RP-HPLC

RP-HPLC（精选7篇）

RP-HPLC 篇1

摘要：目的:建立百令颗粒质量标准的测定方法。方法:色谱柱为迪马C184.6×250mm, 5μ;柱温:室温;流动相:0.04mol/L磷酸二氢钾-乙腈 (95:5) , 流速1.0ml/min, 检测波长260nm。结果:百令颗粒制剂能较好的分离, 且线性良好 (r=1) , 表明腺苷在0.02μg～0.22μg范围内具有良好线性关系。平均回收率 (n=6) 为98.53%, 相对标准偏差1.33%;样品溶液在12小时内稳定。结论:方法简便, 重复性好, 适用于该产品含量测定。

关键词：反相高效液相色谱法,腺苷,甘露醇

百令颗粒由发酵虫草菌粉 (Cs-C-Q80) 加辅料制成的颗粒。具有补肺肾、益精气等功效。用于肺肾两虚引起的咳嗽、气喘、咯血、腰背酸痛;慢性支气管炎的辅助治疗。主要成分为腺苷、甘露醇、氨基酸等。

1 仪器与试药

Agilet1100高效液相色谱仪;岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪;超声波清洗器。

腺苷对照品 (批号:887-200202对照品由中国药品生物制品检定所提供)

乙腈 (色谱级)

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备：

取腺苷对照品适量, 精密称定, 加0.5%磷酸溶液制成每1ml含12μg的溶液, 即得。

2.2 供试品样品溶液的制备:

取装量差异下的本品, 研细, 混匀, 取样品适量约0.8g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 加乙醚20ml, 密塞, 浸泡30分钟, 滤过, 弃去乙醚, 残渣挥干, 连同滤纸一并置具塞锥形瓶中, 精密加入0.5%磷酸溶液50ml, 密塞, 称定重量, 超声处理 (功率250w, 频率33kHz) 30分钟, 放冷, 再称定重量, 用0.5%磷酸溶液补足减失的重量, 摇匀, 离心 (16000转/分) , 取上清液即得。

2.3 色谱条件

色谱柱为迪马C184.6×250mm;柱温:室温;流动相:0.04mol/L磷酸二氢钾-乙腈 (95:5) , 流速1.0ml/min, 检测波长260nm。进样量10μl。理论塔板数胺腺苷峰计为低于3000。在此条件下腺苷与其他组分能达到基线分离 (见图1)

2.4 线性关系的考察

精密称取腺苷对照品加0.5%磷酸溶液制成12μg/ml的溶液, 分别精密吸取2、3、5、8、10、15、20μl, 按上述色谱条件测定峰面积, 峰面积为纵座标, 腺苷对照品量为横座标, 绘制标准曲线得回归方程y=3.2278X-0.4489, r=1, 表明腺苷在0.02μg~0.22μg范围内具有良好线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取质量浓度为12μg/ml的对照品溶液10μl, 重复进样6次, 测定结果如表1。

2.6 稳定性实验

取同一份样品溶液, 分别在0、5、6、7、8、9、12h内腺苷的面积无明显变化, RSD%0.38% (见表2) 。

2.7 重复性实验

取同一批号 (051101) 样品6份, 按样品测试条件测定腺苷的含量, 测定结果见表3。

2.8 加样回收率实验

精密称取已知含量的百令颗粒, 分别添加腺苷对照品, 按“供试品溶液制备”项下操作, 取10μl进样测定, 记录峰面积计算平均回收率, 测定结果见表4。

1、对照品峰2、空白辅料峰

结论:腺苷峰面积的相对标准偏差0.17%。

结果表明:样品溶液在12小时内稳定

结论:样品相对偏差为RSD1.17%。

回收率%=[ (测出腺苷量-样品中腺苷量) /添加腺苷量]*100%

3 讨论

HPLC测定百令颗粒含量具有快速, 灵敏度高, 重复性和稳定性好等优点。

参考文献

[1]中国药典一部2005:434.

[2]不同预处理对冬虫夏草含量测定的影响[J].广西中医学院学报2002, 5 (4) :75.

[3]人工发酵尼古虫草的含量测定菌物研究2004, 2 (1) 40-44.

RP-HPLC 篇2

目前对药物中松香酸的测定有报道[4],但有关生物源农药中松脂酸钠的检测尚无报道,本文通过试验建立松脂酸钠水乳剂生物农药的反相高效液相色谱分析方法。

1 试剂和仪器

松脂酸对照品(进口分装,纯度约85%),北京恒业中远化工有限公司;30%松脂酸钠水乳剂,浙江绿谷生物药业有限公司;甲醇为色谱纯,其它试剂均为分析纯。

Agilent l100 高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;BP210型电子天平,德国赛多利斯;UV-2401PC 紫外-可见分光光度计,日本岛津公司。

2 实验部分

2.1 色谱条件

色谱柱:SB-C18, 5 μm, 250 mm×4.6 mm;流动相:甲醇-pH3.0磷酸与磷酸二氢钾缓冲溶液(70:30),流速:0.7 mL/min,柱温:27 ℃,检测波长:245 nm,定量环进样:20 μL。

