荧光RT-PCR（精选7篇）
荧光RT-PCR 篇1
猪瘟(Classical swine fever,CSFV)是一种高度接触性传染病,遍布于全世界,OIE将其列为A类传染病,是目前危害我国养猪业的头号杀手,严重阻碍我国养猪业的健康发展[1]。猪瘟兔化弱毒疫苗,简称“C”株(Chinese strain),是目前世界公认的最好的猪瘟疫苗,在中国猪瘟防控中起着重要的作用[2,3]。但近年来,我国猪瘟疫苗免疫失败的病例逐渐增多,疫苗质量达不到要求是其中一个重要原因。我国对于猪瘟的防控主要以猪瘟兔化弱毒疫苗的大规模免疫为主,长期的临床使用和实验室检测都表明,猪瘟兔化弱毒疫苗能够为被免疫动物长时间提供广谱、持久、坚强的保护力,表现出极高的稳定性,理论上具有极佳的效力。但是为了能够在临床使用时发挥疫苗的最大作用,就必须实现对商品化疫苗质量的有效控制。疫苗质量控制的重要环节就是要保证所生产疫苗具有符合标准的效价,能够确实激活被免疫动物的免疫系统[4,5,6,7]。
由于猪瘟病毒不能产生细胞病变,国标中对病毒含量或疫苗效力检验主要依靠兔体定型热反应方法,该方法试验成本较高、操作繁琐、试验周期较长,且受试验动物个体差异、环境因素等多方面原因影响,检测结果不是十分准确[8,9]。因此,建立新型实用、标准化疫苗效力检验替代方法势在必行。荧光定量RT-PCR方法可以对病毒含量实时监测,具有特异、敏感、快速、高通量和实时等优点,为猪瘟病毒含量测定及猪瘟疫苗效力检验提供了新的技术支持[10]。本研究采用RT-PCR方法结合荧光探针的扩增检测技术,通过荧光信号的变化检测猪瘟病毒RNA,相对定量对比各批次间猪瘟疫苗的抗原含量。
1材料与方法
1.1试验材料Hight Pure Viral RNA Kit购自Roche;PRRSV荧光RT-PCR检测试剂盒购自北京生科尚仪;常规化学试剂、耗材和药品均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2待检疫苗收集省内使用的由10个厂家生产(A~J)的23种不同类型、不同批次疫苗,包括传代细胞苗、细胞苗、脾淋苗。
1.3病毒核酸提取将待检疫苗用灭菌生理盐水配制成20头份/m L原液,反复冻融3次后,3 000 r/min离心2 min,取上清。按照动物组织基因组RNA提取试剂盒(Hight Pure Viral RNA Kit)操作方法提取疫苗RNA,洗脱核酸,后置于-20℃备用。
1.4实时荧光RT-PCR检测方法猪瘟疫苗病毒含量检测按照北京生科尚仪的方法进行:反应体系25μL,其中RT-PCR反应液15μL、Taq酶0.25μL、模板RNA 10μL。反应条件为42℃、30 min,92℃、3 min后进入第一个循环,循环参数为92℃、10 s,45℃、30 s,72℃、60 s;5个循环后进入第二个循环,参数为92℃、10 s,60℃、30 s,40个循环;60℃时收集荧光。
2结果与分析
2.1实时荧光定量RT-PCR检测结果检测1-23#猪瘟疫苗样品,结果见图1。
2.2疫苗抗原含量检测结果分析通过荧光定量RT-PCR对疫苗的抗原含量进行检测,以9号标准品为参照校准相应的RID值。结果表明:17-23#猪瘟活疫苗抗原量不合格,抽检样品合格率仅为69.56%;传代细胞苗的抗原量明显优于细胞苗和脾淋苗,检测还发现脾淋苗的抗原量优于细胞苗;不同厂家生产的同一类型疫苗,疫苗抗原量差异大,同一厂家生产的同种疫苗批间差异较大;以9号样品为参照标准,换算出各批次的大致兔体反应量,检测仍发现有部分厂家生产的猪瘟活疫苗抗原量为0以及不符合国标的疫苗(见表1)。
3讨论
1)目前,我国猪群流行的CSFV基因型仍以2.1亚型为主,2.1b类毒株为绝对优势流行毒株。根据中国兽医药品监察所王琴等[11,12,13,14,15]证实,猪瘟“C株”兔化弱毒疫苗对不同基因型CSFV毒株仍能提供有效保护,产生良好的体液和细胞免疫。李安等[12]建立基于SYBR Green iv实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量,进一步说明荧光定量RT-PCR代替兔体定型热反应的可行性。尽管客观上讲,荧光定量RT-PCR方法只能对CSFV疫苗中的核酸进行定量,但当选择恰当的标准品并在同一反应体系的前提下,核酸含量的多少还是能在较大程度上反映出病毒含量的高低。
2)当前养殖场的猪瘟免疫意识和生猪的猪瘟免疫密度都较高,80%以上猪群均注射过兔化弱毒疫苗,种猪场几乎是100%免疫。但临床走访和检测发现,猪瘟免疫合格的养殖场比例并不高,仅在70%左右。猪瘟免疫失败的原因,一方面与临床使用的部分厂家猪瘟疫苗质量有关,另一方面与猪体的健康程度、免疫程序、母源抗体的影响及市场化疫苗的冷链系统等方面的问题有关。我国有优质的基础种毒,但因诸如细胞源疫苗、组织苗和传代细胞苗质量标准不同,生产工艺的多样化及不良市场竞争等,猪瘟疫苗的严格统一管理和质量控制存在一定困难,导致临床上猪瘟免疫效果不理想。
3)猪瘟病毒基因组稳定,变异频率低,只有一个血清型,且猪瘟疫苗依然是最优秀的疫苗[15,16,17],这些都为猪瘟的控制提供了技术保障。规模化养殖场只要做好生物安全措施,坚决淘汰病原阳性猪,隔离圈建设与全面定期消毒,加大后备猪筛选和监测力度,严格人员出入,使用合格抗原量高的猪瘟疫苗,猪瘟是完全能够控制的
注:Ct值为校准后值,一般Ct值越小核酸含量相对越高,即疫苗的抗原含量越高。
荧光RT-PCR 篇2
关键词：建兰花叶病毒,荧光RT-PCR,快速检测,蜘蛛兰
建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(OdontogLossum ringspot virus,简称ORSV)是发生最为普遍的兰花病毒,广泛分布于全世界栽培兰花的地区[1,2,3,4,5,6],这2种病毒传染性强,其中CymMV相对ORSV更易传染,在市场上蝴蝶兰、文心兰和卡特兰CymMV的感染率高达66%以上[7],病毒侵染导致植株生长不良甚至死亡,有时病毒感染后还会在植株的营养生长期出现较长时间的隐症现象,但带毒植株开花小而少,花期缩短,发病兰株观赏价值和经济价值大为下降,还会导致种质退化,对兰花产业造成严重危害。
