丹酚酸B（精选7篇）
丹酚酸B 篇1
复方丹参片由丹参、三七、冰片三味中药组成, 丹参为方中主药, 来源于唇形科植物丹参的干燥根及根茎, 含有丹酚酸B, 丹参酮ⅡA等药理活性成分。本实验采用《中华人民共和国药典》2005版一部“复方丹参片”含量测定项下的含量测定方法, 采用高效液相色谱法 (HPLC) 测定丹参中丹酚酸B的含量, 对药典方法加以简单数据说明, 希望对药品检验工作人员有所帮助。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
日本岛津LC-2010自动进样高效液相色谱仪, 丹酚酸B对照品, 购于中国药品生物制品检定所 (供含量测定用, 批号为:111562-200807) 。乙腈为色谱纯, 水为纯化水, 其他试剂均为分析纯。
1.2 色谱条件
色谱柱:用Agilent Extend C18 (250 mm×4.6mm, 5μm) ;流动相:乙腈-甲醇-甲酸-水 (10∶30∶1∶59) 为流动相;检测波长:286nm[1,2]。柱温:30℃[1,2];理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于4000。
1.3 溶液的制备
1.3.1 对照品溶液的制备
精密称取丹酚酸B对照品, 加甲醇制成每1m L含60μg的溶液, 即得。
1.3.2 供试品溶液的制备
取重量差异项下的本品, 取本品10片, 糖衣片除去糖衣, 精密称定, 研细, 取0.15g, 精密称定, 置50ml量瓶中, 加水适量, 超声处理 (功率300W, 频率50kHz) 30min, 放冷, 加水至刻度, 摇匀, 离心, 取上清液, 即得。
2 系统适用性试验
2.1 对照品及供试品分离图谱 (见图1、2)
2.2 线性关系考查
分别精密吸取对照品溶液 (0.06018mg/mL) 2.0、6.0、10.0、14.0、18.0、22.0μL依次注入液相色谱仪, 按上述色谱条件测定, 以进样量 (μg) 为横坐标X, 丹酚酸B峰面积为纵坐标Y作图, 得一直线, 近似通过原点。其线性回归方程为y=53654x+3281.8, 相关系数γ2=0.9998。结果表明, 丹酚酸B在0.12036~1.32396μg范围内样品含量与峰面积呈良好的线性关系。
2.3 精密度试验:
精密吸取同一对照品溶液10μL, 连续进样6次, 测定丹酚酸B峰面积积分值, RSD为0.13%, 所用仪器具良好的精密性。
2.4 重复性试验
取同一批号供试品6份, 分别按供试品溶液制备方法制成样品溶液, 分别进行测定丹酚酸B含量, RSD为0.21%, 本法具有良好的重现性。
2.5 稳定性试验:
取同一供试品溶液, 依法分别于0、2、5、8、10、12h进样, 丹酚酸B峰面积积分值, RSD为0.24%, 12h内供试品溶液中丹酚酸B的含量基本稳定。
3 样品测定结果
依正文方法测定三批样品, 结果见表1。
4 结果
本实验根据《中国药典》2005年版一部复方丹参片中含量测定项下, 采用HPLC法测定同一厂家不同批号的三个批次复方丹参片中丹酚酸B的含量, 辅以数据说明。结果方法稳定, 可靠, 灵敏度高, 重现性好, 方法操作简便易行。
摘要：目的 对复方丹参片进行质量控制。方法 采用高效液相色谱法测定制剂中丹酚酸B的含量。高效液相色谱条件为色谱柱:Agilent Extend C18 (250 mm×4.6mm, 5μm) ;流动相:乙腈-甲醇-甲酸-水 (10∶30∶1∶59) 为流动相;检测波长为286nm。柱温:30℃。结果 高效液相色谱测定丹酚酸B在0.120361.32396μg范围内, 呈良好线性关系。结论 该方法简便易行, 重现性好。
关键词：丹酚酸B,高效液相色谱法,含量测定
参考文献
[1]国家药典委员.中华人民共和国药典[S].2005版.一部.北京:化学工业出版社, 2005.
[2]国家药典委员.中国药典高效液相色谱图集[S].一卷.北京:人民卫生出版社, 2005.
