树突状细胞免疫

树突状细胞免疫（精选7篇）

树突状细胞免疫 篇1

20世纪以来,同种异体移植后为防止排斥反应发生而采用的免疫抑制剂是非特异性的,但非特异性的免疫抑制剂所带来的感染和肿瘤的发生又限制了移植物及受者的长期存活,诱导受者对供者器官特异性免疫耐受是解决排斥反应最理想的措施。随着研究的深入,人们发现树突状细胞(dendritic cells,DCs)在免疫耐受中起重要作用[1]。其中耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells,t DCs)能够诱导特异性T细胞免疫耐受。本实验利用GM-CSF、IL-4、VIP、DXM[2]、LPS等因子体外培养t DCs,通过腹腔输注t DCs,在小鼠体内建立免疫耐受模型,探讨t DCs诱导特异性免疫耐受方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

供体:8周龄的Balb/c纯系雄性小鼠;受体:8周龄的昆明纯系雌性小鼠,均由南昌大学医学院动物实验室提供,体重20～25 g,饲养于清洁环境。

1.2 主要试剂

血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP,北京博奥森生物技术有限公司);重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF,厦门特宝生物工程股份有限公司);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、人重组白细胞介素-4(rhIL-4)均购自Sigma公司;地塞米松(DXM,武汉远程科技发展有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司);RPMI1640细胞培养液(Gibco公司);PE anti-mouse CD4/80/11c、FITC anti-mouse CD25/40/86(BD公司);淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液学研究所)。

1.3 细胞的培养

1.3.1 常规DC的培养

细胞培养体系为在含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中,加GM-CSF100 ng/mL、IL-4 100 ng/mL培养,细胞终浓度为1×106/m L。置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中培养,每周半量换液并补充因子,第7天加入LPS1μg/m L,继续培养72 h后收获DCs。

1.3.2 tDCs的培养

细胞培养体系为在含10%小牛血清RPMI 1640细胞培养液中,加GM-CSF 20ng/m L、VIP 40 ng/mL、DXM 10 ng/mL,细胞终浓度为1×106/m L,置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中培养,每周半量换液并补充因子,第7天加LPS1μg/m L,继续培养72 h后收集t DCs。

1.4 体内输注实验分组

将受体小鼠随机分为4个组,每组4只,进行不同的处理。(1)空白对照组(空白组):不经任何处理。(2)输骨髓细胞组(骨髓组):腹腔输注1×106个骨髓细胞。(3)输常规树突状细胞组(DC组):腹腔输注1×106个常规培养的DCs。(4)输耐受性树突状细胞组(t DC组):腹腔输注1×106个t DCs。

1.5 小鼠免疫耐受模型的建立

1.5.1 小鼠的脾片移植

将供体小鼠处死后,在无菌条件下取出脾脏,去除包膜,切成大小约0.5 cm×0.5cm×0.3 cm的脾片。细胞输注3 d后,将1.4处理的受体小鼠放于含乙醚的密闭罐中,2 min后,小鼠进入浅麻醉状态,将其四肢固定于已消毒的木板上,背部朝上,消毒颈部皮肤,在颈部皮肤上切开一约1 cm长的切口,植入供体脾片,用细线缝合切口,并消毒。动态观察受体小鼠的存活情况及移植部位有无红肿及颜色的改变。

1.5.2 移植脾片的病理组织学观察

于小鼠脾片移植后20 d取移植脾片,并取正常雌性昆明小鼠的脾脏做对照,用福尔马林溶液固定,大体观察并拍照后,送由南昌大学一附院病理科做病理切片。

1.5.3 移植脾片小鼠脾单个核细胞表型分析

取移植后1个月t DC组受体脾脏及正常雌性昆明小鼠的脾脏,去包膜后切成大小约0.2 cm×0.2 cm的脾片,置于含RPMI 1640细胞培养液的平皿中碾磨,200目网筛过滤获得细胞悬液,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离单个核细胞,再加入RPMI 1640细胞培养液,洗涤3次。调整细胞浓度为1×106/m L,分别加入PE anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD80、PE anti-mouse CD11c、FITC anti-mouse CD25、FITC anti-mouse CD40、FITC anti-mouse CD86单抗1μL,4℃避光30 min,冷PBS洗涤2次后,进行流式细胞仪分析。

1.6 数据统计学处理

计量资料实验数据以均数±标准差表示。所获数据均采用SPSS 11.5版软件包进行统计学处理。单变量两组资料均数间比较用t检验。以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 小鼠免疫耐受模型的建立

脾片移植的受体小鼠,在体内输注骨髓细胞、常规DCs、t DCs后,移植部位无红肿、脓液渗出及颜色的改变,小鼠至今仍存活,且活动情况、进食、毛发、皮肤正常,未出现移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease,GVHD),表明本实验方法的t DC输注和脾片移植对受体存活无明显影响。

2.2 移植脾片的形态学及病理检查

正常脾组织:灰红色,脾实质内红髓、白髓清晰可见,结构清楚。空白对照组:灰白色,脾实质内红髓消失,代之以大片的变性坏死,仅存少数结构不完整的白髓,包膜下局部可见含铁血黄素。骨髓细胞组:浅灰红色,细胞水肿,可见泡沫状胞浆,未见红白髓。常规DC组:灰褐色,包膜下出血,脾实质可见变性坏死,少许红髓残留,从中央到包膜下变性坏死梯度性加重,中央区组织结构相对完整,活组织多。t DC组:灰红色,脾结构清楚,细胞轻度水肿,未见明显变性坏死,中央血管扩张、充血,见图1。

2.3 流式细胞仪检测小鼠脾单个核细胞表型分析

移植后1个月取t DC组小鼠及正常雌性昆明小鼠的脾脏,用流式细胞仪对脾单个核细胞CD4+CD+25、CD80、CD86、CD40和CD11c的表达进行分析,结果如下:t DC组小鼠脾单个核细胞CD4+CD+25双表达细胞为(18.15±0.66)%,比正常小鼠的(6.5±0.55)%高近3倍,差异有显著性(P<0.05);t DC组小鼠体内CD40、CD11c、CD80和CD86表达分别为(7.01±0.69)%、(20.17±1.15)%、(11.73±0.86)%和(29.04±1.19)%,与正常小鼠的(17.56±0.44)%、(27.77±1.95)%、(35.95±0.73)%和(36.12±0.69)%相比更低,差异有显著性(P<0.05),见图2～4。DC通过T细胞克隆清除与诱导T细胞无能,清除自身反应性T细胞,从而诱导中枢免疫耐受。

3讨论

3.1 tDC诱导免疫耐受的机制

t DC如何诱导免疫耐受机制可能涉及到以下几个方面。

3.1.1 tDC诱导中枢免疫耐受

目前认为胸腺内的DC通过T细胞克隆清除与诱导T细胞无能,清除自身反应性T细胞,从而诱导中枢免疫耐受。

3.1.2. tDC诱导外周免疫耐受[3]的机理[4]

(1)诱导外周T细胞的无能或低能反应:未成熟DC表面表达低水平的MHC分子,几乎不表达CD40、CD80、CD86、IFA23等激活T细胞所必须的辅助分子[5],所以虽然它们具有很强的抗原摄取加工能力,但由于缺乏多种共刺激分子不活化T细胞,导致T细胞的无能或低反应,从而诱导抗原特异性耐受。(2)诱导激活T细胞的调亡:DC能表达抑制T细胞生长或诱导T细胞凋亡的分子(如NO、Fas L等),使得DC具有破坏T细胞应答的能力。(3)诱导调节性T细胞:DC可诱导产生Treg细胞[6],Treg细胞通过与DC的相互作用,反馈性加强了其耐受状态。这一作用可能与Treg细胞分泌IL-10、IFN-γ等细胞因子有关,其中IFN-γ可诱导DC表达吲哚2,3-脱氧酶,并产生色氨酸分解作用,从而导致T细胞增殖必需的色氨酸缺乏而抑制了T细胞应答。(4)选择性激活Th2样T细胞亚群:DC的耐受性可能与选择性激活Th2样T细胞亚群有关。最近有人将DC根据其功能不同分为DC1/DC2,其中DC1可产生大量IL-12、TNF-α和少量IL-6,诱导Th向Th1分化[7];而DC2可分泌大量IL-6和少量IL-12,诱导Th向Th2分化。在移植免疫中,Th1可致明显的急性排斥反应而使移植物丧失功能;而Th2则被认为对移植具有保护意义。