多年来,国内学者不断深入地对CymMV的检测技术开展研究工作:1997年,潘俊松等[8]从石桷兰中分离出CymMV用于制备抗血清;郑平等[9]用组织涂抹酶联免疫吸附技术检测CymMV和ORSV;周国辉等[10]用RT-PCR方法对病毒分子进行鉴定;2007年施农农等[11]对用电镜法对CyMV和ORSV进行超微结构观察;2008年高焕利等[12]用IC-RT-PCR检测CymMV,提出了该方法可检测到CymMV分离物的最低病毒量为2.72×10-7μg/mL(428个拷贝)。2006—2008年期间,笔者在根据文献资料的多种方法对147个样品进行CymMV检测,并相应的隔离栽培,但不时发现有部分初检为阴性的样品,经过一段时间养护后复检为阳性,对苗圃中兰花种苗的检测也经常发现这种情况。这就涉及检出限的问题,说明有部分样品中只含有微量CymMV,用前述的方法不能被检出。
为解决检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题,笔者摸索建立了利用实时荧光PCR仪快速检测微量建兰花叶病毒的方法,使建兰花叶病毒的检测水平从灵敏度、准确性、稳定性上有所提高。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料。
供试材料为蝴蝶兰(PhaLaenopsis sp.)(1#)、卡特兰(CattLeya sp.)(2#)、文心兰(Oncidium sp.)(3#)、蜘蛛兰(Arachnis sp.)(4#)、皇后兰(GrammatophyLLmn sp.)(5#)、蕙兰(C.Faberi)(6#),所有样品之前经ELISA筛检,并由笔者所在实验室分类保存,其中本试验所用的卡特兰、文心兰和蜘蛛兰为加保护液冻存的叶片组织,其他为从植株上采的新鲜叶片。
1.1.2 供试试剂。
供试试剂为:UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒(上海Sangon),MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒(上海Sangon)、One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(大连Takara公司)。
1.1.3 供试仪器。
供试仪器为:Bio-Rad Opticon 2荧光定量PCR仪(美国),Thermo Labsystem MuLtiskan Mk 3酶标仪(上海雷勃),TC-96/H/G基因扩增仪(大和热磁),VARIAN CAR Y50紫外-可见分光光度计(美国)。
1.2 引物设计与合成
查询NCBI基因库(GeneBank),根据CymMV保守序列,设计并合成3对特异性引物(表1)。
1.3 RNA提取
样品用液氮研磨成粉状,称取粉状未解冻试样(约为100 mg),提取步骤参照RNA抽提试剂盒推荐方法稍加调整,因试样较粘稠,每100 mg试样加0.8 mL裂解液提取,洗脱体积为50μL。取20μL RNA提取物用无菌水稀释100倍在分光光度计上以波长260 nm检测总RNA含量,以A260/280比值和200～400 nm扫描图检测RNA纯度,纯化提取物直到A260/280比值>1.9。将提取物10μL/管分装在RNAase free的PCR管中,-80℃保存备用。
1.4 普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测熔解曲线分析
将1.3提取的兰花RNA用MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒,反应条件参照文献[7]。反应结束后,取C1、C4、C7产物分别为4.0、5.0、6.0μL,各加0.5μL上样缓冲液,于1.2%琼脂糖凝胶上(含EB 0.2μL/mL)进行电泳。
1.5 荧光RT-PCR定性检测和熔解曲线分析
将1.3提取的兰花RNA用One Step SYBR PrimeScript TM RT-PCR试剂盒进行荧光PCR定性检测,具体操作步骤:每孔加RT-PCR Buffer(内含dNTP Mixture,Mg2+,SYBR誖Green I)25μL,反转录酶和Taq酶混合物2.0μL;10μmoL/L上游、下游引物(C7)各1.0μL;水20μL;最后加1.0μL标准品或试样,制成总体积为50μL反应液体系,以无菌水代替试样作空白对照,加盖密封,1 000 r/min离心1 min,在荧光PCR仪上逆转录和扩增反应,经优化后的一步法RT-PCR反应条件为:(1)43℃,30 min;(2)94℃,15 s;(3)94℃,5 s;(4)55℃,30 s;(5)72℃,20 s;(6)读板;(7)将(3)～(6)步PCR反应循环30次;(8)72℃,5 min。将扩增产物进一步做熔解曲线分析:55～94℃;每0.5℃读板1次,每点持续5 s。
1.6 荧光RT-PCR定量检测
由于普通RT-PCR与荧光PCR定性检测存在差异,对有差异结果通过与一定浓度的重组质粒同时扩增进行定量分析。
1.6.1 标准品的制备。
将得到的经纯化的扩增产物,与质粒(p UCm-T载体)连接并克隆,提取相应的重组质粒,制成100 ng/mL的溶液,以此作为标准品储备液。
1.6.2 一点法粗略定量检测。
将C4重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.8×102质粒/μL标准使用液。4#样品和标准品在相同条件下进行反应:RT-PCR Buffer 12.5μL,反转录酶和Taq酶混合物1.0μL;10μmoL/L上游、下游引物(C4)各0.5μL;水10μmoL;最后加0.5μL标准品或试样,制成总体积为25μL反应液体系,反应条件为:(1)43℃,30 min;(2)94℃,2 min;(3)94℃,30 s;(4)、55℃,30 s;(5)72℃,25 s;(6)读板;(7)将(3)～(6)步PCR反应循环35次;(8)72℃,10 min。
