L-精氨酸

L-精氨酸（共8篇）

L-精氨酸 篇1

L-精氨酸是精氨酸生物合成途径的最终产物,是人和动物的半必需碱性氨基酸,是幼小动物的必需氨基酸[1]。由于母乳中的精氨酸量与哺乳仔猪自身的肠道内源合成并不能够满足其最佳的生长需要,因此仔猪日粮中精氨酸不足是限制哺乳仔猪获得最佳生长的一个主要因素[2]。采用传统的提取法生产L-精氨酸远不能满足其日益增长的需要,因此国内外许多学者致力于L-精氨酸生产菌的选育、工程菌的构建以及生产工艺等方面的研究。国外采用发酵法生产L-精氨酸较早。日本在这方面的研究处于领先水平,已经工业化[3,4,5]。国内在这方面的研究主要是80年代,中科院微生物研究所以谷氨酸产生菌钝齿棒杆菌为出发菌株,经NTG多次逐级诱变,获得了一株能够积累大量精氨酸的菌株[6,7]。L-精氨酸在国内主要依靠水解蛋白来生产,操作环境差、收率低、成本高,不适合大规模生产,并且水解产品品质较差,不符合医药用的标准,是我国药用氨基酸生产的“瓶颈”。国家每年在进口L-精氨酸一个产品上的费用需要40到50亿元人民币[8],因此选育L-精氨酸的高产菌株并优化其发酵工艺有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌株与药品

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)DSM1412(购自德国生物材料资源中心,即the German Resource Centre for Biological Material);1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(1-Methyl-1'-nitro-1-nitrosoguanidine,NTG)和N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester,AE)购自阿拉丁试剂公司;葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、Na C1、琼脂、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、Mg SO4·7H2O、尿素、碳酸钙、K2HPO4·3H2O、Fe SO4·7H2O、Mn SO4·H2O、生物素、硫胺素盐酸盐、二乙胺、α-萘酚、无水乙醇、脲、纯溴、Na OH、HCl、Na2HPO4、Na H2PO4、L-Arg和正丙醇购自上海生物工程有限公司。

1.2 培养基

(1)琼脂完全培养基各成分:葡萄糖2.0%,牛肉膏1.0%,蛋白胨1.0,酵母膏0.5,Na C1 0.5%,琼脂2.0%,p H 7.0-7.2,115℃灭菌20 min。

(2)摇瓶种子培养基各成分:葡萄糖3.0%,玉米浆2.0%,(NH4)2SO42.0%,KH2PO40.1%,Mg SO4·7H2O 0.05%,尿素0.15%,p H 7.0-7.2,115℃灭菌20 min。

(3)摇瓶发酵培养基各成分:葡萄糖2.0%,玉米浆2.5%,(NH4)2SO44.5%,KH2PO40.1%,Mg SO4·7H2O 0.05%,碳酸钙3.0%,p H 7.0-7.2,115℃灭菌20 min。

(4)琼脂基本培养基各成分:葡萄糖1.0%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.1%,K2HPO4·3H2O 0.2%,Mg SO4·7H2O 0.05%,Fe SO4·7H2O 0.002%,Mn SO4·H2O 0.002%,生物素50μg/L,硫胺素盐酸盐200μg/L,琼脂2.0%,p H7.0-7.2,115℃灭菌20min。

(5)选择性培养基:在基本培养基的基础上补加各种不同质量分数的精氨酸结构类似物AE。

1.3 谷氨酸棒杆菌生长曲线及最佳诱变菌液稀释浓度的确定

从完全平板培养基上接种菌种于装有40 ml种子液的500 ml三角瓶中,在培养0h、2h、4h、6h、8 h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h和24 h时,取0.1 ml种子培养液,加入10ml的试管,用蒸馏水定容,摇匀,用ND-1000分光光度计测OD562nm值。

取10 ml培养12 h的菌液,离心弃去上清液,加入等体积的无菌生理盐水,充分震荡,然后对菌悬液进行梯度稀释,分别为l00~10-9,将不同稀释度的菌悬液涂布在琼脂基本培养基平板(0.1 ml/个皿),每个稀释度3重复,30℃培养48h~72h观察菌落生长情况。

1.4 紫外诱变时间的确定[9]

取在种子培养基中培养12 h的谷氨酸棒杆菌菌液涂布于基础培养基上(0.1 ml/个皿),编号为1、2、3、4、5和6,分别在20 W紫外灯下50 cm处分别照射0s、5s、10s、20s、30s、40s和50 s,于30℃培养2d~3 d,观察菌落生长情况,选择致死率为80%的时间为诱变时间。

1.5 NTG诱变剂量的确定[8]

用0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml和0.8 mg/ml不同剂量的NTG处理谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌。取6支1.5ml离心管。分别取种子培养12 h的种子培养液0.5 ml至离心管中离心,弃去上清液,菌体用灭菌的磷酸缓冲液离心洗涤3次,然后各试管依次加入灭菌的磷酸缓冲液1.0ml、0.95ml、0.90ml、0.80ml、0.70ml和0.60ml,再依次加入NTG溶液0 ml、0.05 ml、0.10ml、0.20 ml、0.30ml和0.40 ml,震荡摇匀,30℃保温10 min。无菌水离心洗涤3次以终止诱变剂的作用。最后加入无菌水至0.5 ml,振荡摇匀。每支离心管的菌悬液都作梯度稀释到10-6,选择10-6涂布基础培养基平板,0.2 ml/个皿,每个浓度3个重复。30℃培养72 h,观察菌落,选择致死率达到80%的NTG浓度为实验诱变剂量。

1.6 谷氨酸棒杆菌对AE的最低耐受浓度

配制琼脂基本培养基500 ml,分装于6个100 ml的小三角瓶中,每个三角瓶装50 ml,编号为1、2、3、4和5,在1、2、3、4和5中依次加入0g、0.1g、0.2g、0.3g和0.4g AE,混合均匀后倒板,制成含0mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml和8mg/ml AE的梯度平板。将稀释至合适浓度的菌悬液涂布平板(0.1ml/个培养皿),30℃培养72 h后观察菌落的生长,刚好没长菌的AE浓度为结构类似物最低浓度。

1.7 紫外线和NTG的诱变。

(1)紫外线诱变:取谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)DSM1412培养12 h种子液5 ml,用高速离心机5000 rpm离心5 min,弃去上清液,用无菌生理盐水洗涤,菌种用玻璃珠打散,获得细胞悬液,在20W紫外灯下50 cm处照射30~40 s,将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4 mg/ml AE的基本培养基平板上,30℃培养7~8 d,然后挑选长出的较大菌落为变异菌株。筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培养,最后用坂口改良法测定发酵液中的L-精氨酸含量。

(2)NTG诱变:取谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum DSM1412培养12 h种子液5 ml,用高速离心机5000rpm离心5 min,弃去上清液,用无菌生理盐水洗涤,菌种用玻璃珠打散,生理盐水洗涤后,用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)洗涤2次,加入p H 6.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液至6.5 ml,然后加入浓度为0.4 mg/ml NTG,30℃诱变15 min,用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)洗涤3次,除去NTG终止诱变。将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4 mg/ml NTG的基本培养基平板上,30℃培养7~8 d,然后挑选长出的较大菌落为AE的变异菌株。筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培养,最后用坂口改良法测定发酵液中的L-精氨酸含量。

1.8 遗传稳定性试验:

将L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZD2009连续接种八代,摇瓶发酵考察产酸稳定性。

1.9 摇瓶发酵条件的优化

(1)种子培养基优化。采用三因素三水平L9(33)实验设计(三因素三水平,共九个实验组,记为L9(33)):因素A为葡萄糖,设2%、3%和4%三水平;因素B为玉米浆,设1%、2%和3%三水平;因素C为硫酸铵,设1%、2%和3%三水平。其他因素(KH2PO40.1%,Mg SO4·7H2O 0.05%,尿素0.15%,p H 7.0-7.2)保持不变。

(2)发酵培养基及接种量优化。采用七因素三水平L18(37)实验设计(七因素三水平,共十八个实验组,记为L18(37),):因素A为葡萄糖,设9%、12%和15%三水平;因素B为玉米浆,设2%、2.5%和3%三水平;因素C为硫酸铵,设3%、4.5%和6%三水平;因素D为KH2PO4,设0.05%、0.1%和0.15%三水平,因素E为Mg SO4·7H2O,设0.03%、0.05%和0.07%三水平,因素F为碳酸钙,设2%、3%和4%三水平;因素G为接种量,设6%、8%和10%三水平。

(3)最佳pH值确定。通过设置5个发酵培养基pH值梯度:6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,测定不同pH对细菌产酸的影响。

(4)最佳装液量确定。通过设置4个梯度的发酵装液量(100 ml锥形瓶):5ml、10ml、15ml和20ml,测定不同装液量对细菌产酸的影响。

(5)最优条件验证。采用优化的种子培养基(葡萄糖3.0%,玉米浆2.0%,硫酸胺2.0%,磷酸二氢钾0.1%,七水硫酸镁0.05%,尿素0.15%,pH7.0)、优化的发酵培养基(葡萄糖12%,玉米浆2.5%,硫酸胺6.0%,磷酸二氢钾0.05%,七水硫酸镁0.05%,碳酸钙2.0%,pH 7.0)及优化的接种量(10%),最佳发酵培养基pH值(7.0)和最佳发酵装液量(15%)进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 谷氨酸棒杆菌生长曲线及最佳诱变液稀释浓度

微生物的种类不同,其群体生长规律也不同,主要表现为群体生长曲线的不同。测定出发菌DSM1412的生长曲线(图1)。培养4-14 h为谷氨酸棒杆菌对数生长期,经过12 h完全培养液培养,达到对数生长的中后期,此时细菌的细胞代谢旺盛,而且细胞对外界条件的敏感性较其它时期的高。检测菌液10-6稀释后的数量,平均为83个,细胞浓度控制在108~109个/ml之内,符合诱变要求,所以确定诱变的菌液稀释浓度为10-6。

