金丝桃素

金丝桃素（共4篇）

金丝桃素 篇1

金丝桃素 (HY) 是从天然中草药贯叶连翘中提取的一种萘骈二蒽酮类化合物, 是贯叶连翘的主要成分之一, 该成分也是贯叶连翘中最具生物活性的物质, 为抗病毒的中草药活性单体。近年来, 将其作用光动力疗法的新型光敏剂, 具有抗炎、抗肿瘤、增强免疫力等生物学活性, 并且广泛应用于抗病毒[包括抗人类免疫缺陷病毒 (HIV) ]、癌症的光化学治疗、抗抑郁等多方面的研究和临床治疗之中[1]。现将其免疫功能、抗病毒及临床应用研究进展综述如下。

1 免疫功能

金丝桃素是二葱酮类, 即4, 4', 5, 5', 7, 7'-六羟基-2, 2'-二甲基-中位-萘骈二蒽酮, 其衍生物包括假金丝桃素和一些前体物质、原金丝桃素、金丝桃辅脱氢二葱酮等。

传统理论认为, 金丝桃素具有清热解毒、扶正祛邪、补气壮阳、调节动物机体免疫等功能。现代药理学研究证实, 其有收缩血管、升高血压、利胆、诱导机体产生干扰素, 并且有广谱抗病毒作用, 可有效抑制正黏病毒、副黏病毒、疱疹病毒及多种免疫缺陷病毒的复制。T.A.Evstifeeva等[2]研究了贯叶金丝桃素各种基本成分的免疫性质, 结果发现, 金丝桃素除抑制白细胞介素-6 (IL-6) 外, 还抑制花生四烯酸和白三烯B的释放, 这两种物质是人体内可活化淋巴和T淋巴细胞的几种重要化合物的前体。多酚类成分能通过对单核吞噬细胞系统、细胞免疫及激素免疫的应答增强免疫作用, 并能恢复高位耐受情况的免疫应答。亲脂性成分具有抑制免疫的作用。金丝桃素还具有抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶活性的作用。

2 抗病毒作用

近年来发现, 金丝桃素对许多种逆转录病毒均有抑制作用, 包括HIV、副流感病毒、肝炎病毒等。体外试验发现, 金丝桃素对单纯疱疹病毒1型和2型 (HSV-1型、HSV-2型) 、副流感病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、口炎病毒有抑制作用, 对人巨噬细胞也有抑制作用。金丝桃素对小鼠体内感染Friend白血病病毒有治疗作用, 并有抑制病毒复制的作用。金丝桃素的抗病毒机制与其光敏活性有关。在光照条件下, 金丝桃素吸收光子, 然后激发单线态氧, 释放能量, 产生的单线态氧可破坏细胞膜, 干扰蛋白质和核酸。金丝桃素也是一个较强的蛋白激酶C (PKC) 抑制剂, 有研究表明, 体外试验中强于PKC抑制剂他莫昔芬 (tamoxifen) [3]。

2.1 抗DNA病毒

2.1.1 对乙型肝炎病毒 (HBV) 的作用

HBV是一种很小的嗜肝DNA病毒科的包膜病毒, 是引起病毒性肝炎的主要病原体之一。在HBV感染血清中能够检测出3种形态的病毒颗粒, 第1种为22 nm的小球形外膜颗粒;第2种为长40~100 nm, 宽22 nm的管形颗粒;第3种为完整的42 nm的Dane颗粒。Moraleda等人构建了鸭乙肝病毒 (DHBV) 模型, 结果表明, 金丝桃素在一定浓度时可阻断D2细胞产生病毒颗粒, 可引起DHBV表面抗原的释放, 并使病毒颗粒的包膜蛋白形成不可逆的共价交联而凝聚, 但并未发现病毒核外壳的核亚单位有类似的蛋白质凝聚, 也未发现与细胞有关的核心与包膜蛋白之间有类似的凝聚[4]。

