄醇结合蛋白的分子生物学[J].生理科学进展,2000,3(31):277~279.
[2]Max F.RothschiLd,Lori Messer。Andy Day.Richard WaLes,Tom Short,O1wen Southwood,Graham PLastow.Investigation of the retinoL-binding protein4(RBP4)gene as a candidate gene for increased Litteer size in pigs[J].MammaLian Genome,2000,11:75~77.
RBP4 篇3
关键词：猪,NCOA1,OPN,RBP4,PCR-RFLP
核受体辅激活蛋白1基因 (nuclear receptor coactivator 1 gene, NCOA1) 可以增加雌激素受体基因 (ESR) 的活性, 也因此可诱导一些专门与雌激素发生作用的基因活性和间接的、后续的生理反应[1]。骨桥蛋白基因 (Osteopontin, OPN) 是细胞外基质中的一种重要的功能性蛋白, 与心血管疾病、肿瘤的发生发展、抗炎以及损伤修复等有着密切的关系。近年来随着研究的深入, 人们发现OPN基因在生殖领域中也有重要的作用[2]。视黄醇结合蛋白是一个转录蛋白, 它可以与视黄醇特异的结合并将其从肝脏中转运至靶组织, 帮助视黄醇实现转运和在细胞中新陈代谢。据此, 人们推测RBP4基因也是影响猪繁殖性状的候选基因之一[3]。该研究以影响猪繁殖性状的候选基因NCOA1、OPN和RBP4基因为目的基因, 采用PCR-RFLP的方法, 检测和分析了不同基因型对仔猪初生重和30日龄体重效应的大小, 为今后的分子标记辅助选择和猪育种工作提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用猪及耳样来自黑龙江省农业科学院畜牧研究所野猪与大白猪杂交的F1选育群, 选择了2008年6月1～30日产下的25窝共计248头健康仔猪个体 (公猪129头, 母猪119头) , 跟踪记录它们的初生重和30日龄体重。所采耳样用常规的酚/氯仿抽提法分别提取基因组DNA, 并纯化、检测浓度, 稀释成100 ng·mL-1备用。
1.2 PCR扩增
每个基因的PCR扩增用引物序列见表1。PCR反应条件为94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 55～58℃复性30 s, 72℃延伸40 s, 返回到变性过程, 运行30～35个循环, 72℃后延伸10 min。
1.3 PCR产物酶切与分型
由于酶切后片段大小不同, 使用的琼脂糖凝胶浓度也不相同。NCOA1使用1.5%的琼脂糖凝胶, OPN使用0.8%的琼脂糖凝胶, RBP4使用16.0%的丙烯酰胺凝胶, 其它信息详见表1。
2 结果与分析
2.1 3个基因的PCR-RFLP结果
NCOA1、OPN和RBP4基因经各自的限制性内切酶酶切后所获得的带型图见图1～图3。
2.2 基因型频率与基因频率
通过表2可知, RBP4基因的A、B基因频率基本相同, 均接近于0.5。NCOA1基因的A为优势等位基因, OPN的B为优势等位基因。
注:下划线为用于分型的可见带。
2.3 不同基因型对仔猪初生重和30日龄体重的效应
分别计算NCOA1, OPN和RBP4基因的基因型仔猪初生重和30日龄体重, 结果表明 (见表3) , NCOA1基因的AA型个体30日龄体重显著高于BB型个体 (P<0.05) ;而OPN和RBP4基因的不同基因型对仔猪的初生重和30日龄体重效应差异均不显著。
注:同列数据后所标字母相异表示差异显著 (P<0.05) , 所标字母相同表示差异不显著 (P>0.05) 。
3 讨论
2006年施启顺等人在158头大白猪和224头长白猪中进行了相关研究, 结果发现A为优势等位基因 (0.766 7/0.828 1) , AA型母猪的总产仔数和产活仔数均显著高于BB型母猪[4]。与施启顺等人的结果相比, 该研究中A基因频率略有下降, 推测可能是野猪血统的引入在一定程度上降低了该等位基因频率, 与仔猪的初生重和30日龄体重性状进行相关性分析后表明, AA型个体同样也是有益型个体, 可显著增加30日龄体重, 这与前人在其它相关性状上的研究结果类似, 因相关研究报道很少, 所以无法进行更多的比较分析。可在今后的研究中可通过加大样本量, 增加测定的性状来进一步分析。