2.2 紫外诱变时间、NTG诱变剂量和AE抗性浓度的确定

如表1所示,当紫外线诱变时间为30~40 s时,谷氨酸棒杆菌的致死率达83.3%,符合本试验要求,因此紫外线诱变时间定为30~40 s。当NTG诱变剂量为0.4 mg/ml,谷氨酸棒杆菌的致死率达79.5%,符合本试验要求,因此NTG诱变剂量定为0.4 mg/ml。当培养基中AE浓度为2 mg/ml时平板上谷氨酸棒杆菌长势微弱,而当培养基中AE浓度增加到4mg/m L时,平板上刚好无谷氨酸棒杆菌生长,当AE浓度在4mg/ml以上时,菌体不能正常生长,因此确定谷氨酸棒杆菌诱变中AE抗性浓度为4 mg/ml。

2.3 谷氨酸棒杆菌诱变菌及其遗传稳定性

以Corynebacterium glutamicum DSM1412为出发菌株,经过8次紫外线和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变,最后获得L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZD2009。其产酸量为31 g/L。谷氨酸棒杆菌已保藏(保藏编号:CCTCC NO:M209260,分类命名:Corynebacterium glutamicum ZD2009)。从表1可以看出,将菌株Corynebacterium glutamicum ZD2009连续接种八代后,发酵产酸能力依然较强,该菌株遗传稳定性较好,且产酸性能稳定。

注:++表示生长良好,+-表示微弱生长,--表示没有生长

2.4 摇瓶发酵条件的确定

2.4.1 种子培养基的优化结果。

从表2的极差(R)可以看出,各因素对产物的影响顺序为:硫酸胺(C)>玉米浆(B)>葡萄糖(A)。硫酸铵对种子培养基影响最大,因为细胞生长对氮源的要求较高,一般需要丰富的氮源,有利于种子菌的生长,但也不能过多;而玉米浆由于含有生物素和多种氨基酸,也对种子有较大影响;对于葡萄糖,种子培养基中一般含量不高,因为糖分过多,菌体代谢活动旺盛,产生有机酸,使p H降低,容易引起菌种衰老,所以糖含量在低范围内变化对种子菌影响不大。由实验结果确定的各因素的最优水平为A2B3C2,即种子优化培养基各成分质量分数为:葡萄糖2.0%,玉米浆3.0%,硫酸胺3.0%,磷酸二氢钾0.1%,七水硫酸镁0.05%,尿素0.15%,pH 7.0。

2.4.2 发酵培养基及接种量的优化结果

从表3的极差(R)大小可以看出在这七种因素中,显著性结果为:硫酸铵>玉米浆>葡萄糖>磷酸二氢钾>碳酸钙>接种量=七水硫酸镁。结合图2和表4方差分析,可看出发酵培养基中各组分含量的不同对产酸是有影响的。如果培养基中营养物质过于丰富,会引起菌体生长过快,以致发酵产酸后劲不足;而如果营养物质缺乏,种子生长缓慢,代谢活力低,也对产酸不利。七种因素中硫酸铵、玉米浆、葡萄糖对产酸影响显著,其他因素不显著,这和表4的极差分析结果一致。由实验结果确定的各因素的最优水平为A1B3C3D1E1F1G1,即:葡萄糖9.0%,玉米浆3.0%,(NH4)2SO46.0%,KH2PO40.05%,Mg SO4·7H2O 0.03%,碳酸钙2.0%,接种量6%,pH 7.0~7.2。

2.4.3 不同pH值和装液量对发酵产酸的影响

微生物的生长及产物的形成必须进行多种多样的酶催化反应,pH的变化会引起各种酶活力的改变,对菌体形态和代谢途径影响都很大。因此,pH是影响细胞生长及产物形成的重要环境因素。试验考察了pH对发酵产酸的影响,如图3所示,发酵培养基pH值7.0时,产精氨酸量最高。结果还表明,pH在6.0~8.0范围内对产酸影响不大,但最佳pH在7.0左右。

L-精氨酸发酵属于好氧发酵,因此,在菌株Corynebacterium glutamicum ZD2009发酵生产L-精氨酸过程中必须保证一定的溶氧来满足菌体的需求。在摇床转速一定,相同的100 ml凹底三角瓶中,发酵培养基装液量不同,其溶解氧含量也不同,装液量越少,溶解氧含量越高。试验考察了不同装液量对发酵产酸的影响,如图3所示,装液量在15 ml/100ml时,产酸量最高。这说明,虽然装液量越少溶解氧含量越高,但是装液量过少,营养物质相应减少,也会影响菌体生长及产酸。

2.4.4 优化条件验证实验通过以上试验确定最优化的发酵条件为:

葡萄糖9.0%,玉米浆3.0%,(NH4)2SO46.0%,KH2PO40.05%,Mg SO4·7H2O 0.03%,碳酸钙2.0%,接种量6%,pH 7.0,装液量15 ml/100ml,转速100 rpm,30℃发酵培养96 h。设置5个实验组对确定的发酵条件进行验证,以优化前的条件为对照,结果显示,对照组,组1,组2,组3,组4,组5分别产酸31.0g/L,45.7g/L,44.3g/L,43.0g/L,44.7g/L,42.3g/L。这表明,优化后平均产酸达44 g/L,而优化前产酸31 g/L,优化后比优化前产酸量提高了41.9%。

3 结论与讨论

3.1 结论

以Corynebacterium glutamicum DSM1412为出发菌株,经紫外线和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍逐级诱变处理和选育,并采用N-硝基-L-精氨酸甲酯进行抗性选育,获得一株高产L-精氨酸和遗传性稳定的菌株Corynebacterium glutamicum ZDNTG5。该菌种产L-精氨酸的量可达31 g/L,比出发菌提高了1.4倍。通过对发酵培养基优化,确定最佳摇瓶发酵条件为葡萄糖9.0%,玉米浆3.0%,(NH4)2SO46.0%,KH2PO40.05%,Mg SO4·7H2O 0.03%,碳酸钙2.0%,接种量6%,p H 7.0,装液量15 ml/100 ml,转速100 rpm,30℃发酵培养96 h。在此条件下发酵,产酸量达44 g/L,产精氨酸的量比未经优化时提高了41.9%,且产酸稳定。

3.2 讨论

工业微生物的菌种选育在发酵工业中占有重要的地位,是决定该发酵产品能否具有工业化生产价值及发酵过程成败的关键。对工业微生物菌种生产具有一定的要求:在遗传上必须是稳定的;容易产生许多营养细胞、孢子或其他繁殖体;必须是纯种,不带杂菌及噬菌体;种子生长旺盛、迅速;生产目的产物所需的时间短、杂质少,易分离提纯;有自身保护机制,抵抗杂菌能力强;能保持较长时间的良好经济效益;对诱变剂处理敏感,可选育出高产菌株;在规定时间内产生预期数量产物,并保持相对稳定[10]。本文所选的诱变出发菌谷氨酸棒杆菌DSM1412基本符合上述要求,目前还未见有关该菌种诱变生产L-精氨酸的报道。

L-精氨酸的生物合成受其自身的反馈抑制和反馈阻遏,选育结构类似物抗性突变株以解除L-精氨酸自身的反馈调节使L-精氨酸得以积累。AE的结构与L-精氨酸结构基本一致,因此AE可以作为L-精氨酸的结构类似物,选育已经解除代谢途径中精氨酸的反馈调节的突变株[11]。本文以谷氨酸棒杆菌DSM1412诱变出发菌株,经紫外线诱变和亚硝基胍多次诱变,并通过精氨酸甲基酯平板筛选,获得一株产L-精氨酸能力有较大提高的突变株谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZDNTG5,通过发酵条件优化,得出最佳产酸条件,产酸量达44.0 g/L,并具有较好的遗传稳定性。此出发菌为一国外菌种,有关此菌种诱变产酸的研究还未见报道,本研究提供了初步试验结果。

在选育方法上,本文对菌种采用物理方法与化学方法相结合来对菌种进行诱变。另外,据有关报道,对产精氨酸菌种进行基因改造的研究最早开始于上世纪八十年代,1983年,滕亦等将精氨酸生物合成有关的基因进行克隆。然后将含精氨酸生物合成酶系基因群及卡那霉素抗性基因的重组质粒p EArgl导人到宿主谷氨酸棒杆菌ATCC13032,哈库利棒杆菌ATCC13868及黄色短杆菌ATCC14067中,构建精氨酸工程菌,经72 h培养精氨酸产量分别为1.6 mg/ml、1.8 mg/ml和1.0 mg/ml[12]。近年来,国外很多科学家致力于产精氨酸基因工程菌的构建,但产酸量都很低[13],因此,应用基因工程技术构建精氨酸高产菌为选育工业生产精氨酸菌种的研究提供了另一条思路。

摘要：本文以Corynebacterium glutamicum DSM1412为出发菌株,经紫外线和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍逐级诱变处理和选育,并采用N-硝基-L-精氨酸甲酯进行抗性选育,获得一株高产L-精氨酸和遗传性稳定的菌株CorynebacteriumglutamicumZDNTG5。该菌种产L-精氨酸的量可达31g/L,比出发菌提高了1.4倍。通过对发酵培养基优化,确定最佳摇瓶发酵条件为葡萄糖9.0%,玉米浆3.0%,(NH4)2SO46.0%,KH2PO40.05%,MgSO·47H2O0.03%,碳酸钙2.0%,接种量6%,pH7.0,装液量15mL/100ml,转速100rpm,30℃发酵培养96h。在此条件下发酵,产酸量达44g/L,产精氨酸的量比未经优化时提高了41.9%。