2.1.2 抗禽流感病毒

我国禽流感参考实验室采用Klein-Defors悬浮杀灭与感染试验的方法检验了金丝桃素对禽流感H5N1和H9N2亚型病毒的杀灭效果, 结果表明:金丝桃素每毫升含0.034 mg生药浓度时与禽流感病毒作用30 min, 对病毒的杀灭率可达100%;每毫升含0.068 mg生药浓度时与禽流感病毒作用10 min, 对病毒的杀灭率可达99.99%。金丝桃素新制剂在体外不仅对低致病力H9N2亚型禽流感病毒, 而且对严重危害人类健康的高致病力H5N1亚型禽流感病毒均具有良好的杀灭作用。金丝桃素对高致病性禽流感病毒杀灭效果显著。

2.1.3 抗人巨细胞病毒 (HCMV)

巨细胞病毒 (CMV) 是一种在自然界普遍存在的疱疹病毒科β属的双螺旋DNA病毒, 在正常人体中CMV的潜伏感染率很高, 血清学检查阳性率达40%~90%。普通人群感染后并不表现出症状, 但在免疫缺陷或免疫抑制人群中却有极强的致病性, 其感染率在肝移植受体中高达30%~65%, 其中18%~40%表现出临床症状[5]。王向阳等[6]研究证明, 金丝桃素单体溶液能有效抑制HCMV在细胞内的繁殖, 对肝脏移植术后HCMV感染的防治也起到积极作用。

2.2 抗RNA病毒

2.2.1 抗口蹄疫病毒 (FMDV)

FMDV属于小RNA病毒科FMDV属。王曙阳等[7]采用双抗体捕获抗原法、病毒效价测定、MTT法、组织细胞培养等方法在体内外对抗FMDV进行试验, 结果表明, 金丝桃素在体外有抗FMDV作用, 抑制FMDV与宿主细胞的吸附、融合, 是抗病毒的重要途径之一。金丝桃素对FMDV OS/99BF13有直接灭活作用, 并对吸附于细胞表面及进入细胞内的FMDV有抑制作用。金丝桃素在FMDV感染第一环节, 通过光化学反应改变FMDV衣壳结构抑制逆转录酶进入细胞及病毒的吸附、侵入、融合, 有效阻止了FMDV进入宿主细胞。说明金丝桃素抗FMDV效果良好。

2.2.2 对丙型肝炎病毒 (HCV) 的作用

HCV属于黄病毒科HCV属, 主要通过输血传播, 可以引起慢性甚至非常严重的肝脏疾病。电镜观察HCV是直径为55 nm的球形颗粒, 去除包膜后是直径为33 nm的核衣壳蛋白包裹的核心部分, 内部含全长约9 400个核苷酸的单股正链RNA基因, 其脂质包膜能与宿主的脂质或免疫球蛋白结合。在对C型肝炎、慢性C型肝炎治疗过程中金丝桃素起一定作用。J.M.Jacobson等[8]对两组感染慢性HCV的患者进行了临床试验, 第1组12位患者每天口服0.05 mg/kg的金丝桃素, 第2组7名患者每天口服0.10 mg/kg金丝桃素, 8周后在所有接受试验的患者血浆中HCV RNA的水平没有超过1.0lg。

2.2.3 对HIV的作用

自发现艾滋病至今已研制出抗HIV药物数百种, 但经FDA批准并为全球认为可在临床应用的仅有3种, 且都存在严重的毒副作用。金丝桃素通过干扰HIV复制循环的装配与释放过程, 从而抑制HIV活性, 即可能通过干扰逆转录病毒感染宿主, 阻断病毒脱壳和出芽, 通过钝化病毒抑制其传播。在病毒内装配与大多数核苷类似物不同, 金丝桃素对病毒的转录及翻译作用不明显, 对病毒蛋白向细胞膜的转运过程无显著作用, 对DNA聚合酶也无直接作用。金丝桃素抗HIV机理是通过抑制逆转录酶而起作用的。金丝桃素并非影响病毒的转录和翻译过程, 而是干扰病毒的装配和释放过程, 可抑制HIV及其他一些反转录病毒。另外, HIV-Ⅰc D-NA整合作用离体试验结果表明, 金丝桃素可抑制从感染HIV细胞中分离出的整合酶, 因而金丝桃素可能在病毒的整合过程中起作用。