丹酚酸B治疗脑卒中的研究进展 篇2
关键词：脑卒中,丹酚酸B,综述
丹酚酸B作为丹参生物活性含量最高的提取物之一, 已在体内外实验中证实具有神经保护和抗炎作用。在大鼠的体内试验研究中发现, 丹酚酸B能通过减少脂质过氧化物的释放, 清除自由基和提高能量代谢, 保护缺血再灌注诱导的脑损害[1,2]。干细胞作为缺血性脑卒中治疗的另一种新途径, 也被广泛的进行了体内外研究。国内外研究表明, 内源性干细胞增殖及分化, 修复受损脑组织既可以避免外源性干细胞移植中有关伦理问题, 也可以减少个体致病性、免疫反应和移植细胞致瘤性等风险, 又可以根据病情和时间窗随时选择使用时间, 不受外源性干细胞来源的限制, 具有明显的可以多次重复应用的优势。目前研究发现丹酚酸B能维持干细胞的自我增殖和促进其分化[3], 改善脑卒中后运动功能障碍[4], 为促进脑卒中后功能障碍的恢复提供临床依据。
1 丹酚酸B的药理作用
丹酚酸B为中草药丹参的根及根茎提取物, 是丹参中含量最高的水溶性成分, 具有热不稳定性, 纯品为类白色粉末, 味微苦、涩, 具有引湿性, 可溶于水, 乙醇、甲醇。其分子式为C36H30O16, 相对分子质量718.62, 由1分子咖啡酸和3分子丹参素缩合而成, 具有两个羟基, 可以不同的盐 (Mg2+, K+, Ca2+, Na+和NH4+等) 形式存在, 在煎煮、浓缩过程中, 少部分水解生成紫草酸和丹参素。丹酚酸B具有抗氧化、清除自由基的作用[1], 丹酚酸B的抗氧化活性高于丹参中的丹参素和原儿茶醛等小分子酚酸[5]。药理研究表明丹酚酸B还具有对心脑缺血再灌注损伤的保护[1]和神经退行性疾病的治疗作用[6], 可抑制血小板聚集, 改善脑血流量, 降低血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 的异常增多, 调节低密度脂蛋白, 刺激内皮细胞产生NO的作用, 具有保护缺血-再灌注损伤中粒细胞免受损害, 抑制细胞凋亡以及抗动脉粥样硬化, 预防心脑血管疾病, 抗肝损害[7,8,9,10,11,12]等活性。
2 丹酚酸B治疗脑卒中的研究现状
2.1 丹酚酸B对干细胞的增殖分化作用
动物的祖细胞在侧脑室室管膜下区和海马齿状回终生具有增殖能力, 且局部脑缺血会使细胞增殖的数量显著增加, 但是这些增殖分化的神经干细胞相对于脑梗死后组织修复需要的神经干细胞数量来说是远远不够的[13]。因此, 如何提高内源性神经干细胞的增殖能力, 促进其迁移并向神经元方向分化, 以形成新的神经网络而重建受损的神经功能, 成为目前研究的热点。
Guo等[3]用丹酚酸B体外诱导胎鼠的神经干细胞发现, 用梯度浓度的丹酚酸B诱导5 d后, 均可获得较多数量的神经干细胞, 形成的神经干细胞球 (neurosphere stem cells) 不仅数量多, 而且体积较大, 当神经干细胞球完全形成并贴壁后, 用免疫荧光染色方法分别检测巢蛋白的表达, 显示阳性, 具有神经干细胞特性。同时并探讨了丹酚酸B对神经细胞分化为神经元和其他细胞的能力。实验中以丹酚酸B体外培养神经干细胞5 d后, 发现神经干细胞球分化出较多的神经元。证明丹酚酸B可促进胎鼠大脑皮质神经干细胞增殖, 形成较多的神经干细胞球, 并促进神经干细胞球发出较多的突起, 分化出较多的成熟神经元。
脑卒中后的血管新生对神经元再生有重要作用。内皮祖细胞能产生血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 、成纤维细胞生长因子2 (fibroblast growth factor 2, FGF-2) 和胰岛素样生长因子1 (insulin like growth factor, IGF-1) 等细胞因子, 提供有益的神经生成的环境, 能加速内源性神经生成[14]。李庆雯等[15]用丹酚酸B对离体内皮祖细胞黏附、趋化和增殖的影响试验中, 培养至第7天, 5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (5-Bromodeoxyuridine, Brdu) 免疫细胞化学染色, 结果发现, 与对照组比较丹酚酸B能明显提高内皮祖细胞的增殖能力。Bi等[16]在研究丹酚酸B在促进脊髓损伤大鼠的干细胞移植治疗中发现, 在损伤的急性期, 干细胞的存活率较低。在丹酚酸B的作用下, 干细胞免受肿瘤坏死因子 (TNF-α) 的损害, 不仅干细胞的存活率升高, 且病变区域面积减少, 实验组大鼠的BBB功能评分显著高于对照组, 证明丹酚酸B还可以通过改变病损区的微环境, 保护干细胞的存活和促进其增殖。
2.2 丹酚酸B的神经保护作用
尽管有研究证实骨髓来源的干细胞具有修复和取代神经元组织的潜能, 但是在中枢神经系统内, 特别是脑卒中后受损的中枢神经系统内, 干细胞的存活率低, 并且极少分化为成熟的神经元形态[17], 其中一个重要的原因就是, 在受损的中枢神经系统内, 病变区域的持续性炎症反应和氧化作用使细胞无法存活[18,19]。丹酚酸B可以通过抗炎抗氧化作用, 改善神经干细胞的存活环境, 促进神经干细胞向神经元方向分化, 加强干细胞在中枢神经系统疾病中的治疗作用。
2.2.1 丹酚酸B的抗氧化作用