关键词：L-精氨酸,谷氨酸棒杆菌,发酵,诱变育种

L-精氨酸 篇2

摘 要：以鸡胸肉中提取的肌球蛋白为研究对象，考察不同添加量（0～0.09%）L-精氨酸对肌球蛋白凝胶的硬度、保水性和微结构等凝胶特性以及肌球蛋白溶液热特性的影响。结果表明：L-精氨酸可显著提高肌球蛋白凝胶的保水性（P<0.05），降低凝胶硬度（P<0.05）。扫描电镜显示空白组样品呈现大小不均的孔洞与颗粒状聚集物共存的凝胶结构，而添加0.03%～0.05% L-精氨酸的样品呈现相对致密的凝胶结构。L-精氨酸添加量达到0.03%以上时，肌球蛋白的第1个变性温度TM1显著降低；L-精氨酸添加量达到0.04%以上时，肌球蛋白的第2个变性温度TM2显著降低（P<0.05）。

关键词：肌球蛋白；L-精氨酸；保水性；硬度；微观结构；热特性

保水性和质构是肉制品的重要品质特性，对肉制品的产率与口感有十分重要的影响[1]。钠盐的使用是目前提高肉制品保水性和质构的重要手段之一。在肉制品加工过程中，氯化钠能够改善产品的风味、嫩度和多汁性等品质特性，有利于产品的保藏[2]。但是，摄入过量钠盐可诱发高血压[3]，增加中风及心脑血管的发病几率[4]；降低肉制品钠盐的使用量，将降低产品风味、口感，缩短产品货架期。因此，研发钠盐替代物显得尤为重要。

研究表明，添加精氨酸可提高猪肉肠的保水性、硬度、咀嚼性、弹性以及其他感官性能，提高猪肉糜蛋白的变性温度，有利于光滑、致密、均匀凝胶的形成[5]，在肉制品加工中具有潜在的应用前景。

盐溶蛋白是肌肉中的重要蛋白成分，参与肉凝胶的形成过程，对肉制品的保水性和质构特性产生重要影响[6]。研究精氨酸对盐溶蛋白凝胶形成的影响有利于揭示精氨酸对肉制品保水性和质构特性的影响机制。然而，迄今为止，国内外关于外源性氨基酸对盐溶蛋白热凝胶的影响研究很少[7]；精氨酸对肌球蛋白热诱导凝胶的影响尚未见报导。本研究以鸡胸肉中提取的肌球蛋白为研究对象，考察不同添加量（0～0.09%）L-精氨酸对肌球蛋白凝胶的硬度、保水和微结构等凝胶特性以及肌球蛋白溶液热特性的影响，以探讨L-精氨酸对肉制品保水性和质构特性影响的机制，为低钠肉制品研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡胸肉购于合肥市家乐福超市。

磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、焦磷酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氯化钾、无水乙醇、丙酮、戊二醛、甲醛等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BC/BD-241冰柜 青岛Haier集团公司；ML104型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SCX-8/2A绞肉机 上海双碟厨具有限公司；DS-1组织捣碎机 上海越磁电子科技有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；CT14RD冷冻离心机 上海天美生化仪器设备有限公司；8S-1磁力搅拌器 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；752N紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；TA-XT Plus硬度仪 英国Stable Micro System公司；JSM6490LV扫描电子显微镜 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

肌球蛋白提取：参照Chen等[8]的方法，将鸡胸肉剔除可见脂肪和结缔组织，切碎后取约150 g，在0～4 ℃条件下提取肌球蛋白。肌球蛋白溶液浓度的测定参照Zhou等[9]的方法，利用0.6 mol/L氯化钾磷酸盐缓冲溶液（pH 6.5），将蛋白质质量浓度调整至20 mg/mL，待用。

1.3.2 肌球蛋白-精氨酸混合溶液的制备

参照史可夫等[10]的方法，分别向50 g 20 mg/mL肌球蛋白溶液中加入L-精氨酸，使L-精氨酸质量分数分别达到0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%。在0～4 ℃条件下缓慢搅拌30 min，至完全溶解，在冰箱中（约4 ℃）静置过夜（约12 h），形成肌球蛋白-精氨酸混合溶液待用。

1.3.3 肌球蛋白-精氨酸混合凝胶的制备

参照史可夫等[10]的方法，将处理后的肌球蛋白-精氨酸混合凝胶样品倒入小烧杯（27 mm×35 mm），放在20 ℃水浴锅中，以2 ℃/min的升温速率加热至80 ℃，并恒温处理30 min，取出小烧杯放入冰水浴中冷却10 min，放入冰箱中过夜（约12 h），待测。

1.3.4 凝胶保水性的测定

参照Qin等[11]的方法。取约10 g肌球蛋白-精氨酸凝胶在1 000 g/min下离心10 min，重复检测3 组。

1.3.5 凝胶硬度的测定

参照Zhou等[9]的方法。采用TA-XT Plus质构仪，设定GMIA程序测定肌球蛋白-精氨酸混合凝胶的硬度。参数设定：探头选用P/0.5，测试前速率1.50 mm/s，测试中速率1.00 mm/s，测试后速率1.00 mm/s，穿刺距离4 mm，触发力5 g。检测重复3 次。

1.3.6 扫描电子显微镜的测试

参照Qin等[11]的方法。将肌球蛋白-精氨酸凝胶样品放置在4%甲醛和2.5%戊二醛混合溶液（1∶1，V/V）中浸泡固定2 h，在凝胶样品固定变硬后，将样品均匀地切成10 mm×10 mm×2 mm的薄片；采用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.2）漂洗5～10 次；用不同体积分数的乙醇（30%、40%、60%、80%和100%）溶液脱水，每次浸泡10 min，在通风厨中用冷风除去易挥发的有机溶剂；在真空冷冻干燥机中干燥15 h；喷金，观察。

1.3.7 肌球蛋白热特性的检测

参照陈星[12]的方法并稍加改动。称取10～15 mg蛋白样品，密封于铝坩埚中，放入设备中，并同时以空的铝坩埚作为对照。起始温度为20 ℃，并在此温度下平衡5 min，再以2 ℃/min升至80 ℃，收集其热相变温度T及相变焓值△H。实验重复3 次。

1.4 数据处理

结果以平均值±标准差的形式表示，采用Excel 2007进行数据处理，以Origin 8.0进行绘图，方差分析中的显著性检验采用IBM SPSS 19.0软件进行分析，当P<0.05时视为显著。

2 结果与分析

2.1 不同添加量L-精氨酸对肌球蛋白凝胶保水性的影响

样品1～6. L-精氨酸添加量分别为0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%和0.09%。下同。

由图1可知，与空白组相比，添加精氨酸

（L型，下同）能够很明显地提高肌球蛋白凝胶的保水性

（P<0.05）。这一现象与将精氨酸、赖氨酸分别添加到猪肉香肠中能显著提高其保水性的研究结果相似[7，13]。李俊[7]、Zhou[13]等推测由于精氨酸为碱性氨基酸，加入精氨酸可以改变猪肉香肠的pH值，使其偏离等电点，进而改变其保水性。已有研究[14]指出：调整牛肉的pH值可以提高其产率，进一步支持他们的观点。Guo等[15]研究发现精氨酸能够增加猪肉肌球蛋白的溶解性，表明精氨酸能够增强肌球蛋白的水合作用，进一步说明添加精氨酸能够增加蛋白凝胶的保水性。另一方面，Qin等[11]研究结果表明随着精氨酸添加量的增加，鸡盐溶性蛋白凝胶的保水性也随之增加；该研究指出随着精氨酸添加量的增加，盐溶性蛋白的微观组织结构发生改变是可能导致上述结果的又一重要原因。另外，精氨酸添加量为0.03%与0.01%、0.05%与0.03%以及0.07%与0.05%的蛋白凝胶的保水性差异不显著（P>0.05），这可能是由于精氨酸添加量的变化不足以明显改变蛋白溶液的pH值，或添加精氨酸所导致的pH值的改变不足以显著提高其保水性。虽然差别不显著，但是仍然可以发现，随着精氨酸的增加，肌球蛋白凝胶的保水性呈逐渐升高的趋势，意味着精氨酸的添加有利于改善肉制品的产率及多汁性。

2.2 不同添加量L-精氨酸对肌球蛋白凝胶硬度的影响

由图2可知，相对于空白组，添加了精氨酸的肌球蛋白混合凝胶的硬度显著降低（P<0.05）；并且，肌球蛋白凝胶的硬度随着精氨酸添加量的增加而显著降低（P<0.05）。Ma等[16]研究表明，在超高压条件下添加卡拉胶和CaCl2到盐溶蛋白体系后，其凝胶硬度也出现显著性降低（P<0.05）。有学者[17-18]指出肌球蛋白凝胶的质构可以通过高静压等不同技术处理或外源性成分的添加来实现；经上述处理，肌球蛋白得以展开并暴露出更多的带电基团，这种变化可能与其凝胶硬度相关。另外，有学者指出pH值的变化也对肉蛋白凝胶的硬度产生影响[19]，并指出最优的pH值约为6.0。精氨酸的等电点为10.8[20]，可以推测精氨酸的添加能够显著改变肌球蛋白体系的pH值，导致凝胶硬度的降低。但精氨酸影响肌球蛋白凝胶的硬度的机制尚不清楚，有待进一步的探究。然而，Zhou等[5]发现添加精氨酸能够明显增加猪肉肠的硬度（P<0.05），这与目前的研究结果相反，可能由于猪肉蛋白与鸡肌球蛋白的凝胶性质有很大差异。Qin等[11]研究也指出鸡盐溶蛋白凝胶的硬度随精氨酸添加量的增加而显著提高。除了肌球蛋白，盐溶性蛋白中还含有肌动蛋白、肌动球蛋白[21]，这些成分的存在对肌球蛋白凝胶特性有重要的影响[22]，可能是导致Qin等[11]的结果与本结果不同的原因。