本实验中将体外培养的t DC输注受体小鼠体内,t DC组的移植脾片大体形态呈灰红色,与移植部位周围组织建立血液供应;病理学观察组织结构完整未见明显变性坏死,与正常脾组织结构相似。而空白对照组、骨髓细胞组、常规DC组与周围组织未建立血液供应;病理学观察组织结构受破坏。提示t DC组的受体小鼠对供体移植脾片未产生明显的排斥反应,形成了免疫耐受。然而t DC组脾片病理学表现与正常脾结构相比中央血管扩张、充血,部分细胞轻度水肿。其原因可能移植脾片在建立血供前存在缺血缺氧引起的细胞损伤,至取材时尚未完全恢复。

3.2 t DC与调节性T细胞相互作用的影响

本研究观察到t DC组小鼠脾单个核细胞CD4+CD+25双表达细胞为(18.15±0.66)%,比正常小鼠的(6.5±0.55)%高近3倍,差异有显著性(P<0.05)。提示t DCs在体内能诱导CD4+CD+25调节性T细胞的产生,从而诱导受体产生一定程度的特异性免疫耐受。t DC组小鼠体内CD11c、CD40、CD80和CD86表达比正常小鼠均低,表明输t DC的小鼠体内不仅树突状细胞数量有一定减少,且树突状细胞表面共刺激分子表达也降低。其原因可能是外源性DC输注抑制了内源性DC的产生,或增多的T调节细胞反过来抑制免疫源性DC产生及促进低表达共刺激分子的DC产生,进一步增强免疫耐受的作用。

近年积累的大量实验证据表明,机体可能更主要地通过CD4+CD+25调节性T细胞以“主动”的方式维持自身免疫耐受。CD4+CD+25T细胞是机体中主要的调节性T细胞,在体内发挥免疫调节功能。CD4+CD+25T细胞能分泌TGF-β和IL-10,这2种细胞因子都能抑制DC的成熟,因而它能诱导t DC的产生。YAMAZAKI等[8]用骨髓来源DC与CD4+CD+25T细胞共培养,发现DCs能刺激CD4+CD+25T细胞活化增殖,这种刺激作用须通过细胞间的相互接触来实现,增殖后的CD4+CD+25T细胞仍保持原有的抑制作用。这说明DC与CD4+CD+25T细胞在诱导免疫耐受中是相互促进,相辅相成的。更令人兴奋的是,MIN等[9]发现t DC能刺激初始T细胞转化成调节性T细胞,反过来,CD4+CD+25T细胞也能促进DC前体细胞分化为具有耐受性的DC。这样t DC与Treg细胞之间形成了一个抑制性的反馈,在诱导和维持免疫耐受中起重要作用。SAKAGUCHI等[10]研究提示:CD4+CD+25T细胞是维持自身免疫耐受的主要因素之一,CD4+CD+25T细胞在不同种属呈进化保守性,人与小鼠及大鼠的CD4+CD+25T细胞不仅有类似的表型和分布,且均具有体外抑制T增殖和(或)维持自身免疫耐受的作用。

3.3 tDCs输注数量、途径及安全性

本组实验中每只小鼠应用t DCs 1×106个细胞,获得了良好的诱导免疫耐受效果。t DC体内应用的数量尚无标准。一般认为t DC注射的细胞数量与免疫耐受程度成正比。但是否细胞数量越高,免疫耐受程度越高,有无平台效应,细胞数量多少为最佳尚需进一步研究。

输注途径包括外周静脉、动脉、门静脉、胸腺、腹腔或皮下注射等方法,早期DC的输注途径多采用静脉注射。近年来,采用皮下、皮内、腹腔内注射的方法得到了广泛的应用。小鼠尾静脉较细,不易进行细胞输注。若经门静脉或胸腺输注需要行开腹或开胸手术,对机体损伤大,临床应用时难以为患者接受。本实验中笔者采用小鼠腹腔内注射t DCs,t DCs输注前未做任何放疗、化疗和免疫抑制剂预处理,输注后未给免疫抑制治疗。受体小鼠输注部位无红肿、脓液渗出及颜色的改变,且活动情况、进食、毛发、皮肤正常。所有输注小鼠未发生GVHD,无动物死亡,表明腹腔内输注t DCs对受体的存活无明显影响,且具有诱导免疫耐受的效果。此外,本实验中的其他组采用腹腔注射骨髓细胞、常规DCs也未产生GVHD,也无动物死亡,进一步说明腹腔注射用于细胞治疗安全性好。

总之,在移植脾片小鼠模型,经腹腔注射t DCs能诱导受体对移植器官产生特异性免疫耐受。小鼠体内输注t DCs,其脾脏CD4+CD+25Treg细胞增高,CD11c、CD40、CD80和CD86表达降低。腹腔注射t DCs安全性较好,并能形成稳定的嵌合,且维持1个月以上。

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树突状细胞免疫 篇2

树突状细胞 (dendritic cells, DCs) 是人体内专职的抗原呈递细胞, 它能有效活化同源T淋巴细胞产生抗原特异性免疫应答[2], 现阶段利用DCs呈递抗原进而诱导特异性抗肿瘤免疫治疗时是肿瘤免疫治疗领域一个研究的热点。

将TACE与DCs治疗联合在一起, 为肝癌的治疗又提供了一种有效的手段。现国内外开展此类治疗极少, 本文总结了45例应用TACE联合DCs治疗前后肝癌患者的AFP值、肿瘤的大小变化及症状改善。现报道如下:

1 临床资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年2月~2012年8月, 应用TACE联合DCs治疗的肝癌患者45例。其中, 男27例, 女18例, 年龄45~64岁, 平均 (52.25±5.63) 岁;45例肝癌患者均经临床、B超、CT、AFP及肝动脉造影确诊。

1.2 治疗方法

术前30 min给予苯巴比妥50 mg肌肉注射、地西泮10 mg静脉注射。采用改良seldinger穿刺技术, 经皮穿刺股动脉, 进行股动脉插管, 导管于第一腰椎初行动脉造影, 寻找肝动脉, 了解其走形、有无门静脉瘘、动脉瘘、肿瘤供血及分布情况, 进一步超选择。选择肿瘤供血血管, 依次进行化疗药物局部灌注, 具体灌注药物为5-Fu 500 mg、羟喜树碱20 mg、表阿霉素30~40 mg。最后应用40%超液态碘化油5~10m L进行栓塞。术后应用DCs静脉滴注治疗, 隔日一次, 6次为一疗程。

1.2.1 疗效评价

术后72 h、2周、1个月分别复查血、尿、便常规, 肝肾功, 凝血机制及AFP, 并于术后1个月后行B超, CT复查病灶大小[3]。按WHO的疗效评定标准。完全缓解 (CR) :可见的肿瘤完全消失, 维持4周以上。部分缓解 (PR) :肿瘤病灶的最大直径及其最大的垂直横经的乘积缩小>50%, 病灶无增大, 无新病灶出现, 维持4周以上。无变化 (NC) :肿瘤病灶的两径乘积缩小<25%, 且无新病灶的发现。进展 (PD) :肿瘤病灶的两径乘积增大>25%或出现新病灶, 进而可以行再次TACE联合DCs治疗。

1.2.2 统计学分析

所有数据采用SPSS13.0统计软件, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 组间对比采用χ2检验, P<0.05表明差异有显著性。

2 结果

2.1 术中、术后情况

术中少数患者出现恶心、呕吐, 发生率较低。疼痛是肝动脉灌注最常见的症状, 常给予盐酸布桂嗪预防。术中未出现急性肾功能衰竭、应激性溃疡、上消化道出血等严重并发症。术后大多数患者症状改善, 占21.3%, 食欲增加, 体力及精神状态明显好转。个别出现低热, 嘱多饮水, 必要时应用解热药物后均能缓解。无严重术后并发症出现。

2.2 肿瘤大小、AFP变化

肝癌肿块大小是判断疗效的重要标志[4], 术后1个月进行B超、CT检查了解肿瘤大小情况, 与上次相对比, 所有病例均有不同程度的缩小, 最大缩小率约达80%。肝癌患者中70%~85%AFP阳性, 定量测定在判断病情变化及治疗效果方面有一定意义[5]。一个月后复查AFP, 化验结果均明显降低, 最高降低约70%, P<0.05, 差异具有显著性。