氧化应激是脑缺血再灌注诱导的脑损伤的相关机制之一。组织在缺血缺氧性损伤和缺血再灌注过程中, 细胞内活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 清除系统功能降低, 生成系统活性增强, 引起ROS的大量产生和堆积。丹酚酸B有很强的抗氧化作用, 可以清除超氧阴离子和自由基, 抑制过氧化反应, 其抗氧化作用甚至强于维生素C、维生素E和银杏叶提取物[20]。Wang等[21]对丹酚酸B在大鼠葡萄糖剥夺再灌注损伤皮层神经元的神经保护作用研究中发现, 丹酚酸B能抑制ROS的积累, 显著降低ROS水平, 增强细胞活性以及抗氧化酶活性。这项研究还显示缺血再灌注大脑中受损的神经细胞在葡萄糖和氧再供应下促进了线粒体的氧化磷酸化, 丹酚酸B能提高线粒体膜电位水平, 抑制细胞色素C的释放率, 减少神经细胞凋亡和保护受损的神经元。另外, 丹酚酸B在急性脑缺血中通过提高能量代谢来减轻脑积水[22,23]。Chen等[1,2]在对大脑中动脉梗死的大鼠模型中, 研究丹酚酸B对局部脑缺血再灌注诱导的脑损害的保护作用中, 用分光光度测定法检测超氧化物歧化酶 (super oxygen dehydrogenises, SOD) 、谷胱甘肽 (glutathion, GSH) , 用硫代巴比妥酸比色分析丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 的含量, 以及用酶荧光法检测三磷酸腺苷 (ATP) , 实验研究中发现, 丹酚酸B明显抑制局部脑缺血再灌注中MDA水平, 加强SOD活性和GSH含量, 以及降低再灌注中自由基的释放, 提高ATP含量从而减少缺血再灌注中异常的能量代谢达到保护脑组织的作用。
2.2.2 丹酚酸B的抗炎作用
小胶质细胞是定居在脑内的吞噬细胞, 在炎症刺激下, 其抗炎性增强, 形态伸展, 功能活跃。过多的激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。抑制小胶质细胞的过度反应和炎症过程, 是缓解如脑卒中、神经退行性病变等神经性疾病进展的一个治疗目标[24]。Wang等[25]对丹酚酸B的神经保护效应研究中, 发现丹酚酸B能显著减少小胶质细胞过多激活释放的神经毒性物质如, 一氧化氮 (NO) 、TNF-α、白细胞介素1β (interleukin-1β, IL-1β) , ROS的产生;丹酚酸B还能抑制脂多糖诱导的一氧化氮合成酶 (inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS) 、TNF-α和IL-1βmRNA的表达[26], 这些结果表明, 丹酚酸B可以有效地阻止小胶质细胞介导的神经性炎症, 丹酚酸B有潜在的神经保护效应。
2.2.3 丹酚酸B的抗凋亡作用
脑卒中的病理过程中大脑微血管内皮细胞的凋亡破坏了血脑屏障的完整性, 并使对神经元有毒性作用的血管炎性细胞和蛋白溢出。脑血管疾病的发病机制与ROS包括过氧化氢 (H2O2) 引起的大脑微血管内皮细胞的凋亡有关。Liu等[27]通过对丹酚酸B在H2O2诱导的大鼠脑微血管内皮细胞 (rat cerebral microvascular endothelial cells, rCMECs) 凋亡的实验中, 丹酚酸B预处理, 能显著减弱rCMECs内H2O2诱导的凋亡。
2.3 其他作用
2.3.1 丹酚酸B促进神经营养因子分泌
神经营养因子是一组多肽, 与特殊的细胞受体相互作用而产生生物学效应, 包括增殖、分化和改变细胞的运动、结构和一般表型, 许多神经营养因子是在中枢神经系统表达的, 包括脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 、神经胶质细胞源性的神经营养因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) 等。BDNF是重要的神经营养因子, 在各种条件下, 如中枢神经系统损伤, 脑缺血等, 能保护神经元, 促进神经元再生。丹酚酸B能诱导骨髓来源的干细胞产生BDNF, 在脑卒中后的不利微环境中, 能帮助细胞存活并分化[28]。
2.3.2 丹酚酸B改善认知作用
脑缺血中晚期出现神经元迟发性死亡和迟发性炎症, 神经细胞损伤和死亡结伴而来的是神经症状的缺失, 记忆和认知能力下降以及脑梗死、脑水肿。Chen等[29]在丹酚酸B减轻脑损伤和脑损伤后创伤性炎症实验中, 以莫里斯水迷宫 (the morris water maze, MWM) 测试来评价实验动物的空间学习能力和记忆功能[30], 证实在丹酚酸B的干预下, 可以减轻小鼠的脑水肿和梗死体积, 改善功能状态以及空间学习和记忆能力。Du等对丹酚酸B保护短暂性脑缺血大鼠记忆功能的实验中也发现丹酚酸B能改善学习和记忆功能障碍, 并证实丹酚酸B改善认知的作用与它的抗氧化活性相关[1]。
2.3.3 丹酚酸B抗脑缺血作用
缺血性脑损伤后, 损伤灶由缺血区及半暗带组成。在缺血区细胞死亡以坏死为主, 而在半暗带区则以细胞凋亡为主, 细胞凋亡是导致梗死灶扩大的关键[31]。脑缺血后如不能被及时纠正, 半暗带将不可避免地成为永久性梗死灶的一部分。赵旭等[32]在缺血性脑损伤大鼠脑组织病理形态改变以及丹酚酸B的干预作用研究中发现, 丹酚酸B改善脑组织缺血区结构紊乱及间质水肿, 坏死细胞明显减少, 细胞变性程度减轻, 缺血面积减小, 细胞凋亡指数下降。丹酚酸B通过降低细胞凋亡指数, 可能促进了半暗带向正常组织转化, 进而缺血面积得以减小, 并且组织损伤程度也得以减轻。丹酚酸B的干预对缺血性损伤脑组织具有保护作用。丹酚酸B具有抗脑缺血的作用。