2.3 实验方法

2.3.1 标样溶液的配制

准确称取松香酸对照品0.01 g (精确至0.1 mg),加适量甲醇溶解后,缓慢滴加几滴NaOH甲醇溶液使成微弱碱性,以甲醇定容。摇匀后置于冰箱中(-20 ℃)冷存备用。

松香酸标准工作液的制备:准确移取对照品溶液适量,以甲醇配成9份浓度分别为1.011, 2.022, 5.055, 10.11, 20.22, 40.44, 60.66, 80.88, 101.1 mg/L标准溶液用于校准曲线的绘制。

2.3.2 样品溶液的制备

准确称取试样约1 g,加适量甲醇后置于超声波浴中促使其完全溶解,以甲醇定容、摇匀。从中准确移取1.00 mL以甲醇稀释100倍后用0.45 μm 有机滤膜过滤,取续滤液供分析。

3 结果与讨论

3.1 标准工作液、试液溶剂

由于农药中存在添加剂,30%松脂酸钠水乳剂较难溶于水,但在甲醇中可完全溶解,松香酸对照品在滴加几滴NaOH的甲醇溶液后可完全溶于甲醇,故以甲醇作溶剂合适。

3.2 色谱分析条件的选择

3.2.1 检测波长的选择

对适宜浓度的松香酸标准溶液在200～800 nm作吸收曲线得到松香酸在241 nm 波长处有最大吸收。因此选择245 nm 为检测波长。

3.2.2 流动相及流速的选择

考察甲醇和pH 3.0磷酸-磷酸二氢钾缓冲溶液或1%的醋酸(pH 3.0)搭配成流动相,结果表明以甲醇与pH 3.0磷酸-磷酸二氢钾缓冲溶液组成的流动相分析样品时色谱图基线平稳性、结果的重现性与重复性好,其原因是样品呈弱碱性,用醋酸(pH 3.0)虽可调节流动相酸性但没有缓冲作用。对流动相及流速的优化表明:甲醇和pH 3.0磷酸缓冲液体积比70:30、流速0.7 mL/min时,样品分析测试效果好。

3.2.3 色谱图

优化色谱分析条件下的对照品溶液、试液色谱图如图1所示。由图1(a)可见对照品保留时间为14.919 min。对比图1(a) 和图1(b) 图可知,图1(b) 中保留时间14.799 min 峰是松香酸钠组分。分析报告显示图1(b)中峰1的理论塔板数9857,对称性0.87,选择性系数1.21,相对于它前面相邻峰的分离度2.79, 其他色谱峰分离度均大于1.21, 说明样品各组分得到较好分离。

3.3 校准曲线

分别准确进样分析所配的松香酸标准工作液,以对照品保留时间处测得峰面积(A)对浓度(C)作图, 得其校准曲线回归方程为:A=798.26C+23.49 (C: mg/L), r=0.9913), 结果表明浓度在2.022～80.88 mg/ L 范围内线性关系良好。

3.4 方法的精密度与准确度

按“2.3.2”项下样品处理方法制备浓度均为100.8 mg/ L试液5份,各在优化色谱条件下进样分析,以对照品保留时间处测得峰面积计算得到方法的RSD为7.81%, 以3倍噪声电平计算得检出限为0.179 mg/L。由色谱峰面积得到的方法相对标准偏差不是很大,表明方法的精密度较好,具有较好的重现性,并且检出限也较低,说明方法还是较灵敏。

取已知含量的样品约100 mg,平行6份,精密称定,每2份为一组,每组分别加入一定量“2.3.1”项下对照品储备液,按试液的制备方法处理并测定,得到的加样回收率结果见表1。虽然样品加标回收的RSD较大,但从平均回收率值可见,方法的准确性比较好。

3.5 稳定性试验

按“2.3.2”项下样品处理方法制备浓度100.8mg/ L试液,分别于1, 2, 4, 8, 12, 24 h 进行色谱分析,结果见表2。由表2可见,以对照保留时间处峰面积在24 h之内测得值基本稳定,方法的RSD 0.694%也说明方法是稳定可靠的。

3.6 样品测定

分别取3个样品(批号080216,080321,081019) 约0.1 g,精密称定,按“2.3.2”项下样品处理方法制备试液并在优化的色谱条件测定,以外标定量法按校准曲线回归方程计算得3个样品中,松脂酸钠的质量分数分别为31.5%、30.7%、29.3%,平均值为30.5%,RSD为3.65%。

4 结 论

本文建立的以甲醇-pH 3.0磷酸-磷酸二氢钾缓冲溶液=70:30 (V/V)为流动相的RP-HPLC 测定30%松脂酸钠水乳剂方法,基线平稳,分离度较好且回收率良好,测定结果稳定,适用于松脂酸钠水乳剂生物农药中松脂酸钠含量的快速分析测定。

摘要：采用ZORBAX SB-C18柱,检测波长245 nm,以甲醇-pH 3.0磷酸缓冲溶液(体积比70∶30)为流动相,流速0.7 mL/min色谱分析条件。建立了30%松脂酸钠水乳剂生物农药的反相高效液相色谱分析方法。结果表明,松脂酸保留时间14.919 min,松脂酸浓度在2.022～80.88 mg/L时其峰面积与进样浓度呈良好的线性关系,方法回收率90.51%～110.2%,RSD为7.37%,最低检出限0.179 mg/L。该方法灵敏、可靠,具有简便、重现性好的特点。

关键词：30%松脂酸钠水乳剂,生物农药,反相高效液相色谱

参考文献

[1]王运兵,张志勇主编.无公害农药使用手册[M].北京:化学工业出版社,2008:252.

