荧光蛋白基因

荧光蛋白基因（精选9篇）

荧光蛋白基因 篇1

摘要：[目的]克隆日本鳗鲡绿色荧光蛋白UnaG基因,表达并纯化UnaG蛋白。[方法]从日本鳗鲡中克隆了绿色荧光UnaG基因,并克隆至p ET28Aa、pc DNA-Flag质粒中。将重组质粒pc DNA-Flag用脂质体转染到293T细胞中,用荧光显微镜观察绿色荧光,同时用原核表达系统诱导His-UnaG融合蛋白的表达,用亲和层析和凝胶过滤层析纯化HisUnaGg融合蛋白。[结果]转染人293T细胞后不到24 h,荧光显微镜观察到日本鳗鲡UnaG能被激发出较强的绿色荧光;原核表达并纯化的His-UnaG融合蛋白纯度很高,Western Blot检测为单一条带,蛋白量达3μg/μl。[结论]成功克隆并纯化了UnaG,为进一步研究UnaG的应用奠定基础。

关键词：日本鳗鲡,绿色荧光蛋白,克隆

日本鳗鲡(Anguilla japonica)是日本料理的传统食材,也是我国沿海地区喜食的鱼类之一。日本鳗鱼具有长途迁徙生命周期,生长于内陆河中,在海洋中长距离游至菲律宾附近公海产卵[1]。孵化后仔鳗(larvae)随海流需几个月时间才能返回中国、日本等淡水栖息地。然而直到现在,人们对于这一淡水鳗鱼的生物学研究仍然很少。2013年日本RIKEN脑科学研究所(RIKEN Brain Science Institute)的科学家发现了鳗鱼肌肉的绿色荧光蛋白,并命名为Una G[2,3]。GFP绿色荧光蛋白以前只在水母等低等生物中发现[4],Una G是第一个发现的来自脊椎动物的绿色荧光蛋白。与传统的绿色荧光蛋白GFP相比,Una G需要一种天然的化学物质胆红素(Bilirubin)来激发其绿色荧光,且绿色荧光不依赖于分子氧,这一发现具有广泛的生物医学研究和临床检测应用前景。日本学者研究了Una G在临床检测未结合胆红素的应用[2],Una G在蛋白荧光标记、蛋白相互作用及低氧环境如:厌氧生物和肿瘤深层组织的蛋白标记方面也将会有广泛应用。为了Una G荧光标记应用研究,作者从日本鳗鲡中克隆了Una G基因,并利用哺乳动物细胞表达并观察到较强的绿色荧光,同时原核表达了Una G蛋白,下一步将进行Una G蛋白发光特性及荧光标记应用研究,目前国内尚未有Una G研究的报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

日本鳗鲡玻璃鳗3月初采集于南通长江入海口,水深8 m、水温4℃,共采集雄性日本玻璃鳗2条,每条约0.1 g。人胚肾293T细胞株,克隆所需的质粒有p ET28a、pc DNA3-Flag、大肠杆菌菌株E.coli DH5α等均由作者实验室保存。

1.1.2 试剂

DL2000 DNA marker、限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ、T4 DNA连接酶等购自NEB公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和PCR纯化试剂盒等购自Tiangen公司;基因组DNA提取试剂盒、质粒抽提试剂盒等购自北京百泰克生物公司;Neo DNA聚合酶购自Toyobo公司;LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司;英骏生物公司上海合成部合成所需的引物;所用化学试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

CO2培养箱为Thermo公司产品;电泳仪和电泳槽为上海天能公司产品;PCR仪为Eppendorf公司产品。

1.1.4 培养基

DMEM高糖培养基、双抗和胎牛血清FBS均为HYCLONE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 日本鳗鲡Una G基因的克隆

取日本鳗鲡少量肌肉组织,加1 ml的TRIzol试剂抽提日本鳗鲡总RNA,并逆转录成c DNA,然后再用设计合成的Una G引物扩增出日本鳗鲡Una G基因。

引物序列如下:

Una G F:5’-CGGGATCCATGGTCGAGAAATTT-GTTGG-3’;

Una G R:5’-CCGCTCGAGTCATTCCGTCGC-CCTCCGGT-3’。

PCR反应程序如下:95℃变性2 min;然后98℃变性10 s,68℃退火和延伸1 min共循环40次;PCR反应最后68℃继续延伸5 min。扩增的Una G PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化后,再用限制性内切酶HindⅢ、XhoⅠ37℃双酶切10 h,并用PCR产物纯化试剂盒纯化;pc DNA-Flag和p ET28a克隆载体用同样的方法双酶切并割胶纯化。纯化双切的Una G、pc DNA-Flag、p ET28a,经连接、转化和涂板,用菌落PCR和酶切方法鉴定阳性克隆,摇菌后抽质粒由上海Invitrogen公司测序,正确的克隆命名为pc DNA-Flag-Una G和p ET28a-Una G。

1.2.2 细胞培养及转染

用含10%胎牛血清、双抗的DMEM高糖培养基培养人HEK293T细胞,培养条件为37℃、5%CO2。每3 d换1次培养基,传代用0.25%胰蛋白酶消化293T细胞。转染前细胞接种到6孔板中,待细胞长到90~95%汇合度时用LipofectamineTM2000 Reagent转染,将pc DNA-Flag-Una G质粒转染293T细胞中。

1.2.3 荧光显微镜观察Una G的绿色荧光

将pc DNA-flag-Una G转染入293T细胞后,培养24 h或48 h,用荧光显微镜蓝光激发观察Una G蛋白绿色荧光的表达情况。

1.2.4 Western Blot检测Una G蛋白表达

将重组质粒pc DNA-flag-Una G转染293T细胞48h后,PBS洗2次,通过离心收集细胞,用IP裂解液冰上裂解细胞,14 000 g离心10 min。然后再取适量的细胞裂解液加2×SDS煮样、离心,上样跑12%PAGE胶,经过转膜,孵育一抗、二抗后,最后用Odyssey扫膜仪扫膜,用odyssey v3.0软件分析实验结果。

1.2.5 Una G绿色荧光蛋白的原核表与纯化

将测序并比对验证完毕的重组p ET28a-Una G质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,涂布卡那平板,将平板在37℃倒置培养过夜。挑单克隆摇菌,摇菌至OD600达到0.7~0.9,加入终浓度100μmol/L的IPTG,25℃低温诱导2 h后收集菌体,Western Blot检测Una G蛋白表达,并用His Beads纯化His-Una G融合蛋白。

2 结果与分析

2.1 鳗鱼绿色荧光蛋白Una G基因克隆

用Una G特异性引物扩增得到Una G全长的ORF为420 bp,片段长度与预计相符。将Una G克隆到p ET28a和pc DNA-Flag质粒中,用双酶切鉴定重组质粒,鉴定结果如1,鉴定正确的重组质粒送测序,测序结果与NCBI上已公布的日本鳗鲡Una G核酸序列比较,结果完全正确。

2.2 Una G与人脑脂肪酸结合蛋白(B-FABP)氨基酸序列比较

根据克隆到的Una G基因的DNA序列,发现Una G属于脂肪酸结合蛋白(FABP)家族[5,6,7](图1),它与脑(B-)FABP有较高的氨基酸序列同源性(56%)。像FABP家族的其他成员一样[7],其蛋白结构由N端的2个α螺旋和10个反向的β折叠组成,2个α螺旋结构域作为帽子覆盖顶部,形成一个桶状胆红素配体结合口袋。胆红素的外乙烯基二吡咯环部分(吡咯环C/D)和B-环丙氨酸是位于桶状结构的深处,而内乙烯基二吡咯环部分(吡咯环A/B)和C-环丙氨酸则位于口袋的入口处。胆红素是血红蛋白代谢的产物[8,9],Una G与胆红素通过氢键特异、非共价结合结合(图2),相比于低亲和力、宽谱配体结合的其他的FABP蛋白,Una G与胆红素复合物具有独特的协调、紧密结合特性,这解释了胆红素与Una G结合的高亲和力和特异性。

2.3 日本鳗鲡绿色荧光蛋白Una G的真核表达

用Invitrogen公司的Lipo 2000转染试剂将pc D-NA-flag-Una G转染至293T细胞中,转染48 h后,用荧光显微镜观察,经蓝光激发后观察到绿色荧光,且荧光强度与GFP没有差别,转染24 h后就有较强的绿色荧光,比GFP表达更快(图3)。日本鳗鲡Una G的绿色荧光蛋白与GFP发光特性不一样,需要未结合胆红素的结合,在细胞培养基中有胎牛血清,而血清中就有未结合的胆红素。