2.3 术后患者生存情况

术后患者1、2和3年生存期分别为88.8%、71.1%和51.1%。由于时间较短, 未完成更长时间的生存期跟踪。

3 讨论

肝癌的血液供应95.0%~99.0%来自肝动脉, 正常的肝组织血供则是70.0%~75.0%来自门静脉, 仅25.0%~30.0%来自肝动脉。TACE治疗肝癌可使其局部药物浓度高于正常肝脏组织5~20倍, 而肿瘤的杀伤能力与局部的抗肿瘤药物浓度呈正比, 浓度越高杀伤力就越强。同时肝脏可减轻化疗药物的毒副作用, 减轻全身的副反应。对于一些血供明显的肝癌患者, 可以应用局部栓塞, 栓塞后肝癌的血供受限, 致使肿瘤缺血坏死, 而正常的肝脏主要由门静脉供血, 不受影响[6]。

但是, TACE治疗后, 肝癌组织中浸润的DCs数量明显减少, 而且VEGF (血管内皮生长因子) 的表达明显增强, 这可能导致TACE术后肝癌复发及转移的重要原因之一。在体外被肿瘤负载的DCs所诱导的肿瘤反应性T淋巴细胞是肿瘤特异性的, 未发现其对自身淋巴细胞有直接的损伤作用。说明DCs在诱导和维持抗肿瘤免疫反应中起重要作用。有研究显示DCs和淋巴细胞浸润多的病人的复发时间和生存时间明显要长。TACE后的肝癌患者其抗肿瘤免疫明显减弱, DCs减少, VEGF增加。故给予DCs治疗可以与TACE相辅相成, 提高肿瘤患者的免疫能力[7]。

目前应用DCs治疗临床观察较少, 尤其大样本随机对照研究仍很缺乏, 故对其确切的疗效尚有待于商榷。现阶段对于其抗肿瘤作用的机制尚不明朗, 所以与其他治疗方法进行结合仍在探索之中。但其切实能改善患者的体力、食欲、睡眠等方面, 能减轻患者应用化疗药物的副反应。肿瘤标志物大多有下降, 免疫功能有所提高, 而且应用DCs治疗安全性高, 未见明显不良反应[8]。其不仅可以一定程度上控制肿瘤进展, 改善患者症状, 延长生存期, 为晚期肿瘤患者提供了一种新的治疗措施, 具有良好的应用前景和一定的推广价值。

摘要：目的 探讨经肝动脉灌注栓塞—肿瘤树突状细胞免疫 (TACE-DCs) 介入治疗肝癌的临床疗效。方法2009年2月2012年8月, 我院对45例肝癌患者行肝动脉灌注栓塞—肿瘤树突状细胞免疫治疗, 灌注抗癌药物为5-Fu 500 mg, 羟喜树碱20 mg, 表阿霉素3040 mg;40%碘化油510 mL进行肝动脉栓塞;树突状细胞辅助治疗。结果 45例均成功施行肝动脉灌注栓塞术并应用树突状细胞治疗。手术成功率100%, 总有效率91.1% (41/45) 。患者肝癌均有不同程度缩小, AFP也不同程度的下降。1、2和3年生存率分别为88.8% (40/45) 、71.1% (32/45) 和51.1% (23/45) 。结论 TACE-DCs治疗肝癌临床疗效好, 创伤小、并发症少、安全。

关键词：动脉栓塞,树突状细胞治疗,肝癌

参考文献

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树突状细胞免疫 篇3

1 DC的来源及其生物学特性

DC因其表面有许多树枝状突起而得名, 于1973年首次由Steinman和Cohn发现。DC均来源于体内的多能造血干细胞, 主要分为三大类: (1) 皮肤DC, 即郎格罕细胞 (Langerhans cell, LC) ; (2) 髓系来源的DC (myeloid-drived DC) , 与单核细胞、粒细胞有共同的祖先; (3) 淋巴系来源的DC (lymphoid-related DC) , 与T细胞、B细胞有共同的前体细胞。其中髓系DC是体内最主要的DC。大多数DC来源于骨髓, 由骨髓进入外周血, 再分布到全身各组织。DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器, 数量极少, 仅占外周血单个核细胞的1%以下。

DC的基本功能是识别、摄取、处理、加工和提呈抗原, 最大的特点是直接激活静息型T淋巴细胞产生免疫应答[1], 能刺激幼稚T细胞活化和增殖, 是机体免疫应答的始动者, 因此, 调节DC可以诱导免疫应答或耐受。在摄取抗原之前, DC处于未成熟阶段, 称为未成熟DC (immature DC, imDC) 。imDC位于外周非淋巴组织, 以吞噬、巨吞饮和受体介导的内吞作用摄取抗原, 具有强大的抗原摄取和处理能力。获取抗原后, imDC逐渐分化成为成熟DC (mature DC, mDC) , 上调主要组织的相容性 (抗原) 复合物Ⅱ (MHCⅡ) 、共刺激分子 (CD86、CD80和CD40等) 和趋化因子受体 (CCR7等) 等的表达, 完善其活化幼稚T细胞的能力, 同时, 它们显著地下调其抗原摄取能力并向二级淋巴组织迁移, 从而导致免疫应答或耐受。

2 DC与RA发病机制的相关性

最新研究发现, RA的发病机制可能与机体自身免疫耐受被破坏有关, 病程中APC对自身抗原异常提呈, 自身反应性T细胞被激活致自身免疫反应亢进, 从而产生一种免疫性炎症。DC作为唯一能激活初始型T细胞的重要抗原提呈细胞, 同时能分泌大量的促炎因子和抗炎因子, 与RA的炎症活动情况有密切关系, 在RA的发病机制中起着重要作用[2]。

研究发现, DC的存在部位与RA炎症病变部位非常一致, 在RA炎症病变较重的部位DC的数量也较多[3], 从形态学所见证实了DC与RA的炎症活动情况有密切关系。活动期RA患者滑膜液及滑膜周围组织表达与DC分化有关的共刺激因子明显增多, 而上述指标在RA外周血新分离的DC上很少或几乎不表达[4]。韩捷等[5]通过实验发现, 具有较强抗原提呈功能的DC受到抗原刺激后逐渐由外周血转移至关节, 转化为成熟DC, 摄取和处理抗原提呈的能力下降, 激活T细胞能力增强, 在关节局部通过激活Th细胞引起自身免疫反应, 造成组织损伤。此外还发现细胞毒性T淋巴细胞抗原4免疫球蛋白 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 IgG1, CTLA4 Ig) 通过封闭DC上协同刺激分子CD80、CD86和与之相结合的T细胞上的CD28分子可阻断DC激活T细胞, 从而阻止炎症反应。CTLA4 Ig已应用于临床并取得疗效, 进一步支持了在RA发病中DC与T细胞相互作用可能起重要的作用[4]。

3 DC与RA的免疫耐受治疗

研究发现, 临床常用治疗RA有效的药物, 在控制RA的同时调节了DC的功能, 抑制了DC的成熟或活性, 诱导了免疫耐受, 可能是治疗RA重要机制之一。

3.1 可调节DC功能的西药

(1) 非甾体抗炎药 (NSAIDs) 。

阿司匹林是治疗RA的NSAIDs之一。实验发现, 阿司匹林可以特异地阻止DC成熟, 经其处理过的DC表现出很弱的T细胞刺激能力, T细胞的IL- 2分泌也减少[6], 可能在RA的治疗中发挥一定作用。

(2) 改善病情的抗风湿药 (DMARDs) 。

目前, 来氟米特 (leflunomide, LEF) 和环孢素 (CsA) 作为常用治疗RA的DMARDs也有关于调节DC功能的研究。董光富等[7]通过实验发现, LEF可以通过阻断NF-κB的活化和基因表达, 从而抑制DC成熟和CD86表达, 抑制T细胞向Th2分化, 达到治愈炎性病变的目的。研究[8]发现, CsA通过使细胞内神经钙蛋白活性降低, 使灭活的κB减少, 抑制了NF-κB的核转位及其转录活性, 进而使DC表面的共刺激分子 (CD80、CD86) 表达下降。进一步证实了CsA可以抑制DC的成熟, 而不影响其发育分化, 并可以通过抑制DC成熟而发挥免疫抑制作用。

(3) 糖皮质激素 (glucocorticoid, GC) 。

GC是广谱的免疫抑制药物, 在RA急性发作或伴有心肺等器官受累的重症患者中, 能够迅速减轻关节疼痛、肿胀。GC可作用于T细胞、单核和 (或) 巨噬细胞、破骨细胞、DC等多种细胞。曾有学者研究指出GC及其类似物能抑制DC分化发育, 增加DC内吞活性, 抑制DC提呈抗原, 降低共刺激分子表达和减少脾脏中DC数量, 从而降低了DC刺激T细胞的活性。Kim等[9]进一步证实GC与DC的凋亡呈时间效应关系和剂量效应关系。