[2]张文龙,吴玉英,龚宁,等.松脂酸钠等药剂防治柑桔红蜡蚧初报[J].上海农业科技,2009(5):140-141.

[3]吴远彬.新农村建设丛书:果园科学用药[M].北京:中国农业科学技术出版社,2006:107.

RP-HPLC 篇3

1 仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱仪, PDA-100检测器, YUP-ING FA2004b型电子天平 (上海越平科学仪器有限公司) ;KQ-100E型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ;盐酸小檗碱 (批号713-8703) 中国药品生物制品检定所提供, 乙腈为色谱纯 (天津四友) ;水为娃哈哈纯净水, 其余试剂均为分析纯。供试品平喘颗粒为实验室自制。

2 方法

2.1 色谱条件

C18色谱柱 (250mm×4.6mm, 5μm) ;柱温:30℃;流动相乙腈∶水 (100mL加十二烷基磺酸钠0.4g, 磷酸调节pH值为4) , 体积比为50∶50;流速:1.0mL·min-1;检测波长:345nm[2,3,4]。

2.2 对照品溶液制备

精密称取盐酸小檗碱对照品适量, 用甲醇配制成每lmL含0.092 7mg的溶液, 作为盐酸小檗碱对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取本品粉末 (过2号筛) 约0.2g, 精密称定, 置于具塞锥形瓶中, 精密加人甲醇-盐酸 (100︰1) 的混合溶液50mL, 密塞, 称定重量, 超声处理 (功率250W, 频率40kHz) 30min, 放冷, 再称定重量, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 滤过, 精密量取续滤液2mL, 置于10mL容量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。

2.4 阴性对照溶液制备

取同平喘颗粒制备方法一致但不含黄连药材的粉末适量, 处理方法同“2.3”项下供试品制备方法, 即得阴性对照品溶液, 实验结果表明阴性溶液无干扰。

3 结果

3.1 线性范围考察

分别精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液2、4、6、8、10μL进样, 测定峰面积, 以对照品溶液中盐酸小檗碱含量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 进行线性回归, 得回归方程为:Y=3 724 061.5X+46 237, r=0.999 9, 结果表明盐酸小檗碱在0.185 4~0.927μg范围内线性关系良好。

3.2 稳定性试验

取供试品溶液进样, 进样量为6μL, 分别于0、2、4、6、8h、12h各测定1次峰面积, 结果表明峰面积积分值在12h内基本无变化, RSD为1.76%, 供试品溶液在12h内稳定。

3.3 精密度试验

取供试品溶液进样, 进样量为6μL, 连续进样5次, 根据线性方程计算盐酸小檗碱的含量, 测得其含量的RSD为1.42%, 表明该测定方法精密度良好。

3.4 重现性试验

精密称取同一批号样品5份, 每份约0.2g, 按“2.3“项下供试品制备方法处理后进行盐酸小檗碱含量测定。结果测得盐酸小檗碱含量的RSD为1.69%, 表明该方法重现性良好。

3.5 加样回收率试验

精密称取已知盐酸小檗碱含量的平喘颗粒6份, 每份约0.2g, 按高、中、低三种浓度分别加入盐酸小檗碱对照品溶液, 按“2.3项”下供试品处理的方法制备样品溶液并进样测定, 进样量为6μL, 测得盐酸小檗碱的加样回收率为99.24%, RSD=0.98%, 说明该方法的回收率良好。

4 讨论

2005版中国药典中黄连中盐酸小檗碱的含量测定采用的是薄层扫描法, 2010年版中国药典开始采用高效液相色谱法测定盐酸小檗碱的含量。本实验中流动相的制备是重点, 因其既要添加十二烷基磺酸钠又要用磷酸调节流动相pH, 操作需严格遵守规范, 否则会影响测定时盐酸小檗碱的分离效果和基线的稳定性。本文建立了平喘颗粒中盐酸小檗碱的含量测定方法, 并对其实验条件进行了方法学考察, 为该中成药的质量控制奠定了基础, 值得推广应用。

摘要：目的:测定平喘颗粒中盐酸小檗碱的含量, 建立平喘颗粒的质量控制方法。方法:色谱柱为Hypersil ODS2C18 (250mm×4.6mm, 5μm) ;流动相为乙腈∶水 (100mL加十二烷基磺酸钠0.4g, 磷酸调节pH值为4) , 体积比为 (50∶50) ;检测波长为345nm。结果:盐酸小檗碱在0.18540.927μg范围内线性关系良好, r=0.999 9。结论:该法简便、准确、重复性好, 可作为平喘颗粒的质量控制方法。

关键词：平喘颗粒,盐酸小檗碱,HPLC

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:化学工业出版社, 2010:286.