2.4 Western Blot检测Flag-Una G的表达

用转染Flag-Una G质粒的细胞裂解液做Western Blot,再用Sigma公司的mouse Flag抗体检测Flag-Una G融合蛋白表达情况,内参用mouse Actin抗体。Western Blot结果见图4。从结果中可见Flag-Una G融合蛋白能很好地表达,分子量约为16k Da,与预期完全一致。

2.5 Flag-Una G融合蛋白的纯化

将IPTG诱导后的菌体离心沉淀,用25 ml Lysis buffer重悬菌液,超声破碎后,低温离心。用His融合蛋白亲和纯化柱His60 Ni Superflow TM Resin处理离心后的上清,经漂洗后,用500μl的elution buffer洗脱,用3个1.5 ml的离心管收集3次洗脱液。取适量诱导前的全菌、诱导后的全菌、洗脱液分别加入等体积2×SDS上样Buffer,SDS-PAGE电泳,结果表明经过亲和纯化,得到较纯的His-Una G蛋白条带(图5),分子量约16 k Da与预期的分子量基本一致。进一步通过凝胶过滤层析,得到了纯度更高的His-Una G融合蛋白(图6),我们得到高纯度的Flag-Una G为以后Una G抗体制备、蛋白性质研究及Una G荧光标记研究打下了坚实的基础。

1:Before IPTG induction;2:After IPTG induction;3-5:1,2,3 elution.

1,2 were elution 1 and 2.

3 讨论

日本鳗鲡绿色荧光蛋白Una G的研究国内目前尚未见报道,我们纯化得到的Una G蛋白分子量为16k Da,而GFP的分子量为28k Da。小分子量的Una G更适合作为荧光标记,对目标蛋白的影响更小。同时我们也发现Una G比GFP能更快表达,据我们荧光显微镜观察,转染6h后就可以观察到Una G的绿色荧光,而GFP需要12h,这个特性让Una G比GFP更适合在蛋白荧光快速标记实验中的应用。我们应用His-beads纯化Una G蛋白后,用凝胶过滤的方法进一步纯化了Una G蛋白,得到了只有单一条带,这比日本学者纯化的蛋白更纯。这些为下一步研究Una G蛋白性质及应用研究做了很好的工作。

Una G蛋白分子量小、不依赖于分子氧、需胆红素激发绿色荧光的特性,除了在临床检测胆红素含量外,将会在像GFP荧光蛋白一样,在蛋白荧光标记方面有广泛应用[10]。最近Erapaneedi raghu等[11]将Una G基因接在HIF1启动子后,低氧条件下低氧触发Una G在细胞和活体移植的肿瘤组织中均能很好的表达,结合m Cherry荧光蛋白的应用能清楚地标记处于低氧条件的细胞和最近复氧的细胞,这为肿瘤发生的分子生物学和肿瘤代谢研究提供非常理想的荧光标记手段。To Tsz-Leung[12]等根据Una G蛋白的晶体结构将Una G基因分成两部分,在载体上分别与能相互作用蛋白的基因相连,当药物诱导两个蛋白相互作用时能激发出绿色荧光。目前,关于Una G应用研究的文章非常少,值得深入研究。

我们在克隆日本鳗鲡Una G基因的基础上,细胞验证了Una G确实能激发绿色荧光。并进一步纯化了Una G蛋白,得到高纯度的Una G的蛋白,为下一步Una G抗体的制备及应用研究打下了良好的基础。

参考文献

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[12]To TL,Zhang Q,Shu XK.Structure-guided design of a reversible fluorogenic reporter of proteinprotein interactions[J].Protein Science,2016,25(3):748-753.

荧光蛋白基因 篇2

应用绿色荧光蛋白基因标记细菌进行生物膜结构定量化新方法

绿色荧光蛋白基因pEGFP经CaCl2转化法标记E.coli JM109菌株,获得的.标记菌株作为模式细菌接种含50μg/mL氨苄的LB培养基,在摇瓶中与火山岩颗粒共混培养挂膜(37℃,120 r/min,16 h).用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得火山岩填料生物膜250μm×250μm区域不同层面的图片堆,所获图片堆经COMSTAT程序处理可以获得相关的定量化参数,如16 h生物膜平均厚度为0.120 844 μm,生物膜最大厚度为10.5μm,生物膜体积为0.136 986μm3/μm2,生物膜表面积21 338.1μm2,生物膜比表面积为3.36 854μm2/μm3.该方法也可以扩展至其他绿色荧光蛋白基因标记细菌的生物膜结构定量化.

作 者： 作者单位： 刊 名：环境科学  ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCE 年，卷(期)： 26(4) 分类号：X172 关键词：绿色荧光蛋白   大肠杆菌   生物膜  

绿色荧光蛋白的发现与发展 篇3

生物发光是一个很普遍的生物学现象。早期的生物研究大多涉及分类、形成和生态方面，后来重点转移到生态、生化的研究，目前已进入分子生物学的研究水平。从不同生物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同。迄今，腔肠动物门多管水母属的维多利亚多管水母（aequorea victoria）的发光蛋白系统研究得较为深入。

多管水母体内存在着两种发光蛋白，即光蛋白——水母素（aequorin）和绿色荧光蛋白（GFP，green fluorescent protein）。光蛋白作为分子标记及Ca2+的生物学指示剂，已被成功地应用于哺乳动物、植物、酵母、大肠杆菌细胞，用于检测很多重要的生理学和病理学反应。GFP作为良好的细胞、发育、分子生物学的活体标记，用于监测各种体系中的基因表达、蛋白定位以及多种细胞活动。利用GFP进行示踪的研究范围相当广泛，从细胞生物学的基础研究如细胞骨架和细胞分化、细胞器动力学和囊泡跟踪，到一些热门的前沿和学科和技术领域，如器官移植、基因治疗、神经生物学等等。

日本科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖。他们的工作不但在科学上对化学、生物学、医学等领域具有重要的意义，而且也与人们的日常生活密切相关，对于提高人类的生活品质以及进一步改善人类的健康有十分重要的意义。

1研究GFP的时间线索

GFP从最初被发现到今天广为应用，经历了半个多世纪的时间。首先简单回顾一下这半个多世纪内和GFP相关的主要事件。

1955年人们首次注意到水母体内的绿色荧光物质。

1962年下村修从维多利亚多管水母中提取并分离了GFP，证实了绿色荧光物质是一种蛋白质。它的溶液在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。

1969年之前称为绿色蛋白质（green protein）得名“绿色荧光蛋白”。

1974年研究发现光蛋白和GFP两种分子之间会发生能量转移（图2）。

1979年下村修找到了GFP中的生色基团（Chromophore）（图3，图5）。

1985年普腊石（Douglas Prasher）根据蛋白质的氨基酸顺序拿到了光蛋白（水母素）的基因。

1992年普腊石拿到了GFP的基因。

1993年GFP中生色基团的结构被确认。

1994年沙尔菲通过大肠杆菌和线虫研究获得了GFP的生色机理；是年，第一种蓝色荧光蛋白被报道，并提到了它可用于荧光共振能量转移（FRET）实验中。

1995年研制出了增强型绿色荧光蛋白（EGFP），它的转录速度比野生GFP快四倍。

1996年得到了野生GFP和EGFP的晶体结构，钱永健在EGFP的基础上，利用突变技术，设计并研制出黄色荧光蛋白。

1997年光蛋白和GFP被用于Ca²⁺的敏感指示剂。

1999年后各种各样的荧光蛋白被发明、改造并用于科学研究。

在研究GFP的50多年间，2008年诺贝尔化学奖的三位得主做出了至关重要的贡献。

2下村修与维多利亚水母

在下村修以前就有人研究过生物发光现象，例如萤火虫发出荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化氧化底物分子荧光素（luciferin）以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修的研究。

1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了维多利亚多管水母中的发光蛋白—水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班前，他将产物倒进水池里。临出门前关灯，回望了一眼水池，见到水池闪闪发光。因为水池也排放有养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响了光蛋白。然而不久之后，他便确定钙离子能增强光蛋白发光。

1963年，他和另一位研究者约翰森在《科学》杂志报道钙和光蛋白发光的关系。其后Ridgway和Ashley提出可以用光蛋白来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，光蛋白成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。