2.2.4 对流感病毒的作用

流感病毒A1是一种含有包膜的单链RNA病毒。病毒包膜来自宿主细胞的双层类脂膜, 3种膜蛋白镶嵌在膜上, 分别为血凝素 (HA) 、神经氨酸酶 (NA) 和M2蛋白。J.Tang等[9]将甲型流感病毒浸染细胞与一定浓度的金丝桃素混合培养以检测金丝桃素对细胞病变 (CPE) 的抑制作用, 结果显示, 金丝桃素在浓度为1.56~1.78μg/m L时可明显杀灭流感病毒。杨子峰[10]报道, 贯叶金丝桃醇提物50 g/L浓度组在体外细胞水平有抑制流感病毒的作用;体内试验结果表明, 金丝桃素能帮助小鼠抵抗流感病毒性肺炎, 并可延长感染流感病毒小鼠的存活时间。

3 临床应用

3.1 抗癌作用

金丝桃素在紫外光或可见光的激活下能诱导恶性T淋巴细胞凋亡, 从而抑制表皮恶性T淋巴细胞淋巴瘤的生长。金丝桃素可直接引起癌细胞程序性死亡, 并伴有细胞色素C由线粒体向细胞质释放。W.Zhang等[11]在离体试验中观察到金丝桃素能抑制神经质瘤细胞的机动性和浸润。金丝桃素可以治疗胰腺癌、膀胱癌、淋巴癌、前列腺癌、白血病等。将金丝桃素应用于新的光学技术, 可提供另一种检测癌症发展过程中表现的细微结构和分子变化[12]。以金丝桃素为光敏剂进行光动力疗法 (PDT) 治疗及以金丝桃素为放射增敏剂进行放射治疗, 都可以起到明确的抗癌效果。PDT已成为一种用于治疗癌症的有效方法。PDT是一种靶向癌症疗法, 通过促进肿瘤微环境中一些促炎性细胞因子分泌和多个凋亡介质表达, 进而导致肿瘤细胞凋亡或坏死[13]。

3.2 抗肿瘤作用

金丝桃素抗肿瘤作用主要通过光动作用接受光敏色素光活化提供的能量, 产生高细胞毒性的单线态氧。金丝桃素通过吸收光子激发单线态氧, 使处于三线激发态的金丝桃素分子跃迁到基态, 释放能量, 以单线态氧和O2作为主要氧化剂, 进而将细胞膜破坏。L.Miccoli等[14]报道, 金丝桃素在光激活下, 通过抑制神经质瘤线粒体中己糖激酶活性, 级联调节其能量代谢, 改变肿瘤细胞内代谢, 使肿瘤细胞内发生一系列异常的生化变化, 导致肿瘤细胞不可逆的损伤、坏死。金丝桃素光动活性能辅助治疗脑瘤, 口服还可作为治疗恶性肿瘤的附加剂。由于金丝桃素属于强酸, 极易失去一个质子, 使得金丝桃素在没有光的条件下同样能释放质子。M.Alecu等人发现, 金丝桃素对肿瘤细胞显示出选择性增殖和细胞毒效应, 此作用需要可见光激活和O2, 而对周围组织无损伤, 用金丝桃素治疗恶性肿瘤时还发现表面有新的表皮生长出来。金丝桃素作为光敏剂进行PDT, 对喉癌细胞的生长呈剂量依赖性的抑制作用, 并可诱导细胞凋亡, 从而发挥明确的抗肿瘤作用。

3.3 抗抑郁作用

金丝桃素具有明显的抗抑郁作用, 在治疗轻度和中度抑郁症时, 与标准抗抑郁药物三环类相比贯叶连翘明显优于安慰剂, 疗效相同且不良反应小。R.Brenner等[15]用双盲法对金丝桃素浸膏制剂与斯托宁进行对比试验, 对30位轻度、中度抑郁症患者临床用药1周后, 结果金丝桃素制剂 (2.7 mg/d) 疗效与斯托宁相当, 甚至优于斯托宁。现阶段认为, 贯叶金丝桃制剂抗抑郁是其中多种成分通过多种机制的协同而发挥作用的。

3.4 其他作用

金丝桃素具有消炎、止痛的功效, 可治疗牙痛, 疱疹、骨折后的慢性神经痛, 还能治疗外科伤的疼痛、炎症、神经手术引起的撕裂、创伤手术后镇静。金丝桃素可以作为PKC的特异性抑制剂, 延缓衰老。金丝桃素可舒张豚鼠冠状动脉, 扩张血管;可增加胆汁流量, 有效减弱CCl4对肝脏的损害, 保护肝脏。经光诱导可增强金丝桃素抗病毒活性, 有效抑制人体内的白细胞利用光的作用, 金丝桃素产生单线态氧, 发生高能态原子迁移, 抑制HL-60细胞, 甚至杀死白细胞。