[2]梁海春, 石书江, 李一江, 等.HPLC法测定加味胃炎消片中野黄芩苷、盐酸小檗碱的含量[J].中药新药及临床药理, 2011, 22 (1) :96-98.

[3]宋霄宏, 昝日增.HPLC法测定胃炎平颗粒剂中盐酸小檗碱的含量[J].中国实验方剂学杂志, 2003, 9 (1) :14-16.

RP-HPLC 篇4

1 仪器与试药

DIONEX Ultimate3000高效液相色谱仪:LPG3400A泵,VDW3100紫外检测器,Chromeleon色谱工作站;BS21S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司);Aquapro纯水仪(重庆颐洋企业发展有限公司)。

士的宁对照品(中国药品生物制品检定所,批号110705-200005);元明丹(鄂州市某医院提供,批号为090201,090401,090411);甲醇、乙腈为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性

色谱柱为DIONEX C18(4.6 mm×250 mm,5μm);乙腈-0.3%三乙胺溶液(磷酸调pH=2.6)(9∶91)为流动相,流速:1.0 ml/min,柱温:30℃,检测波长:254 nm;进样体积:20μl。理论塔板数按士的宁峰计算不少于5 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

称取士的宁对照品10.14 mg,置20 ml量瓶中,加三氯甲烷使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液。精密量取对照品储备液3 ml,置25 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得

2.2.2 供试品溶液

取元明丹适量,粉碎,过二号筛,取粉末0.7 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加氢氧化钠试液3 ml,混匀,放置30 min,精密加三氯甲烷20 ml,密塞,称定重量,置水浴中回流提取2.5 h,放冷,再称定重量,用三氯甲烷补足减失的重量,摇匀,分取三氯甲烷提取液,用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液5 ml,置60℃水浴挥干,残渣用甲醇溶解定容至5.00 ml,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。

2.2.3 阴性对照溶液

按处方比例制备不含马钱子的阴性对照样品,按照“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适应性试验

分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μl,注入色谱仪,同法测定,结果供试品溶液与对照品溶液主峰的保留时间一致,士的宁峰与其他峰完全分离,峰形理想,阴性对照无干扰。见图1。

2.4 线性关系

精密量取对照品储备液5 ml,置25 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得对照品溶液(5);精密量取对照品溶液(5)1、2、3、4 ml,分别置5 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,分别作为对照品溶液(1)、(2)、(3)、(4)。将对照品溶液(1)~(5)用微孔滤膜(0.45μm)过滤,依次进样20μl,测定峰面积。以士的宁的峰面积(Y),分别对其进样量(X)进行线性回归,得回归方程为:Y=33.226 1X+11.139 5(r=0.999 7)。结果表明,士的宁在0.405 6~2.028μg与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

取对照品溶液,连续重复进样6次,每次20μl,测定士的宁峰面积,RSD为0.96%(n=6)。

2.6 重复性试验

取批号为090401供试品6份,分别制备成供试品溶液,依法测定,计算含量。士的宁平均含量为1.63 mg/g,RSD为1.9%(n=6)。

2.7 稳定性试验

将供试品溶液常温放置,分别于0、2、4、6、8,10 h进样20μl,测定士的宁峰面积,RSD为1.5%(n=6)。结果表明,供试品溶液在10 h内基本稳定。

2.8 加样回收试验

精密量取对照品储备液5份,每份各1 ml,分置锥形瓶中,于60℃水浴上挥干;精密称取“2.6”项下的已测定含量的元明丹5份分别至锥形瓶中,每份约0.35 g,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,进样20μl,计算回收率,结果见表1。

2.9 样品含量测定

取本品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,依法测定,记录峰面积,按外标法计算含量,结果见表2。

3 讨论

3.1 提取方法

提取士的宁常采用碱性三氯甲烷水浴回流的方法[2,4],比较氢氧化钠试液和浓氨试液两种不同碱化试剂的提取效果,结果显示采用氢氧化钠试液效果较好;比较回流提取2.0、2.5、3.0 h,发现回流2.5 h已提取完全。

3.2 流动相的选择

采用文献[4,5,6,7,8]报道的乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值为2.8)组成流动相时,发现士的宁峰与相邻峰不易分离。采用本文流动相时,利用三乙胺调节峰形,加入磷酸改善基线漂移现象,此时,样品中士的宁峰与其他峰完全分离,峰形较好。

参考文献

[1]马密霞,胡文祥,刘接卿,等.马钱子属植物的药理毒理作用及临床应用进展[J].中国医院药学杂志,2007,(12):1725-1728.

[2]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2005:34.