Knoll等人[5]首次发现OPN基因第6内含子处存在一个305 bp片断的插入性多态。该研究中A等位基因频率显著低于B等位基因频率, 这与罗仍卓么等[6]在大白猪群体中的研究结果基本一致 (0.296 1/0.703 9) , 推测野猪血统的引入并没有改变OPN基因在大白猪群体内的原有频率。性状相关性分析表明, 虽然AA型个体可在一定程度上提高仔猪初生重, AB型个体可提高30日龄体重, 但因均没有达到显著水平, 所以还无法定论。RBP4基因的MspⅠ酶切多态性首次由Rothschild等人[7]发现, 在PIC的商品系中, 优势等位基因A可以显著提高母猪的产仔数。该研究中, BB型和AB型可分别提高仔猪的出生重和30日龄体重, 但均没有达到显著水平, 这与Drogemuller等[8]的研究结果类似。
参考文献
[1]Melville J S, Gibbins A M V, Robinson J A B, et al.AMeishan positive QTL for prolificacy traits found at theNCOA1 locus on SSC 3[C]//7th World Congress on Ge-netics Applied to Livestock Production.Montpellier, 2002.
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[3]Trout W E, Mcdonnell J J, Kramer K K, et al.The retinol-binding protein of the expanding pig blastocyst:molecularcloning and expression in trophectoderm and embryonic disc[J].Molecular Endocrinology, 1991, 5:1533-1540.
[4]施启顺, 柳小春, 刘志伟, 等.5个与猪产仔数相关基因的效应分析[J].遗传, 2006, 28 (6) :652-658.
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[7]Rothschild M F, Messer L, Day A, et al.Investigation ofthe retinol-binding protein 4 (RBP4) gene as a candidategene for increased litter size in pigs[J].Mammalian Ge-nome, 2000, 11 (1) :75-77.
RBP4 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料选取2013 年6 月-2015 年6 月在临沂市河东区人民医院住院的T2DM合并ACI患者110 例, 其中男57 例, 女53 例;年龄37~84 岁, 平均 (60.7±12.8) 岁;糖尿病病程11 个月~28 年, 平均 (9.3±4.1) 年。将患者按入院序号随机分为治疗组56 例和对照组54 例, 所有患者符合1999 年WHO糖尿病的诊断标准和全国第四届脑血管病变学术会议修订的诊断标准, 并经颅脑CT或MRI证实, 且脑梗死发病时间均在72 h之内, 并排除糖尿病急性并发症、合并感染、继发性糖尿病、肝肾功能异常、恶性肿瘤、脑出血、胃肠疾病及精神障碍患者。本研究已经通过本院伦理委员会审理, 所有研究对象均知情并签署了同意书, 两组的性别、年龄、体重指数等一般资料比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。