2.3 不同添加量L-精氨酸对肌球蛋白凝胶微观结构的影响

A～F. L-精氨酸添加量分别为0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%和0.09%。

由图3可知，空白组的肌球蛋白凝胶由大小不均一的无规则的空洞和不规则的团状聚集物共同组成。

Qin[11]、Sun[23]等研究表明，未添加精氨酸的肌盐溶蛋白加热也形成相对粗糙的凝胶。当精氨酸的加入量达到0.03%和0.05%时，可以明显观察到肌球蛋白凝胶较为平整，且团状聚集物呈现减少的现象。随着添加量增加到0.07%和0.09%时，可以看到肌球蛋白凝胶三维网状结构中分布着较为均匀的孔洞。Sun等[23]认为，蛋白凝胶的保水性与其孔径呈负相关，添加精氨酸导致凝胶结构的变化可能与其保水性的变化密切相关。另外，多孔的凝胶结构与其硬度降低也可能有关。

2.4 不同添加量精氨酸对肌球蛋白凝胶热特性的影响

由图4及表1可知，空白组的差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）呈现出2 个特征峰，分别位于52.81 ℃和66.95 ℃，这与Ma等[16]的研究结果基本一致。有研究[23-24]报道，位于52.81 ℃特征峰为肌球蛋白头部变性所致，而位于66.95 ℃特征峰为肌球蛋白尾部变性所致。相较于空白组，精氨酸的添加量达到0.03%以上时，第1个峰对应的温度显著降低

（P<0.05），表明添加精氨酸之后肌球蛋白头部的转变温度朝较低的温度方向移动、稳定性呈现降低的趋势。精氨酸的添加量达到0.04%以上时，第2个峰对应的温度显著降低（P<0.05），表明添加精氨酸之后肌球蛋白尾部的变性温度降低、稳定性下降。Qin等[11]发现精氨酸添加到鸡胸盐溶蛋白中导致盐溶蛋白对应的第1个峰消失，而第2个峰对应的温度降低。Ma等[16]研究也表明，同时向猪盐溶蛋白中加入0.2% CaCl2和0.6%卡拉胶的混合物，可以显著降低肌球蛋白尾部的变性温度，同时肌球蛋白头部的转变峰消失。这些研究报导与本研究结果基本类似。Ma等[16]指出加入的Ca2+可能激活了内源性谷氨酰胺酶，同时卡拉胶可能与蛋白质间产生静电作用，两者共同作用于盐溶蛋白，导致上述结果。

3 结 论

添加精氨酸能够提高肌球蛋白凝胶的保水性，降低硬度（P<0.05）。同时，添加0.03%和0.05%精氨酸的样品呈现结构均匀致密的凝胶网状，显著改变肌球蛋白凝胶的微观结构。精氨酸的添加量达到0.03%以上显著降低肌球蛋白头部变性温度，添加量达0.04%以上显著降低尾部变性温度（P<0.05）。本研究表明，精氨酸的添加改变了肌球蛋白溶液的热特性及肌球蛋白凝胶的微观结构，可能导致最终肌球蛋白凝胶保水性的提高、硬度的降低。

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L-精氨酸 篇3

1 材料与方法1.1 实验动物

昆明系小白鼠雌鼠20只(贵阳医学院实验动物中心提供),随机分成2组,每组10只,单笼饲养。饲养室室温及光照与环境一致,食物和水自由摄取。预饲1周后按1 ∶1比例配种,当晚将雄鼠放进雌鼠笼内。次日早晨拿出并检查母鼠,若有阴道栓的判定为配上,并确定为怀孕第1天。试验期间对照组饲喂由实验中心提供的基础料,试验组饲喂在基础料中添加了0.5%L-精氨酸的饲料。

1.2 实验试剂和仪器L-精氨酸(北京科昊泽生物技术有限公司),CA-500全自动血液分析仪(山东兰桥医学科技有限公司),溶血素-SYS-Ⅲ(03106,山东兰桥医学科技有限公司),稀释液(山东兰桥医学科技有限公司)等。

1.3 血样采集 在怀孕第15天每组随机抽取5只孕鼠进行颈静脉采血,EDTA抗凝后立即测定。

1.4 血样测定 用CA-500全自动血液分析仪按照说明书测定如下指标:白细胞总数(WBC)、白细胞中淋巴细胞数量(LYM)、白细胞中单核细胞数量(MON)、白细胞中中性粒细胞数量(GRA)、白细胞中淋巴细胞比率(LYM%)、白细胞中单核细胞比率(MON%)、白细胞中中性粒细胞比率(GRA%)、红细胞总数(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板含量(PLT)、血小板压积(PCT)、平均血小板(MPV)、血小板分布宽度(PDW)。

1.5 统计处理 实验数据用SPSS软件进行统计学分析,并做t检验,统计结果用“均数±标准差undefined”表示。

2 结果

经测定,试验组孕鼠血液中WBC、LYM、MON、GRA、RBC显著(P<0.05)高于对照组;而LYM%、MON%、GRA%、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、PCT、MPV、PDW变化不显著(结果见表1)。

注:表中*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1L-精氨酸对白细胞的影响

Reynolds(1987,1988)报道[4,5],补充精氨酸能调节T淋巴细胞活性,促进其有丝分裂,增加自然杀伤细胞和巨噬细胞的活力,增加机体的免疫功能。亦有研究表明,精氨酸可增加大鼠胸腺淋巴细胞数量,从而导致大鼠胸腺重量的增加,在停止给予精氨酸6周时间内,精氨酸对小鼠胸腺的作用仍然保持,同时指出精氨酸可使先天性无胸腺裸鼠(nu/nu)脾脏的T细胞数量增加及功能增强[6]。这可能是精氨酸可在胸腺外,如脾、淋巴结、骨髓促进其成熟与分化。本试验研究发现,妊娠小白鼠日粮中添加0.5%L-精氨酸后孕鼠血液中WBC、LYM、MON、GRA与对照组相比皆有显著增加,但LYM%、MON%、GRA%变化不显著。白细胞数量的变化与机体的免疫功能有关,淋巴细胞增多促进机体非特异性免疫,而单核细胞和中性粒细胞增多则参与机体特异性免疫[7]。从上述结果表明,精氨酸可增强妊娠小鼠免疫功能。但Fligger(1997)在哺乳牛犊上的研究表明,饲喂添加L-精氨酸(500 mg/d·kg BW)的日粮可降低血浆全部及KLH-特异性IgG浓度(P<0.05)以及循环白血球数(P<0.01)[8],这与本试验的结果不一致,可能是动物种属不同或是本试验采用妊娠期的动物所致。

3.2L-精氨酸对红细胞的影响

子宫和胎盘的血流量不仅取决于灌注压和血管内径,而且与血液流变学(包括全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集性、红细胞变形性等)有关[11,12]。资料表明,人妊娠后血容量会有所增加,而且血浆比红细胞增加更多,从而出现血液稀释,红细胞压积下降[9]。有报道指出,L-精氨酸能明显改善血浆粘度,红细胞数量及变形能力[3]。本试验研究表明,妊娠小白鼠日粮中添加0.5%L-精氨酸后孕鼠血液中RBC显著增加,而HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW变化不显著,这提示添加适量精氨酸可增加红细胞数量,从而改善妊娠母鼠胎盘的供血和供氧功能。

3.3L-精氨酸对血小板的影响

有报道证实,NO可抑制血小板、中性粒细胞、淋巴细胞等多种血液成分黏附于血管内皮细胞[8]。王立赞等[10]研究发现,静脉注射L-精氨酸可使家兔血粘度、体外血栓形成、血小板聚集和红细胞聚集显著降低,红细胞变形能力增强。本试验结果显示,妊娠小白鼠日粮中添加0.5%L-精氨酸后孕鼠血液中PLT、PCT、MPV、PDW变化不显著,这说明添加0.5%L-精氨酸未造成血小板增多,对其凝血功能未见明显的影响。

4 小结

妊娠小白鼠日粮中添加0.5%L-精氨酸可增加孕鼠血液白细胞总数、淋巴细胞数量、单核细胞数量、中性粒细胞数量和红细胞总数。这些结果提示,精氨酸可影响孕鼠血液白细胞数量、红细胞数量及血液流变性,从而改善胎盘血液循环及运输氧和营养物质的能力,这可能在缓解胎儿宫内生长受限上具有重要的意义。

参考文献

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L-精氨酸 篇4

关键词：centralcompositedesign,RSM,对比实验

L-精氨酸 (L-Arg) 是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物, 具有多种独特的生理和药理作用。研究发现L-精氨酸对氨中毒性肝昏迷及病毒性肝炎有显著疗效, 对于恶性肿瘤、脂肪肝、外科创伤和男性无精症等有明显抑制、减轻或治疗作用;随着L-Arg-NO (一氧化氮) 途径在临床上研究的不断深入, 发现L-精氨酸还具有抗动脉粥样硬化、防治高血压及心力衰竭等作用[1]。因此, 早在20世纪70年代国外就开始研究发酵法生产L-精氨酸。日本在这方面的研究处于领先水平, 他们对黄色短杆菌进行诱变, 突变株产酸可达40g/L[2], 实现了L-精氨酸的大规模发酵法生产。目前国内有少量采用水解法生产L-精氨酸。发酵法生产仅限于实验室水平, 产量在30g/L～40g/L[3,4], 但由于产酸水平不稳定等原因, 未能应用于工业化生产。

响应面法 (Response Surface Methodology, 简称RSM) 是利用合理的实验设计, 采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系, 通过对回归方程的分析来寻求最优条件参数, 解决多变量问题的一种统计方法[5,6]。