其实早在1955年，Davenport和Nicol就发现水母可以发出绿光，但不知其因。在1962年下村修和约翰森在那篇纯化光蛋白的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，通过纯化他们得到了这种蛋白，当时称之为绿色蛋白，即现在所谓的称绿色荧光蛋白。Morin和Hastings提出光蛋白和GFP之间可以发生能量转移。光蛋白在钙刺激下会发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光（图2）。

GFP是一种酸性球状蛋白质，它的发射光谱在505 nm具有吸收峰；激发光谱则在395 nm和470 nm具有吸收高峰（图4）。

只有完整的GFP分子才会产生生物荧光，但与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为生色基团的部位。在GFP的初级氨基酸序列上，第65个至第67个氨基酸（Ser-Tyr-Gly）形成环状六肽三体，以共价键与GFP蛋白肽键骨架相连（图5）。生色基团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧存在的条件下，酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸，并环化形成六肽，这可能是形成色基的必然过程。下村修最先推导了水母GFP色基结构，后来又进行了进一步验证与修改。

下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。但他的研究却切切实实地对之后的生物科学起到了革命性的作用。当他离开普林斯顿到Woods Hole海洋研究所后，他的同事普腊石（Douglas Prasher）对生物示踪分子非常感兴趣。1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了光蛋白的基因（准确地说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物学研究者就能很好地应用它，比使用蛋白质更为方便。

1996年，GFP的晶体结构也被研究得到，它是一个由11个β－折叠的蛋白质以一个α－螺旋蛋白质为中心轴所形成的笼状圆柱体，生色基团是α－螺旋蛋白质的重要组成部分，它的位置非常接近这个笼状圆柱体的中心位置（图6）。另一种平面的GFP表示方式如图7，其中绿色的代表β－折叠，红色的代表α－螺旋。

3沙尔菲将GFP应用于生物示踪

将GFP表达到其他生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的沙尔菲实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。

沙尔菲在之前的工作中一直和Caenorhabditis elegans（一种被广泛用于生物研究的线虫）打交道。C. elegans这种线虫只有959个细胞的一个脑，并且其三分之一的基因和人类基因有关。更重要的是，C. elegans是透明的，研究人员可以很方便的应用显微镜对其进行观察研究。

1988年当沙尔菲得知GFP后，他意识到可以使用这一工具对C. elegans进行研究，它可以作为变化的绿色信号对线虫不同细胞间的活动进行示踪观察。他将GFP基因与其他不同基因结合成可发出荧光的蛋白质的想法付诸于实践后，就能观察到细胞中不同蛋白质的形成。

沙尔菲使用DNA技术，将GFP的基因作为一个片段注射到成熟的线虫的性腺细胞核中（图7A），由于线虫是雌雄同体，它可以使自已受精。GFP基因就出现在它的卵中（图7B），这些卵分裂后形成新的细胞核在紫外光照射下可发出荧光（图7C和D），图7E中显示了两个这样的细胞核。

光蛋白和GFP都有重要的应用，但光蛋白是荧光酶的一种，它需要荧光素才能发光，而GFP蛋白质本身即能发光，在原理上有重大突破。在上世纪90年代，科学家一般认为荧光物质在细胞中是通过许多步骤得到，每一步都需要蛋白质来控制，并且此过程需要一些特殊的蛋白质（荧光素）来产生GFP中的生色基团。但沙尔菲用实验证实了这个假设是错误的。沙尔菲的研究向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的示踪分子的作用。

当时沙尔菲的论文引起了巨大轰动，很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，其实不过是跟风性质，没有原创性。

将GFP用作示踪分子，具有以下优点：①荧光稳定；②检测方便；③无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制；④GFP对受体细胞基本无毒害；⑤由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果；⑥不需任何反应底物和辅助因子；⑦可制成永久标本；⑧灵敏度高。

尽管GFP作为报告基因或示踪分子有许多优点，但野生GFP发出的荧光较弱。其次，荧光反应不是酶反应，不能通过添加某些物质来加强信号，且不易对荧光进行定量检测。另一方面，GFP基因在植物细胞内的表现频率并不高，甚至在某些植物细胞中并不表现。所以有更多的科学家对GFP进行了改进。

从1961年到1974年，下村修和约翰森的研究遥遥领先，而很少被人注意。在1974年以后，特别是八十年代后的后继工作，很多研究生都能够完成。其中例外的是钱永健所在实验室所发现的变种出现新颜色，这一发现却非显而易见。

4钱永健改造并发展了GFP的应用

随着生物信息学、定点突变，DNA－shuffling等一系列理论和技术的应用，绿色荧光蛋白的家族成员不断扩大，出现荧光光谱、温度敏感性等改变的多种变异型。具有不同光谱特性的GFP突变体的获得拓宽了GFP的应用范围，解决了许多单独运用GFP不能解决的问题。GFP基因的改进目前主要通过以下几个途径得到突变体GFP：①更换GFP生色团氨基酸；②改变碱基组成；③除去GFP基因中隐蔽剪接位点；④插入植物内含子；⑤更换强启动子等突变体GFP；⑥增加荧光强度和热稳定性。

目前已有的具不同光谱的突变型有EBFP（增强型蓝色荧光蛋白）、ECFP（增强型青色荧光蛋白）、EGFP（增强型绿色荧光蛋白）和EVFP（增强型黄色荧光蛋白），分别呈现蓝、青、绿、黄四种颜色。至今所获得突变型的最大发射波长为529nm，为黄绿色荧光。

钱永健是和下村修研究相关的一位重要科学家。从八十年代一开始，他的工作就非常引人瞩目。同时他十分肯定下村修的工作，较早公开介绍下村修的发现。在他的研究工作中，有两项重要工作都与下村修有一定联系。

一项是研究钙染料。1980年钱永健发明检测Ca²⁺浓度的染料分子，1981年改进了将染料引入细胞的方法，以后发明了更多、更好的染料，被广泛地应用。检测钙的方法有三种：选择性电极、光蛋白、钙染料。在钱永健研制的钙染料没有出现以前，具有空间检测能力的只有光蛋白，但当时光蛋白需要注射到细胞内，应用不方便。钱永健的钙染料可以通透到细胞里面去。

钱永健的第二项工作是研究GFP。1994年起，钱永健开始研究并改造GFP，并获得了多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种。改造后的GFP促进了生色基团的折叠，改善了其荧光特性，甚至可以得到红色、黄绿色、蓝色等多种颜色的荧光蛋白，有的可激活、可变色，大大拓宽了GFP研究的领域。他被公认为这方面的先驱。

钱永健对人们理解GFP及GFP族的化学荧光特性做出了重要的贡献，他使不同的GFP产生的荧光颜色覆盖了整个可见光谱，同时他改善了生色基团，增强了GFP的荧光效应，也使荧光的稳定性增强。他发展了GFP，使之成为极有效的研究动态生命过程的基因标记工具。

5结束语

科学上一个偶然的发现往往会引起巨大的科学革命，新工具的出现会使研究取得意想不到的新成果。当年下村修研究了GFP，但他并没有意识到GFP重要的应用前景。沙尔菲恰恰在自己的实验研究过程中采用了最新的GFP研究成果，并发展了GFP的应用领域。而当今世界上用的GFP大多数是钱永健实验室改造后的变种。

获得2008年诺贝尔化学奖的三位科学家在发现和研究GFP的过程中各有贡献，而且可以看出他们的研究是一脉相承的。随着分子生物学理论与技术的发展，对GFP研究的进一步深入，GFP在分子生物学领域的应用进一步加强。GFP工程，包括GFP蛋白工程和GFP基因工程，尤其GFP基因作为新型报告基因越来越受到关注。当然在应用GFP作为研究工具时，也遇到了一些问题。例如将GFP作为选择标记基因成功构建多种表达外源基因的重组质粒时发现一些因素影响着GFP的检测。此外，在细胞生物学的研究过程中发现新生GFP通过折叠和加工成为具有活性的形式过程十分缓慢。但随着生物技术的发展，对GFP的基础理论研究的进一步深入和新型突变体的不断出现，有理由相信这些问题终将会得到解决，从而使GFP更好地为科学研究服务。