4 结语

关于金丝桃素的免疫功能及其生物活性成分在抗病毒和临床癌症的光化学治疗、抗肿瘤、抗抑郁中的应用已被广泛报道, 但有关金丝桃素的作用机理及生物合成途径涉及较少, 随着今后对其主要化学成分的组成、含量和活性的深入研究, 弄清金丝桃素与病毒、肿瘤细胞相互之间的作用机制及抗抑郁作用机制, 金丝桃素将成为有发展前景的天然抗病毒、抗癌、抗衰老药物, 必将为进一步研发、利用金丝桃属植物提供广阔的前景。

金丝桃素 篇2

1 发病情况

临床234例多发生于寒冷季节, 一旦侵入猪群, 迅速传播蔓延。各种年龄猪均可发病, 但主要危害仔猪, 日龄越小, 病程越短, 病死率越高, 5日龄左右的仔猪死亡率高达100%。病仔猪发病初期中轻热, 精神不振, 食欲减退, 随后出现呕吐、剧烈腹泻。病初粪便呈灰白色糊状, 随后变黄或带绿色, 并杂有未消化的乳凝块或混有血块。病仔猪极度口渴, 眼球凹陷, 体重减轻, 如不及时治疗或治疗不当, 严重病例多数衰竭死亡, 少数康复后生长缓慢或停止生长。临床上单用抗生素治疗, 效果不佳。

2 剖检变化

病猪严重脱水, 胃肠粘膜有明显的卡他性炎症, 小肠粘膜充血、出血, 小肠绒毛缩短, 内有黄色或绿色水样内容物, 肠系膜淋巴结肿胀, 上皮细胞变性明显, 上皮细胞由柱型变为扁平或方形, 肾脏见有浑浊肿胀和脂肪变性。

3 实验室检查

3.1 荧光抗体法取早期病猪空肠或回肠刮取物

涂片, 室温下丙酮固定5min, 加入荧光抗体37℃染色30min, 用p H7.2磷酸盐缓冲液洗10min, 再用蒸馏水洗5min, 缓冲甘油封盖, 荧光显微镜检查, 上皮细胞呈现荧光者即可确诊。

3.2 血清学检查采取急性期和康复期病猪作中

和试验。康复期血清滴度超过急性期的4倍以上可判定为阳性。

3.3 病毒分离取典型病猪的肛棉拭粪或肠内容

物, 经口接种5日龄内的健康易感仔猪2~3只, 或接种猪睾丸 (ST) 、猪肾 (PK) 细胞盲传二代以上, 分离病毒再根据接种仔猪产生典型的临床症状、明显细胞病变, 而对照猪正常即可确诊。

4 治疗

4.1 立即隔离病仔猪, 并用碱性消毒剂严密消毒猪舍、场地、用具等。

4.2 对病仔猪于防寒保暖而又干燥的环境中加强

护理, 立即停止哺乳或喂料, 给予足够的清洁饮水, 并在饮水中加入抗生素 (四环素、磺胺类药物) 、速补-14、中药“金丝桃素”以减轻症状, 促进机体康复。严重的静注含适量抗生素 (痢菌净、环丙沙星) 的葡萄糖林格氏液, 以减轻失水、缓解酸中毒和防止并发性感染。

4.3 全群未发病仔猪和母猪给予适量中药金丝桃素拌料或饮水2次/d, 连喂3d, 可减少该病的发生。

5 体会

5.1 因本病主要危害仔猪并造成死亡, 且目前尚无

特效药物治疗, 故一旦发病, 应加强护理, 采取中西兽药结合对症治疗, 以减轻失水、防止酸中毒和并发性细菌感染是治疗该病的关键。

5.2 中药“金丝桃素”是贯叶连翘中最具生物活性

的物质, 为抗病毒的中草药活性单体, 能直接添加在动物饲料和饮用水中, 具有清热解毒、止血、抗菌消炎、驱虫、利尿等功效, 尤其是其抗病毒作用突出, 能抗DNA、RNA病毒, 并能直接作用于病原体且不易产生耐药性, 从而可有效地调动机体免疫力, 防止猪的继发感染, 与西药抗生素联合运用可迅速减缓症状, 缩短治疗时间, 大大提高治愈率。