作者通过对实验室保藏菌株的诱变筛选, 得到一株具有多重抗性的L-精氨酸产生菌YHR-09 (L-HAr, D-Argr, AEr, Sucg, Pros, SGr) , 其L-精氨酸生产能力较亲株有了较大提高。本文在研究影响YHR-09产酸的葡萄糖、硫酸铵、玉米浆和生物素4个单因素实验的基础上, 应用响应面分析法, 以葡萄糖、玉米浆、硫酸铵为响应因子, 以L-精氨酸产量为响应Y值, 用Design Expert 7.1的Central Composite Design (中心组合设计, 简称CCD) 建立响应曲面模型优化YHR-09的发酵培养基。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum YHR-09) , 琼脂斜面传代物在4℃下保藏, 每4～6w转接1次。

1.1.2 培养基

(1) 斜面保藏培养基 (g/L) :

葡萄糖1, 牛肉膏10, 蛋白胨10, NaCl 5, 琼脂20;pH 7.0～7.2;0.1MPa压力下灭菌20min。

(2) 完全培养基 (g/L) :

葡萄糖5, 蛋白胨10, 牛肉膏10, NaCl 5, 琼脂20;pH 7.0～7.2;0.1MPa压力下灭菌20min。

(3) 种子培养基 (g/L) :

葡萄糖25, 硫酸铵5, 玉米浆25, KH2PO4 1, MgSO4·7H2O 0.5, CaCO3 10;pH 7.0～7.2;0.1MPa压力下灭菌20min。

(4) 发酵培养基 (g/L) :

葡萄糖75, 硫酸铵30, 玉米浆20, KH2PO4 1.5, MgSO4·7H2O 0.5, CaCO3 30, 生物素VH 80μg/L;pH 7.0～7.2;0.07MPa压力下灭菌7min。

1.2 方法

1.2.1 L-精氨酸发酵与检测

(1) 发酵方法:

将精氨酸产生菌YHR-09在完全培养基上活化, 挑取1环接种于装有30mL液体种子培养基的250mL三角瓶中, 在往复式摇床上30℃, 震荡培养18h后以8%接种量接种于装有15mL发酵培养基的250mL三角瓶中, 30℃震荡培养96h。摇床转速为100r/min。

(2) L-精氨酸浓度测定:

采用改良坂口法[7]。

(3) 菌浓测定:

取0.2mL发酵液, 加入0.25mol/L盐酸5mL以溶解其中CaCO3, 1cm光程, 562nm下用蒸馏水做空白对照测OD值。

1.2.2 单因素实验

对葡萄糖 (碳源) 、硫酸铵 (氮源) 、玉米浆、生物素 (生长因子) 四个传统上认为对YHR-09产酸影响较大的因素进行单因素实验优化, 以确定影响较显著的因素并粗略估计响应面实验中的中心实验点和各因素的取值区间。

1.2.3 响应面实验

根据单因素实验结果, 以葡萄糖、玉米浆和硫酸铵浓度为响应因子进行响应面设计。以L-精氨酸浓度为响应值, 通过Design Expert软件对实验结果进行回归分析, 确定YHR-09发酵生产L-精氨酸的最佳培养基组分。

2 结果与分析

2.1 L-精氨酸标准曲线

本实验的标准曲线见图1, 当L-精氨酸浓度在0～30g/L范围内时, OD540值和L-精氨酸浓度之间的线性关系良好 (R2=0.9937) , 能用于L-精氨酸的定量分析。

2.2 单因素实验

2.2.1 葡萄糖浓度对产酸的影响

由图2可见, 当葡萄糖浓度低于70g/L时, 由于碳源不足, L-精氨酸产量较低, 但当葡萄糖浓度超120g/L时, 对产酸形成了明显的抑制。因此, 认为葡萄糖浓度70～120g/L为YHR-09产酸的合适浓度。

2.2.2 硫酸铵浓度对产酸的影响

由图3可见, 硫酸铵的较佳浓度为35g/L, 浓度太低或太高都不适于YHR-09发酵中L-精氨酸的积累。因此, 考虑模型的可信度, 选择关于35g/L对称的区间20～50g/L为YHR-09产酸的合适硫酸铵浓度。

2.2.3 玉米浆浓度对产酸的影响

由图4可见, 玉米浆浓度的变化对L-精氨酸的产酸量影响非常显著:浓度太低 (低于10g/L) 时L-精氨酸的产量只有最适浓度时的一半;而当其浓度超过25g/L时, 对L-精氨酸的积累产生了明显的抑制。因此, 选择玉米浆浓度5～25g/L为响应面实验的浓度跨度。

2.2.4 生物素浓度对产酸的影响

由图5可见, 生物素浓度太低 (低于40μg/L) 时不利于L-精氨酸的积累, 但当其浓度超过60μg/L时, 随着生物素浓度的进一步提高, L-精氨酸产量变化不大, 可见生物素对YHR-09产酸的抑制作用并不显著。因而, 后续实验中将该因素作为不显著因素而不进行优化, 只选择对产酸较有利的浓度80μg/L。

2.3 响应面实验

2.3.1 实验设计与结果

单因素实验确定了3个显著因素:葡萄糖、玉米浆和硫酸铵。根据CCD实验设计原理, 利用Design Expert设计了3因素5水平共20个实验点的响应面分析实验, 实验设计与响应值见表1。

利用Design Expert软件对表1数据进行多元二次回归拟合, 回归方程如下:

(1) 响应值Y (L-Arg浓度 (g/L) ) 与因素编码值 (Coded Factors) 之间的函数关系:

Y=24.89+0.62×A +5.18×B+2.63×C+3.02×A×B+0.98×A×C+3.37×B×C-2.75×A2-4.53×B2-3.24×C2

(2) L-Arg浓度 (g/L) 预测值与各因素实际值 (Actual Factors) 之间的函数关系:

[L-Arg]=-21.2199 +0.588612×[葡萄糖]-0.05707×[玉米浆]+0.59706×[硫酸铵]+0.012075×[葡萄糖]×[玉米浆]+0.002617×[葡萄糖]×[硫酸铵]+0.022475×[玉米浆]×[硫酸铵]-0.0044×[葡萄糖]2-0.04528×[玉米浆]2-0.01439×[硫酸铵]2

上述回归模型的方差分析和可信度分析分别见表2和表3。

由表2可见, 该回归模型 (p值<0.0001) 高度显著, 失拟项 (p值=0.6462) 不显著;而且模型的一次项、平方项和交叉乘积项都是高度显著的。

由表3可见, 其复相关系数的平方R2=0.9672, 说明由这3个因素及其二次项能解释Y变化的96.72%, 模型拟合程度很好[8]。

2.3.2 响应因子水平的优化

由图6可见, 关于A、B、C的二次曲面存在极值点, 对回归方程 (2) 求极大值, 即得L-精氨酸的预测值为29.57g/L。对应的三因素浓度 (g/L) 分别为:葡萄糖112.95, 玉米浆 22.61, 硫酸铵49.44。

为验证回归模型的可靠性, 以响应面实验得到的YHR-09最佳产酸条件进行了3次平行验证实验, L-精氨酸平均产量为29.36g/L, 与预测值 (29.57g/L) 吻合度较高。由此可见, 用该回归模型优化L-精氨酸发酵培养基是可行的。

2.4 优化前后L-精氨酸发酵实验对比

将种子分别接入优化后和优化前的发酵培养基, 在相同外界条件下进行发酵实验, 每隔6h取样测定L-精氨酸浓度和菌浓, L-精氨酸浓度对比和菌浓对比见图7和图8。

由图7可见, 二者发酵产酸均在96h达到最大浓度, 但在优化条件下, 各时间点的浓度均比优化前的高。最高点的L-精氨酸浓度达29.39g/L, 比优化前的最高点高出9.72g/L, 与前面验证实验的结果一致。

由图8可见, 经过响应面优化, 营养条件的改善使菌体的生长得到显著的促进, 这在一定程度上能够解释L-精氨酸产量的显著提高。

3 讨论

在单因素分析的基础上, 采用响应面分析法综合考虑葡萄糖、玉米浆和硫酸铵3个显著因素对YHR-09发酵产酸的影响, 根据CCD原理设计了3因素5水平共20个实验。用Design Expert软件处理实验数据, 得到了产酸的回归模型以及取得模型最优值时各因素的水平。实验结果表明, YHR-09最佳产酸条件为:葡萄糖 112.95g/L, 玉米浆 22.61g/L, 硫酸铵 49.44g/L。在此条件下L-精氨酸的产量为29.36g/L, 与优化前的产量 (19.60g/L) 相比, 产量提高接近50%。通过发酵对比实验可见, 菌体浓度的明显提高是L-精氨酸产量上升的重要因素。通过优化, 菌株YHR-09的产量已接近工业化水平, 并且该菌种为传统诱变方法得到, 遗传稳定性很高, 与刘建成等于2008年6月报道的基因工程菌的优化产量14.86g/L[9]相比, 有较大优势。

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L-精氨酸 篇5

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

Trizol Reagent,RNase-free的DNase I,Ta Ka RaEx Taq TM(Ta Ka Ra),Reverse Transcription System(Ta Ka Ra);DEPC;异丙醇、无水乙醇、苯甲酰氯、甲醇(国产分析纯),氯仿(国产色谱级)、i NOS抗体(Santa公司)、e NOS抗体(Santa公司)。

1.2 实验动物和模型复制

健康Wistar大鼠,体重0.20~0.25 kg,雌雄不拘,由哈医大附属二院动物研究所提供。参照文献[2]制备大鼠心肌肥厚模型:大鼠背部皮下注射ISO 5mg/kg·d,连续7 d,自由进食,给水;对照组大鼠背部皮下注射等体积的生理盐水。

1.3 实验分组

(1)对照组(Control);(2)异丙肾上腺素给药组(ISO);(3)L-精氨酸干预组(ISO+L-Arg);(4)L-精氨酸对照组(L-Arg)。各组按照给药时间不同又分为1 d、3 d、5 d和7 d组。