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荧光蛋白基因 篇4

成纤维细胞灶的形成是IPF关键的病理改变,其主要效应细胞是成肌纤维细胞[6]。目前大多数学者认为,损伤的肺泡上皮细胞通过上皮细胞-间质转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是肌纤维细胞的主要来源[6]。EMT的过程表现为上皮细胞标志物的消失,转而表达间质细胞标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)[7]。

α-SMA基因表达的异常激活与调控在肺泡上皮细胞向成肌纤维细胞转分化的过程中占有极为重要的地位,在EMT过程中细胞如何启动和调控α-SMA基因的表达尚未明了。为了探讨肺泡上皮α-SMA基因在肺纤维化微环境下的转录激活,本课题组构建了由α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告载体,并在肺泡上皮细胞中进行表达和定位。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

人肺泡上皮细胞A549细胞株、大肠杆菌DH5α、VSMp8质粒(含小鼠α-SMA启动子序列)由本校实验室保存;质粒微量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒(优晶公司);红色荧光蛋白报告质粒空载体pDs-Red(Clontech公司);限制性核酸内切酶(宝生物公司);Lipofactine 2000转染试剂(Invitrogen公司);重组人TGF-β1(R&D公司);倒置荧光显微镜(德国Leica公司);凝胶成像系统(美国Kodak公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 α-SMA启动子红色荧光报告载体pDs-Red-SMAp的构建

已知α-SMA启动子区是插入在质粒VSMp8多克隆位点BamHⅠ和sphⅠ之间,用BamHⅠ和sphⅠ内切酶酶切VSMp8得到启动子序列,将其插入pGEM-7Zf质粒的BamHⅠ和sphⅠ位点之间;然后用BamHⅠ和ApaⅠ内切酶酶切再次得到α-SMA启动子序列;继而将启动子序列亚克隆于pDs-Red的BamHⅠ和ApaⅠ位点之间;最终得到重组质粒pDsRed-SMAp。重组子经BamHⅠ和ApaⅠ双酶切鉴定、测序鉴定无误后,扩增备用。

1.2.2 细胞培养

A549细胞株培养在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,常规培养于5%的CO2、37℃人工培养箱。

1.2.3质粒转染

转染前1天,将A549细胞以1.5×104/mL细胞密度接种于24孔板,待24孔培养板中细胞融合至70%～80%时,依照Lipofectine 2000转染试剂的操作指南进行转染。

1.2.4 实验分组和TGF-β1刺激

实验分为4组,A组:转染对照空载体质粒pDsRed组;B组:转染对照空载体质粒pDsRed+TGF-β1组;C组:转染重组质粒pDsRed-SMAp组;D组:转染重组质粒pDsRed-SMAp+TGF-β1组。需用TGF-β1刺激的组,分别于转染后12 h加入终浓度为10μg/L的TGF-β1刺激4 h,在荧光显微镜下观察细胞内红色荧光蛋白表达。上述实验重复3次。

2 结果

2.1 pDsRed-SMAp重组载体的酶切鉴定

pDsRed-SMAp重组载体经BamHⅠ和ApaⅠ双酶切,凝胶电泳可见切出约4.1 kb和3.7 kb的两个片段,所得酶切片段与设计相符(图1)。

2.2 pDsRed-SMAp重组载体的测序鉴定

经上海生工生物工程有限公司T7通用引物测序,结果与预期序列完全一致,DNA序列和读码框完全正确。

2.3 pDsRed-SMAp红色荧光报告载体在上皮细胞中的表达

A组细胞转染红色荧光蛋白表达空载体质粒pDsRed,在荧光显微镜下该组肺泡细胞中未观察到红色荧光蛋白(图2A)。B组为转染了空载体质粒pDs-Red的细胞在TGF-β1刺激4 h以后,依然不能在荧光显微镜下观察到红色荧光(图2B)。C组细胞是转染α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,在镜下后可见到少量而微弱的红色荧光,但是表达荧光的细胞数量少,细胞呈颗粒状,缺少正常细胞形态(图2C)。D细胞在转染α-SMA启动子红色荧光报告载体12 h后加TGF-β1刺激4 h,在荧光显微镜下则可观察到细胞发出高亮度的红色荧光,表达红色荧光的细胞数量较多,细胞形态呈铺路石状贴壁生长,与正常的肺泡上皮细胞形态一致(图2D)。上述实验共重复3次,结果一致。

3 讨论

传统的观点认为特发性肺纤维化是由慢性炎症引起的,因此予以皮质激素和细胞毒性药物治疗IPF,可以抑制炎症造成的肺组织损伤,从而减轻和治疗肺纤维化[8,9]。但是临床治疗表明,使用糖皮质激素和细胞毒性抗炎治疗对于IPF无明确的疗效,并且许多确诊为IPF的病例中发现其病理组织炎性反应较轻微。近年来的研究表明,IPF的病理改变是由肺泡上皮细胞的损伤造成,反复的损伤刺激导致肺泡上皮细胞转分化为表达α-SMA的成肌纤维细胞,发生EMT。成肌纤维细胞由于其表达间质细胞标志物α-SMA,从而具有了收缩性,并且可以分泌大量的细胞外基质(ECM)沉积在肺组织中,成为IPF的主要效应细胞[10]。

TGF-β被认为是诱导器官纤维化(包括肺纤维化)的“总开关”,是促EMT作用最强的细胞因子,可以启动并完成整个EMT过程[10]。无论是离体实验或在体实验均证实,过表达的TGF-β能促进肺泡上皮细胞转分化,表达间质细胞标志蛋白α-SMA,加重肺纤维化[11,12,13]。因此,深入研究TGF-β诱导作用下上皮细胞α-SMA的分子调控机制对阐明IPF过程中肺泡上皮细胞发生EMT的病理机制非常重要。

红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)是海葵中分离出来的一种生物发光蛋白,能够在紫外线激发下发出红色荧光[14]。而本研究所采用的DsRed是Clontech公司商业化的一种低毒、低寡聚化及成熟快的红色荧光蛋白突变体[15]。由于荧光蛋白基因可以在未受任何损坏的活体细胞中检测其表达,DsRed被广泛地应用于报告基因的研究。报告基因技术是将一段顺式调控序列插入报告基因上游以控制报告基因的表达,从而直观地“报道”该顺式调控序列的表达调控以及与其相关信号转导通路的活动[16]。DsReD具有很高的消光系数和荧光量子产量,用作报告基因具有荧光亮度高的优势;DsReD发射荧光的强度要比罗丹明B等染料和最好的GFP突变体高得多;DsReD具有较强的抵御光漂白的能力;另外,DsReD对pH值不敏感,pH范围4.5～12时仍保持稳定,这使其使用范围更加广泛。同时,DsReD除了可在活体细胞连续观察的优点,较少受到外来荧光干扰,灵敏度与信噪比高[17]。

本研究构建的α-SMA启动子红色荧光报告载体pDsRed-SMAp是将α-SMA启动子序列插入红色荧光报告基因上游,通过紫外线激发检测红色荧光的强弱,从而示踪α-SMA启动子在活体细胞中的活化情况,对启动子的表达调控进行评估。本研究将成功构建的pDsRedSMAp重组质粒在人肺泡上皮细胞内进行转染后发现,在静息的上皮细胞可见到少量而微弱的红色荧光,但是表达荧光的细胞数量少,细胞呈颗粒状,缺少正常细胞形态,因此可以推测这些微弱的荧光并非由活体的上皮细胞发出,有可能是死亡细胞产生的非特异性荧光。说明在肺泡上皮细胞中缺乏α-SMA的表达,与既往研究结果一致。而在1 0 μg/L的TGF-β1刺激4 h后,可在荧光显微镜下观察到由α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白基因高水平表达,发出高亮度的红色荧光,表达红色荧光的细胞数量较多,细胞形态呈铺路石状贴壁生长,与正常的肺泡上皮细胞形态一致。表明在TGF-β1的刺激下诱导了α-SMA启动子活化,所构建的α-SMA启动子驱动的红色荧光报告基因系统具有完整的细胞内功能。

综上所述,本研究成功构建了α-SMA启动子红色荧光报告载体pDsRed-SMAp,具有稳定性好、荧光持续时间长、不破坏细胞结构及直接观察等优点,为研究肺纤维化EMT病理过程中α-SMA的基因调控提供了有效的工具。

摘要：目的 构建α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具。方法 克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp;用脂质体瞬时转染上皮细胞A549,观察α-SMA启动子对转化生长因子(TGF-β1)刺激的反应。结果 酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体;该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低,经TGF-β1刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论 成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究。