1.6.3 绝对定量法检测。
将C7重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.6×107、2.6×105、2.6×102质粒/μL的标准使用液。将1#、4#和5#样品和标准品在相同条件下进行反应,引物为C1,其他反应试剂同1.62,反应条件参照文献[13]。对线性范围内未知样品用绝对定量法计算其原始拷贝数,对线性范围以下的样品进行半定量分析其浓度范围。
1.7 测序验证
收集1.4和1.6的扩增产物,经纯化、克隆,委托上海Sangon测序。
2 结果与分析
2.1 CymMV的普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测结果
用所设计3对的CymMV PCR引物进行RT-PCR反应,能够成功地在部分兰花病样总RNA抽提物中扩增到与预期大小相符的单一明亮的DNA电泳条带(图1)。由图1可见4#样在电泳图上未检出CymMV,但该植株再经过3个月的隔离栽培后出现症状,并用ELISA和PCR方法均检出CymMV,随后逐渐枯死。
注:图中1为DNA Marker,2～8、9～16、16～22孔依次为1#～6#样品C1、C4、C6和相应的空白对照的产物。
2.2 荧光RT-PC定性检测结果
由图2可知,4#样的总RNA提取物经荧光RT-PC定性检测发现该蜘蛛兰已被CymMV感染,但其含量极低,对产物进一步进行熔解曲线分析,结果4#样与其他样品的产物Tm都是78.0℃,并由图3可知,其熔解曲线均为单一产物形态,表明4#样与其他样品的具有相同的单一产物。
2.3 荧光RT-PCR半定量检测结果
由图4可知,4#样的CymMV C4模板浓度<2.8×102质粒/μL的C4重组质粒模板浓度,因重组质粒中的模板为双链DNA,0.5μL重组质粒模板数为2.8×102×2×0.5=2.8×102拷贝,即4#样的CymMV C4模板<2.8×102拷贝。由图5可知,4#样的CymMV C1模板<2.6×102拷贝,同时可以看出,2.6×102拷贝和2.6×100拷贝扩增曲线并无明显的区别,因此当模板数<2.6×102拷贝,只能进行定性分析。
2.4 测序结果
测序结果表明,所有扩增产物的实际长度与预期完全相符。应用NCBI基因库的BLAST对产物进行同源性分析,C1产物与基因库中CymMV相应序列的同源性≥96%;C4产物同源性89%～99%。C7产物的测序结果同源性比较见图6,由图6可知,1#样蝴蝶兰同源性≥96%;5#样皇后兰同源性≥97%,与AM055640.2所报道的序列完全相同,与1#样有5个碱基的差异(同源性97%);4#样蜘蛛兰与基因库序列的同源性94%～96%;与基因库中EU672821.1序列最接近,存在7个碱基的差异(同源性96%);4#样与1#样有12个碱基的差异(同源性94%),4#样被其他样品污染的可能性极小。因此,认为该植株在引进时已经携带微量的CymMV。
3 结论与讨论
3.1 建立了微量CymMV的快速检测方法
传统的PCR-电泳方法无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析,必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力,而且电泳分辨率限制了该方法的检测灵敏度。
荧光RT-PCR法在检测时可进行实时观察扩增状态,因此在很大程度上加快检测速度;该方法因所有试验在封闭系统内完成,可变因素大大减少,比普通PCR方法灵敏度提高了102倍;因为不需要进行后期处理,可防止强致癌物溴乙锭对操作人员的危害。本研究建立的CymMV实时荧光RT-PCR检测方法具有灵敏度高、操作快速、结果直观准确的特点,可应用于种苗中微量CymMV的早期检测,并对深入开展CymMV生物学特性研究打下基础。
3.2 检测灵敏度可达基因拷贝数仅在个位数
荧光RT-PCR检测方法不但可以定性分析,也可进行定量分析,导入基因拷贝数解析,在本文中主要针对病毒含量在定量限(2.6×102拷贝)以下的样品进行分析,因此只能通过半定量方法推算其基因拷贝数仅在个位数。
3.3 荧光RT-PCR定性和绝对定量检测对引物要求高
荧光PCR法的荧光扩增曲线,不能分辨扩增产物有几个,因此必须是单一产物的扩增。扩增结束时,可用熔解曲线法对扩增的特异性进行验证。因此,要求引物具有高度的特异性和目标基因的保守性。
荧光RT-PCR定量检测方法分为绝对定量和相对定量法,相对定量法检测成本高,本研究主要针对生产应用,因此,采用了绝对定量法,该种方法对于引物的特异性、保守性和产物的稳定性要求较高,所应用的引物应经过反复验证。
荧光RT-PCR 篇3
荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度高, 并且可以有效的防止检测过程中样品的污染, 极大的提高了检测的准确性。此外荧光定量RT-PCR检测方法灵活性也好, 可一次获得样品的多个遗传信息, 这就大大的缩短了检测时间, 为A型流感病毒患者的治疗创造了最佳治疗时间。本次研究选取2011年9月至2012年3月我院收治的10例A型流感病毒感染者, 随机分为两组, 对照组5例进行常规检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。两组临床资料进行分析, 情况如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次研究病例10例, 其中女性6人, 男性4人, 年龄5~70岁。小孩4例和老人3例比重较大, 男女比例相当。10例患者中, 发烧咳嗽的有1例, 浑身酸痛流涕的有2例, 出汗咳嗽流涕的有1例, 发烧浑身酸痛的有2例, 发烧并且出汗的有1例, 浑身酸痛兼出汗的有1例, 发烧、浑身酸痛、出汗、咳嗽流涕的有2例。两组在性别、年龄、病情等一般资料上比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 方法