注:Hb A1c :糖化血红蛋白;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇;SBP:收缩压;ALT:谷丙转氨酶;Cr:肌酐
1.2 方法所有受检者入院24 h内空腹采血, 用日立7180Q全自动生化分析仪测定血糖 (FPG、2 h PG、Hb A1c) 、血脂 (TG、TC、LDL-C、FFA) 、β 细胞功能 (HOMA-IR、HOMA-β) 、胱抑素C (Cys-C) 、半胱氨酸 (Hcy) 、高敏C反应蛋白 (hs-CRP) 、肝肾功能等, 采用胶乳免疫比浊法测定RBP4 滴度, 试剂盒由北京九强生物技术股份有限公司提供, 严格按照其说明书程序操作。入院后患者均行生活方式干预, 停用口服降糖药物, 单纯给予胰岛素控制血糖, 应用抗血小板凝聚、改善循环药物, 并根据患者血脂、血压水平选用调脂、降压药物治疗。在此基础上治疗组将α- 硫辛酸注射液 (亚宝药业有限公司生产) 600 mg加入250 m L 0.9% 氯化钠溶液中静脉滴注, 1 次/d, 连用3 周。对照组将维生素C 3.0 g加入250 m L 0.9% 氯化钠溶液中静脉滴注, 1 次/d, 连用3 周。治疗结束后空腹采血复查上述指标, 观察治疗前后患者的RBP4、Cys-C、Hcy、hs-CRP、β 细胞功能、 血糖、血脂、血压、体重指数、心电图、肝肾功能、电解质等方面的变化, 按照《脑卒中患者神经功能缺损程度评分标准》 (NIHSS) 进行评分并比较治疗前后的变化, 同时观察药物不良反应。
1.3 统计学处理使用SPSS 18.0 统计软件进行分析, 计量资料以表示, 比较采用配对t检验, 组间比较采用两样本独立t检验, 计数资料采用字2检验, 以P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组治疗前后的RBP4、Cys-C、Hcy及hs-CRP比较两组治疗前的RBP4、Cys-C、Hcy、hs-CRP比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) ;两组治疗后的RBP4、Cys-C、Hcy、hs-CRP比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。
2.2 两组治疗前后血糖和 β 细胞功能比较两组治疗前的FPG、2 h PG、Hb A1c、HOMA-IR、HOMA-β比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) ;两组治疗后的FPG、2 h PG、Hb A1c、HOMA-IR、HOMA-β 比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01 或P<0.05) , 见表3。
2.3 两组治疗前后的血脂指标比较两组治疗前的TG、TC、LDL-C、FFA比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) ; 两组治疗后的TG、LDL-C、FFA比较, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 但两组治疗后的TC比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表4。
2.4 两组治疗前后的NIHSS评分比较两组治疗前的NIHSS评分比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 治疗后的NIHSS评分均低于治疗前, 治疗前后比较差异有统计学意义 (P<0.01) ;两组治疗前后NIHSS评分差值分别为 (4.67±2.51) 分和 (6.18±2.74) 分, 差值比较差异有统计学意义 (t=2.641, P=0.002) , 见表5。
2.5 两组的不良反应比较治疗组有2 例出现轻微腹胀, 1 例出现皮肤瘙痒, 经对症处理2 d内症状消失;治疗前后患者白细胞计数、血压、体质指数、心电图、肝肾功能、电解质均无明显变化, 无患者退出冶疗。
3 讨论