(4) 免疫抑制药物 (immunosuppressive drug, SD) 。

他克莫斯 (FK506) 是治疗RA的免疫抑制药物之一。Morelli等[10]发现FK506能够抑制大鼠骨髓系来源的DC发育成熟, 但不影响MHC- Ⅱ类分子及协同刺激因子的表达。他们还发现给予FK506干预后的同种异体基因受体, 氨基酸3激酶配体能够诱导增强供体骨髓来源的DC黏附于宿主淋巴细胞组织, 从而抑制T细胞的增殖反应和活性, 并呈现为剂量依赖关系。郑凯等[11]研究发现在大鼠体内实验中, FK506-DCs回输给受者后可明显延长移植物存活时间。FK506处理的DCs能抑制T淋巴细胞向Th1的分化, 并诱导其向Th2分化, 这可能是移植物长期存活的主要或至少是相关的重要因素。此外发现FK506可以抑制淋巴细胞来源、炎性表皮细胞来源的DC免疫球蛋白IgE的表达, 同样的结果在对人淋巴细胞来源的DC的功能影响[12]也已见报道。

(5) 生物制剂。

近年来, 肿瘤坏死因子拮抗剂在RA治疗中应用逐渐增多。Infliximab是肿瘤坏死因子拮抗剂的代表药物之一。最近做了使用infliximab治疗RA前后 (24 h和6个月) 循环中DC的表型分析, 并对这种变化与治疗的临床反应相联系进行分析, 显示在临床改善的同时, DC活化的标志降低, 支持肿瘤坏死因子拮抗剂在阻滞循环DC成熟和减少活化标志表达的作用[13]。

3.2 治疗RA的药物中可调节DC功能的中药

(1) 雷公藤 (Tripterygium wilfordii) 。

雷公藤多甙和雷公藤内酯也是治疗RA常用的中药提取物。雷公藤多甙 (5～20 μg·ml-1) 能下调DC表面HLA-DR和CD80的表达, 抑制DC内IL- 12 p 40 mRNA的转录和分泌, 进而通过抑制表面分子的表达和细胞因子的合成而干扰DC的成熟和功能[14]。此外, DC还调控幼稚T细胞的T辅助细胞1型 (Th1) 或Th2表型转化, 若DC经雷公藤修饰, 可促使T细胞向Th2表型转化, 诱导受体发生特异性移植免疫耐受, 是目前诱导移植后免疫耐受的有效方法, 可能亦是克服移植排斥的重要途径[15]。同时研究还发现, 雷公藤内酯能够抑制成熟或不成熟DC的NF-κB水平, 从而影响DC的功能和成熟, 并且能诱导DC凋亡。

(2) 青风藤 (Orientvine stem) 。

青藤碱 (SN) 是从传统中药青风藤中分离出来的一种单体成分, 研究发现, SN对RA的治疗作用与抑制DC的免疫活性有关。其作用机制是抑制DC介导的抗原提呈和协同刺激信号的表达, 导致T细胞的活化失常[16]。杨承英[17]研究发现, 合适剂量的SN可以促进单核细胞分化为DC, SN处理单核细胞可使CD1a表达明显上调;然而SN处理imDC不仅使CD83、HLA明显下调, IL- 12分泌减少, 且抗原捕捉能力较强, imDC成熟受到抑制, 从而抑制了DC刺激T和B细胞活化的能力。

(3) 姜黄 (Turmetric yellow) 。

临床用姜黄的提取成分姜黄素治疗RA疗效显著。研究发现, 姜黄素可以提高DC通过甘露糖受体介导的细胞内摄作用, 增加DC捕获抗原的能力。进一步研究发现, 在脂多糖刺激前用姜黄素处理DC, 可以完全地抑制脂多糖诱导的信号通路MAPK磷酸化和核因子-κB的核转位。姜黄素通过抑制DC对抗原处理和提呈, 减弱了T细胞介导的免疫反应[18]。

4 展 望

RA是一种发生过程非常复杂的自身免疫性疾病。近年来, 有关RA发病机制的研究显示, DC可上调T细胞的免疫应答, 启动自身免疫反应, 是RA发病中心环节之一。利用DC诱导免疫耐受是治疗RA的新策略, 治疗RA常用的中西药物显示了具有抑制DC功能诱导免疫耐受的一定作用, 深入研究这些药物干预DC功能的机制, 同时挖掘更多有效的副作用更小的药物, 通过干预DC诱导免疫耐受治疗RA也将有很好的前景。

树突状细胞免疫 篇4

1资料与方法

1.1研究对象

选取普外科2010年5月 -2012年12月收治的胰腺肿瘤患者共30例。其中男18例,女12例,年龄40~70岁。全部患者都是胰腺肿瘤确诊病例,全部病例按国际抗肿瘤联盟(UICC)标准给予分期(TNM分期),Ⅰ~Ⅱ期9例,Ⅲ期12名,Ⅳ期9例。全部患者卡氏评分≥60分,心、肾、肝脏功能均正常。所有均是根 治手术后 患者 , 术后给予 采自自身 的DC-CIK细胞输注,全部患者在输注DC-CIK细胞前, 医生都与家属及患者本人进行沟通,本人及家属均表示同意,并签字。

1.2主要试剂

rh INF-γ 购自上海克隆生物技术公司,抗人CD3单克隆抗体购自e Bioscience公司,人rh IL-4、rh IL-2、 rh IL-1a、rh GM-CSF购自Pepro Tech公司,Ficoll液、 人无血清培养基AIM-V购自美国GIB-CO公司, FITC标记鼠抗人CD3、CD127单克隆抗体、PE标记鼠抗人CD8、CD4、CD56单克隆抗体、PE-Cy5标记鼠抗人CD25单克隆抗体和同型对照Ig Gα1购自美国BD公司,人IFN-γ、IL-4酶联免疫吸附试验 (ELISA)试剂盒购自晶美生物工程有限公司,rh GMCSF(注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子)购自厦门特宝生物工程股份有限公司。

1.3实验方法

1.3.1树突状细胞的制备所有操作严格遵守标准程序。采集患者外周血2×109~3×109个单个核细胞及血浆80 ml(Kabi Fresenius,German)。经Ficoll Hypaque(Gibco,USA)分离单个核细胞后,离心洗涤重悬,调整细胞浓度为2×106~4×106个 /ml铺入6孔板,培养箱中孵育2 h后,收集悬浮细胞至另一个50 ml离心管继续培养;第3天补加树突状细胞 (dendritic cells,DC)培养液;第5天加入肿瘤特异性抗原(终浓度为20~80μg/ml),诱导后12~16 h加入肿瘤坏死因子(TNF-α,500 U/ml);第8天收集细胞,离心,洗涤,用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬,总体积为100 ml,静脉回输患者,共4次,回输时间选择在2次DC回输之间。

1.3.2细胞因子诱导的杀伤细胞制备将经Ficoll Hypaque(Gibco,USA)分离的单个核细胞重悬于含10% FBS的RPMI 1640培养液中,以2×106个 /ml铺入培养瓶,补加 γ- 干扰素(INF-γ,1 000 U/ml), 置于37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育;次日补加CD3单抗(0.5μg/ml)及白细胞介素 -2(IL-2,1 000 U/ml) 继续培养;第3天用10%FBS的RPMI-1640培养液进行补液;第11~12天收集细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)细胞,离心, 生理盐水洗涤3次。用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬,总体积为100 ml,经静脉回输患者,共4次,回输时间选择在2次DC回输之间。

1.3.3 DC-CIK回输后效果分析如果输入DC-CIK后患者有发热等不舒服的感觉,各项化验有一定的改变,且对患者的生活有严重的影响,这些是评价的指标。

1.3.4患者血液中免疫指标细胞对采集及分析在回输DC-CIK之前7 d抽取患者血液,并于输注DC -CIK细胞后14 d再次抽取血液,经过处理后,分别加入管中,小管中加入血液及相应的抗体,血液加100μl,抗体量为10μl,抗体分别是CD3-FITC、 CD127-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、CD25PE-Cy5,用Ig Gα1做相应的对照,2者经过反应后, 时间是15 min,反应后再次经过处理,上仪器检测, 检测后行记录数据分析总结。

1.3.5检测Th1/Th2按前述回输DC-CIK之前7 d抽取患者血液,并于输注DC-CIK细胞后14 d再次抽取血液,经过离心等处理后,留取患者血清,置入冰箱低温冷冻备用。取ELISA试剂盒,按操作程序测定IFN-γ 与IL-4血清中的含量,操作务求规范严密。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,实验设计为自体配对均数的t检验,P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1效果及副反应