对照组5例进行常规检测, 采用血清学检测方法和病毒分离培养方法进行检测。实验组5例采用荧光定量RT-PCR方法进行检测。
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计学软件, 计数资料行χ2检验, P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
实验组荧光定量RT-PCR方法检测时间短, 且具有特异高, 敏感性高的特点。这些特性对疾病治疗也有极大的帮助。对照组发现有3例病情加重, 其中1例并发淋巴系统疾病2例并发肺部细菌感染, 继发性肺炎主要症状表现为持续发烧、头痛、呕吐、恶心、嗜睡、食欲不振、吐浓痰、痰液黏稠且黄、少数痰中带血、病人面色发黄。并发淋巴系统疾病的患者表现为淋巴结中大、身体浮肿、淋巴管扩张扭曲、局部淋巴管管壁及其周围组织发生炎症细胞浸润、浸润的细胞中有大量噬酸性粒细胞。实验组有2例病人并发肺部细菌感染, 症状表现为发烧、恶心、呕吐、嗜睡惊厥等症状, 没有发现有淋巴系统病变的病例。经化验科检验, 肺部细菌感染的继发性肺炎主要是感染金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌和肺炎链球菌。实验组治疗时间为1~3周, 对照组治疗时间为2~4周, 其中有1例病情严重的为6周左右。有1例因病情恶化转移到上级医院去接受治疗。值得提醒的是, 在研究过程中发现A型流感病毒容易感染其他住院病人。而这些病人都是些免疫能力相对比较低的病患。见表1。
注:*与对照组比较1) P<0.05。
3 讨论
A型流感病毒具有很强的侵袭力, 而且对药物的治疗具有抵抗力的突变或是变异, 可以对病人的健康造成威胁。对照组并发症较高, 可能是因为血清学检测特异性和敏感性不高, 检验的准确性低从而有误诊影响到对疾病的治疗或是错误治疗诱发病毒变异, 这些因素都可能加重疾病或是引起并发症;病毒分离培养方法至少需要21d才能得到检测结果, 检测时间过长, 有些患者所感染的病毒在检验过程中可能已经发生突变或者是变异, 从而影响到治疗的效果。A型流感病毒极易突变, 不正确的治疗以及治疗时间过长均易导致突变, 从而加重治疗的困难性。而且突变后的A型流感病毒株具有更强的毒力和攻击性。此外, 耐药性也是一个不可忽视的问题, 在确诊之前采用广谱抗病毒药物, 不仅易导致耐药还可能导致突变从而贻误病机。从感染A型流感病毒的人群分析, 老人和小孩所占比重相对较大, 老人免疫系统功能退化而小孩免疫系统尚未发育好, 这两大人群共同特点就是免疫力比较差。因此加强对老人和小孩的保护也很重要。感染A型流感病毒后, 人体的免疫力降低, 原本寄居于人体的正常菌群如金黄色葡萄球菌变成致病菌, 从而引发一系列的感染。早期识别以及采取长期隔离防范措施看来对预防受到感染的免疫功能受损患者发生 (医院性) 流感病毒爆发不失为是一种谨慎的作法[1]。然而, A型流感病毒感染早期症状并不明显, 只有50%左右的有明显的类似于呼吸道感染疾病的症状。这就加重了防治的难度。到医院就诊的都是症状明显、病情较严重的患者。这就需要医院有快速的检测结果和尽早的治疗。荧光定量RT-PCR检测方法正好弥补了血清学、病毒分离检测方法的不足, 对A型流感病毒的检测时间短, 异性高, 敏感性好, 为疾病A型流感病毒感染的尽早治疗创造了条件。荧光定量RT-PCR检测方法不仅对A型流感病毒的治疗有积极作用, 而且有利于隔离传染源, 切断传播途径, 保护易感者, 减轻人们的恐慌心里和心理压力。有利于提高治愈率, 缩短治病时间, 提高病人的生活质量。
摘要：目的:探析荧光定量RT-PCR检测方法对A型流感病毒检测的快速性、敏感性和特异性以指导临床治疗。方法:选择我院2011年9月至2012年3月收治的10例感染A型流感病毒病人, 随机分为对照组和实验组。对照组5例进行血清学、病毒分离培养等方法进行检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。结果:实验组的确诊率和治疗效果均高于对照组, 且所用的检测时间和治疗时间均短, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:荧光定量RT-PCR检测A型流感病毒准确率高, 对临床治疗有积极的指导作用。
关键词：荧光定量RT-PCR,A型流感病毒,检测方法
参考文献
荧光RT-PCR 篇4
地市级动物疫病防控部门实验室已把荧光RT-PCR方法作为初步监测禽流感病毒的首选方法,但市场上禽流感病毒荧光RT-PCR试剂盒众多,不同厂家的试剂盒的特异性、敏感性和扩增效率存在差异,为保证禽流感病毒监测结果的准确性、一致性,及早发现动物疫情[2,3],本研究对市场上较常见的3种禽流感病毒实时荧光RT-PCR试剂盒进行比较分析和评价,以期为禽流感监测提供方法和参考,从而降低禽流感发生风险。
1 材料
1.1 检测样品
禽流感病毒H5亚型(Re-6株)血凝抑制试验抗原(批号为2015019)和禽流感病毒H7亚型(H7N9株)HI试验抗原(批号为2014003),购自哈尔滨维科生物技术开发公司。
1.2 主要试剂
核酸提取试剂盒,购自西安天隆科技有限公司;禽流感病毒通用型荧光RT-PCR试剂盒,购自市场上3种试剂厂家,分别命名为厂家1、厂家2、厂家3。
1.3 主要仪器
微量移液器,Eppendorf公司产品;台式高速冷冻离心机(型号为SIGMA3K15),德国Sigma公司产品;生物安全柜(型号为Hfsafe1200/c+),上海力申科学仪器有限公司产品;核酸提取仪(型号为NP968)、实时荧光定量PCR仪(型号为TL988-Ⅱ),西安天隆科技有限公司产品。