3 展 望
丹酚酸B 篇3
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根茎。丹参含有脂溶性成分丹参酮,水溶性成分丹参酸A、B、C等。现代研究表明,丹参具有多方面的药理作用,可增加冠脉流量,降低心肌兴奋性和传导性,对急性心肌缺血缺氧所致的心肌损伤具有明显的保护作用。常用来治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、心动过速等症。治疗慢性肝炎、早期肝硬变等症,亦有良好效果。
1仪器与试药
1.1 仪器
岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪,SPD-10Avp紫外检测器,BP210电子天平(德国赛多利斯),日本岛津高效液相色谱仪 LC-10ATVP泵 SPD-10AVP检测器 ,AS-3120超声波振荡器(天津奥特赛恩斯)
1.2 试药
丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所,批号:111562-200302,供含量测定用)丹参养心颗粒本医院研制甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、甲酸(分析纯)、甲醇(分析纯)、水(重蒸水)
2试验条件的选择
2.1 检测波长的选择
丹酚酸B对照品溶液的制备:精密称取丹酚酸B对照品4.00 mg,置100 ml量瓶中,加入75%甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得。
丹参对照药材溶液的制备:取丹参粉末(过3号筛)约0.2 g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入75%甲醇50 ml,称定重量,加热回流1 h,取出,放冷,再称定重量,用75%甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取出续滤液,即得。
供试品溶液的制备:取本品研细,称取0.5 g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入75%甲醇50 ml,称定重量,加热回流1 h,取出,放冷,再称定重量,用75%甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取出续滤液,即得。
阴性对照溶液的制备:根据处方称取一定量除丹参外的其他药材,按照与样品相同的工艺制剂进行提取制备,与供试品相同的方法制备阴性对照溶液。
2.2 样品提取方法的选择
对照品溶液的制备:精密称取丹酚酸B对照品4.00 mg,置100 ml量瓶中,加入75%甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得对照品溶液,浓度为0.040 mg/ml。
2.2.1 超声提取方法
取本品研细,称取0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇50 ml,称定重量,超声15 min,放冷,再称定重量,用75%的甲醇补足减失的重量,摇匀,微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
2.2.2 回流提取方法
取本品内容物,称取0.5 g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入75%甲醇50 ml,称定重量,加热回流1 h,放冷,再称定重量,用75%的甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
按照上述仪器及试验条件进行HPLC检测,分析结果见表1。
由上表可知,超声15 min提取效果优于回流1 h。因此,确定为超声提取。
2.3 样品提取取样量的选择
供试品溶液的制备:分别称取颗粒内容物0.2、0.5、0.8 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇50 ml,称定重量,超声15 min,放冷,再称定重量,用75%的甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
按照上述仪器及试验条件进行HPLC检测,分析结果见表2。
由上表可知,取样量为0.5 g时,样品中丹酚酸B提取量最高。因此,选择取样量0.5 g。
2.4 样品提取溶剂量的选择
供试品溶液的制备:称取样品3份,每份0.5 g,精密称定, 置具塞锥形瓶中,分别精密加入75%甲醇25,50,75 ml,称定重量,超声15 min,放冷,再称定重量,用75%的甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
按照上述仪器及试验条件进行HPLC检测,结果见表3。
由上表可知,25 ml比50 ml测的含量低1.45%<2%,从节约及环境保护角度考虑溶剂量定为25 ml。
2.5 样品提取时间的选择