总体上,DC-CIK注入人体后,多数患者状态有明显改善,进食增加、精力恢复、乏力倦怠症状消失, 其中有个例患者有暂时的体温升高现象,均未超过39℃,时间较短,应用药物后,体温下降至正常,并没有反复,全部患者无皮疹瘙痒等不良症状,各项化验指标也未见显著变化。

2.2患者免疫指标评价

DC-CIK注入人体后,患者CD3+、CD4+百分比增加,CD8+百分比下降,CD4+/CD8+数值提高;标志CD3+CD56+细胞数量提升;标志CD127low Treg CD25+CD4+细胞比例下降,相比注入CIK-DC细胞前,差异有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。见表1。

2.3细胞因子比较

CIK-DC细胞输注组IFN-γ 含量提高,IL-4含量减少,差异有统计学意义(P <0.01)。见表2。

3讨论

胰腺癌是消化道常见肿瘤,恶性程度高,治疗困难,晚期放化疗都难以延长生存期,临床及科研都在多方探索有效的疗法。治疗的主要难度在于复发和转移,手术前治疗重点在局部,术后治疗重点在于全身,近年开展的生物治疗是有希望的全身治疗办法。

自身防御机制在抗肿瘤过程中发挥着不可替代的作用,T细胞在自身防御的过程中发挥着重要作用,癌症之所以能发生、发展,在于机体免疫状态有了问题,导致免疫监视减弱,正常状态下,人体免疫细胞量和功能都协调一致,能够发挥正常的免疫机制,当这种平衡被打破,免疫功能在一定程度上的缺失,至使肿瘤产生免疫逃逸。实验证明,DC-CIK的输注可以改善患者的免疫状态,是一种有效的支持治疗。患者免疫状态的改善对患者的无病生存期及带瘤生存期的延长都有一个良好的预期。DC细胞是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞,当细胞数量达到一定数量后回输给患者,可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应[4]。最新研究显示,DC细胞与CIK细胞共培养后,提高细胞的增殖速度和杀伤活性,且使其对肿瘤细胞的杀伤作用更具特异性。对于血液、消化、呼吸等多个系统肿瘤细胞均有杀伤作用。 CIK细胞最初是指在正常人体外周血中只占1%~ 5%的CD3+CD56+的T淋巴细胞,目前国内外制备的用于过继免疫治疗的CIK细胞,实际上是体外扩增以CD3+CD56+、CD3+CD8+为主的异质性细胞群[5]。该细胞群具有广泛的非MHC限制的极强的溶瘤活性。CIK增殖能力强,细胞毒作用强,对肿瘤细胞的识别能力很强,能精确“点射”肿瘤细胞,但不会伤及 “无辜”的正常细胞。能消除残留微小的转移病灶, 对手术后或放化疗后患者效果显著,因此,CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

本文结果表明经过以往的治疗后,机体的免疫力受到不同程度的打击和抑制,有些已不能进行下一步治疗。经过DC-CIK细胞的提取和输注后, CD3+、CD4+含量和CD4+/CD8+数值升高,共表达CD3+CD56+细胞含量显著提高。CIK细胞对肿瘤细胞有直接的杀伤,在体内受某些淋巴因子作用后,CIK细胞大量释放具有细胞毒性的胞浆颗粒到胞外,这些颗粒直接破坏瘤细胞,进入体内活化的DC-CIK细胞分泌多种细胞因子,如干扰素 γ、TNF-α 和IL-2等,不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用,而且还可通过调节免疫系统间接杀伤肿瘤细胞。

1995年SAKAGUCHI等人首先提出CD4+CD25+Treg,引起免疫界越来越多的关注。CD4+CD25+Treg细胞可以维持自身免疫耐受,由于肿瘤抗原是自身抗原量或质的改变,因此,可以推测CD4+CD25+Treg细胞可以抑制肿瘤免疫的发生。研究发现无论癌症患者还是肿瘤动物模型,其外周CD4+CD25+Treg细胞数量及功能均不同程度地增高,与患者死亡率增加,存活率降低密切相关。去除CD4+CD25+Treg细胞, 利于诱导对多种肿瘤抗原的免疫应答,证明CD4+CD25+Treg细胞可以抑制体内抗肿瘤免疫反应。因此,CD4+CD25+Treg细胞可能在肿瘤逃逸、促进肿瘤的生长中发挥重要作用,也可能是肿瘤疫苗和免疫增强剂难以奏效的原因。

文献显示CD4+CD25+CD127lowTreg是人体自有的,可以识别身体内被激活的T淋巴细胞[6],对Treg尤其可以区别,其特异性在目前发现的细胞标志中可以说是高的,而这种技术的发现,已经在临床中得到应用,效果良好。应用流式细胞术三色标记法检测患者血液里CD4+CD25+CD127lowTreg含量,可以对Treg在血液中的含量反映得更精准。上述研究检测DC-CIK细胞输注前后血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量,可以看出胰腺肿瘤患者输注DC-CIK前血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量较多。DC-CIK细胞输注2星期,患者血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量减少。因而,CIK细胞以减少Treg含量的方式增强患者的免疫功能。

人体的免疫结构中,细胞因子有着重要的地位。 从产生细胞因子和其功能作用的区别,细胞可区分为Th1细胞与Th2细胞。Th1的细胞作用是使人免疫力更强,这类细胞可以分泌诸如IFN-γ、IL-2等因子;Th2细胞分泌诸如IL-4、IL-10等因子,在体液免疫中发挥关键效能。健康状态下,人体处在一个免疫平衡状态,Th1、Th2分别分泌增强免疫和抑制免疫的因子[7],互相制衡。肿瘤患者疾病的开始及进展均有Th1参与的免疫机能伴随。上述通过检测两类细胞因子在血液中的含量,可以看出输注DC-CIK细胞的患者,IFN-γ 含量增加,IL-4含量减少。显示DC-CIK细胞输注在一定程度上影响着Th1/Th2的平衡,保持人体免疫状态的平衡,促进免疫系统对肿瘤的免疫反应。

总之,DC-CIK细胞输注对增强胰腺肿瘤患者T淋巴细胞生理效能,减少患者血液中Treg的含量, 同时使Th1/Th2的比例保守一个相对稳定的水平起到关键作用。但是,上述论述所涉范围有限,DC-CIK细胞对胰腺肿瘤患者更深层次的作用及效果还有待揭示。

摘要：目的 探究树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)细胞输注对胰腺肿瘤患者的影响。方法对30例经病理证实的胰腺肿瘤患者输注自体DC-CIK细胞,每例均在输注前、后抽取血液,应用流式细胞技术测量T细胞亚群和CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(Treg)的改变;ELISA法测量IFN-γ和IL-4数值的变化。结果 患者输注后外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+T细胞含量增加,CD4+/CD8+含量增加,CD8+T细胞含量减少(P<0.01);CD4+CD25+CD127low Treg减少(P<0.01);Th1细胞因子IFN-γ含量较输注前增加,而Th2细胞因子IL-4含量减少(P<0.01)。结论 DC-CIK细胞输注可以改善胰腺肿瘤患者的免疫机能,加强人体的抗肿瘤免疫应答,是治疗胰腺肿瘤患者的一个方法。

树突状细胞免疫 篇5

关键词：肺癌,树突状细胞,细胞因子诱导的杀伤细胞,护理

树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞 (DC-CIK) 抗瘤治疗是一种自体免疫细胞回输疗法, 通过对自体免疫细胞进行体外激活和扩增, 并加入多种生长因子, 然后重新输回肿瘤病人体内[1], 通过激活自身免疫反应杀伤肿瘤细胞, 从而达到治疗的目的。与放化疗相比, DC-CIK抗瘤疗法具有损伤小、安全、不良反应少等优点, 尤其是对于一些年老体弱、机体抵抗力较弱不能耐受放化疗的老年病人, 更是首选。目前, DC-CIK抗瘤疗法在国内甚至国际的生物治疗领域都具有良好的前景, 更是开辟了治疗癌症的新途径。为了促进DC-CIK抗瘤疗法的规范化, 探讨有效的护理方法, 我院对40例晚期肺癌病人实施DC-CIK抗瘤治疗, 现将护理总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年1月—2014年1月我院收治的40例晚期肺癌病人, 其中男28例, 女12例;年龄39岁~68岁 (32.7岁±8.9岁) ;均经病理学诊断为Ⅲ期、Ⅳ期肺癌, 其中鳞癌26例, 腺癌8例, 大细胞癌6例;均无放化疗及手术指证, 均实施DC-CIK抗瘤治疗。