5.3 因本病多发生在寒冷季节, 对发病仔猪和易感

金丝桃素 篇3

1材料

1.1试验动物

健康SD大鼠,雌雄各半,体重为( 200 ± 20) g,生产许可证号为SCXK( 黑) 2008 - 0004,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2主要试剂

金丝桃素对照品( 纯度大于98% ) ,自制; 甲醇 ( 色谱纯) ,美国迪马公司生产; 其他试剂均为分析纯; 水为重蒸水。

1.3主要仪器

高效液相色谱仪( 型号为LC—2010 AHT) ,购自日本岛津公司; 电子天平( 型号为Sartorius BT25S) , 购自德国Sartorius公司; 旋涡混合器( 型号为QL— 901) ,购自江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司; 高速台式离心机( 型号为TGL—16C) ,购自上海安亭科学仪器厂; 恒温氮吹浓缩仪( 型号为L—128) ,购自北京来亨科贸有限责任公司; 超声波清洗器( 型号为KQ5200B) ,购自昆山市超声仪器有限公司。

2方法

2.1色谱条件

色谱柱为SHIMADZU Shim - pack VP - ODS C18色谱柱 ( 4. 6 mm × 150 mm,5 μm) ; 流动相为 甲醇∶0. 006 mol/L磷酸氢二钠( 90∶10,用磷酸调节p H值至6. 5) ; 检测波长为590 nm; 流速为1. 0 m L/min; 柱温为30 ℃。

2.2金丝桃素标准溶液的配制

精密称取金丝桃素5. 00 mg,置于25 m L量瓶中,用甲醇超声溶解并稀释至刻度,摇匀,配制成浓度为200. 00 μg /m L的标准储备液,精密量取标准储备液适量,分别置于10 m L量瓶中,加甲醇稀释并定容至刻度,配制成金丝桃素浓度分别为5. 00,10. 00, 25. 00,50. 00,75. 00,100. 00 μg / m L的系列标准溶液,备用。

2.3血浆样品的处理

精密吸取血浆样品100 μL,置于1. 5 m L离心管中,加入甲醇200 μL,涡旋混合2 min; 10 000 r/min离心10 min; 吸取全部上清液转移至另一支1. 5 m L离心管中,用37 ℃ 氮气吹干,残渣用100 μL流动相溶解,吸取上清液过0. 22 μm微孔滤膜,进样量为10 μL,采用HPLC法进行分析。

2.4方法学考察

2. 4. 1专属性分别制备空白血浆、空白血浆 + 金丝桃素及大鼠尾静脉注射给药后血浆样品,按照2. 3中的步骤操作,进样量为10 μL,采用HPLC法进行分析,记录色谱图。

2. 4. 2标准曲线和最低检测限在100 μL空白血浆中加入金丝桃素系列标准溶液100 μL,按照2. 3中的步骤操作,用100 μL流动相溶解,使相应血浆所含的金丝 桃素浓度 分别为5. 00,10. 00,25. 00, 50. 00,75. 00,100. 00 μg / m L,进样量为10 μL,采用HPLC法进行分析,记录峰面积,以峰面积( A) 为纵坐标,金丝桃素血药浓度( C) 为横坐标,进行线性回归分析。以信噪比为3( S /N = 3) 计算最低检测限。

2. 4. 3日内精密度及日间精密度按照2. 3中的方法制备金丝桃素在血浆样品中的低、中、高( 5. 00, 50. 00,100. 00 μg / m L) 3个浓度的样品,每个浓度设5个样本,连续测定3 d,计算测得的样品浓度,与配制浓度对照,求得各组织样品测定方法的日内精密度及日间精密度。

2. 4. 4提取回收率按照2. 3中的方法制备金丝桃素在血 浆样品中 的低、中、高 ( 5. 00,50. 00, 100. 00 μg / m L) 3个浓度的样品,每个浓度设5个样本,进样量为10 μL,采用HPLC法进行分析,将所得峰面积与未经提取的相同浓度直接采用HPLC法分析所得峰面积进行比较,考察样品的提取回收率。