糖尿病是当前威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病之一, 最近的全国流行病学调查发现, 18 周岁以上成年人糖尿病的患病率高达11.6%[5]。长期高糖状态下, 血浆纤维蛋白原增加, 血黏度升高, 红细胞聚集性增强、脆性增加, 循环血流减慢, 红细胞淤积、破裂, 动脉内膜光滑程度减低, 弹性纤维和平滑肌纤维在动脉管壁中层的沉积增多, 因此, 糖尿病患者极易发生脑梗死[6]。糖尿病合并脑梗死致死率、致残率高, 存活者50%~70% 遗留不同程度的肢体瘫痪、智力障碍、言语功能减退或丧失等后遗症, 已成为严重的社会公共卫生问题, 给家庭和社会带来沉重的负担。因此, 寻找新的治疗措施, 对于促进糖尿病合并脑梗死患者的早日康复、改善预后、提高患者的生活质量具有重要意义。
研究证实氧化应激是缺血性脑血管病发生发展过程的重要因素。急性脑梗死时缺血、缺氧的线粒体产生大量自由基, 再灌注时这些自由基大量进入缺血组织引起生物膜脂质过氧化反应, 使细胞膜生理功能遭到破坏, 导致神经元结构异常而坏死。抗氧化治疗被认为是治疗糖尿病及并发症的新策略, 在动物实验中疗效确切, 但因临床研究所选择药物的种类、剂量、疗程等不同所获得的结果差异较大。α- 硫辛酸是目前临床使用的抗氧剂中作用最强的一种, 可通过清除自由基、抑制脂质过氧化反应、再生体内其他抗氧化剂、螯合金属离子等机制发挥治疗作用[7]。同时 α-硫辛酸还参与三羧酸循环, 改善K+-Na+-ATP酶的活性, 恢复神经细胞能量通路;另外, α- 硫辛酸兼具脂溶性和水溶性, 可以顺利通过血脑屏障深入到细胞各个部位发挥作用, 所以也被称为“万能抗氧化剂”。α- 硫辛酸在国内外已被广泛用于治疗糖尿病周围神经病变和糖尿病肾病等糖尿病的慢性并发症[8]。
本研究应用抗氧化剂 α- 硫辛酸治疗后发现患者的RBP4、Cys-C、Hcy、hs-CRP水平均明显降低, 与使用维生素C治疗相比差异有统计学意义 (P<0.05) , 与Uyar等[9]的研究类似。RBP4 是新近发现的一种脂肪因子, 主要来源于脂肪细胞和肝细胞, 与IR、肥胖及多种心脑血管危险因素密切相关[10]。研究认为RBP4 与糖尿病的多种并发症相关, 有学者将RBP4作为2 型糖尿病合并脑梗死的预测因子[11]。胱抑素C (Cys-C) 即半胱氨酸蛋白酶抑制剂, 是一种低分子蛋白质, 研究显示Cys-C不仅是早期肾损害的标志, 还能够预测糖尿病的发生, 参与糖尿病大血管、微血管病变的发生和发展, 半胱氨酸 (Hcy) 是脑梗死的独立危险因素[12,13]。高敏C反应蛋白 (hs-CRP) 是临床上最敏感的炎性标志物之一[14]。使用抗氧化剂 α- 硫辛酸治疗后上述指标均明显下降说明 α- 硫辛酸可通过抑制脂质过氧化反应、清除自由基、再生其他抗氧化剂等途径而发挥降低脂肪因子分泌、调节半胱氨酸代谢、减轻炎症反应的作用。本研究也发现在胰岛素用量相当的情况下使用 α- 硫辛酸治疗后患者FPG、2 h PG、Hb A1c下降更明显, 可能是通过 α- 硫辛酸直接保护 β 细胞免受自由基攻击、抑制肝糖原分解、降低氧化应激、改善胰岛素抵抗等机制达到显著降糖作用, 与Bao等[15]的研究结果一致。本研究还发现使用 α- 硫辛酸治疗后患者的TG、TC、LDL-C、FFA均明显下降, 显示 α- 硫辛酸有明显的调脂作用, 从而降低血脂异常对胰岛 β 细胞的脂毒性, 利于 β 细胞功能的恢复。同时本研究还发现应用 α- 硫辛酸治疗后患者的HOMA-IA下降明显, HOMA-β 升高显著, 说明 α- 硫辛酸可明显改善胰岛素抵抗, 改善胰岛 β 细胞功能。另外, 本研究发现应用 α- 硫辛酸治疗后患者NIHSS评分明显降低, 表明 α- 硫辛酸可通过降糖、调脂、降低氧化应激、改善胰岛素抵抗等途径改善脑细胞代谢, 促进患者症状的改善和功能的恢复[16]。在整个治疗过程中, 仅个别患者出现轻微不适, 经对症处理症状很快消失, 说明 α- 硫辛酸用于治疗糖尿病合并脑梗死是安全的。
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