荧光蛋白基因 篇5

正常情况下, 生物体内的p53蛋白水平维持在较低水平, 当细胞出现DNA损伤或者低氧刺激时, p53蛋白就会大量表达并通过三种方式应答DNA损伤, 激活p21基因的表达引起细胞周期阻滞, 激活DNA修复相关基因的表达, 但如果损伤过度, p53基因就会激活促凋亡基因的表达诱导细胞凋亡。因此, p53蛋白的表达水平和转录活性的提高, 是细胞出现DNA损伤的一种重要表现形式。在此理论基础上, 可以构建由p53或p53靶基因的启动子驱动的荧光虫荧光素酶表达载体, 辅以海肾荧光素酶报告基因载体 (如p RL-CMV) 作为内参质粒转染到细胞中, 观察具有遗传毒性的化学物质对荧光素酶报告基因表达的诱导性, 从而检测化学物质遗传毒性。

2 双荧光素酶报告基因系统在信号通路研究中的应用

双荧光素酶报告基因系统常被运用于研究p53信号通路及NF-k B信号通路。P53信号通路在1中已作阐述, 通常构建由p53或p5 3靶基因的启动子驱动的荧光虫荧光素酶表达载体并转染到细胞系中, 在此基础进行p53信号通路相关的研究。N F-k B即核转录因子, N F-k B信号通路核心成分是Ik B激酶复合物、Ik B抑制蛋白和NF-k B二聚体。当细胞受到来自胞内外的刺激后, Ik B蛋白降解, NF-k B二聚体释放。释放后的二聚体被进一步激活后转移至细胞核与目的基因结合以促进目的基因的转录[3]。Ja Shil Hvun等构建由NF-k B基因启动子驱动的p GL 3-lu c载体, 瞬转到人结肠癌细胞Caco-2中, 用镉处理细胞后研究依赖NF-k B信号通路激活的白介素-8的产生情况[4]。

3 双荧光素酶报告基因系统在转录活性分析中的应用

某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序 (顺式作用元件) 共价结合, 从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。王健等通过萤火虫和海肾双荧光素酶分析了PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性[5]。Naoko MATSUO等通过测定荧光虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因在高等植物中的表达来监测瞬态基因的表达情况[6]。Jason W.Harger等在酵母表达载体上的海肾和萤火虫报告基因之间插入移码信号, 通过检测这两种蛋白的活性来研究啤酒酵母中的移码编程 (progra mmed frameshifting) [7]。

4 双荧光素酶报告基因系统的发展

与传统的共报告基因 (比如CAT, β-Gal, GUS) 相比, 萤火虫双荧光素酶报告基因系统更加灵敏, 有望把可能削弱实验准确性的内在因素的变化降到最小, 而且报告基因的检测极为快速 (30s内完成测试) 、简便。常用的检测双荧光素酶报告基因的试剂盒是Promega公司提供的E1910等试剂盒, 能够定量检测到萤火虫荧光蛋白和海肾荧光蛋白的表达, 为与双荧光素酶报告基因载体相关的实验研究提供了极大的便利, 这将会促进双荧光素酶报告基因系统在更广更深的领域发挥空间。

摘要：双报告基因即在一个信号系统内同时表达, 但独立测量的两个荧光酶的报告基因。在双报告基因系统中, 一个报告基因活性的改变, 与基因表达的特定实验条件相关, 而另个报告基因的组成型活性则提供内对照, 使实验值正态化。目前很多实验都采用了荧光素酶报告基因 (Luc) , 但从检测速度、灵敏度和线性范围来考虑, 双荧光素酶即萤火虫荧光素酶 (firefly luciferase) 和海肾荧光素酶 (Renilla luciferase) 的组合, 可以较好地体现检测结果的精确性。本文以萤火虫双荧光素酶报告基因系统为重点, 综述了该报告系统的特点、应用和近年来的研究进展。

关键词：双报告基因,萤火虫荧光素酶,海肾荧光素酶

参考文献

[1]Sherf, B.A.et al., Dual-Luciferasereporter assay:An advanced co-re-porter technology integrating fireflyand Renilla luciferase assays[G].Promegan ot e s, 19 9 6, 57:2-9.

[2]薛丽香, 童坦君, 等.报告基因的选择及其研究趋向[J].生理科学进展, 2002, 33 (4) :364-366.

[3]L.A.J O'Neilla, C.Kaltschmidtb, NF-kB:a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function[J].Trends in neurosciences, 1997, 20 (6) :252-258.

[4]Ja Shil Hyun et al.Cadmium induces Interleukin-8production via NF-kB activation in the human intestinal epi-thelial cell, Caco-2[J].Cytokine, 2007, 37:26-34.

[5]王健, 周建光, 等.PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性分析[J].癌症, 2002, 21 (11) :1187-1191.

[6]Naoko MATSUO et al.Dual Luciferase Assay for Monitoring Transient Gene Expression in Higher Plants[J].Plant Biotechology, 2001, 18 (1) :71-75.

荧光蛋白基因 篇6

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验稻谷是由中国科学院亚热带农业生态研究所开发的转Bar基因抗除草剂水稻 (Bar68-1) , 基因转入方法为基因枪法, 外源基因拷贝数为2[6]。

1.2 含不同比例转Bar基因稻谷样品

将转Bar基因稻谷 (Bar68-1) 和非转基因稻谷 (Xiang125S) 在同等条件下 (相同的粉碎机、相同的粉碎时间) 粉碎后, 全部通过100目筛, 用分析天平分别称取不同重量粉碎产物按照重量比配制成含30%, 20%, 10%, 5%, 0.9%, 0.5%的转Bar基因稻谷的样品, 混合均匀。用于转Bar基因水稻的RT-PCR定量检测准确性的验证。

1.3 仪器设备与试剂

仪器:Roter-Gene-3000型实时荧光定量PCR仪, Gorbett research公司, 澳大利亚;

试剂:SYBR Premix Ex TaqR Ta Ka Ra (日本宝生物) , 中国大连。

1.4 样品DNA的提取

本研究采用改进的CTAB法提取DNA分子, 样品为稻谷粉碎产物, 每组样品分别做三个重复以提取DNA分子, 改进的CTAB法试剂配制及操作步骤参照许文涛等[7]方法。

1.5 荧光定量PCR引物及扩增条件

本研究选择两个水稻基因, 蔗糖磷酸合成酶基因 (sucrose phosphate synthase, SPS, 基因Bank号:U33175) 和水稻特有的淀粉分支酶基因 (rice starch branchingenzyme 4, RBE4, 基因Bank号:AB023498) 作为内参基因, 这两个基因在水稻基因组中均为单拷贝基因, SPS基因引物参照杨立桃等设计[8], RBE4引物序列参照Soon-Chun Jeong等[9]设计。根据转Bar基因水稻中转入的外源基因盒, 分别选择Bar基因和Ca MV35s启动子作为目的基因。基于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR的要求设计引物进行PCR扩增, 引物设计采用Primer Premier5.0软件设计, 引物序列及扩增片断长度如表1。引物由Ta Ka Ra (日本宝生物, 大连) 公司合成。

荧光定量PCR为20μL反应体系, 10μL SYBR Green I荧光结合染料的混合液, 引物浓度分别为1.0μmol/L, 一定量的模板DNA, 最后用灭菌超纯水补齐至20μL。空白对照以超纯水代替模板DNA。

定量PCR反应在Roter-Gene-3000型实时荧光定量PCR仪上进行, 采用两步法进行PCR反应, PCR反应条件:60℃保温15 s, 预变性为95℃, 60s, 变性94℃20s, 退火20s, 延伸72℃20s, 其中Bar、Ca MV35s、SPS、RBE4基因的退火温度分别是59℃、60℃、60℃、60℃, 循环次数均为40, 熔解曲线的温度范围设置为65℃到95.0℃。每个DNA样品对应的每个基因分别做两个重复。

1.6 荧光定量PCR反应标准曲线的制作

荧光定量PCR的标准曲线用100%含量的转Bar基因稻谷 (Bar68-1) 基因组DNA制作, 本研究将纯化的转Bar基因稻谷DNA模板用灭菌蒸馏水按5倍逐级稀释成5个浓度梯度, 然后把每一个梯度的DNA模板做两个平行进行荧光定量PCR扩增, 分别作出Bar, Ca MV35s, SPS, RBE4四个基因的标准曲线, 扩增体系与条件同1.5。