2. 4. 5稳定性考察按照2. 3中的方法制备金丝桃素在血 浆样品中 的低、中、高 ( 5. 00,50. 00, 100. 00 μg / m L) 3个浓度的样品,分别考察血浆样品在室温放置12 h、在4 ℃放置12 h、在 - 20 ℃冰箱冷冻保存21 d及在 - 20 ℃反复冻融3次后的稳定性。

2.5血浆样品的采集

取SD大鼠8只( 雌雄各半) ,试验前禁食12 h, 自由饮水,精密称量金丝桃素适量,用0. 1% 羧甲基纤维素钠溶液配制药液,按体重50 mg /kg于大鼠尾静脉注射; 在给药前及给药后2,5,10,20,30,45,60, 90,120,180分钟于大鼠眼底静脉丛取血0. 3 m L,置预先肝素化的1. 5 m L离心管中,5 000 r/min离心5 min; 取上层血浆0. 1 m L于 - 20 ℃ 保存,备用。

3结果与分析

3.1专属性考察(结果见图1)

由图1可知,在色谱图中金丝桃素的保留时间约为3. 9 min。在血浆样品处理过程中未引入干扰性杂质,且血浆中内源性物质不干扰测定结果。

3.2标准曲线(结果见图2)和最低检测限

由图2可知,金丝桃素血浆样品的线性回归方程为: A = 14 134C + 5 103. 6,R2= 0. 999 2。该结果说明在5. 00 ~ 100. 00 μg /m L浓度范围内线性关系良好,最低检测限为0. 20 μg /m L( S /N = 3) 。

3.3日内精密度及日间精密度考察(结果见表1)

由表1可知,大鼠血浆内金丝桃素日内精密度和日间精密度的RSD均小于15% ,符合药代动力学研究方法中对精密度的要求。

3.4提取回收率考察(结果见表2)

%

由表2可知,大鼠血浆内金丝桃素提取回收率均在80. 00% 以上,满足测定要求。

3.5稳定性考察(结果见表3)

%

由表3可知,RSD均小于15% ,说明大鼠血浆内金丝桃在室温放置12 h、在4 ℃放置12 h、- 20 ℃反复冻融及 - 20 ℃冰箱冷冻保存21 d均是稳定的。

3.6药动学结果

按照以上确立的方法测定血药浓度,所得血药浓度 - 时间数据采用3p97药动学软件进行拟合处理, 以AIC值和拟合优度值最小为原则,结果大鼠尾静脉注射金丝桃素溶液的血药浓度 - 时间曲线符合二室模型,药动学主要参数: 药时曲线下面积( AUC0 - t) 为( 126. 46 ± 18. 25) ( μg /L) ·h,生物半衰期( t1 /2) 为 ( 4. 86 ± 2. 58 ) h,清除率 ( CL ) 为 ( 0. 32 ± 0. 12) L / ( h·kg) 。金丝桃素血药浓度 - 时间曲线见图3。

4讨论

金丝桃素属于萘并二蒽酮类化合物,不溶于水, 研究发现,金丝桃素在甲醇∶吡啶( 9∶1) 混合溶液中的溶解度较好,在甲醇中也能较好溶解,为了减少试验样品中溶剂的种类,以降低杂质的引入,本试验采用甲醇辅以超声波技术溶解金丝桃素来配制标准溶液。

金丝桃素 篇4

关键词：金丝桃素,高效液相色谱-荧光检测法,组织分布,药动学

贯叶连翘又名圣约翰草,为多年生金丝桃科金丝桃属的草本植物。贯叶连翘是近年来国际上最畅销草本之一,也是国际医药市场上最重要的抗抑郁植物制剂原料。金丝桃素是贯叶连翘中最具有生物活性的物质,近年来国内外研究发现其具有优良的生物活性,具有抗抑郁、抗病毒和光活性作用,且具有抗逆转录病毒作用,对艾滋病、肿瘤有治疗作用,深受国际医药界重视。以金丝桃素为主要成分治疗抑郁症、甲型肝炎、乙型肝炎及获得性免疫缺陷综合征的药物在德国、英国等国家已上市[1,2,3,4]。本实验采用灵敏度较高的高效液相色谱-荧光检测法,通过静脉注射和灌胃2种给药途径,对贯叶连翘提取物中金丝桃素在小鼠体内的药动学和组织分布情况作了初步探讨,为开发金丝桃素新制剂提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物:

昆明系小鼠,由河北医科大学实验动物中心提供,清洁级,合格证号: 7080118。

1.1.2 药品与试剂:

贯叶连翘提取物(含金丝桃素0.3%,西安天一生物技术有限公司);金丝桃素对照品(上海融禾医药科技有限公司,批号:061230);甲醇(美国TEDIA公司,批号:610078);四氢呋喃(天津市博迪化工有限公司,批号:20070309);乙腈(美国TEDIA公司,批号:608062);磷酸二氢钠(天津市永大化学试剂开发中心,批号:20070315)。色谱分析使用色谱纯;其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器:

医用离心机(北京医用离心机厂),旋涡混合器(常州国华仪器厂),Waters高效液相色谱仪600E、四元泵/2475型荧光检测器(美国Waters公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 金丝桃素标准液及提取物溶液的制备:

精密称取金丝桃素对照品配制成100μg/ml的贮备液,精密吸取贮备液一定量,分别配制成0.05、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml的系列标准溶液。取贯叶连翘提取物配制成18mg/ml的水溶液,备用。

1.2.2 体内样品色谱条件:

色谱柱规格:YMGC18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相∶ 甲醇∶四氢呋喃∶0.1mol/L磷酸盐缓冲液=45∶30∶25;流速:1.0ml/min; 激发波长:315nm,检测波长:590nm;柱温:35℃。

1.2.3 小鼠生物样品处理及色谱行为:

取小鼠空白血浆100μl,精密加入10.0μg/ml金丝桃素标准液100μl,加入乙腈500μl,涡旋1min后以 6000r/min离心10min,吸取上层有机相,微孔滤膜过滤后,取 20μl进样,入 HPLC分析。另取小鼠空白血浆100μl,精密加入贯叶连翘提取物水溶液100 μl,加入乙腈500μl,,涡旋1min后以 6000r/min离心10min,吸取上层有机相,微孔滤膜过滤后,取20μl进样,入高效液相色谱(HPLC)分析。小鼠空白血浆同法操作。 取小鼠心、肝、脾、肺、肾及脑组织样品,分别精密称质量,加生理盐水制成组织匀浆,取100μl 组织匀浆,处理方法同血浆。

1.3 金丝桃素标准曲线的测定

分别取空白小鼠血浆及心、肝、脾、肺、肾及脑匀浆样品100μl,精密加入上述标准溶液100μl,使金丝桃素的血浆浓度分别为0.025、0.25、0.5、1.25、2.5、5.0、10.0μg/ml,按样品的预处理与测定方法进行处理与分析。记录样品峰面积(A),A对血浆或组织匀浆液中药物浓度(C)进行线性回归,得到血浆及各组织样品的回归方程。

1.4 精密度和回收率

取小鼠空白血浆及各组织匀浆100μl,分别加入0.5、2.5、10.0μg/ml的金丝桃素标准液100μl,使血浆浓度分别为0.25、1.25、5.0μg/ml,在1d内处理、测定5次,并连续5d分别提取测定,计算日内和日间差异。分别取上述3种浓度的血浆样品,在同1d内提取,测定,将测定结果代入标准曲线方程,计算回收率。

1.5 金丝桃素在小鼠体内的分布和药动学分析

选取体质量为(25±5)g的健康成熟昆明小鼠132只,雌雄各半,随机分成22组,每组6只,其中11组按相当于0.36mg/kg(以金丝桃素计)剂量给予贯叶连翘提取物灌胃,另11组按同等剂量给予小鼠尾静脉注射。分别于给药后1、5、10、20、30、40、60、90、120、180、240min时采眼球血,置肝素化试管中,4000r/min离心10min分离血浆,按样品处理方法操作;并取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等组织,定量称取各组织,按样品处理方法操作。样品入HPLC分析。采用中国药理学会数学药理委员会编制的3P97药动学程序对2种给药途径所得到的药物浓度-时间数据进行处理。