供试品溶液的制备:称取样品三份,每份0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇25 ml,称定重量,分别超声15,30,45 min,放冷,再称定重量,用75%的甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
按照上述仪器及试验条件进行HPLC检测,结果见表4。
由上表可知,15 min测的含量比30 min低0.95%M1%,从节约能源角度分析比较,提取时间定为15 min。
3试验方法与结果
3.1 色谱条件
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱:流动相:乙腈-2.5%甲酸(20 ∶ 80);流速:1.0 ml/min;检测波长:286 nm;柱温:35℃。在此条件下。可使丹酚酸B与相临峰较好的分离。理论塔板数按丹酚酸B峰计应不低于4 000。
3.1.1 丹酚酸B对照品溶液的制备
精密称取丹酚酸B对照品4.00 mg,用75%甲醇定容至100 ml,得丹酚酸B对照品溶液,浓度为0.04 mg/ml。
3.1.2 丹参对照药材溶液的制备
称取丹参药材粉末0.1 g,按照样品的制备工艺提取。干膏按照供试品的制备方法制备对照药材溶液。
3.1.3 样品溶液的制备
取本品颗粒内容物,称取0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇25 ml,称定重量,超声处理15 min,放冷,再称定重量,用75%的甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
3.1.4 空白溶液的制备
按处方工艺制备不含丹参药材的空白药粉,与供试品相同的方法制备空白溶液。
将上述空白对照溶液、丹酚酸B对照品溶液、丹参对照药材溶液、供试品溶液,按照上述仪器及实验条件进行HPLC检测,结果见图1-4。从色谱图可见,空白在此处无干扰。
3.2 标准曲线的制备
对照品溶液的制备:精密称取丹酚酸B对照品1.20 mg,置10 ml量瓶中,加入75%甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,得对照品溶液,浓度为0.12 mg/ml。
分别精密量取上述对照品溶液0.5、1、2、3、4 ml于10 ml容量瓶中,加入75%甲醇稀释至刻度,摇匀。按照上述仪器及试验条件进行HPLC检测,以丹酚酸B对照品溶液的浓度为横坐标,面积为纵坐标,进行线性回归。试验结果见表5。
回归方程:C=8.17×10-8A-1.15×10-4,相关系数r=0.999 3,结果表明在丹酚酸B进样量为0.06～0.48 μg之间与峰面积积分值呈良好的线性关系。
3.3 稳定性试验
取本品颗粒内容物,按照上述确定的方法制备供试品溶液。
按照上述仪器及试验条件,每间隔1 h进样一次,连续进样6次,比较丹酚酸B峰的峰面积,考察样品的稳定性。测定结果见表6。
结果分析其峰面积基本一致,RSD%=0.94%<1%,说明供试品溶液在5 h内具有良好的稳定性。
3.4 重复性试验
取同一批颗粒内容物,按照上述确定的方法制备供试品溶液6份。
按照上述仪器及试验条件,重复测定6次。测定结果见表7。
从测定结果可以看出,测定的平均含量为5.00 mg/g,RSD%=1.67%<2%。本法具有良好的重复性。
3.6 回收率试验
对照品溶液的制备:精密称取丹酚酸B对照品2.5 mg,制成浓度为0.25 mg/ml的对照品溶液。
供试品溶液的制备:称取0.25 g己知含量(5.000 mg/g)的颗粒样品6份,精密称定,于具塞锥形瓶中,分别精密加入浓度为0.25 mg/ml的丹酚酸B对照品溶液5 ml,再精密加入75%甲醇20 ml,称定重量,超声15 min,放冷,再称定重量,加75%甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10 μl,注入液相色谱仪,按下式计算回收率,结果见表8。
回收率
通过对回收率试验结果的分析,平均回收率=99.55%,RSD%=0.42%<1%,表明HPLC法用于本品的质量控制具有良好的准确度。
3.5 样品测定
4讨论
4.1
曾用不同比例流动相,但均分离不好,以乙腈-2.5%甲酸(20 ∶ 80)分离效果最好故选此流动相。
4.2
该方法操作简便,结果准确,重复性好,灵敏度高,基线分离效果好,可以用于丹参颗粒的质量控制。
摘要：目的建立丹参养心颗粒中丹酚酸B含量的测定方法。方法采用HPLC法测定丹酚酸B的含量,色谱柱:OSD C18反相色谱柱(5μm,4.6×250 mm);流动相:乙腈-2.5%甲酸(20:80);流速:1.0 ml/min;检测波长:286 nm;柱温:35℃。结果平均回收率为99.55%,RSD%=0.42%。结论方法简便可行,重现性好,可很好地控制丹参养心颗粒的内在质量。
关键词：丹参养心颗粒,丹酚酸B,HPLC法
参考文献
[1]中华人民共和国药典(一部).化学工业出版社,2005:52.
[2]刘常五.中药药理与应用(第二版).人民卫生出版社,1998:190.
[3]李德华.现代中药药理学.天津科学技术出版社.1997:1175.
[4]王宝?.中成药质量标准与标准物质研究.中国医学科技出版社,1994:284.