2 数据统计与分析

荧光定量PCR定量检测试验结束后, 分别将样品中各基因的CT值带入标准曲线公式中算出该基因在样品中的初始拷贝数, 然后将计算所得内参基因 (RBE4, SPS) 和外源目标基因 (Bar, Ca MV35s) 的初始拷贝数应用公式:

计算样品转Bar基因水稻的混入率, 其中, 重组基因拷贝数和内源基因拷贝数之比是指样品中初始重组基因拷贝数与内源基因初始拷贝数之比。内标比是基因组中内源基因拷贝数与外源基因拷贝数的比值, 本试验所用的转Bar基因水稻Bar68-1中转入的外源重组基因 (Bar, Ca MV35s) 的拷贝数为2, 而内源基因 (SPS, REB4) 拷贝数为1, 但由于水稻内参基因SPS和RBE4是纯合二倍体, 而转基因当代的外源基因一般不是纯合的, 因此内标比为1。所得结果用Excel软件整理分析。

3 试验结果

3.1 四种基因RT-PCR荧光定量标准曲线分析

注:其中SPS0, REB40, Bar0, Ca MV35s0分别表示各基因的初始拷贝数

本研究分别选取了两个水稻自身基因 (SPS基因, RBE4基因) 和两个外源基因 (Bar, Ca MV35s) 作为转基因作物荧光定量检测的内参基因和外源基因。采用经纯化的Bar68-1稻谷基因组DNA为模板制作各基因的标准曲线。应用5倍稀释制作荧光定量PCR标准曲线结果如表2所示, 各标准曲线的相关系数均达到0.99以上, 说明四个基因的标准曲线已经满足了荧光定量的标准曲线的精度要求。四种基因扩增曲线如图1。四种基因的熔解曲线如图2所示, 熔解曲线是RT-PCR扩增特异性的反映, 这四个基因的熔解曲线均呈单峰型, 说明在PCR扩增过程中, 没有出现非特异性扩增, 由此推断设计的四对定量PCR引物均具有较好的特异性。

3.2 不同比例转Bar基因稻谷的结果

表3列出了四种不同内参和外源基因组合条件下, RT-PCR法对于转Bar基因稻谷定量检测的结果。从结果可见, RT-PCR法可以实现对于高含量 (大于5%) 的转Bar基因水稻组的准确定量检测, 所有基因组合的检测结果误差范围大多处于20%以内。而定量检测结果误差主要以5%, 0.9%, 0.5%转Bar基因稻谷含量组误差最大, 且含量越小误差越大, 四种基因组合对于0.5%含量组的检测结果误差范围均大于25%。综合四种不同的内参和外源基因的组合的定量检测误差分析, 表明SPS/Ca MV35s两个基因组合的误差范围相对小于其它三组。

4 讨论

4.1 荧光定量PCR法的内参基因和外源基因的选择

本研究中, 转基因作物定量检测的内参基因分别选择了水稻蔗糖磷酸合成酶基因和水稻淀粉分支酶基因, 这两个基因在水稻基因组中均为单拷贝基因, SPS基因在检测水稻某些特异基因的表达量及转基因水稻检测等方面获得了广泛应用[8,10]。淀粉分支酶基因是一种水稻特异性基因, Soon-Chun Jeong等将其应用于转基因水稻的实时PCR定量检测获得了较高准确性[9]。本研究通过对转Bar基因水稻两种内参基因, 两种外源基因的定量检测, 分别进行相对比较, 选择出一对相对准确的检测转Bar基因水稻的内参和外源基因的组合。

4.2 荧光定量PCR法的定量检测结果

目前, 欧盟对食品和饲料中转基因成分的含量规定了严格的标准, 要求食品和饲料中的转基因成分不能超过0.9%, 超过了这个界限就需要进行标识[11]。因此, 本研究按照欧盟的标准, 设计了最低含量为0.5%转Bar基因稻谷的混合稻谷, 用实时PCR法检测转基因水稻的含量, 以验证该法的准确性。

研究结果认为基于RT-PCR法能较准确的检测转Bar基因水稻的含量, 可以作为转Bar基因水稻定量检测的可信方法之一, 本研究中的试验样品采集过程一致, 并且在同等条件下粉碎后严格按照比例进行混合, 因此所用的样品具有较好的均一性。但在实际生产条件下, 由于试验样品采集的误差, 或不同品种的作物混合后, 由于两者物理性质的不同而引起粉碎粒度的差异, 从而导致DNA抽提的不均一, 都将造成转基因作物检测结果的巨大误差[12]。Knut等使用某种转基因大豆进行转基因大豆定量检测, 其转基因含量按重量算是10%, 如果按照DNA比例来计算, 转基因含量约为12%, 二者略有差异[13]。这种差异可能是由于食品中转基因和非转基因组分单位重量材料里面含有不同量的DNA所致。一般认为最佳的定量PCR方法通常被认为存在25%的不确定性。因此, 韩国对转基因作物定量检测误差的可接受范围为20%[14]。可见, 本研究结果所表明的以SPS为内参基因, Ca MV35s为外源基因的组合对转Bar基因水稻Bar68-1的定量检测结果可信度较高, 除0.5%组以外, 各组误差均在20%以内, 符合对转基因作物定量检测的误差要求。

研究发现, RT-PCR法对于转Bar基因稻谷定量检测的结果的准确性随着转基因稻谷含量的降低而降低, 其原因可能与采样时样品的混合均匀度有关, 对于含转基因稻谷越低的混合稻谷样品, 其混匀的程度会给采样的准确性带来较大的误差, 特别是对于检测目标在样品中含量较低的待检样品, 采样的误差会给检测结果造成较大的影响[15]。此外, 基因组DNA抽提的过程中也可能会给定量检测的结果带来较大的误差, 因为转基因稻谷含量低组中外源基因的含量较低, 抽提过程中较小的降解都会给定量检测结果带来巨大误差[16,17]。

4.3 荧光定量PCR法的定量检测的局限

RT-PCR法是目前常用的转基因作物定量检测的方法之一, 许多转基因作物的实时PCR定量检测方法都被建立了起来[4,14,18]。但是, 实时PCR方法准确定量检测食品或饲料中转基因成分的前提条件是明确该作物转入基因片段在基因组中的拷贝数。然而, 在实际情况下, 食品或饲料中可能含有多种不同的转基因作物, 而这些转基因作物的外源基因片段资料又很难明确, 因此实时PCR法定量检测转基因成分的技术应用还有很大的局限性, 仅限于单一作物品种, 且所含的转基因成分背景明确的前提之下。此外, RT-PCR法是针对转基因作物的外源基因和内源基因片段进行检测的方法, 准确定量的前提是存在完整的重组和内源基因片段, 因此, 对于经过高温高压或其它特殊手段加工的含转基因作物的样品可能发生基因片段的降解而影响定量的准确性, 甚至无法进行RT-PCR的定量检测。

5 结论

5.1 RT-PCR法可作为稻谷中转Bar基因水稻定量检测的可信方法, 以SPS/Ca MV35s组合可获得相对较准确的检测结果。

5.2 RT-PCR法定量检测的准确性随混合稻谷中转Bar基因水稻含量的提高而提高。

荧光蛋白基因 篇7

1 材料

1.1 试验材料

银狐肌肉组织, 采自河北金岛彩狐养殖场。

1.2 引物

于吉林大学畜牧兽医学院分子遗传实验室, 采用微卫星富集文库法筛选获得微卫星位点, 引物序列见表1, 每个位点的正向引物末端均添加通用引物M13 (-21) , 引物序列为5′-TAAAACGACGGCCAGT-3′[9], 对用引物M13 (-21) 的5′末端进行HEX荧光标记, 所有引物序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2 方法

2.1 PCR扩增

采用蛋白酶K和苯酚抽提法从银狐肌肉组织中提取基因组DNA, 以基因组DNA为模板进行第1轮PCR扩增, 反应体系 (25 μL) :10×Taq Buffer 2.5 μL, 0.1 mmol/L dNTPs 1 μL, 10 pmol/L正、反向引物各0.25 μL, 0.5 U Taq酶, 模板DNA 0.2 μL (5 ng) , 加ddH2O至25 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共20个循环;72 ℃延伸10 min。