[3]杨春静,郜娜,姬广山.RP-HPLC法测定强筋健骨片中马钱子碱和士的宁的含量[J].中国药师,2010,13(4):519-520.

[4]宋玉国,彭振宇,张新茹.HPLC法测定风湿福音丸中马钱子碱、士的宁的含量[J].中国药事,2010,24(5):507-513.

[5]丁红仙.高效液相色谱法测定十三味马钱子丸士的宁的含量[J].浙江中医药大学学报,2009,33(3):425-426.

[6]王歆君,刘进疆,王芳,等.胃尔康片质量标准的研究[J].西北药学杂志,2009,24(6):451-452.

[7]冯益民.高效液相色谱法测定平消片中士的宁含量[J].中国药业,2009,18(12):50.

RP-HPLC 篇5

关键词：水果,维生素C (Vc) ,反相高效液相色谱 (RP-HPLC)

维生素C, 又称抗坏血酸 (AH 2) ) 。医学研究发现它不但具有生理活性, 而且在人体内能阻止亚硝胺的形成, 具有一定的防癌作用[1]。但人体自身不能合成维生素C, 必须由食物中摄取, 所以分析测定水果和蔬菜中维生素C含量, 将对鉴别水果和蔬菜的营养价值具有重要意义。目前水果和蔬菜中维生素C测定的方法除了药典规定的碘量法[2], 还有比色法[3]、紫外分光光度法[4]、荧光法[5]等, 但这些方法所需试剂多且操作繁琐, 测定结果准确性也存在一定问题[6]。近年来发展了用高效液相色谱法测定维生素C含量的方法, 具有高效、快速、稳定、可靠等特点, 但文献报道的所用流动相体系均较复杂, 一般都采用了缓冲盐或者低浓度酸[7—10]。本文应用反相高效液相色谱法, 采用乙腈-水 (40∶60v/v) 作流动相, 直接测定了时令常见水果中的维生素C含量, 取得了理想的效果。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪, 配有VWD检测器;UV-2450紫外分光光度计;Milli-Q纯水超纯水系统;HS-120D超声波清洗机;AP-01过滤器;FA 2004A电子天平

甲醇、乙腈 (色谱纯) , TEDIA公司;抗坏血酸 (分析纯) , 无锡展望化工试剂有限公司;磷酸 (分析纯) , 无锡飞达化工厂;超纯水 (由Milli-Q纯水超纯水系统制备) 。

1.2色谱分离条件

色谱柱:EclipseXDB-C18 (5μm 4.6×250mm) , 流动相:乙腈-水 (40∶60v/v) , 流速:1.0mL/min, 波长:275nm;进样量:10μL:。

1.3溶液配制

1.3.1标准贮备液的配制

精密称取抗坏血酸0.25g, 置250mL容量瓶中, 加0.1%磷酸溶液溶解并稀释至刻度, 摇匀。得1000μg/mL的标准贮备液。

1.3.2标准溶液的配制

分别精密量取1mL、2mL、4mL、8mL、16mL、32mL、64mL的标准贮备液至100mL量瓶中, 用0.1%磷酸溶液稀释至刻度, 得10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL的系列标准溶液。

1.3.3供试品溶液的配制 (样品前处理)

将买来的新鲜水果洗净, 晾干后分别置于匀浆机中匀浆, 用布氏漏斗过滤, 再精确称取10g滤液至50mL容量瓶中, 用0.1%磷酸稀释至刻度, 进样前用0.45μm针头式过滤器过滤。

1.4测定方法和结果计算

根据色谱分离条件, 将仪器调节到进样分析状态, 用平头针头精确量取10μL进样分析, 保存色谱图记录峰面积, 并根据质量浓度-峰面积作标准曲线用外标法进行计算。

2结果与讨论

2.1溶剂的选择

维生素C具有较强还原性, 且易受空气、热、光、碱性物质、金属离子等因素影响, 但在酸性溶液中稳定[11], 为防止分析过程中维生素C的破坏, 实验采用0.1%磷酸溶液作溶剂配制各种溶液。

2.2检测波长的确定

取抗坏血酸适量, 加0.1%磷酸溶液配成约160μg/mL的溶液, 用0.1%磷酸溶液作参比溶液, 在200～400nm波长扫描, 结果发现在275nm波长处有最大吸收。故本文以275nm为检测波长。

2.3流动相和流速的确定

取抗坏血酸适量, 用0.1%磷酸溶液配成约160μg/mL的溶液, 实验过程中尝试了甲醇、甲醇-水乙腈、乙腈-水等不同体系及配比的流动相, 并对流速从 (0.5～1.5) mL/min之间进行反复实验, 结果表明, 当流动相为乙腈-水 (40∶60v/v) , 流速为1.0mL/min时, 不但能得到了良好的峰形、适当的保留时间和较高的理论塔板数, 同时能对果汁中其它物质得到较好的分离;而且避免了流动相体系中加入缓冲盐和低浓度的酸, 既保护了色谱柱, 又使得实验操作更简便, 维生素C的定性分析图见图1。