丹酚酸B 篇4
丹参的有效成分分水溶性和脂溶性两大类, 脂溶性部分主要为二萜醌类化合物 (包括丹参酮、隐丹参酮等) , 水溶性部分主要为酚酸类化合物 (包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸等) 。丹参素为丹参的主要活性成分[1,2]。酚酸类化合物具有苯酸和羧基结构, 其水溶性较强, 丹酚酸B是丹参中酚酸的主要成分[3]。丹酚酸B的含量越高, 则其疗效越好, 因此, 该类成分是控制丹参类注射液质量的重要指标。本次实验采用高效液相法测定丹酚酸B的含量, 以此来比较不同厂家复方丹参注射液的质量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪:大连依利特分析仪器有限公司;UV230+紫外-可见检测器:大连依利特分析仪器有限公司;微量进样器:上海安亭微量进样器厂;色谱柱:Hyper ODS2C18, 4.6mm×250mm;超声振荡器:HS3120, 大连依利特分析仪器有限公司。
1.2 试药
丹酚酸B对照品:20mg, Hplc>98%, 批号110781-200612, 中国药品生物制品检定所。6个不同厂家生产的复方丹参注射液 (A厂, 批号为0709063, B厂, 批号为080118, C厂, 批号为071124, D厂, 批号为070940, E厂, 批号为071125, F厂, 批号为0712046) 。甲醇:天津市科密欧化学试剂有限公司。乙腈:天津科密欧化学试剂有限公司。水为纯化水。高相液相色谱仪所用的全部试剂均经过0.45µm微孔滤膜过滤及超声波脱气处理。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Hyper ODS2C18 (4.6mm×250mm) , 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;柱温:16℃;检测波长:286nm;进样量:10μL;流动相:甲醇-乙腈-甲酸-水 (30∶10∶1∶59) , 流速:1m L/min。
2.2 对照品溶液与样品溶液的制备
对照品溶液的制备:精密称取丹酚酸B对照品3.15mg, 置10m L容量瓶中, 加水至刻度, 摇匀。精密量取3m L, 置于10m L量瓶中, 加水至刻度, 即得每1m L中含丹酚酸B 94.5μg。
样品溶液的制备:精密量取复方丹参注射液3m L, 置10m L的量瓶中, 加水稀释至刻度, 摇匀, 0.45µm微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得。
在上述色谱条件下, 取阴性样品溶液、对照品溶液与样品溶液各10μL进样, 记录色谱图。丹酚酸B的保留时间约为12.3min。阴性样品溶液在丹酚酸B对照品峰处未见色谱峰出现, 说明样品中的其他药物对测定无干扰。
2.3 线性关系考察
精密吸取丹酚酸对照品溶液5、10、12.5、15、17.5、20μL, 注入液相色谱仪中并测定色谱峰面积。以峰面积 (y) 为纵坐标, 以进样量 (x) 为横坐标绘制标准曲线, 进行线性回归统计, 得线性回归方程为:y=938.36x+39.288 (r=0.9998) 。结果表明, 丹酚酸B在进样0.4725-1.89µg范围内与峰面积具有良好的线性关系。
2.4 精密度试验
精密吸取同一丹酚酸B对照品溶液10 ul, 重复进样6次, 测定峰面积, 峰面积的RSD=0.56% (n=6) , 结果表明仪器的精密度良好。
2.5 重复性试验
同一批样品连续进样6次所得的峰面积的比较。取同一批号 (0709063) 的复方丹参注射液6份, 精密量取3m L于10m L容量瓶中, 进样, 依次测定丹酚酸B的含量, 重现性的RSD值为0.8% (n=6) , 结果表明方法重现性良好。
2.6 稳定性试验
精密吸取同一批样品溶液, 分别在配制完毕0、1、4、8、10h进样测定, RSD值为0.35% (n=5) , 结果表明样品溶液在室温下放置10h稳定, 可以满足测定的需要。
2.7 加样回收率试验
精密量取已知丹酚酸B含量的同一批次样品1m L, 共6份, 分别精密加入丹酚酸B浓度为94.5µg/m L的对照品溶液1m L、1.5m L、2m L各两份, 测得峰面积, 并计算回收率, 结果平均值为99.33%, RSD=0.54%
2.8 样品的测定
六个不同厂家的复方丹参注射液按上述方法后, 进行含量测定, 其结果见表1。
3 讨论
3.1 色谱条件的确定
有关文献为了分离多种水溶性成分, 采用甲醇-乙腈-水 (41.5∶1∶57.5) 为流动相, 并用甲酸调p H至2.20[4];另有作者简化了流动相的组成, 使用甲醇-醋酸水溶液配比, 也将丹酚酸B很好的分离, 并且还考察了在甲醇-醋酸水 (36∶64) 条件下不同醋酸浓度 (6%, 5%, 4%) 以及在甲醇-5%醋酸条件下不同比例 (36∶64, 35∶65, 34∶66) 对丹酚酸B峰的影响。结果表明酸浓度以及流动相比例在这几个范围的变化除对保留时间有一定的影响外, 对丹酚酸B的分离和峰纯度无影响[5]。本实验采用中国药典2005年版测定丹酚酸B的方法, 丹酚酸B分离效果很好。柱温对丹酚酸B的保留时间影响较大, 随柱温升高, 保留时间缩短, 实验过程中制备标准曲线时的温度为16℃, 保留时间较长, 当测样品时温度为24℃, 保留时间较短。
3.2 实验结果表明
不同厂家生产的复方丹参注射液有效成分-丹酚酸B的含量差别很大, 最高含量与最低含量相比为3.39倍, 并且所有厂家的注射液中所含的丹酚酸B较低, 这可能与药品的制备工艺有关。国内生产复方丹参注射液的厂家较多, 除了卫生部部颁标准外, 国家食品药品监督管理局还同意多家药厂制订了不同的标准, 由于各厂家药材来源、生产工艺、质量标准有所不同, 故产品的主要成分含量存在差异。由于该注射液含量的不稳定, 导致临床无法控制实际药量, 直接影响临床疗效。
3.3 分析丹酚酸B
在丹参的水溶性成分-酚酸类中, 丹酚酸B含量达5%以上[5], 但是在复方丹参注射液中, 丹酚酸B的含量较少 (图谱中一般都能测到二三十个峰, 最大峰即样品溶液中含量最多的多为一些杂质成分) 。并且丹酚酸B在湿热的作用下, 会分解生成丹参素、原儿茶醛等, 长时间放置, 特别是在温度较高的环境中, 丹酚酸B的峰面积下降很快, 再加上稳定性实验[6], 可知实验过程最好在10小时以内。
参考文献
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[5]张启伟, 张颖, 李计萍, 等.高效液相色谱法测定丹参中丹酚酸B[J].中国中药杂志, 2001, 26 (12) :848-849.