2 方法
2.1 样品制备和提取
将禽流感病毒H5亚型(Re-6株)血凝抑制试验抗原和禽流感病毒H7亚型(H7N9株)血凝抑制试验抗原用2 m L PBS液溶解,并使用核酸提取仪提取抗原RNA;将禽流感病毒H5亚型(Re-6株)血凝抑制试验抗原提取的RNA按10倍稀释成3个浓度制备成4个样品,编号分别为AI-1(RNA不稀释)、AI-2(RNA按1∶100倍稀释)、AI-3(RNA按1∶1 000倍稀释)、AI-4(RNA按1∶10 000倍稀释);禽流感病毒H7亚型(H7N9株)血凝抑制试验抗原提取的RNA不稀释制备成1个样品,编号为AI-5(RNA不稀释);无核酸酶水制备成1个样品,编号为AI-6。
2.2 核酸检测和判定
使用3个厂家的禽流感病毒通用型荧光RT-PCR试剂盒对AI-1、AI-2、AI-3、AI-4、AI-5、AI-6共6份样品按照各自厂家检测试剂盒说明书进行操作,并按照相应判定标准进行结果判定。
3 结果
3.1 特异性
3个厂家禽流感病毒通用型荧光RT-PCR试剂盒的特异性不一致,厂家1只能检测出禽流感H5亚型抗原,而不能检测出禽流感H7亚型抗原;厂家2和厂家3均能同时检测出禽流感H5亚型抗原和禽流感H7亚型抗原(见表1)。
3.2 灵敏性
3个厂家禽流感病毒通用型荧光RT-PCR试剂盒的灵敏性不一致,差别较大,厂家1只能检测出禽流感H5亚型抗原RNA 1∶1 000倍稀释以下的样品,厂家2和厂家3能够检出禽流感H5亚型抗原RNA1∶10 000倍稀释以下的样品(见表1)。
3.3 扩增效率
3个厂家禽流感病毒通用型荧光RT-PCR试剂盒的扩增效率存在差异。用3个厂家试剂盒检测后,扩增曲线明显不同,见298页彩图1~彩图3。从298页彩图1~彩图3可以看出,厂家2试剂盒的扩增效率优于厂家1,厂家1试剂盒的扩增效率优于厂家3。厂家2的试剂盒扩增效率较好,扩增曲线光滑,荧光值较高,宜于检测结果的判定。
4 讨论
1)禽流感病毒可引起禽类呼吸器官或全身性感染,禽流感流行会严重影响畜牧业发展和国际进出口贸易。高致病性禽流感病毒是在人群中引发流感的一个潜在危险因素,并会严重地威胁人类健康[4]。因此,对禽流感病毒的检测和监测已成为世界各国政府卫生、畜牧防疫部门日益关注和积极着手解决的重大问题之一[5]。荧光定量PCR技术由于具有定量、特异、灵敏和快速等特点,是目前监测禽流感病毒的较为可靠方法之一,尤其在地市级动物疫病防控部门实验室应用较为广泛。
2)本研究从临床实验室的角度对市场上3种禽流感病毒实时荧光RT-PCR试剂盒进行了综合比较,厂家2的试剂盒检测性能优于厂家1和厂家3,同时也为地市级动物疫病防控部门实验室选择不同厂家禽流感病毒监测试剂盒提供方法和参考。
3)研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系[6],起始拷贝数越多,Ct值越小。但在本研究中,3个试剂厂家对编号为AI-1、AI-2样品检测时,均出现AI-1样品大于AI-2样品的Ct值,这可能是PCR反应液中RNA浓度较高、而d NTP探针和酶浓度相对较低所致[6]。
4)国内也有一些评价荧光PCR试剂的文献,需要较多的样本和重复性试验,鉴于地市级动物疫病防控实验室没有禽流感阳性样本,只能使用哈尔滨维科生物技术开发公司生产的禽流感病毒H5亚型(Re-6株)血凝抑制试验抗原和禽流感病毒H7亚型(H7N9株)血凝抑制试验抗原作为样品对市场上3种禽流感病毒实时荧光RT-PCR试剂盒进行初步比较分析。
参考文献
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荧光RT-PCR 篇5
1 材料与方法
1.1 标本
黑龙江省2012年58例散发风疹疑似病例, 采集发病早期患者的血清标本和咽拭子标本。标本在冷藏条件下运送风疹实验室。
1.2 风疹Ig M抗体测定
血清标本进行风疹Ig M抗体检测。使用德国维润赛润公司生产的试剂盒进行风疹Ig M抗体检测。
1.3 real-time RT-PCR检测
咽拭子标本进行real-time RT-PCR检测。使用QIAGEN公司生产的试剂盒进行风疹病毒RNA提取。引物、探针和反应体系采用北京金豪公司生产的试剂盒。反应结束后通过荧光定量PCR仪对结果进行判定。
2 结果
2.1 血标本采集与患者出疹时间间隔
58例风疹疑似病例血标本, 采集血标本最短时间是出疹当天采集, 最长时间是出疹后7天采集, 其中多数病例是在出疹后2~3天采集的。出疹3天内采集的血标本占总标本数的63.8%。
2.2 风疹疑似病例临床标本的检测
在58例风疹疑似病例中, 应用real-time RT-PCR法对咽拭子标本进行风疹病毒核酸检测, 结果均为阳性;应用ELISA法检测风疹Ig M抗体, 48份为阳性, 占82.8%;10份为阴性, 占17.2%。在10份阴性血清标本中, 有5例再次采集了血标本, 其风疹Ig M抗体检测结果为阳性。见表1。
3 讨论
风疹和麻疹都为发热出疹性疾病, 由于临床症状相似, 在临床上不易区分, 临床风疹病例往往可能误诊为麻疹, 因此, 在消除麻疹的关键阶段, 特异性的实验室诊断显得尤为重要[2]。
目前RV的实验室诊断主要有以下3种方法:血清学方法、病毒分离、分子生物学方法等。血清学方法 (ELISA) 是一种快速、传统的实验室诊断方法, 但由于在发病早期风疹Ig M抗体产生较少或不产生[4], 在出疹后的前3天内, 风疹特异Ig M抗体检测可能会出现50%的假阴性结果[5]。通常情况下, 患者采血时间往往处于发病的初期, 本文中患者采血时间在出疹后3天内采集的标本数占总标本数的63.8%, 所以临床上用ELISA法检测风疹Ig M抗体作为确诊指标, 会发生假阴性的结果, 造成误诊[6]。相比之下, 咽拭子采集的最佳时间是患者出疹后3天内。咽拭子标本适用于病毒分离和分子生物学检测, 但对于风疹病毒分离来说, 由于所需时间较长, 不适于对病例早期诊断, 在实际诊断中很少使用。而近年来发展起来的实时荧光定量RT-PCR技术具有敏感、快速、简便和检测时间短等优点, 适用于作病例早期诊断的实验室检测依据。本文对58例患者的血清标本和咽拭子标本检测中也证实了这一点, 用real-time RT-PCR法检测咽拭子标本阳性率为100%, 而ELISA法检测风疹Ig M抗体阳性率为83%。对于在检测阴性的10份标本中, 有5份采集了第二份血清标本, ELISA法检测风疹Ig M抗体均为阳性。由此可见, real-time RT-PCR技术更适合于作病例早期诊断的实验室检查依据, 可作为ELISA法的一个补充诊断方法。