2.4标准曲线和线性范围

精确吸取上述不同质量浓度的系列标准溶液10μL, 按色谱分离条件进样分析, 保存色谱图记录峰面积。并以质量浓度X (μg/mL) 为横坐标, 峰面积Y (mAU·s) 为纵坐标作图, 得标准工作曲线的回归方程为Y=2.516 01+3.556 17X, 相关系数R 2为0.999 96。结果表明:维生素C在 (10～640) μg/mL之间呈现良好的线性关系, 见图2。

2.5样品测定

2.5.1样品定性分析

精密吸取各供试品溶液10μL, 按色谱分离条件进样分析, 保存色谱图记录峰面积, 并根据在同一实验条件下纯物质保留时间定性, 得出各水果样品中维生素C的相对应的归属峰。猕猴桃的色谱分离图见图3。

2.5.2 样品定量测定

精密吸取各供试品溶液10 μL, 按色谱分离条件进样分析, 保存色谱图并记录色谱图中的维生素C对应的峰面积, 然后根据外标法对各时令水果中的维生素C含量进行定量计算, 各时令水果的维生素C分析结果见表1。

2.6 精密度实验

取草莓供试品溶液, 按上述的色谱条件连续进样6次, 保存色谱图并记录色谱图中的维生素C对应的峰面积。结果峰面积相对标准偏差RSD为0.941 6%, 表明本法精密度较高, 重现性较好。实验结果见表2。

2.7 稳定性实验

准确称取20.0 mg的抗坏血酸分别置于两洁净的50 mL烧杯中, 其中一份用超纯水溶解, 稀释定容至50 mL容量瓶中, 另一份用0.1%磷酸溶解、稀释定容至50 mL容量瓶中。每隔2小时对两溶液按色谱分离条件进样分析, 保存色谱图并记录色谱图中的维生素C的峰面积, 然后计算并比较两溶液中维生素C含量的变化情况。结果表明:用0.1%磷酸溶解的维生素C在4 h内较稳定, 而用超纯水溶解的溶液稳定性则相对较差, 因此更进一步说明了维生素C在酸性条件下相对比较稳定;但随着时间的推移, 维生素C含量也将逐渐减少, 这同时表明新鲜水果要尽快食用, 以免营养成分流失。实验结果见表3。

2.8 回收率实验

回收率实验选在圣女果中进行。分别精确移取圣女果的供试品溶液5 mL于5个50 mL洁净容量瓶中, 再分别直接准确加入2、4、6、8、10 mL质量浓度为320 μg /mL的维生素C标准溶液, 然后用0.1%磷酸稀释到刻度, 按色谱分离条件测定, 保存色谱图并记录色谱图中的维生素C对应的峰面积, 然后根据外标法定量计算, 同时计算回收率, 实验结果见表4。

3 结论

本文利用反相液相色谱法直接测定了水果中维生素C含量, 其操作简单, 分离时间短, 分离效果较好, 测定结果准确度和重现性也较好, 且不受样品中其它组分的干扰, 特别是流动相体系中不需用到缓冲盐和低浓度的酸, 既能保护色谱柱, 又能使实验操作更简便。该法同样可以适用用于其他水果或果汁饮料等食品中的维生素C含量的快速测定。

参考文献

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RP-HPLC 篇6

1 仪器与试药

紫外检测器, Agilent 1200高效液相色谱仪, Agilent色谱工作站;BS124S电子天平、CP225D sartorius电子天平 (北京赛多科斯仪器系统有限公司) ;FQ-300DE超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) 。

阿魏酸对照品 (中国药品生物制品检定所, 批号:110773-200611) ;甲醇 (色谱纯, 江苏汉邦科技有限公司, 批号:111496) ;醋酸 (宜兴市化学试剂三厂, 批号:20020601) ;乙酸乙酯 (国药集团化学试剂有限公司, 批号:10009418) ;水为过0.2μm滤膜的双蒸水。小金丸 (成都九芝堂金鼎药业有限公司, 批号:111201, 120201, 120202) 。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hederaods-2 C18 (4.6 mm×200 mm, 5μm) ;流动相:甲醇-2%醋酸溶液 (28∶72) ;检测波长:324nm;流速:1m L/min;进样量为10μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取阿魏酸对照品13.15mg置于50m L棕色量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 得对照品贮备液, 浓度为0.263mg/m L。精密吸取2.00m L贮备液置于50m L棕色量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 即得阿魏酸对照品溶液, 浓度为10.52μg/m L。

2.3 供试品溶液的制备

取小金丸3g, 研细, 精密称定, 加水70%甲醇30m L, 超声30min, 过滤, 加70%甲醇20m L洗涤残渣, 过滤, 合并滤液, 蒸干, 残渣加水15m L溶解, 乙酸乙酯萃取4次 (20、20、15、15m L) , 合并萃取液并蒸干, 残渣用甲醇溶解, 转移至10m L容量瓶, 定容, 摇匀, 0.45μm微孔滤膜滤过, 取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除当归的其他药味, 按照小金丸的制备工艺制成缺当归的阴性制剂, 再按供试品溶液的制备方法制成缺当归的阴性对照溶液。