1.4 心脏重量参数的测定

分别在ISO注射后1 d、3 d、5 d和7 d后处死各组大鼠,处死前每只大鼠称量体重(body weight,BW),3%戊巴比妥钠(ip)麻醉,迅速开胸取出心脏,剪去心脏周围组织和血管,称全心重(heart weight,HW)。沿冠状沟将左心房剪下,沿室间沟将右心室游离壁去除称左室重(left ventricular weight,LVW),计算HW/BW、LVW/BW并以此判断心肌肥厚的程度。取心肌组织左室游离壁,10%福尔马林固定,石蜡包埋,常规HE染色和胶原纤维染色(Van Gieson,VG),光镜下观察心肌细胞及心肌间质的变化。将左心室置于液氮中保存备用。

1.5 ANP m RNA表达水平的RT-PCR检测

应用Trizol提取心脏总RNA。依A260和A280数据判断RNA的纯度及含量。RNA 15μL;DNase I1μL;10×DNase I缓冲液5μL;DEPC-H2O 29μL;37℃水浴30 min;加入Trizol reagent及氯仿重新提取总RNA。用AMV逆转录酶逆转RNA,合成第一链c DNA,取RNA 1μL,Random 9mers 0.5μL,RNase Free d H2O 3.75μL,总体积10μL。30℃,10min,42℃,30 min,99℃,5 min,5℃,5 min。-20℃冰箱保存。依据文献的大鼠心肌组织中ANP c DNA序列合成引物(Ta Ka Ra)。正义链5'-ggctccttctccatgaccaa-3',反义链5'-tgttatcttcggtaccg-3',引物长度458bp。ANP扩增条件:首次循环为94℃,2 min,随后进行32次如下循环:94℃,30 s,59℃,30 s,72℃,1min,最后于72℃延伸5 min。取8μL产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统下拍照,并用ANP和β-actin扩增条带的信号面积之比评定其m RNA水平[3]。

1.6 心肌组织总蛋白的提取和蛋白质免疫印迹检测

取大鼠左心室样品,液氮内研磨,加入全细胞裂解液,将匀浆冰上处理30 min,4℃,12 000×g离心15 min,取上清进行蛋白质定量。取50μg总蛋白样品于10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,随后转印至PVDF膜,10%无脂肪牛奶封闭后,用1∶500抗e NOS和i NOS抗体4℃孵育过夜。用二抗(碱性磷酸酶标记,稀释度1∶1 000)室温孵育1 h,最后用AP法显色,光密度扫描半定量分析显影条带[4,5]。

1.7 统计学处理

实验数据用平均数±标准差(±s)表示,统计学处理使用SPSS统计软件,采用方差分析方法判断其差异显著性。

2 结果

2.1 L-精氨酸干预对心脏重量参数的影响

与正常对照组相比,异丙肾上腺组(ISO)HW/BW和LVW/BW都显著增加(P<0.01),L-精氨酸干预组(ISO+L-Arg)与ISO组比较,HW/BW和LVW/BW降低(P<0.05),L-精氨酸干预组与L-精氨酸对照组(L-Arg)比较,HW/BW变化不明显,LVW/BW增加明显(P<0.05)。(表1)

注:1)ISO组与对照组比较,P<0.01;2)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.05;3)ISO+L-Arg组与L-Arg组比较,P<0.05

2.2 L-精氨酸干预对心肌细胞胶原含量的影响

心肌组织经苦味酸酸性品红染色后,光镜下见心肌细胞呈橘黄色,间质胶原纤维呈亮红色。病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心)分析显示(图1),异丙肾上腺素组与正常对照组比较,心肌细胞增大,排列紊乱,小血管周围有大量亮红色胶原沉积,并较多地延伸至心肌细胞间隙(P<0.01);L-精氨酸干预组与异丙肾上腺素组比较,心肌间质胶原含量显著减少(P<0.01),但L-精氨酸干预组与L-精氨酸对照组比较,胶原含量增加(P<0.01)。

1)ISO组与对照组比较,P<0.01;2)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.01;3)ISO+L-Arg组与L-Arg组比较,P<0.01

2.3 L-精氨酸干预对心肌组织ANP m RNA表达的影响

RT-PCR结果表明,与正常对照组比较,异丙肾上腺素组ANP m RNA的表达水平明显增高(P<0.01),L-精氨酸干预组与异丙肾上腺素组比较,ANP m RNA的表达水平显著降低(P<0.05)。L-精氨酸干预组与L-精氨酸对照组比较,ANP m RNA的表达变化无统计学差异(P>0.05)。(图2)

1)ISO组与对照组比较,P<0.01;2)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.05

2.4 L-精氨酸干预对血清NOS活性和NO含量的影响

与正常对照组相比,ISO组NO(NO2-/NO3-)含量和NOS活性明显降低(P<0.01,P<0.05)。与ISO组比较,L-精氨酸干预组NO含量和NOS活性升高(P<0.01,P<0.05)。L-精氨酸干预组NO含量低于L-精氨酸对照组(P<0.05),见表2。

注:1)ISO组与对照组比较,P<0.05;2)ISO组与对照组比较,P<0.01;3)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.05;4)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.05;5)ISO+L-Arg组与Arg组比较,P<0.05

2.5 L-精氨酸干预对心肌组织e NOS和i NOS蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示,与正常对照组比较,ISO 7 d时e NOS蛋白表达下降了13%(P<0.05),i NOS蛋白表达上升了28%(P<0.01)。与ISO组比较,L-精氨酸干预7 d后,e NOS蛋白表达上调了18%(P<0.05),而i NOS表达下调12%(P<0.05)。L-精氨酸干预组与L-精氨酸对照组比较,5 d时iNOS表达显著上升(P<0.01),而e NOS蛋白表达无差异(图3,4)。

3 讨论

心肌肥大是多种心脏疾病患者发展为心功能衰竭甚至死亡的常见合并症,其发生机制的研究对于进一步预防或逆转心肌肥大有着非常重要的意义。本研究运用在体手段,在异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥大模型上观察L-精氨酸-一氧化氮途径对病理性心肌肥大的抑制作用及其机制,为临床病理性心肌肥厚的治疗提供新的思路和实验依据。

NO是由血管内皮细胞或心肌细胞合成和释放的血管舒张因子,可维持血压的稳定和心脏的生理功能,同时参与高血压心肌肥大的调控。L-Arg是一种碱性氨基酸,可在体内多种细胞所表达的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化下,生成NO及L-瓜氨酸,该过程即L-Arg-NO途径[6]。

目前认为,L-Arg-NO途径所产生的NO主要通过自分泌和(或)旁分泌的方式作用于邻近的相关细胞,从而发挥其生理效应。体内NOS分三种亚型[7,8]:神经元型(neuronal NOS,n NOS)、内皮型(endothelial NOS,e NOS)及诱导型(inducible NOS,i NOS)。血管内皮细胞中存在e NOS和i NOS,而神经系统的多种细胞主要表达n NOS。心脏内细胞成分复杂,含有丰富的微血管及多种间质细胞,在体心肌组织于生理状态下即表达e NOS及i NOS,且e NOS及i NOS在心脏中的表达模式具有同步化的特点。

本研究发现,与ISO组比较,外源性L-Arg干预后,大鼠心肌肥大指数明显下降,且心肌组织ANP m RNA的表达水平下调。更有意义的是,我们还观察到经L-Arg干预后,心肌间质胶原沉积大大减少。由于病理性心肌肥大不仅包括心肌细胞的肥大,还包括间质和血管周围胶原沉积。心脏胶原网络的重塑可增加心肌僵硬度,直接影响心脏舒张功能。所以,对心肌间质胶原沉积的抑制作用对防止心功能恶化具有重要意义。

实验中我们观察到,心肌肥大时e NOS蛋白表达减少,i NOS蛋白表达增加,NOS活性与正常对照组比较降低了18%,NO含量比正常对照组减少了43%,提示ISO诱导心肌肥大过程中通过下调e NOS,上调i NOS,降低总NOS活性,从而减少血清NO含量。外源性L-Arg干预可增加e NOS蛋白表达(P<0.05),减少i NOS蛋白表达(P<0.01),显著增加血清NO含量(P<0.01),增加NOS活性(P<0.05)。这些结果提示,L-精氨酸干预后,可通过提供NOS的底物,增加NO含量,进而使心肌肥大减轻。

一氧化氮合酶是机体中一种以精氨酸为底物的酶。一般认为,n NOS和e NOS在生理状态下即可催化NO的基础释放,发挥生物效应并传递细胞间的信息。由e NOS催化产生的适量NO具有心血管保护作用,它能够维持血管张力、增强心肌的舒张功能并对心脏收缩功能有利[9]。肥厚心肌中e NOS的减少可导致心肌舒张和收缩功能障碍,改变心肌对β2肾上腺素刺激的反应性,以及增加心肌耗氧量进而打破机体中氧的供需平衡。同时NO还能和超氧阴离子生成细胞毒过氧化亚硝基(ONOO-),提示了NO作用的双向性。i NOS在正常条件下不存在,无活性表达,当有内毒素或其他细胞因子刺激时,才可迅速而大量地诱导其基因表达,经数小时就可产生大量NO,以杀死微生物甚至肿瘤细胞,由其产生的细胞毒性也同样可以损伤组织。研究认为,心肌细胞中P42/P44MAPK级联反应的激活可以诱导NOS转录,进而可能通过凋亡的途径致使心肌细胞死亡和丢失,参与各种心肌疾病的恶性发展[10]。

综上所述,我们认为异丙肾上腺素诱导的心肌肥大与NO代谢密切相关,L-Arg通过增强心肌e NOS表达,减少i NOS表达致NO生成增加,抑制病理性心肌肥大的形成。

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L-精氨酸 篇6

L-精氨酸能有效地降低正常人及高血压患者的血压[1], 而瓜氨酸在代谢上和精氨酸密切相关, 但目前对瓜氨酸和高血压关系的研究还很少。本实验旨在对精氨酸和瓜氨酸的降血压作用进行比较, 并探讨其降压机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组雄性SD大鼠30只, 体重200～220 g, 购自山西医科大学实验动物中心。

所有大鼠随机分为2组, 一组为精氨酸组, 一组为瓜氨酸组。2组大鼠在实验前测量血压, 血压测定采用尾套法, 连续测3次, 取平均值。

1.2 高血压模型制备

所有大鼠使用左旋硝基精氨酸 (L-NNA) , 每日腹腔注射15 mg/kg, 分2次注射, 连续注射7 d, 并在第7天测量血压。造模后2组大鼠血压较造模前均明显升高, 2组均造模成功。造模后2组大鼠血压无明显差异, 见表1.