1.2 治疗方法

每位病人实施DC-CIK治疗2个疗程, 共回输12次, 每次输注细胞数不低于5×109个。DC细胞采用皮下注射, 按病人实际情况选择注射部位, 隔日1次, 每次1 mL, 共4次;CIK细胞采用静脉回输, 每次100mL, 隔日1次, 共2次。注意在单核细胞和淋巴细胞分离和培养过程中必须保证严格无菌, 所有细胞均经检验合格后再将细胞回输给病人[2]。

2 护理

2.1 心理护理

主动与病人进行沟通, 了解病人的实际需求。由于治疗方法比较新颖, 家属及病人对于治疗方法缺乏一定的认识和了解, 存在一些疑惑和焦虑心理[3]。术前应该主动向病人介绍DC-CIK抗瘤治疗的操作程序、疗效、风险性、优越性、毒副反应等, 让病人有一个大致的了解, 并介绍国内外相关成功案例, 消除病人的不确定感和不安全感。告知病人外周静脉采血50mL~80mL在人体的正常耐受范围内, 对人体没有影响。细胞回输后出现体温升高的现象也不用担心, 体温很快可自行缓解或使用解热药后降至正常水平, 消除病人的担忧和恐惧。建议病人通过聆听一些舒缓的轻音乐或是阅读一些笑话、杂志等分散注意力, 避免过度焦虑和紧张。告诉病人家属要多关心、留意病人的言行举止, 一旦发现异常及时通知医护人员, 认真做好陪护工作。告诉病人大多数肿瘤通过此方法治疗后可以得到很好控制, 改善生活质量, 提高病人治疗的信心。鼓励病人以积极乐观的心态对待疾病, 主动配合医生和护士的工作。

2.2 细胞回输护理

做好细胞回输前的准备工作, 认真核对病人的信息和各项检查结果, 同时检查分离培养细胞的存活情况。保证无菌操作, 认真核对细菌、真菌、支原体和内毒素检查结果。回输CIK细胞时注意事项:细胞回输尽量在半小时之内完成, 在回输过程中密切监测病人的生命体征, 一旦发现异常情况立即停止输注, 回输结束后仍用生理盐水行管路冲洗, 减少细胞损失, 拔除静脉通路, 停止心电监护;回输后由当班护士将回输袋送回实验室妥善保管。

2.3 并发症皮疹的护理

对于细胞回输后出现皮肤瘙痒、身上有红斑的病人, 告诉病人不要慌张, 这是由于机体对DC-CIK细胞溶液某些成分的轻微变态反应。嘱病人不要抓挠, 以免皮肤破溃后诱发感染, 可以遵医嘱应用异丙嗪25mg肌肉注射。

2.4 胃肠道护理

对治疗后出现恶心、呕吐无法进食的病人, 首先做好病人的安慰工作, 如果病人仍然克服不了, 可以遵医嘱给予甲氧氯普胺10mg每天3次口服。详细记录病人呕吐次数、量及呕吐物颜色、性质, 观察有无水电解质紊乱, 鼓励病人呕吐后适当进食。指导病人练习腹式呼吸以减轻恶心感, 防止误吸造成吸入性肺炎。

2.5 发热护理

定期测量病人体温, 一般治疗24h内很多病人会出现体温升高的现象, 无寒战。部分病人体温可以自行恢复正常。对于体温持续升高的病人可以采用物理降温的方法, 给病人进行温水、酒精擦浴, 擦拭过程中注意动作要轻柔, 避免损伤病人的皮肤造成刺激和感染。也可以适当补液或口服一些解热药, 但避免使用糖皮质激素降温。

2.6 日常生活护理

为病人提供科学的饮食指导, 鼓励病人多进食高蛋白、低脂肪、易消化、好吸收的食物, 饮食上要清淡, 忌油腻、忌辛辣。多食富含维生素和膳食纤维的食物, 如水果、青菜等, 促进胃肠蠕动, 防止便秘。病人身体好转后可以进行适当运动, 注意运动强度和运动量要适宜, 尽量选择一些户外比较舒缓的运动, 如慢走、太极拳等, 不仅可以呼吸新鲜的空气, 锻炼心肺功能, 还能促进全身血液循环, 增强身体的抵抗力。嘱病人保证充足的睡眠和休息, 规律作息, 防止过度劳累, 保持充沛的精力和体力。在日常生活中尽量要求病人自己独立完成一些力所能及的事情, 如吃饭、穿衣等, 锻炼病人的肢体功能, 增强病人的自理能力, 有利于提高病人的生活质量和适应社会的能力。

3 结果

40例病人顺利完成2个疗程治疗, 13例病情部分缓解, 27例病情稳定;治疗后1例病人出现皮疹, 经过药物治疗4h后病情得到明显缓解。2例病人出现恶心、呕吐, 及时服药及补充水电解质后可以正常进食。6例病人出现一过性发热反应, 其中3例自行缓解, 另外3例通过物理及药物降温后体温很快恢复正常。

4讨论

从20世纪80年代初, 美国国立癌症研究所Rosenberg博士建立淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK) 用于肿瘤治疗, 开创了肿瘤生物治疗新纪元。它是一种全新的肿瘤生物治疗方法, 利用自身的免疫细胞杀伤癌细胞, 不仅可以避免放化疗所带来的巨大副反应, 还能明显抑制肿瘤细胞的增殖及生长[4], 能够有效控制病情发展, 延长病人的生存时间及生活质量, 是目前治疗晚期癌症的一种有效方法。由于其治疗方法比较新颖, 在CIK细胞回输治疗恶性肿瘤的过程中对护理人员的要求也较高, 护理人员除了具备常规的专业知识外, 还需要了解心理学、营养运动学等相关知识, 关注病人的需求, 为病人提供良好的护理服务。

本组病人结果显示, 病人经过治疗和精心的护理以后, 疗效较为显著, 对术中出现的并发症也得到及时有效解决。治疗过程的顺利实施与治疗后的显著疗效与护理有密切的关系。通过有效的心理辅导可以缓解病人的紧张情绪, 解开病人的疑惑, 使病人对治疗更加放心。科学的心理支持不仅增强了病人治疗的信心, 同时也加强了护理人员与病人之间的交流, 使病人对护理人员更加信任, 主动配合各项检查及治疗[5]。治疗过程中护理人员认真负责的态度和专业娴熟的技能可以确保手术的顺利进行, 将手术风险降至最低, 最大可能地确保病人的安全。术后并发症的护理可以防止感染发生, 促进病人早日康复。对于日常生活方面, 充分体现了护理工作中以人为本的核心精神。主动关心病人, 为病人提供生活上的帮助和指导, 让病人更好地适应周围的环境和生活, 有效提高病人的生活质量。

参考文献

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[2]陈颖.DC-CIK细胞过继免疫治疗恶性肿瘤的护理体会[J].临床医药实践, 2010, 19 (3A) :218-220.

[3]程月芳.心理护理对恶性肿瘤首次化疗患者的实施体会[J].中国实用医药, 2011, 6 (20) :190-191.

[4]陈进.DC-CIK生物联合治疗晚期肿瘤56例护理与观察[J].齐鲁护理杂志, 2011, 17 (1) :59-62.

树突状细胞免疫 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

白细胞介素-4 (IL-4) 和粒细胞-巨细胞集落刺激因子 (GM-CSF) , 购自美国PEPRO TECH公司;RPMI 1640培养液、青霉素、链霉素, 购自美国HYCLONE公司;胎牛血清, 购自杭州四季青生物工程材料有限公司;B16黑色素瘤细胞, 购自哈尔滨医科大学肿瘤研究所;C57BL/6N小鼠 (合格证号为SCXK京2004-0001, 8周龄, 雌性, 体重16～22 g, 40只) , 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 DC的分离和培养

于无菌条件下提取小鼠股骨骨髓细胞 (方法参照参考文献[3]) , 放入RPMI 1640培养液 (含胎牛血清、青霉素和链霉素) 中吹打混匀;3 h后取贴壁细胞加入IL-4和GM-CSF, 于37 ℃、5%CO2培养箱中培养;每3 d半量更换1次培养液, 同时加入GM-CSF和IL-4。

1.2.2 肿瘤全细胞DC和ADC的制备

消化、收集对数生长期的B16黑色素瘤细胞, 离心、洗涤、封装入冻存管内;将冻存管缓慢放入液氮内10 min, 取出后立即放入37 ℃水浴箱中水浴10 min, 重复3次;再放入离心机中3 000 r/min离心10 min;取上清液, -20 ℃保存, 备用;在DC培养的第6天加入上述的肿瘤抗原, 共培养3 d后即为ADC, 用倒置相差显微镜观察。