2.5 阴性对照试验

分别吸取阿魏酸对照品溶液、小金丸供试品溶液及缺当归的阴性对照溶液各10μL注入HPLC色谱仪, 按”2.1”项下色谱条件分别测定, 结果, 阴性对照对阿魏酸的测定无干扰。色谱见图1。

2.6 线性关系考察

精密吸取0.263mg/m L对照品溶液0.40, 0.56, 0.80, 1.04, 1.20m L, 分别置于20m L棕色量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 得浓度为5.26, 7.364, 10.52, 13.676, 15.78μg/m L的对照品溶液。在上述色谱条件下, 分别进样10μL进行测定, 以进样量X (μg) 为横坐标, 峰面积积分值Y为纵坐标进行线性回归, 回归方程为:Y=0.0002X-0.0029 (r=0.9997) , 结果表明阿魏酸在0.0526~0.1578µg范围内呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取10.52μg/m L的对照品溶液重复进样5次, 每次10μL, 结果阿魏酸峰面积的RSD为0.8%, 表明精密度良好。

2.8 稳定性实验

取同一供试品溶液 (批号111201) , 分别于0, 2, 4, 8, 16, 32, 48h进样20μL, 测定峰面积, 无显著变化, RSD为1.3%, 表明供试品溶液在48h内是稳定性良好。

2.9 重复性试验

取5份同一批次 (批号111201) 样品, 同法制备成供试品溶液, 并在上述色谱条件下进样测定。结果5批样品中阿魏酸的含量平均为0.02699mg/g, RSD为1.23%, 表明本法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取已测定阿魏酸含量的小金丸 (批号111201) 5份, 每份约1.5g, 精密称定, 溶解, 再分别精密加入0.263mg/m L对照品溶液0.20m L, 按供试品溶液制备方法制备成供试液进行回收率试验, 算得加样回收率, 得到平均加样回收率为99.4%, RSD=0.82% (表1) 。

2.11 样品含量测定

取3批不同批号小金丸各3份, 每份约3.0g, 精密称定, 再按供试品溶液制备方法制备成供试液, 进样测定, 计算样品中阿魏酸的含量, 结果见表2。

3 讨论

3.1 阿魏酸的稳定性

阿魏酸的稳定性差, 极易因见光、受热而发生异构化从而降解, 阿魏酸对照品在放置4h后含量随即降低, 故在实验过程中应有效的避光和防热。但制剂中由于各成分的相互影响, 使阿魏酸含量相对稳定。在48h内变化不大。

3.2 流动相的选择

实验参考相关文献[1,6,8], 尝试使用乙腈-磷酸, 甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相, 比较发现甲醇-2%醋酸溶液流动相分离效果好, 峰形好。

3.3 提取溶剂的确定

实验曾分别采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯萃取样品, 结果发现乙酸乙酯萃取率较高。

摘要：目的 建立测定小金丸中阿魏酸的RP-HPLC含量方法。方法 采用反相高效液相色谱法 (RP-HPLC) 。色谱柱为Hedera ods-2 C1 (8200mm×4.6 mm, 5μm) , 流动相为甲醇-2%醋酸溶液 (28∶72) , 流速为1mL/min, 检测波长为324nm。结果 回归方程为Y=0.0002X-0.0029 (r=0.9997) , 阿魏酸在0.0526～0.1578μg范围内线性关系良好, 平均加样回收率为99.4%, RSD=0.82% (n=5) 。结论 本方法操作简便、快速、准确, 适用于小金丸中的阿魏酸的质量控制。

关键词：RP-HPLC,小金丸,阿魏酸,含量测定

参考文献

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RP-HPLC 篇7

1实验材料

岛津高效液相色谱系统 (SPD-M20A二极管阵列检测器, LC solution色谱工作站) ;KQ5200DE型超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;AUW120D型岛津电子天平:日本;TTL-2C型超纯水制备仪:北京同泰联科技发展有限公司。甘草苷对照品 (批号:111610-200604, 供含量测定用) :中国药品生物制品检定所;沙参止咳汤散:内蒙古民族大学附属医院蒙药临床药理研究所提供, 批号:081003, 081005, 081007。乙腈为色谱纯 (批号:2008042508) :山东禹王实业有限公司化学分公司;水为超纯水, 其余试剂为分析纯。

2方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Shim-pack VP-ODS (4.6mm×150mm, 5μm) 。流动相:乙腈-0.5%冰醋酸 (20∶80) ;流速:1.0ml·min-1;进样量:10μl;检测波长:276nm;柱温:30℃。理论塔板数按甘草苷峰计算为7000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取甘草苷对照品10.16mg, 置于20ml量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得每1ml中含甘草苷0.508mg的溶液, 分别精密吸取溶液0.1、0.3、0.5、1、3、5ml分别置于25ml量瓶中加甲醇稀释至刻度, 用微孔滤膜 (0.45μm) 滤过, 取续滤液, 即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密取沙参止咳汤散0.6g, 置具塞锥形瓶中, 加入甲醇10ml称定重量, 超声 (功率200W, 频率40kHz) 30分钟取出放至室温, 再称定重量用甲醇补足减失重量, 摇匀, 滤过。精密吸取续滤液5ml, 移入100ml量瓶中, 用20%乙腈稀释至刻度, 摇匀, 用微孔滤膜 (0.45μm) 滤过, 取续滤液, 即得。