丹酚酸B 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物及分组
雄性昆明小鼠（8周龄，体重35g～40g），清洁级，50只，由南方医科大学实验动物中心提供，随机分为5组：对照组，模型组，低浓度SA-B组、中浓度SA-B组、高浓度SA-B，每组10只。
1.1.2 主要药品及试剂
丹酚酸-B，淡黄色粉针剂，纯度大于98%，中国药品生物制品检定所/临用前用生理盐水配制成不同浓度：1 200mg/L,2 400mg/L,3 600mg/L；胶原（美国Sigma公司产品）；藻红蛋白标记的抗小鼠IgG(IgG-PE），异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠CD61单克隆抗体（CD61-FITC），藻红蛋白标记的抗小鼠CD62P单克隆抗体（CD62P-PE）（美国BD公司）。
1.1.3 主要仪器
流式细胞仪（Epics XL型，美国Beckman Coulter公司），隔水式恒温培养箱（型号GNP-9160，上海雷韵试验仪器制造公司）。
1.2 方法
1.2.1 采血
采用眼球摘除法取全血于3.8%枸橼酸钠抗凝EP管中。
1.2.2 胶原激活
取对照组小鼠全血10μL加入生理盐水10μL（分别取2管），混匀，37℃孵育15min；分别取其余各组小鼠全血10μL加入200μg/mL胶原10μL（美国Sigma公司，胶原终浓度为100μg/mL，分别取2管），混匀，37℃孵育15min。
1.2.3药物作用
在低浓度SA-B组全血加入1 200 mg/L SA-B 10μL(SA-B终浓度为400mg/L），在中浓度SA-B组加入2 400mg/L SA-B 10μL(SA-B终浓度为800mg/L），在高浓度SA-B组加入3 600 mg/L SA-B 10μL(SA-B终浓度为1 200mg/L），模型组加入等量的生理盐水，37℃孵育30min。
1.2.4 流式细胞检测
在上述经过处理的标本中，对照管加入抗小鼠CD61-FITC、抗小鼠IgG-PE，试验管加入抗小鼠CD61-FITC、CD62P-PE。混匀室温避光孵育20 min，然后再加入1mL冷的磷酸缓冲液（PBS）。采用流式细胞仪检测，以CD61-FITC和侧散射光散点图设血小板门，测定血小板膜CD62P(P-选择素）表达阳性百分率。
1.3 统计学处理
采用SPSS 17.0进行分析，数据以均数±标准差表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），组间均数比较采用LSD-t检验。
2 结果
模型组P-选择素高于对照组（P<0.01）；低浓度SA-B组、中浓度SA-B组、高浓度SA-B组P-选择素均低于模型组（P<0.05）；不同浓度SA-B组P-选择素随SA-B浓度的增加而减少（P<0.05）。详见表1。
%
3 讨论
传统中药丹参被证实可以有效抑制血栓形成，对心血管、神经细胞具有保护作用，且无明显副作用，价格低廉，广泛应用于治疗缺血性心脑血管疾病[3]。丹参的主要化学成分包括脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物，丹参各种成分的抗血栓机制尚未明确[4]。丹酚酸B是丹参最主要的有效活性成分[5]。
静息状态下，P-选择素主要存在于血小板α颗粒内，血小板活化后，α颗粒与血小板质膜融合，P-选择素表达血小板质膜表面[6]，成为血小板活化的一个特征性指标。本研究发现，加入胶原后，血小板膜P-选择素阳性率明显升高，提示胶原可刺激血小板活化。胶原是启动血小板黏附、聚集过程最强有力的血管壁成分。血小板有2个受体在血小板-胶原相互作用起重要作用，即糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）和整合素α2β1。血小板特异性GPⅥ（62kDa）是血小板胶原特异的信号转导蛋白，它与胶原的亲和力低，不能单独介导稳定的血小板黏附，但对血小板稳定的黏附到胶原上起关键作用，因为它通过结合的FcRγ链诱导强大的信号途径；整合素α2β1经过活化后由低亲和力构象转化为高亲和力构象，胶原结合到整合素α2β1促进血小板活化和紧密黏附途径的下游步骤的进行。
本研究发现不同浓度的SA-B组P-选择素均低于模型组，P-选择素随SA-B浓度的增加而减少，不同浓度的SA-B对胶原引起的血小板活化具有抑制作用，SA-B浓度越高，这种抑制作用越强。因此，可以认为，SA-B抗血栓的机制可能与其抑制胶原引起的血小板活化有关。另外，P-选择素与其配体结合后起信号转导作用，活化靶细胞或改变其功能状态，从而介导白细胞-内皮细胞、白细胞-血小板间反应，最终导致组织损伤[7],SA-B对P-选择素具有抑制作用，减少炎症反应对心血管、神经细胞的损伤。
本研究的不足之处在于仅测定P-选择素，而未检测血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa纤维蛋白原受体。目前标记小鼠GPⅡb/Ⅲa纤维蛋白原受体的荧光抗体为JON/A-PE或JON/A-FITC[8]，该试剂价格较为昂贵且不易获得，这是本研究不能检测GPⅡb/Ⅲa纤维蛋白原受体的原因。GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合是血小板聚集的最后通路[9]。GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原结合，引起血小板聚集，促进血栓形成，在脑缺血缺氧性损伤起重要的作用。