1.2.3 动物模型的建立及免疫细胞的注射

将黑色素瘤细胞复苏后培养、传代, 取对数生长期细胞消化, 离心并调整细胞浓度为1×106个/ mL;取0.2 mL注射到小鼠左侧肩背部皮下, 注射8～10 d后小鼠皮肤会长出肿瘤;在小鼠肿瘤周围皮下注入0.1 mL的DC和ADC, 对照组注射 0.1 mL生理盐水。每天肉眼观察并记录肿瘤的变化, 每3 d测量肿瘤体积1次, 9 d后计算抑瘤率。

1.2.4 光镜观察

取肿瘤与正常组织交界处的皮肤制备光镜样品, 光镜观察。

1.2.5 透射电镜观察

取肿瘤与正常组织交界处的皮肤及局部淋巴结制备常规透射电镜样品, 半薄和超薄切片, 醋酸铀-柠檬酸铅双重染色, 透射电镜观察。

1.2.6 统计学方法

分别测量每只小鼠肿瘤的长 (a) 、宽 (b) 、高 (c) , 肿瘤体积和抑瘤率分别按以下公式[4]计算:肿瘤体积 (cm3) = 4/3π (a+b+c/3×2) 3 , 抑瘤率=[ (对照组肿瘤平均体积-试验组肿瘤平均体积) /对照组肿瘤平均体积]×100%, 分别计算样本均数, 用q检验进行统计学处理。

2 结果

2.1 显微镜观察及肉眼观察结果

在倒置相差显微镜下, 肿瘤细胞形态不规则, 常呈梭形或三角形, 胞核较大, 形状不规则。视野中肿瘤细胞生长旺盛, 呈密集排列 (见图1) 。

在小鼠左侧肩背部皮下注射生长旺盛的B16黑色素瘤细胞 (1×106个/mL) , 0.2 mL/只, 8 d后肉眼可见对照组小鼠脊柱与左前肢之间皮下出现黑色素瘤, 皮肤凸起, 瘤体质地稍硬, 呈黑色, 大小约为1.5 cm×1.5 cm (见图2) , 且肿瘤一直增大, 15 d后生长速度明显加快, 部分结节出现溃疡、大片结痂现象, 小鼠精神萎靡、食欲差甚至死亡。

DC组和ADC组肿瘤体积均缩小 (见图3、图4) , 且ADC组缩小更明显, 肿瘤表面皮肤出现明显皱缩, 黑色变浅, 肿瘤生长变得局限, 部分萎靡小鼠精神状态好转。

每组小鼠肿瘤平均体积和抑瘤率的比较结果见表1。

由表1可知, DC和ADC诱导机体的抗肿瘤效应显著, 与对照组相比均差异显著 (P<0.05) , 且ADC组与DC组抑瘤率比较亦有显著差异 (P<0.05) 。

2.2 光镜观察结果

在光镜下, 对照组肿瘤呈巢状或弥散分布, 可见较多大小不等的黑色颗粒;细胞体积较大, 细胞核不规则, 核仁明显, 胞浆丰富, 可见核分裂相。

注:数据肩标*表示与DC组相比差异显著 (P<0.05) , △表示与对照组相比差异显著 (P<0.05) 。

DC组小鼠可见皮肤中有大量的肿瘤细胞, 呈浸润性生长, 胞核大而不规则, 分裂相较多, 核深染, 淋巴细胞浸润较少 (见图5) 。

ADC组可见皮下组织内有许多黑色素瘤细胞分布, 胞质较大, 周围有大量淋巴细胞浸润, 可见明显的癌团 (见图6) 。

2.3 透射电镜观察结果

2.3.1 DC组电镜观察

肿瘤细胞周围的DC核有切迹, 不规则, 核仁明显, 胞浆丰富, 细胞器较多, 细胞表面突起粗大, 与癌细胞之间有膜接触 (见图7) 。腋窝淋巴结的副皮质区内可见DC, 其表面伸出突起与周围淋巴细胞有紧密的膜接触, 有一个对一个、一个对多个或形成环形接触方式 (有紧密膜接触、点状膜接触、指状膜接触和球状膜接触形式) , DC周围环绕许多淋巴细胞, 形成树突状细胞-淋巴细胞环 (或簇) (见图8) 。

T.肿瘤细胞;D.DC。

L.淋巴细胞;D.DC。

2.3.2 ADC组电镜观察

在肿瘤的周边和边缘区可见ADC、淋巴细胞和癌细胞互相接触或者是几个淋巴细胞同时包绕癌细胞。与ADC接触的淋巴细胞形态不规则, 细胞质增多, 呈活化状态。培养2 d后大量淋巴细胞浸润, 淋巴细胞以多个包绕或单个攻击的形式与癌细胞密切接触 (见图9) 。癌细胞周围可见一群淋巴细胞, 癌细胞核已固缩, 细胞质缩小, 与淋巴细胞接触处有多处较大面积的融合。培养5 d后可见多个淋巴细胞围绕癌细胞或进入癌细胞内, 两者的细胞膜消失, 细胞质融合, 裸露的淋巴细胞核固缩凋亡, 癌细胞细胞质溶解坏死, 两者在互相作用中双双死亡 (见图10) 。

L.淋巴细胞;T.肿瘤细胞。

L.淋巴细胞;T.肿瘤细胞。

3 讨论

3.1 DC诱导特异性CTL的抗肿瘤效应

谢遵江等[5]通过对人胃癌肿瘤浸润DC的研究发现, DC与淋巴细胞、肿瘤细胞之间有着紧密的接触, 接触方式和形式呈多样性, 为DC接受抗原刺激后向淋巴细胞递呈提供了形态学基础。有研究表明[2], 在抗原摄入后到有效抗原递呈的时间是24～48 h。本研究通过透射电镜观察发现局部回输后12小时癌组织周围皮肤内即可见到淋巴细胞散在分布, 12～48 h癌巢周边和边缘区DC、淋巴细胞和癌细胞常常互相接触。透射电镜观察发现, 癌巢周边及附近有很多类高内皮微静脉的存在, 管腔内外有很多淋巴细胞积聚和穿越管壁的淋巴细胞。试验中还发现, DC分枝状小突起与邻近的淋巴细胞以点或面接触, 接触部位有高电子密度颗粒, 与DC接触的淋巴细胞呈活化状态。作者推断淋巴细胞在肿瘤局部与刚刚摄取、处理完肿瘤抗原的DC直接接触并被活化, 杀伤肿瘤细胞, 发挥细胞毒作用, 这与Bodey B等[6]的研究结果相符。

试验发现肿瘤局部皮下注射回输DC 48 h后, 有大量淋巴细胞浸润, 淋巴细胞以多个包绕或单个攻击的形式与癌细胞密切接触, 有时可见淋巴细胞进入癌细胞内与癌细胞融合, 淋巴细胞的细胞核挤压癌细胞核使其凹陷, 这可能是淋巴细胞攻击癌细胞的又一种方式。回输后5～7 d癌细胞出现凋亡和溶解。由于在抗原摄入后到有效抗原递呈的时间是24～48 h[7], 因此认为此时的淋巴细胞是淋巴组织内接受DC递呈的肿瘤抗原后活化进而迁移至肿瘤局部的抗原特异性淋巴细胞, 其杀伤活力大且特异性强。

3.2 ADC诱导特异性CTL的抗肿瘤效应

由肉眼观察可知, DC组和ADC组肿瘤体积均缩小, 且ADC组缩小更明显。DC组和ADC组注射后诱导机体抗肿瘤效应显著, 与对照组相比均差异显著 (P<0.05) , 并且ADC组诱导抗肿瘤作用明显高于DC组, 二者比较差异也显著 (P<0.05) , 此结果表明ADC诱导CTL抗肿瘤效应明显强于DC。

有关DC和ADC的抗肿瘤机理已有很多报道[8,9], 主要是CTL效应和TIL效应。本研究结果的形态学表现提示, ADC不用再摄取抗原就可以直接通过淋巴和血液循环两条经路进入局部淋巴结、递呈抗原、激活副皮质区的淋巴细胞、启动肿瘤免疫应答的初始反应。在肿瘤局部有大量淋巴细胞积聚, 甚至一群淋巴细胞包围癌细胞或进入癌细胞内, 癌细胞核固缩, 细胞质缩小, 与淋巴细胞接触处有多处较大面积的融合, 癌细胞的细胞质溶解坏死, 提示ADC能激发有效的CTL 效应。

试验发现, 在肿瘤局部ADC直接与淋巴细胞接触, 或者ADC、肿瘤细胞和淋巴细胞三者互相接触, 同时发生细胞形态的变化和癌细胞的凋亡、坏死, 说明ADC可以激活TIL特异性细胞毒作用。