2.4 阴性溶液的制备

按上述供试品溶液制备方法制成缺甘草的阴性溶液。

2.5 阴性干扰试验

按上述色谱条件, 吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性溶液各10μl, 分别注入色谱仪中。供试品色谱图中, 在与对照品色谱图相应的位置上, 有一相同的色谱峰, 而阴性溶液在此保留时间无干扰, 见图1。

2.6 线性关系考察

精密吸取甘草苷对照品溶液各10μl, 分别注入高效液相色谱仪测定。以甘草苷对照品含量 (μg) 为横坐标, 峰面积积分值为纵坐标, 绘制标准曲线, 直线几乎通过原点, 所以采用外标一点法进行含量测定。线性回归方程Y=2.1623484×107X-4.3703×103, r=0.9999

2.7 精密度试验

取同一甘草苷对照品溶液10μl, 注入液相色谱仪, 连续测定6次, 结果峰面积积分值分别为:436925、435696、438249、433631、437657、438460;积分值平均为:436769.7, RSD=0.38% (n=6) 。结果表明仪器精密度较好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液 (批号:081003) 各10μl, 分别于0、2、5、10、15、20、24小时注入液相色谱仪测定, 结果峰面积积分值平均为:128490.3, RSD=1.09% (n=6) 。表明在24小时内溶液稳定性良好。

2.9 重复性试验

取同一批号样品 (081003) , 研细, 按上述方法制得6份供试品溶液, 按含量测定项下的方法, 测定峰面积。结果峰面积积分值的RSD=0.76% (n=6) 。表明重复性好。

2.10 回收率试验

精密称取已知含量的同一批号 (081003) 沙参止咳汤散6份各0.3g, 分别精密加入0.0311μg·μl-1甘草苷对照品溶液2ml, 按上述供试品溶液制备方法操作, 制成加样供试品溶液。精密吸取加样供试品溶液10μl, 注入液相色谱仪, 按上述方法测定, 结果见表1。

2.11 样品含量测定

取3个批号 (081003、081005、081007) 的样品, 分别按上述供试品溶液制备方法操作, 依上述色谱条件, 注入高效液相色谱仪, 测定各自样品中甘草苷的峰面积, 计算甘草苷的含量。结果甘草苷含量的平均值分别为0.2064、0.2070、0.2077mg/g。

3讨论

3.1 提取溶剂的确定

由甘草苷的结构可知, 其水溶性较小, 具有一定的脂溶性, 适宜使用中等极性的溶剂提取。参考2005年版《中国药典》 (一部) 中甘草药材的含量测定方法及相关文献资料[2,3], 本实验采用甲醇进行提取, 既能保证甘草苷的提取完全, 加样回收率达96.75%, 又能减少其它成分的干扰。

3.2 提取方法及提取时间的确定

甘草苷的提取方法主要有:超声提取法、加热回流法等。本实验考察了煎煮法、超声提取法、加热回流法, 发现上述方法的提取效果相当。考虑超声提取法节省资源, 简便易行, 故确定采用该方法提取。本实验对提取时间 (20、30、40分钟) 分别做了考察, 结果证明, 提取时间为30分钟时, 沙参止咳汤散中的甘草苷能被提取完全。

3.3 流动相的确定

本实验采用了RP-HPLC法, 同时分别考察了甲醇-0.5%冰醋酸溶液 (35∶65) , 乙腈-2.5%冰醋酸溶液 (13∶87) , 乙腈-0.1%冰醋酸溶液 (4∶96) , 乙腈-0.5%冰醋酸溶液 (20∶80) 等流动相体系, 结果发现当流动相为乙腈-0.5%冰醋酸溶液 (20∶80) 时, 色谱峰峰形较好, 分离度、理论塔板数、拖尾因子等系统适应性均符合要求。

本实验方法操作简便, 结果可靠, 重现性好, 可用于沙参止咳汤散的质量控制。

摘要：目的:测定沙参止咳汤散中甘草苷含量。方法:采用Shim-pack VP-ODS (4.6mm×150mm, 5μm) 色谱柱, 流动相为乙腈-0.5%冰醋酸溶液 (20∶80) 为流动相;流速1.0ml.min-1, 检测波长276nm, 柱温为30℃。结果:甘草苷进样量在0.02～1.0μg范围内与峰面积线性关系良好, 回归方程Y=2.1623484×107X-4.3703×103 (r=0.9999) , 平均加样回收率为96.75%, RSD=1.08% (n=6) 。结论:本方法简便、快速、重现性好, 可作为沙参止咳汤散的质量控制方法。

关键词：沙参止咳汤散/分析,甘草苷

参考文献

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