1.3 实验方法

造模成功后, 继续维持原剂量使用L-NNA.测定2组大鼠实验前的血浆内皮素 (ET) 和一氧化氮 (NO) 含量。ET测定采用放射免疫法, 试剂盒购自中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所;NO测定采用硝酸还原酶法, 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。上述各指标测定均按试剂盒说明书严格执行。

精氨酸组使用L-精氨酸灌胃0.3 g/kg, 每日1次;瓜氨酸组使用L-瓜氨酸灌胃0.3 g/kg, 每日1次。2组喂养6周后, 测量血压和血浆ET与NO含量。

1.4 统计学方法

数据以均数±标准差表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验前后2组大鼠血压比较

见表2.

2.2 实验前后血浆ET和NO含量比较见表3、表4.

3讨论

Rector等认为, 连续6周口服L-精氨酸将明显增加心力衰竭患者运动时的肢体血流和动脉弹性, 同时血浆内皮素水平也明显降低[2]。另一项研究表明, 心力衰竭患者在连续4周使用L-精氨酸后, 桡动脉舒张增加了8.8%[3].

从本次实验结果来看, 精氨酸对高血压大鼠有降压作用, 同时可以降低血浆ET含量, 并升高血浆NO含量。

研究证明高血压存在不同程度的内皮细胞功能障碍[4], 而血浆ET和NO含量和内皮细胞功能密切相关。因此精氨酸可能是通过抑制ET的生成并促进NO的生成, 影响血管的舒张程度, 从而发挥降血压的作用。

L-瓜氨酸可以通过转变为L-精氨酸来发挥降血压作用。从实验结果来看, 同样剂量的L-瓜氨酸和L-精氨酸相比, L-瓜氨酸降血压作用更强。

L-瓜氨酸可在内皮细胞、肾细胞等细胞中转变为L-精氨酸, 由于L-瓜氨酸无需经肠肝代谢, 因此口服L-瓜氨酸比口服L-精氨酸本身更能增加L-精氨酸的血液浓度。由于L-瓜氨酸不是精氨酸酶的底物, 因此它不会诱导该酶的表达, 也不会激活该酶的活性。当给予L-瓜氨酸 (3.8 g/m2体表面积) 4 h后, L-精氨酸的最大浓度可以增加227%, 而使用同样剂量的L-精氨酸仅能增加90%[5].因此L-瓜氨酸可以比同样剂量的L-精氨酸发挥更强的降压作用。

虽然通过本实验来看, 精氨酸可能通过改善血管内皮功能来发挥降压作用, 但其如何改善血管内皮功能以及是否有其他机制, 还有待于今后的进一步研究。同时瓜氨酸的降血压作用是否有独立于精氨酸以外的机制, 也有待于进一步的研究。

摘要：目的 对照分析精氨酸和瓜氨酸对大鼠血压影响的差异。方法 雄性SD大鼠30只, 制备高血压模型后, 随机分为2组, 分别使用L-精氨酸和L-瓜氨酸治疗。比较实验前后大鼠的血压与血浆内皮素 (ET) 和一氧化氮 (NO) 含量。结果 2组大鼠实验后的血压与血浆ET和NO含量有显著差异, 瓜氨酸组血压和血浆ET含量下降较明显, 而血浆NO含量上升较明显。结论 精氨酸可能是通过改善内皮功能来发挥降压作用, 而瓜氨酸比精氨酸降压作用更强。

关键词：精氨酸,瓜氨酸,血压,血浆ET和NO含量

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L-精氨酸 篇7

1 实验材料

1.1 主要试剂与仪器

L-精氨酸(L-Arginine,纯度>99%),美国Sigma公司;低分子肝素(平均相对分子质量4500 Da,抗Xa效价105 U/mg),杭州九源基因工程有限公司);戊巴比妥钠(纯度>99%),美国Sigma公司;电子天平,德国赛多利斯天平有限公司;磁力搅拌器,上海司东仪器有限公司。

1.2 动物

健康SD雄性大鼠,体重(200±20)g,由中国药科大学实验动物中心提供。

2 实验方法

2.1 LMWH-精氨酸溶液的制备

按照表1的处方,将不同比例的LMWH与精氨酸溶解在10.0 ml pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中即得。

2.2 大鼠十二指肠给药的血液凝固实验

取健康雄性SD大鼠(200±20)g30只,正常饮食1周;随机分为5组(n=6),试验前禁食12 h,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg),在鼠板上固定后沿腹中线剖开腹腔,皮下注射组(Sc.组)皮下注射LMWH水溶液(LMWH 20 U/kg);对照组(Control组)十二指肠处注入LMWH水溶液(LMWH 200 U/kg);试验组在十二指肠处分别给予表1中A(A组)、B(B组)、C(C组)处方(LMWH 200 U/kg),缝合伤口,给药后于0、0.5、1、2、4、6、 8 h在大鼠眼底静脉丛取血,弃去第1滴,滴3滴于载玻片两端,计时,用干燥针头挑动,当挑出第1根血纤蛋白丝时,停止计时,取3滴的平均值即为各取血时间的血液凝固时间。以用药后各时期与用药前(0 h)血液凝固时间的差值计算血液凝固时间延长百分率[7],绘制血液凝固时间延长百分率和时间的关系曲线,采用梯形面积法计算LMWH血液凝固时间延长百分率——时间曲线下的面积(AUC)。LMWH十二指肠给药的药效学相对生物利用度计算方法如下式:

undefined

式中,PA为LMWH十二指肠给药相对于皮下注射LMWH的相对生物利用度;AUCoral和AUCs.c.分别为十二指肠给药和皮下注射LMWH的血液凝固时间延长百分率——时间曲线下面积;DOSEoral和DOSEs.c.分别为十二指肠给药和皮下注射的LMWH剂量。

2.3 大鼠在体肠袢法给药的血液凝固实验

取健康雄性SD大鼠(200±20)g 18只,正常饮食1周;随机分为3组(n=6),考察表1中C处方在体肠袢法给药的抗凝血效果。大鼠实验前禁食12 h,用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg),在鼠板上固定后沿腹中线剖开腹腔,小肠分为3段:自幽门以下2 cm处向下取10 cm为十二指肠段,幽门以下15 cm向下取10 cm为空肠段,盲肠上端2 cm向上取10 cm为回肠段,各肠段两端结扎。肠袢中给药(LMWH 200 U/kg),缝合伤口,给药后于0、0.5、1、2、4、6、8 h在大鼠眼底静脉丛取血。血液凝固时间测定、血液凝固时间延长百分率计算、血液凝固时间延长百分率——时间曲线下的面积(AUC)计算同2.2项。

2.4 统计学处理

数据统计分析为SPSS 17.0软件,本研究计量资料以undefined表示,用药后各时期血液凝固时间延长百分率与0 h的比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠十二指肠给药血液凝固实验

大鼠十二指肠给药血液凝固实验的结果如图1和表2所示。给药后0.5、1、2、4、6、8 h,A、B、C组与0 h相比,大鼠血液凝固时间显著延长(P<0.05),对照组大鼠血液凝固时间延长百分率虽有增大的趋势,但无统计学意义(P>0.05)。A、B、C组的AUC和PA显著高于对照组(P<0.05)。A、B、C组之间比较,AUC和PA随着精氨酸与LMWH摩尔比从10 ∶1、20 ∶1提高到30 ∶1时,有依次增加的趋势(P<0.05)。

百分率

3.2 大鼠在体肠袢法给药的血液凝固实验

大鼠经体肠袢法给药的血液凝固实验的结果如图2和表3所示,给药后0.5、1、2、4、6、8 h,各组与0 h相比,大鼠血液凝固时间显著延长(P<0.05)。十二指肠组、空肠组、回肠组组间相比,AUC差异无统计学意义(P>0.05)。结果说明精氨酸在十二指肠、空肠、回肠部位均能显著促进低分子肝素的吸收,并且在3个部位的促吸收作用,差异无统计学意义(P>0.05)。

时间的百分率

4 讨论

低分子肝素为有效的抑制血栓形成的抗凝新药,它疗效显著,近年来广泛应用于临床,已取代肝素成为急性冠脉综合征的首选抗凝药物。目前,低分子肝素给药途径大多为皮下注射,但皮下注射不良反应较多,如皮下淤斑、皮下出血等,且患者使用不便[8]。为了方便给药、能够长期应用以及避免皮下注射出现的不良反应,我们以天然氨基酸中的L-精氨酸为LMWH的肠道促吸收剂,探讨其对LMWH的口服促吸收作用。