第2轮PCR扩增, 反应体系 (25 μL) :除用第1轮PCR扩增产物0.2 μL和荧光标记的通用引物M13 (-21) 分别替代第1轮PCR反应中的基因组DNA和正向引物外, 其他成分保持不变。将PCR反应条件由20个循环改为30个循环, 其他条件不变。

2.2 PCR产物的检测

第2轮PCR扩增产物经变性处理后用ABI 3730 DNA测序仪毛细管电泳, 采用Genemapper 4.0软件和GeneScan-500分子内标计算等位基因大小。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增

在第1轮PCR扩增中, 以银狐基因组DNA为模板, 对微卫星位点的正向 (添加通用引物) 和反向引物进行PCR扩增;而在第2轮PCR扩增中, 以第1轮PCR产物为模板, 对荧光标记的通用引物和微卫星反向引物进行PCR扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示, 7个微卫星位点在5个个体中均得到特异性扩增, 扩增大小与预期大小相符, 图1为微卫星位点VVM149的扩增结果。

M.DL-2 000 Marker;1～5.5个个体PCR扩增产物。

3.2 PCR产物的检测

检测结果表明:PCR扩增产物出现特异性荧光峰值, 部分结果见图2。利用GeneScan-500分子内标计算等位基因的相对大小, 结果在所检测的5个个体中, VVM564 、VVM120 、VVM788、VVM220 4个微卫星位点呈多态性, 而VVM566、VVM149、VVM73 3个位点呈单态性 (见表2) 。

4 讨论

荧光标记通用引物法是多个微卫星位点利用同一个荧光标记引物, 通过PCR扩增将扩增片段进行荧光标记, 从而降低多位点检测时特异性引物标记的费用。针对某一特定微卫星位点来说, 荧光标记通用引物法需要3种引物, 即正向嵌合引物 (5′末端增加了一段与靶基因组不配对的通用引物序列) 、反向引物 (与靶基因组完全配对) 和带有荧光标记的通用引物, 试验采用通用引物M13 (-21) , 以HEX进行荧光标记。

采用荧光标记通用引物法进行微卫星位点PCR扩增时, 通常有种2种PCR扩增方式, 即三引物PCR法 (也称为巢式PCR法) 和二步PCR法。三引物PCR法是在同一个PCR反应中同时加入上述3种引物, 其中反向引物与通用引物的量相等, 但正向嵌合引物的量低于其他2种引物, 其摩尔数一般为1/4。PCR反应条件分为2个阶段:前30个循环的退火温度为56 ℃, 最后8个循环的退火温度为53 ℃, 在首轮PCR反应开始后, 正向嵌合引物和反向引物进行目的片段扩增, 同时将18 bp的M13 (-21) 序列引入扩增产物中, 多轮PCR反应后, 随着扩增产物的累积, 正向嵌合引物越来越少, 这时降低退火温度至M13 (-21) 的最佳退火温度 (53 ℃) , 反向引物和M13 (-21) 引物将以扩增产物为模板进一步扩增, 从而将荧光标记融入PCR产物中, 为PCR产物的基因分型提供了条件[9]。二步PCR法是采用2次PCR扩增, 第1次是利用正向嵌合引物和反向引物进行PCR扩增, 然后以第1次PCR扩增产物为模板, 采用通用引物和反向引物进行第2次PCR扩增, 荧光标记PCR产物用于基因分型[11]。三引物PCR法比二步PCR法操作简单, 但PCR扩增效果特别是正向嵌合引物与反向引物的浓度比对PCR扩增效果和PCR产物的荧光标记效率具有重要影响, 因此需要反复摸索不同微卫星位点的最适引物浓度[10]。二步PCR法操作相对繁琐, 但一般不用于探索和优化PCR引物浓度及反应条件, 而且荧光标记效率有保障。

试验采用二步PCR法对5只银狐的7个微卫星位点进行了基因分型, 试验结果表明:荧光标记通用引物法是一种经济有效的检测方法, 大大降低了试验成本, 因为对所有位点来说, 只需在18 bp处对通用引物的5′末端进行荧光标记, 特别是针对新微卫星位点的筛选。试验为下一步银狐、蓝狐及乌苏里貉新多态性微卫星位点的筛选奠定了基础。

参考文献

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荧光蛋白基因 篇8

1 材料与方法

1.1 标本来源

均来自本院2008年1月—2009年1月临床手术切除标本, 其中正常胃黏膜18例, 胃癌原发灶32例, 胃癌转移灶29例, 同时送病理组织切片, 其中有12例分别取了以上3种组织。所有标本均经病理诊断确认。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol购自美国Invitrogen公司。RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录 (RT) 试剂盒购自立陶宛Fermentas (MBI) 公司。PTC-200 PCR循环仪由美国MJ公司提供。LightCycler® 480高通量实时荧光定量PCR系统购自美国Roche Diagnostics公司。荧光定量PCR酶反应系统TaKaRa Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time) Code:DRRO39A由大连TaKaRa公司提供。

1.3 组织总RNA提取和cDNA的合成

Trizol法提取细胞总RNA, 紫外分光光度仪检测RNA的质量和浓度。取总RNA 3 μg进行逆转录反应, 步骤按操作说明书进行, 逆转录的cDNA置-20 ℃保存。

1.4 引物设计及合成

根据已知的Twist基因全序列04688546001和18 s tRNA全序列100008588, 将其递交至 UPL的在线分析设计中心http://WWW.universalprobelibrary.com, 分析得到的特异引物序列如下[4]:Twist基因上游引物为5’-GCGAATGTTTGAGGTGACAG-3’, 下游引物为5’-AGTTGGCCCATTGTTTGGT-3’。18 s tRNA:上游引物5’-GTTCTTAGTTGGTGGAGGGATTT-3’, 下游引物为5’-GGCTGAACGCCACTTGTCC-3’, 长度131bp。 Twist基因和18s tRNA引物均由上海生物公司合成。

1.5 实时定量RT-PCR分析 (水解TaqMan探针)

20 μl反应体系PCR扩增反Twist (10 μl Premix Ex TaqTM, 0.2 μl (20 μm) Left Primer, 0.2 μl (20 μm) Right Primer, 0.2 μl Probe, 8.4 μl H2O, 1 μl cDNA template) [5]:94 ℃预变性1 min, 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 40 s, 40个循环。反应结束时检测荧光信号, 冷却, 37 ℃ 1 s。以拷贝数的自然对数为坐标, 循环阈值 (Ct) 为纵坐标制作标准曲线。根据标准品建立标准曲线。为消除标本处理、逆转录和PCR反应差异, 做基因表达的相对定量时, 用18 sRNA在 cDNA样品中的表达量作为衡量cDNA浓度的内参, 样品间同一基因的相对表达量用以下公式计算:表达倍数=2-Δ (Cp) , 其中ΔCp=同一样品目的基因的Cp值-18 sRNA的Cp值, Δ (ΔCp值) =不同样品间ΔCp值的差值[5]。

1.6 统计学分析

采用SPSS 11.5软件分析结果, 采用配对t检验处理结果

2 结果与分析

2.1 提取的组织总RNA质量和纯度

Trizol法提去胃癌组织总RNA, 经紫外分光光度计监测A260/A280为1.871±0.061, 提示总RNA质量较好。

2.2 电泳检测PCR扩增产物

以cDNA为模板, 分别以Twist, 18sRNA上、下游引物进行PCR扩增和20 g/L琼脂糖凝胶电泳、Twist扩增目的片断和预计大小符合。

2.3 方法的稳定性测定

将5个不同稀释度[ (5.0×109) ～ (5.0×105) copies/ml]的标准品分5批次不同时间进行检测, 得到批CV%分别为2.05%、1.52%、1.56%、7.97%、12.38%;将上述标准品同批次各重复5管检测, 得到批内CV%分别为0.63%、0.96%、0.67%、3.17%、8.71%。

2.4 Twist基因在胃癌患组织中的表达

用上述方法, 对收集的标本进行实时荧光定量PCR定量测定。Twist在正常胃黏膜和原癌灶及转移组织中的表达水平差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示胃癌组织Twist表达上调;淋巴转移和腹膜转移组织的表上调的患者与病理确诊的胃癌病程有一定关系, 可提示该基因的的高表达可能与胃癌的病程发展有关 (表1) 。