real-time RT-PCR法和ELISA法相结合对病例进行早期诊断, 不仅可以及时发现、诊断风疹病例, 为疫情处理赢得宝贵时间, 而且还可以提高实验室诊断阳性率, 减少假阴性的发生。
参考文献
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荧光RT-PCR 篇6
MicroRNA (miRNA)是一类进化上保守的,长度约22个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA。在动物中,绝大多数miRNA可通过与靶mRNA的3'UTRs(untranslated regions)近乎完全互补结合在转录后水平使其降解,或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成,从而在基因表达中发挥重要的调节作用[3]。在人体内大约发现的500种miRNA,主要通过与mRNA碱基互补从而抑制目标mRNA的翻译或者降解目标mRNA,同一个miRNA可以调节多个mRNA。Lewis[4]等预测人类至少有三分之一的基因受miRNA调控,平均每个miRNA调节人类200种不同的mRNA,而且多个miRNA能够协调活动以调节一些特殊的目标靶基因。
在生物体中,miRNA的特异性不强,往往一个miRNA作用于多个靶基因[5],其调控主要通过两种机制调控基因的表达[6],其一是当miRNA序列与靶基因mRNA的3'UTRs碱基近似完全互补配对时则进行切割,促使靶基因的mRNA发生降解[7];另一作用机制是miRNA通过与靶基因mRNA的3'UTRs碱基不完全匹配结合,抑制靶基因mRNA翻译表达,进而发挥其功能,但不影响靶基因mRNA的稳定性[8]。近年来国际上对于miRNA与乳腺癌的相关研究进展很快。研究表明,在人类乳腺癌细胞中,特定miRNA的表达缺失或表达上调会使这些癌细胞具有潜在的转移性。Trvzoie等[9]采用微阵列芯片筛选多个转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞株,证明miR-126在抑制肿瘤转移中发挥关键作用。并且在大多数高侵袭性的乳腺癌细胞系中miR-126表达缺失或降低,通过恢复其表达可以使癌细胞的转移活性减少80%。其中miR-126表达能够抑制肿瘤的生长和增殖。另外miR-126也参与肺癌细胞的黏附、转移和侵袭,可能是信号接头蛋白Crk参与受体酪氨酸激酶和整合蛋白等多种分子的信号转导通路而改变细胞的黏附、转移和侵袭能力[10]。
1 资料与方法
1.1 标本来源
本实验所采用的标本来自云南省肿瘤医院乳腺病科及解放军昆明总医院普通外科2010年6月至2010年12月外科手术切除的乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织(距离原发病灶5cm) 20例。均为女性患者,平均年龄48.25岁,所有标本均经过病理学证实。患者手术前、手术中均未曾进行过放疗、化疗及免疫治疗等。手术切除的新鲜标本均立即放入加有RNAlater solution (AMBION) 5ml的Rnase free冻存管中,并且按照厚度小于0.5cm的新鲜组织(如果厚度大于0.5cm先切薄)浸入5～10倍体积的RNAlater solution中为标准保存组织。
1.2 总RNA的提取
按照Trizol法提取组织总RNA,先称取0.05～0.1g组织,放入EP管后加入Trizol (invitrgen) 1ml使用Handy pestle进行充分研磨。将研磨匀浆后的组织悬液严格按照Trizol(invitrgen)操作说明提取总RNA。提取后的样品均使用紫外分光光度仪评估RNA的浓度及纯度。
1.3反转录及实时荧光定量RT～PCR cDNA的合成采用Universal
cDNA synthesis kit(EXIQON),严格根据操作说明进行,每一合成反应体系中包含约2μl的5x Reaction buffer,5μl的Nucleasefree water,1μl的Enzyme mix和2 ul稀释为5ng/μl的总RNA,采取42℃水浴1h,95℃水浴5min或者PCR仪完成反转录。实时荧光定量RT-PCR反应采用LNAtmPCR primer set(EXIQON),严格按照操作说明进行,反应总体系为10μl,其中含有SYBR Green master mix5μl,PCR primer 1μl,cDNA模板4μl。其中的引物序列由EXIQON公司提供。最好应用ABI-7900HT荧光定量仪进行实时荧光定量RT-PCR。在扩增miRNA-126的同时,还扩增了U6RNA作为内对照,待测miRNA-126的量通过2-△CT法确定△△CCT=癌组织[CT(miRNA)-CT(U6RNA)]-癌旁正常组织[CT(miRNA)-CT(U6RNA)]。癌组织及癌旁正常乳腺组织均经过病理学证实,实时荧光定量RT-PCR结果为3次独立实验的校正结果。
2 结果
笔者所选择的miR-126在反应体系中均能有效扩增,根据CT值间的比较,采用配对t检验法分析每一组织miRNA-126的变化比率,用以评估miR-126在乳腺癌和癌旁正常组织的表达情况。根据数据分析得出的结果,发现癌组织中miR-126的表达量低于正常组织中的表达量P<0.0001。