透射电镜观察发现, ADC分化成熟度高和处于变形的游走状态, 提示ADC较DC更为成熟, 同时可见多个淋巴细胞围绕癌细胞或进入癌细胞内。因此, ADC比DC诱导CTL抗肿瘤效应更强。

参考文献

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树突状细胞免疫 篇7

在机体组织内,树突状细胞负责病原体细胞的识别过程,收集抗原所处的环境信息,并将采集到的信息予以处理,最后提呈给免疫细胞[4]。树突状细胞执行着这一系列的功能,主要取决于它的存在状态,最初的树突状细胞处于未成熟状态,根据检测到的环境信号来调整自己的成熟度:半成熟(Semi-mature),成熟(Mature)。这些环境信号包括:病原相关分子模式(pathogenic associated molecular patterns,PAMPs),危险信号(danger signals,DS),安全信号(safe signals,SS),发炎因子(inflammatory cytokines,IC)。未成熟DC(iDC)转化为半成熟状态或成熟状态则需要采集到这四种信号。未成熟DC存在于机体组织内,负责收集抗原物质和组织内的信号,经历着状态转化的过程,成熟与半成熟的树突状细胞迁移到淋巴结后将抗原信息提呈给免疫细胞。免疫T细胞根据树突状细胞种群的成熟程度,来对某一特定的抗原做出免疫效应或者是免疫耐受。成熟的DC越多免疫细胞做出免疫效应趋势越强烈,反之,未成熟DC越多,免疫细胞则愈趋于耐受状态[5]。

1 树突状细胞算法

源于树突状细胞功能的启发,Greenssmith等人做了进一步的研究,并对DC的行为特征建立了相关模型,抽象出了树突状细胞算法(DCA)[6]如图2。

1.1 DCA算法流程

第一步:当组织内细胞受损时会产生PAMP信号,然后未成熟DC摄取危险信号,安全信号,发炎因子与抗原。

第二步:未成熟DC处理信号与抗原,并输出CSM,半成熟信号,成熟信号。

第三步:评估DC内累加的CSM,如果CSM大于设定阈值则DC迁移至淋巴结[7],如果CSM小于设定阈值则DC继续参与信号的摄取返回第一步。

第四步:评估迁移到淋巴结的每一个DC,比较DC释放的Semi与Mat,如果Semi>Mat则此DC提呈抗原Context=0,DC转变为半成熟状态;如果Semi

1.2 算法的输入

PAMPs信号:病原分子相关模式,它的存在表明有异常情况的发生。

危险信号DS:产生于细胞的意外死亡或损伤,它的产生并不能表示组织一定处于异常状态,只能说处于异常状态的可能性非常大。

安全信号SS:产生于细胞的正常性死亡通常只周期性的凋亡,它的产生浓度越大则表示当前组织内发生异常的可能性越小。

发炎因子:一般性的组织受损会产生此信号,可用来放大其它三种信号的影响程度[8],但在没有前三种信号的情况下对未成熟DC没有影响。

1.3 算法的输出

协同刺激分子:决定着未成熟细胞是否迁移,是否要转变为其它状态,此值与预先设定的迁移阈值进行比较,超出阈值则iDC迁移到淋巴结。

半成熟信号:由安全信号作用而来,安全信号越强烈此值越大。

成熟信号:由PAMP与危险信号作用而来,危险信号越强烈此值越大。

每个DC都将对输入信号进行处理,并输出相应信号,其中转化处理过程公式如公式(1)

其中权值W的具体数值(如表1)。

从表中的权值数据可以得出,输入信号与输出信号之间的相互影响关系,PAMPs影响Csm与Mat,危险信号影响Csm与Mat,安全信号则影响所有输出信号。表1中的权值数据是由免疫学家通过对生物免疫的实验得出[8],其中权值可以根据具体的应用场景进行调整,但是信号之间的关联关系应该满足以上条件[9],如图3所示。

2.4抗原评价

在采集抗原的过程中,不同的输入信号组合将会产生两种不同的抗原上下文,半成熟状态的抗原上下文暗示抗原数据是在正常状态下收集的,而成熟的抗原上下文则表示存在潜在的异常。免疫细胞做出反应主要依靠最后半成熟状态与成熟状态DC的数量,一个重要的指标MCAV(mature context antigen value),计算公式(2)如下:

其中O1是指该抗原在提呈过程中标识为“成熟”的DC的个数;O2是指该抗原在提呈过程中标识为“半成熟”的DC的个数。

MCAV越接近于1,表明抗原为异常数据的可能性越大,MCAV趋近于0则表示抗原为正常数据可能性越大。通过MCAV与预设阈值的比较可以对此类抗原做出评价,判断是否为异常数据。

2 建立模型

基于DCA的模型只要有四个组成模块,抗原模块、记忆模块、DC模块与分析模块。如图4所示。

抗原模块中的抗原单元由数据集合里的每一个数据项生成,直到数据集合内的数据处理完毕,每一个抗原即为数据集合里抽取的一条数据项,提取该数据项的相关属性并记录下来。在算法运行过程中每个抗原都会被从DC种群中随机抽取的部分DC采样多次。其中DC的数据结构如图5。

记忆模块主要负责将待分类的抗原数据进行预处理,记忆模块里存储了系统处理过的分类状态,当数据到达此模块时首先对数据进行预处理,与记录的分类特征进行匹配,采用基于加权的欧式距离公式进行计算,如公式(3)所示,如果距离小于近似度阈值T,则流程直接跳转至分析模块,增强系统处理数据的能力。

DC模块在这个模型中最复杂的一个模块,当算法启动时DC模块会创建并初始化多个DC单元,每个DC单元会有三个不同的状态:未成熟,半成熟,成熟。每个DC单元都是从未成熟状态开始,当DC单元收到来自抗原模块的数据后,该DC单元会记录此抗原的ID,并存储此抗原的相关属性,执行信号处理的过程。

分析模块直接访问DC模块,当收到来自于DC模块发出的抗原成熟上下文后,根据公式计算出每个抗原单元的MCAV,输出抗原分类结果,并将抗原的输出属性、分类状态信息反馈到记忆模块,以此更新记忆模块。分析模块还通过对每个抗原输出属性与原始属性的比较来衡量系统性能。

3 实验与分析

为了验证模型的分类效果,使用了标准的UCI Wisconsin Breast Cancer数据集,该数据集含有699条数据,其中包括458条良性细胞与241条恶性细胞,每条数据都有9个正规化的属性值(介于1-10)和1个分类的标记(良性与恶性),每条数据代表一个可能发生癌变的细胞。数据集部分实例如下:

每条数据的属性意义如表2所示。

由数据属性抽象出各种信号:

危险信号:首先计算Cell Size,CellShape,Bare Nuclei,Normal Nucleoli,四个属性值在所有良性数据集中各自的平均值,计算每个条目的这四个属性与相应属性平均值的绝对偏差,每个条目四个属性绝对偏差的平均值构成危险信号。

安全信号与PAMP:计算所有条目Clump Thickness属性平均值,比较每一个条目Clump Thickness属性,如果大于平均值,则安全信号为Clump Thickness属性与平均值的差值,PAMP值为0,如果小于平均值,则安全信号值为0,PAMP值为Clump Thickness属性与平均值的差值。

例如数据1002945,5,4,4,5,7,10,3,2,1,2则计算结果如表3所示。

利用公式(1)则计算结果如表4所示。

表5列出了其它分类算法在UCI Wisconsin Breast Cancer上的计算结果,加入了记忆模块的DCA分类模型在处理大量数据时具有快速处理数据的能力,降低了误报率的同时耗时也较少,节省了系统资源。

4 结束语

本文给出了树突状细胞的功能详细描述,以及树突状细胞算法实现过程,并在算法的基础上建立了分类模型。通过实验表明模型能够产生预期的结果。在实验中合适信号的选择是整个过程的关键。该模型体现了很多优点,各模块保持功能的独立性,与人体免疫系统高度相似,实现起来更直观。各模块间的交互简单、明了,模型具有高度灵活性。在以后的研究中,要充分发挥模型的智能性可以加入更多的模块。

摘要：树突状细胞算法DCA(Dendritic Cell Algorithm)是人工免疫学理论中危险理论的最新研究成果,该算法具有对实时异常数据的检测能力,该文将树突状细胞算法引入到数据分类的应用中来,建立了对数据分类的模型,使用UCI Wisconsin Breast Cancer数据集对模型和其他分类算法进行了测试,结果表明基于树突状算法的分类模型降低了误报率的同时,提高了处理数据的能力,处理速度更快。

关键词：人工免疫系统,危险理论,树突状细胞算法

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