3 讨论

Twist基因是一种在胚胎发育中起到调控作用的转录因子, 在诱导细胞移动及组织塑型中起重要作用[6]。新发现Twist具有癌基因的特征, 能编码凋亡抑制蛋白, Twist表达的显著上调可见于浸润性胃癌、乳腺癌 (小叶癌) 、肝癌等恶性程度高、侵袭性强的肿瘤亚型中, 但在正常组织和恶性程度低的癌细胞中并无表达[7]。一些学者因此推测Twist的激活可能是某些恶性肿瘤发生、发展和转移的重要因素[8]。Twist基因首先在果蝇中被发现, 随后相继在水母、小鼠及人类中被确认, 他们均能编码碱性的螺旋—环—螺旋DNA结合的转录因子, 在不同的种属之间其核苷酸和氨基酸序列高度保守。Twist在胎盘和中胚层来源的组织和细胞中高表达。不同研究表明, Twist蛋白对凋亡起调节作用[9]。

研究证实, Twist能够通过多种途径引起肿瘤的发生, 有抑制分化、阻断P53通路、阻碍N-Myc的促凋亡作用和抑制NF-B/TNF通路等, 从而发挥调亡作用[10], Twist也能诱导上皮细胞—间皮细胞的转变 (EMT) , EMT有助于上皮源性肿瘤细胞的侵袭扩散[11]。一些重要的基因如Twist, snail能够诱导EMT, 它们的共同特征是有能够识别靶基因启动子上的E-box程序的DNA结合序列。E-钙黏合蛋白介导的细胞与细胞黏附作用的丧失是肿瘤细胞侵袭与转移过程形成的原因。在体外, E-钙黏蛋白功能或表达的下调将使无侵袭能力细胞变得具有侵袭能力, 相反, 将E-钙黏蛋白cDNA转染入高侵袭性上皮肿瘤细胞系后, 其侵袭能力下降。

本研究发现, Twist蛋白普遍表达于胃癌中, 当胃癌发生转移时, 则表达明显提高。少数癌旁正常组织虽有弱表达, 而胃癌中表达强度明显高于癌旁正常组织, 二者的表达差异显著。说明Twist在胃癌的发生、发展过程中起到重要作用, 与肿瘤的侵袭转移有一定的关系, 这和其他研究者在乳腺癌和前列腺癌中的研究结果类似[12]。

本实验研究采用的是相对定量的方法, 因为我们更加关注的是胃癌组织及淋巴转移组织中Twist mRNA的表达水平比正常组织中高出多少倍, 而不是在于其具体的拷贝数目是多少, 并且相对定量更加简单、经济, 而且也更为可靠和准确, 因为存在于反应体系中的干扰因素, 如样本不纯、试剂影响等都可以通过内标进行校正而去除。

总之, 利用实时荧光定量PCR检测胃癌Twist基因, 可以作为诊断和检测胃癌术后的疗效观察, 临床应用具有很大的前景。

摘要：目的分析实时荧光定量PCR检测胃癌组织Twist基因的临床意义。方法用实时荧光定量PCR的方法检测正常胃黏膜、胃癌原发灶、胃癌转移灶组织中TwistmRNA的表达含量。并以Twist基因和18 s tRNA含量的比值作为评价Twist表达水平的指标, 组间进行配对t检验。结果Twist/18 s tRNA (log比值) 正常组为0.139±0.003;原发组为0.304±0.046;转移组为0.654±0.015。原发性胃癌组织及转移组织中Twist基因表达水平与正常胃黏膜组织比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;转移组与原发组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论Twist基因在正常胃黏膜组织中表达量较低, 在胃癌及其转移组织中表达水平较高, 而且Twist基因的表达水平与胃癌转移程度存在一定相关性。可以辅助诊断和观察胃癌术后疗效。

关键词：实时荧光定量PCR,Twist基因,胃癌

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荧光蛋白基因 篇9

1 材料

1.1 质粒

绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1,购自Clontech公司。

1.2 细胞

293T细胞,由中国农业大学动物分子与细胞工程实验室惠赠。

1.3 主要试剂

DMEM,购自GIBCO公司;胎牛血清,购自PAA laboratories GmbH公司;限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、XmaⅠ、AseⅠ,购自Fermentas公司;T4 DNA连接酶,购自Promega公司;其他试剂均购自Sigma公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2 方法

2.1

pEGFP-TLR2-N1融合载体的构建(结果见封三彩图1)

2.2 目的片段的获得

根据获得的山羊T-TLR2载体的测序结果,设计TLR2的引物:上游引物(带有XhoⅠ酶切位点)5′-TAACTCGAGATGCCACGTGCTTTGTGGAC-3′,下游引物(带有XmaⅠ酶切位点)5′-TAACCCGGGAGGACCTTATTGCAGCTC-3′。

用pfu 保真酶以T-TLR2载体为模板进行PCR反应:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性40 s,68 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min 30 s,共35个循环;72 ℃延伸5 min。4 ℃保存1 h,产物长度约为2 350 bp。

2.3 质粒的制备

用XhoⅠ、XmaⅠ分别酶切PCR产物和pEGFP-N1质粒,胶回收后连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株,挑取单菌落,37 ℃培养过夜。取5 mL菌液提取质粒,-20 ℃保存,备用。质粒双酶切鉴定及测序正确后大量扩增。

2.4 磷酸钙法转染293T细胞

以4×105/cm3接种293T细胞,用直径为 30 mm、内含10%胎牛血清的DMEM培养基的培养皿在37 ℃、5% CO2培养箱中培养,用AseⅠ限制性内切酶将pEGFP-TLR2-N1线性化,采用磷酸钙法转染293T细胞[7]。

3 结果与分析

3.1 重组载体的鉴定

为了保证重组载体的准确性,对pEGFP-N1和pEGFP-TLR2-N1分别进行双酶切鉴定。用XhoⅠ和BamHⅠ酶切pEGFP-N1载体可以得到2 350 bp和3 010 bp 2条带(见图2);用XhoⅠ和XmaⅠ酶切pEGFP-TLR2-N1载体可以得到2 350 bp和4 700 bp 2条带(见图3)。测序结果显示,插入pEGFP-TLR2-N1载体中的目的片段正确。

M.DL-5 000 Marker;1,2.pEGFP-N1载体XhoⅠ、BamHⅠ双酶 切结果;3.空T载体XhoⅠ、BamHⅠ双酶切结果;4.空白对照。

M.DL -5 000 Marker;1.pEGFP-N1载体XhoⅠ、XmaⅠ双酶切结果; 2.pEGFP-TLR2-N1载体XhoⅠ、XmaⅠ双酶切结果;3.空白对照。

3.2 pEGFP-TLR2-N1载体在293T细胞中的表达

用构建好的 pEGFP-TLR2-N1转染293T细胞24 h后,在荧光显微镜下观察到融合蛋白发出绿色荧光(见封三彩图4)。

4 讨论

TLR2属于Ⅰ型跨膜蛋白质,具有 TLRs家族共同的结构特征:胞外区、跨膜区及胞内区存在大量的外源性和内源性配体,这些配体通过TLR2激活细胞信号途径,调节机体免疫应答。在细菌、真菌、病毒和其他病原体的感染中具有重要作用[8]。TLR2通常与TLR1、TLR6形成二聚体发挥作用[9]。已知TLR2信号转导途径是MyD88依赖途径[10]。研究表明,山羊TLR2在不同组织器官中表达丰度不同[11]。在某些配体的刺激下TLR2表达量会升高,因而TLR2备受关注。本试验已成功构建山羊TLR2绿色荧光蛋白融合表达载体,为进一步研究TLR2的应用奠定基础。

1组无转染载体(空白对照),A为荧光结果,a为普通光结果;2组转染p EGFP-N1载体,B为荧光结果,b为普通光结果;3组转染p EGFP-TLR2-N1载体,C为荧光结果,c为普通光结果;D是B的局部放大结果,E是C的局部放大结果。

摘要：为了构建在哺乳动物细胞中表达的山羊TLR2绿色荧光蛋白融合载体,试验根据克隆到T载体上的山羊TLR2测序结果,设计1对不含终止子的引物,将山羊TLR2 PCR产物连接到pEGFP-N1载体上,用磷酸钙法转染293T细胞,并在荧光显微镜下观察。结果表明:重组质粒经酶切和测序鉴定正确,且在293T细胞中表达;融合蛋白发出绿色荧光,表明TLR2-EGFP主要分布在细胞膜上。说明试验成功地构建了pEGFP-TLR2-N1绿色荧光蛋白融合载体。

关键词：山羊,TLR2,绿色荧光蛋白,基因表达

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