3 讨论
LNA (Locked Nucleic Acid),即锁核苷酸,是由一类新的二环高亲和性RNA类似物组成,其中通过引入2'-O,4'-C亚甲基桥,使糖-磷酸骨架的呋喃糖环被化学锁定而形成N形(内部C3')结构的RNA模拟物,LNA修饰的寡核苷酸链在与其标靶RNA分子杂交时具有前所未有的热稳定性。故在此基础上,检测miRNA-126时利用LNA修饰的探针做Northern杂交。用LNA修饰的探针灵敏度比末端标记的同序列DNA探针至少高出10倍,这便能节省总RNA的用量。另外值得一提的是,LNA可以改善错配识别,使得LNA介导的高亲和性杂交符合标准Watson-Crick碱基互补配对原则而不会出现碱基配对差错。
实时荧光定量RT-PCR在空间表达分辨率、准确性、灵敏度、特异性等方面较之Northern杂交分析及芯片分析有绝对倾倒性的优势[11]。
相对于传统DNA及mRNA水平的诊断方式而言,在时间及准确性上miRNA能够更早的提示癌变。并且miRNA作为重要的肿瘤抑制基因或癌基因,可以对于那些作为癌基因的miRNA采用特异性敲除来抑制肿瘤生长,对于那些作为抑癌基因的miRNA采用人为引入的方法来针对肿瘤进行治疗,或者将来若使用合成的反义核苷酸与作为癌基因的miRNA互补,如抗miRNA的寡核苷酸,可靶向性抑制miRNA的功能,减慢肿瘤生长。这种更稳定及低毒性的特点很有可能在肿瘤的基因治疗中发挥巨大作用。因此,miRNA有望成为一些肿瘤早期诊断、恶性分级的重要指标[12]。
摘要：目的 采用实时荧光定量RT-PCR分析miR-126在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达水平,探讨miR-126在乳腺癌疾病中的临床诊断意义。方法 运用ABI-7900HT实时荧光定量仪对20例己由病理确诊的乳腺癌组织及癌旁正常组织的miR-126进行了定量分析。结果 采用配对t检验的统计学方法 将乳腺癌与正常组织表达量相比较,发现了miR-126在所有被检测的乳腺癌组织中有不同程度的表达水平下调,且结果有显著差异(P<0.0001)。结论 乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织中存在上述miR-126表达水平的改变,实时荧光定量RT-PCR方法检测miRNA-126水平在乳腺癌早期诊断和治疗方面提供了新的思路并具有广阔的应用前景。
关键词：miR-126,乳腺癌,早期诊断,相关性,LNA,实时荧光定量RT-PCR
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荧光RT-PCR 篇7
IBV属于冠状病毒科,病毒基因组为单股RNA, 易发生基因突变,导致病毒血清型众多、致病性复杂[6],目前IBV仍在不断变异,不时出现新的基因型并引起抗原性变异[7,8,9,10]。在临床上,IB与新城疫、禽流感、传染性喉气管炎等疾病的症状相似,这给疾病的诊断造成了困难。目前,检测IBV的方法有血清学、分子生物学等方法[11,12,13],但这些方法在特异性、 敏感性和时效性等方面都有缺陷。近年发展起来的Real - time RT - PCR技术具有快速、灵敏、特异、定量等优点。本研究旨在建立快速检测IBV的Real time RT - PCR技术,现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1毒株
IBV H120系、新城疫病毒 ( NDV) La Sola系、禽流感病毒( AIV) 、传染性喉气管炎病毒( ILTV) 、马立克病毒( MDV) 和传染性法氏囊病毒( IBDV) ,均由广西区动物疫病预防控制中心保存。
1.2主要试剂和仪器
一步法荧光定量RT - PCR试剂盒、胶回收试剂盒、DNA/RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、p MD18 - T载体,均购自Ta KaRa公司; DH5α 感受态细胞,购自Tiangen公司; 荧光定量PCR仪( 型号为ABI Step One Plus) ,ABI公司生产。
1.3引物与TaqMan探针的设计与合成
根据Gen Bank收录的IBV基因序列保守区域, 设计1对特异性引物及相应的Taq Mam探针。引物序列: 上游引物5' - AGCAGCAATCTATTCATC - 3', 下游引物5' - CCAAGAACTTGAATGATTC - 3',扩增片段长度 为77 bp。 探针序列: JOE - TCTCAGAACTCGTGGCAGCA - BHQ1,探针的5' 端以荧光报告基团JOE标记,3'端以荧光淬灭基团BHQ1标记。 引物和探针均由宝生物工程( 大连) 有限公司合成。
1.4病毒RNA的提取与cDNA合成
参照DNA/RNA提取试剂盒说明书提取鸡胚尿囊液中的总RNA,按照DNA/RNA提取试剂盒说明书用下游引物进行反转录来合成病毒c DNA。
1.5阳性标准模板的制备
对获得的c DNA进行PCR扩增,PCR反应体系: 上、下游引物各0. 2 μmol/L,5 × PCR Buffer 10 μL, Ta KaRa Ex Taq HS 0. 5 μL,c DNA 10 μL,用dd H2O补至50 μL。PCR反应条件: 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,共30个循环; 72 ℃ 7 min。 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收目的DNA片段,将目的片段与p MD18 - T载体于16 ℃ 连接过夜,转化DH5α 感受态细胞,经质粒PCR鉴定为阳性后命名为IBV - P,用核酸蛋白分析仪测定阳性质粒浓度,并换算成拷贝数。