前期实验研究证明,穿膜肽六聚精氨酸(R6)能够与LMWH非共价键偶合,显著促进LMWH的口服吸收,其原因可能是R6的6个精氨酸残基上的阳离子基团与LMWH上的阴离子基团偶合,LMWH被R6携带透过肠道细胞膜而吸收[2]。考虑到穿膜肽的价格较高,应用于LMWH的口服给药将大幅度增加治疗成本,阳离子性的精氨酸同样能够与LMWH上的众多阴离子基团偶合,有可能促进LMWH的口服吸收,因此考察了精氨酸促进低分子肝素肠道吸收的效果。结果证明精氨酸能够显著促进LMWH的口服吸收,在精氨酸与LMWH的摩尔比达到30 ∶1时,以血液凝固时间延长百分率计算,LMWH口服的生物利用度甚至超过了10%。

预试验已经证明精氨酸不具有改变大鼠血液凝固时间的作用,因此本实验不再考察精氨酸对血液凝固时间的影响,仅证实精氨酸能够显著促进LMWH的口服吸收作用。精氨酸对低分子肝素的肠道促吸收作用,为开发安全有效、成本较低的低分子肝素口服制剂奠定了一定的实验基础,也希望为低分子肝素的肠道给药开辟一条新的途径。关于精氨酸对LMWH的口服促吸收作用目前还建立在实验动物的基础上,其确切机制尚需进一步研究。

摘要：目的 低分子肝素是一种有效的溶栓剂,目前只有注射剂用于临床,该实验研究精氨酸对低分子肝素口服吸收的促进作用。方法 以大鼠用药前后血液凝固时间的变化研究精氨酸的肠道促吸收作用。结果 精氨酸能够显著延长大鼠的凝血时间。在精氨酸与低分子肝素摩尔比为30∶1时,低分子肝素的药效学生物利用度达到11.7%。结论 精氨酸能够显著促进低分子肝素的肠道吸收。

关键词：精氨酸,低分子肝素,口服

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精氨酸对胎鼠宫内生长迟缓的影响 篇8

关键词：精氨酸,胎儿宫内发育迟缓,胎鼠数,胎鼠重

胎儿的生长和发育是1个复杂的生理学过程, 受遗传、环境因素 (营养、应激和疾病等) 及母体成熟程度的影响, 这些因素通过影响子宫胎盘血流量、母-胎营养物质和氧气转运、孕体营养供给、内分泌环境和代谢途径等发挥作用, 与怀孕母体子宫微循环有密切的联系。精氨酸 (Arginine, Arg) 在NOS和鸟氨酸脱羧酶作用下分别生成NO和多胺, 两者均是胎盘生长和血管发生以及增加子宫和胎盘-胎儿血流量必需的物质[1], 猪等动物证实了其具有缓解胎儿宫内发育迟缓 (IUGR) 的作用, 本试验通过探讨Arg对孕小白鼠的毒性作用及IUGR的调控作用, 为应用Arg提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

昆明系小白鼠 (scxk (黔) 2002-0001) 、小鼠饲料, 购自贵阳医学院实验动物中心;精氨酸 (L-Arginine) , 纯度≥99.8%, 购自北京科昊泽生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 急性毒力试验:

10只小白鼠 (体重16~20 g) , 雌雄各半, 参照文献[2]进行毒性试验;另外取10只小白鼠作为对照。灌胃后观察小白鼠变化, 统计24 h内死亡数据。配制0.5 g/m L Arg水溶液。妊娠10~15 d小白鼠10只 (体重40~44 g) , 用药前禁食不禁水1夜, 8只灌胃Arg水溶液0.5 m L;另外10只孕鼠用蒸馏水灌胃作为对照。灌胃后观察小白鼠变化, 统计24 h内流产和死亡数据。

1.2.2 分组与管理:

将120只雌性小白鼠随机分为6组:对照组 (饲喂基础日粮) 、0.25%Arg组 (基础日粮添加0.25%Arg, 下同) 、0.5%Arg组、0.75%Arg组、1.0%Arg组、1.5%Arg组。每组20只, 每笼4只, 预饲3天, 雄雌比例1∶4配种。当晚将雄鼠放进雌鼠笼内, 次日早晨拿出, 并检查母鼠, 若有阴道栓的判定为配上, 并确定为怀孕第1天。试验期间各组自由采食和饮水。基础日粮营养成分测定结果见表1。

注:除总能为推测值外, 其余均为实测值。常规营养成分在贵州大学动物饲料与营养学实验室测定;氨基酸含量由贵州师范大学分析测试中心代为测定。

1.2.3 样品采集:

在妊娠第16天, 每组随机抽取10只孕鼠进行眼球摘除采血, 颈椎脱臼处死孕鼠, 剖腹取胎鼠、胎盘和子宫, 分别称重, 记录胎鼠数、胎鼠重和相应的胎盘重、子宫重、死胎数 (含吸收胎数) 、IUGR数。

1.3 数据统计分析

统计结果用“平均值±标准误差 (MEAN±SEM) ”表示, 用SPSS软件16.0进行方差分析, 当P≤0.05为差异显著, P≤0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 精氨酸急性毒力试验

未孕小白鼠最大耐受灌胃精氨酸剂量超过10 g/ (kg·BW) , 已孕小白鼠最大耐受灌胃剂量超过4.55 g/ (kg·BW) 。试验过程中未见小白鼠有异常表现, 亦未发现孕鼠流产发生。见表2。

2.2 精氨酸对胎鼠数的影响

0.5%Arg组胎鼠数极显著高于对照组、0.75%Arg组、1.0%Arg组 (P<0.01) 和0.25%Arg组 (P=0.01) 。1.5%Arg组胎鼠数显著 (P<0.05) 高于0.75%Arg组、1.0%Arg组。见表3。

2.3 精氨酸对胎鼠IUGR率的影响

0.25%Arg、0.5%Arg、0.75%Arg、1.0%Arg、1.5%Arg组的IUGR率分别比对照组降低了22.84% (P>0.05) 、42.13% (P>0.05) 、18.30% (P>0.05) 、64.99% (P<0.05) 和26.90% (P>0.05) 。此外, 1.0%Arg组IUGR率比0.25%Arg组、0.75%Arg组也有显著降低 (P<0.05) 。见表3。

2.4 精氨酸对胎鼠死胎率的影响

0.25%Arg、0.5%Arg、0.75%Arg、1.0%Arg、1.5%Arg组的死胎率分别比对照组降低了38.63% (P>0.05) 、54.70% (P<0.05) 、5.08% (P>0.05) 、35.20% (P>0.05) 、41.73% (P>0.05) 。0.5%Arg组死胎率也比0.75%Arg组显著降低 (P<0.05) 。见表3。

2.5 精氨酸对胎鼠重的影响

0.25%Arg、0.5%Arg、0.75%Arg、1.0%Arg、1.5%Arg组的平均胎鼠重分别比对照组提高了3.89%、9.34%、18.21%、23.95%、7.33%, 但均不显著 (P>0.05) 。见表3。

2.6 精氨酸对胎鼠胎盘和子宫重的影响

0.5%Arg组子宫重比对照组提高10.37%, 其它各组间平均子宫重差异不显著 (P>0.05) , 而各组平均胎盘重差异不显著 (P>0.05) 。见表3。

注:与对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。IUGR率 (%) =IUGR例数/胎鼠数。死胎率 (%) =死胎数/ (胎鼠数+死胎数) 。

3 讨论

3.1 日粮添加精氨酸安全可行

Arg对细胞没有毒性[3], 因此在适合剂量、化学药品形式和用药方式下对动物和人均安全[4]。但有研究认为, 添加过量的Arg, 因产生大量的NO, 对机体造成强烈破坏, 具有毒副作用[5]。本急性毒性试验结果显示, 未孕小白鼠灌胃Arg最大耐受剂量超过10 g/ (kg·BW) , 根据《中国药典》应判为无毒;孕鼠灌胃Arg最大耐受剂量超过4.55 g/ (kg·BW) , 该剂量对母鼠和胎儿都安全。本试验结果与Wu等[1]结果基本一致, 表明日粮中添加Arg是比较安全的, 而Arg高温高压灭菌条件下能保持稳定[6], 因此作为营养添加剂具有可行性。

3.2 精氨酸可促进小白鼠胎鼠宫内生长发育

Arg是重要的氮源, 有助于体蛋白合成, 促进动物激素释放 (如生长激素、胰岛素) , 从而促进动物和胚胎的生长[7,8]。Arg是NO和多胺的合成前体, 可改善胎盘和胎儿营养物质及氧气供应, 调节蛋白质合成[3,9], 对调节新血管生成、胚胎形成以及胎盘和胎儿生长有重要影响[10]。本试验结果表明:Arg可能会降低死胎率和IUGR率, 提高产仔数, 但是过低剂量效果不理想, 而过高剂量可能会通过其他途径影响产仔数的增加和IUGR率及死胎率的降低。其中日粮添加0.5%Arg可降低死胎率达54.70%, 从而极显著提高胎鼠数。本试验中各组平均胎盘重和平均子宫重虽然较对照组有所提高, 但均差异不显著, 这与在猪上的研究结果基本相同[6]。同时本研究发现, 每个组内IUGR胎鼠对应的胎盘重量都会较同窝平均胎盘重轻, 表明胎盘的生长对胎儿的生长可能具有重要影响, 但各组发生IUGR胎鼠数所占比例不大, 即胎盘较轻者比例低, 所以每组平均胎盘重难以反映出组间的具有统计学意义的差异。综合IUGR发生率、死胎及吸收胎发生率、胎鼠数、胎鼠重等方面以及添加剂量进行考虑, 1%Arg虽然IU-GR率降低显著, 在预防IUGR发生方面具有重要影响, 但其胎鼠数仍然未能取得实质性提高;与对照组及其他剂量组比较, 0.5%Arg组胎鼠数取得了实质性提高, 而胎鼠重亦未因此显著下降, IUGR率和死胎率降幅亦较大, 甚至达显著水平, 因此添加0.5%Arg可能对妊娠小白鼠胎鼠宫内发育有较理想的促进作用。

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