2 结 果

2.1 方法专属性

小鼠空白血浆色谱图、空白血浆加入对照品、提取物及给药后血浆样品色谱图显示:金丝桃素保留时间为17min,表明在所选用的测定条件下,内源性物质均不干扰测定,方法的专属性较好。见图1~4。

2.2 标准曲线和线性范围

血浆和各组织的线性范围及线性方程及相关系数见表1。

2.3 精密度和回收率

各浓度的血浆和组织样品所测日内差异结果RSD≤3.9%(n=5),日间差异结果相对标准差(RSD)≤4.4%(n=5),平均回收率≥90.5%,RSD≤5.0%。

2.4 给药后血浆和组织浓度

血药浓度-时间曲线结果显示:静脉注射后药时曲线呈现双峰,血药浓度在给药20min后迅速下降,之后趋于缓和,而灌胃给药无明显峰谷现象,整体药时曲线平缓。由组织分布结果可知,灌胃及静脉注射后金丝桃素在肝脏浓度均较高,且有一定程度的蓄积,在脾、肾、肺及脑中消除迅速,在心脏组织中未测出。见图5、表2。

注:◆:静脉给药 ■:灌胃给药

2.5 药动学分析

血药浓度-时间曲线数据以3P97程序经计算机拟合证明,灌胃和静脉注射给药均符合二室模型,绝对生物利用度为34%,药动学参数见表3。

3 讨 论

金丝桃素体外含量测定方法多采用紫外检测器[5,6],而生物样品浓度均很低,紫外检测器很难测出,利用金丝桃素分子

有荧光这一特性[7,8,9],选用荧光检测法测定金丝桃素的生物样品浓度,灵敏度高,专属性强。生物样品处理时采用乙腈为蛋白沉淀剂兼提取溶剂,可简化操作步骤,效果良好。提取物水溶液静脉注射后药时曲线出现双峰现象,而灌胃后药时曲线未出现双峰,分析原因可能是贯叶连翘提取物中其他成分对金丝桃素的体内过程产生干扰所致,具体原因有待进一步研究。

小鼠体内药动学研究表明,灌胃和静脉注射后消除半衰期均较长,药时曲线平缓,提示金丝桃素在体内的排泄或代谢较缓,在进行制剂设计时应充分考虑这一性质。金丝桃素给药后迅速分布于肝脏,并存在蓄积现象,表明金丝桃素与肝脏组织的亲和力较强,肝脏可能是其作用靶器官,对其抗肝炎病毒作用有积极意义,但是否存在蓄积毒性有待研究。

参考文献

[1]Butterweck V,Schmidt MSt.John's wort:Role of active compounds for itsmechanism of action and efficacy[J].Wien Med Wochenschr,2007,157(13-14):356-361.

[2]Vacek J,Klejdus B,Kubán V.Hypericin and hyperforin:bioactive com-ponents of St.John's Wort(Hypericum perforatum).Their isolation,a-nalysis and study of physiological effect[J].Ceska Slov Farm,2007,56(2):62-66.

[3]Sosa S,Pace R,Bornancin A,et al.Topical anti-inflammatory activity of extracts and compounds from Hypericum perforatum L[J].Pharm Phar-macol,2007,59(5):703-709.

[4]Zhao J,Zhang ZP,Chen HS.Studies on synthesis and Anti-HIV RT ac-tivity of hypericin and ethylhypericin[J].Acta Pharmaceutica Sinica,1998,33(1):67-71

[5]Rückert U,Likussar W,Michelitsch A.Simultaneous determination of to-tal hypericin and hyperforin in St.John's wort extracts by HPLC with electrochemical detection[J].Phytochem Anal,2007,18(3):204-208.

[6]Rückert U,Eggenreich K,Likussar W.A high-performance liquidchrom-atography with electrochemical detection for the determination of total hy-pericin in extracts of St.John's Wort[J].Phytochem Anal,2006,17(3):162-167.

[7]Han GD.Herbal Pharmacokinetics[M].Beijing:China Medical Tech-nology Press,1999.

[8]Butterweck V,Liefl nder-Wulf U,Winterhoff H.Plasma levels of hyperi-cin in presence of procyanidin B2and hyperoside:a pharmacokinetic study in rats[J].Planta Med,2003,69(3):189-192.