1.6Real-timeRT-PCR方法的建立
1. 6. 1Real - time RT - PCR反应体系与反应条件的优化参考一步法荧光定量RT - PCR试剂盒推荐的反应体系和条件,在相同浓度模板和反应体系中, 采用矩阵法确定引物和探针的最佳浓度。在以上参数优化的基础上,进行荧光定量RT - PCR循环参数的优化,整个优化过程综合考虑Ct值、荧光强度、重复性等,确定反应条件。
1. 6. 2标准曲线的建立对阳性质粒标准品进行10倍梯度稀释,取浓度为3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝/μL的阳性质粒标准品作为模板,根据优化后的体系和条件进行Real - time RT - PCR反应,建立标准曲线,并得出反应的扩增效率和曲线的相关系数。
1. 6. 3敏感性试验取浓度为3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝/μL的阳性质粒标准品作为模板,根据优化后的体系和条件进行Real - time RT - PCR反应,同时以常规RT - PCR反应作为参比方法,检测其灵敏度。
1. 6. 4特异性试验分别取IBV、NDV、MDV、IBDV、AIV、ILTV的等量样 品提取病 毒RNA ( 或DNA) ,采用所建立的Real - time RT - PCR方法进行检测。
1. 6. 5重复性试验取5个10倍梯度稀释的阳性质粒标准品,按照所建立的Real - time RT - PCR方法分别进行批内、批间检测的可重复性试验。批内检测时,每个浓度设3个重复; 批间检测时,进行3次独立检测,每次间隔10 d,计算Ct值的平均值和变异系数( CV) 。
1.7临床样品的检测
对广西区动物疫病预防控制中心收集、保存的185份历年鸡肺脏、气管、脾脏等组织进行检测。将每份样品分成2份,提取病毒核酸,其中一份进行Real - time RT - PCR检测,另一份进行常规RT -PCR检测,以评价其临床实用性。
2结果与分析
2.1阳性质粒浓度的计算
经测定阳性质粒的OD260/ OD280= 1. 81,则质粒浓度为0. 094 μg/μL,其拷贝数为3. 1 ×108拷贝/μL。
2.2Real-timeRT-PCR方法的建立
2. 2. 1Real - time RT - PCR反应体系与反应条件的建立经优化确定了最终反应体系与反应条件。 反应体系: ( 总体积为20 μL) : 2 × One Step RT - PCR Buffer Ⅲ 10 μL,Ta KaRa Ex Taq HS 0. 4 μL,Prime-Script RT Enzyme Mix Ⅱ 0. 4 μL,Rox Reference Dye Ⅱ( 50 × ) 0. 4 μL,上游引物、下游引物、探针各0. 8 μL,模板RNA 3 μL,加双蒸水补至20 μL。反应条件: 42 ℃ 反转录5 min; 92 ℃ 预变性10 s; 92 ℃ 3 s,54 ℃ 收集荧光30 s,共40个循环。
2. 2. 2Real - time RT - PCR标准曲线的建立通过Real - time RT - PCR反应得到检测IBV的标准曲线,见图1。阳性质粒标准品具有良好的线性关系, 相关系数( R2) = 0. 997,扩增效率( E) = 1. 142。
2. 2. 3敏感性试验结果经检测: Real - time RT -PCR反应的最低检出限为3. 1 × 101拷贝/μL,见图2; 常规RT - PCR反应的检 测极限为3. 1 × 103拷贝/μL,见图3。Real - time RT - PCR与常规RT -PCR相比,敏感性高100倍。
2. 2. 4特异性试验结果经测定,仅IBV出现扩增曲线,而NDV、ILTV、IBDV、MDV、AIV和空白对照均未出现扩增曲线,说明针对IBV设计的检测引物和探针特异性好。
2. 2. 5重复性试验结果见表1。
由表1可知,批内检测变异系数为0. 38% ~0. 76% ,批间检测变异系数为0. 86% ~ 1. 35% ,均小于2. 00% ,说明所建立的Real - time RT - PCR方法具有良好的可重复性。
1 ~ 7. 3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝 /μL; 8. 阴性对照。
M. DL - 500 bp Marker; 1 ~ 7. 3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝 /μL。
2.3临床样品的检测结果
利用建立的Real - time RT - PCR方法,对广西区动物疫病预防控制中心收集、保存的185份病料核酸进行检测,结果显示,检出IBV 2份,阳性率为1. 08% ,检测结果与常规RT - PCR结果一致。
3讨论
本研究建立的检测IBV的Real - time RT - PCR方法特异性好,只从IBV阳性病料中检测到特异性的扩增信号,不与检测的其他常见家禽传染病病毒发生特异性反应。试验所建立的标 准曲线的R2= 0. 997,E = 1. 142,说明核酸拷贝数的对数值与Ct值之间有极显著的线性关系,优化的体系和条件很好地满足了试验要求。重复性试验得出组内和组间变异系数为0. 38% ~ 1. 35% ,说明此方法具有很好的准确性和重复性,可以稳定地用于IBV核酸的定量检测。试验建立的曲线可检测到3. 1 × 101拷贝/μL的初始模板量,检测敏感 性比常规RT - PCR提高100倍。检测量大,一次可以检测96份样品,整个反应都在密闭系统内进行,避免了样品间的污染。检测速度快,从样品处理( 包括RNA的提取、PCR等) 到试验结束,大约需要4 h,比其他血清学检测方法节省时间,准确性高。Taq Man探针只与特异性模板发生反应,假阳性率低,与SYBR GreenⅠ相比,不需要考虑引物二聚体和其他非特异性扩增[4]。
4结论