参考文献
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丹酚酸B 篇6
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
仪器:Agilent1100高压液相色谱仪系列 (美国) , Sartorius BP211D电子分析天平 (德国) , 电热恒温水浴锅 (北京市医疗设备厂) , 超声清洗器 (北京医疗设备二厂) , 丹酚酸B对照品 (中国药品生物制品检定所111562-200403) , 心可宁滴丸 (自制, 批号分别为20070401、20070301、20070312) ;试剂:乙睛为色谱纯, 甲醇、磷酸等其它试剂均为分析纯, 水为三蒸水。
1.2 方法与结果
1.2.1 色谱条件
Agilent Hypersil ODS (4.6mm*150mm, 5μm) ;乙腈-0.1%磷酸水液 (21.5∶78.5) 为流动相;检测波长为286nm。流速1.0ml/min, 柱温25℃。理论塔板数按丹酚酸B峰计应不低于5000。
1.2.2 对照品溶液的制备
称取丹酚酸B对照品, 置量瓶中, 加水溶解, 制成0.098mg/mL的溶液, 摇匀, 即得。
1.2.3 供试品溶液的制备
取心可宁滴丸适量, 碾碎, 取约0.4g, 精密称量, 置于100ml具塞锥形瓶中, 加入水50ml称重, 超声处理90min (250W, 30kHz) , 取出, 放冷, 再称重, 用水补足减失的重量, 摇匀, 滤过, 弃去初滤液10ml, 取续滤液过0.22um微孔滤膜, 即得供试品溶液。
1.2.4 阴性对照溶液的制备
取缺丹参药材的配方混合物, 按照供试品溶液的制备方法同法制备成溶液, 作为阴性对照品。
C A 丹酚酸B色谱图 B 供试品色谱图 C 阴性对照色谱图
1.3 方法学考察
1.3.1 标准曲线的绘制
分别吸取对照溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、15μl、20μl注入色谱仪, 以峰面积积分值 (mAU*s) 对进样量 (μg) 进行回归, 得回归方程:Y=496.321X-3.078, r=0.99996, 结果表明, 丹酚酸B在0.196～1.96 μg范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。
1.3.2 稳定性试验
取同一批号供试品溶液, 分别在0、2、4、8、16、24h的不同时间点进行测定, 考察保留时间和峰面积的一致性, 丹酚酸B的平均保留时间为11.69min, RSD为0.047%, 平均峰面积为487.2 mAU*s, RSD为0.12%。
1.3.3 精密度试验
取上述对照品溶液, 连续进样5次, 考察色谱峰保留时间和峰面积的一致性。丹酚酸B的平均保留时间为11.64min, RSD为0.11%, 平均峰面积为486.4mAU*s, RSD为0.25%。
1.3.4重现性试验
取同一批号供试品, 称取5份, 同法提取, 检测, 考察色谱峰保留时间和峰面积的一致性。丹酚酸B的平均保留时间为11.62min, RSD为0.34%, 平均峰面积为486.5 mAU*s, RSD为1.31%。
1.3.5 回收率试验
取同一批号已测知含量的样品0.2g 5份, 精密称定, 分别准确加入1.20mg/mL对照品溶液各1mL, 按供试品溶液制备方法进行提取, 分别取10μL进样, 测定, 计算回收率, 结果得到丹酚酸B平均加样回收率为97.83%, RSD=3.33%。见表1。
1.3.6 供试品的测定
分别取20070401、20070301、20070312批样品0.4g, 精密称定, 按供试品制备方法制备成供试品溶液, 精密吸取供试品溶液10L, 注入液相色谱仪, 按上述色谱条件进行测定, 结果得到丹酚酸B含量分别为6.27mg/g、6.26mg/g、6.24mg/g。
2 讨论
在含有丹参的中药制剂中, 特别是水提取工艺中, 对丹参中的丹酚酸B进行含量测定对保证药品的安全、有效是必要的。曾以中国药典2005版一部丹参项下的流动相进行分析, 结果分析时间较长, 峰塔板数相对较低一些, 而采用本文所述条件得到很好的分析效果, 分析速度快, 阴性无干扰。
采用甲醇、乙醇回流提取、甲醇超声和水超声提取等方法, 以水溶液进行直接超声提取, 避免了脂溶性成分对分离的干扰, 丹酚酸B峰分离度好, 峰塔板数高, 且回收率良好;甲醇提取后蒸干再用水溶解进样分离, 效果和水液基本一致, 但操作繁琐一些, 且回收率低于水提, 故而确定丹酚酸B的含量测定采用水溶液直接超声提取。提取时间的选择采用水超声30、60、90、120min后进行考察测定, 结果显示, 在90min后提取基本完全, 回收率考察达到了97.83%。
本文方法简便准确, 稳定性、重现性好, 为心可宁滴丸的质量控制和标准建立奠定了良好基础。
摘要：目的:对中药复方制剂心可宁滴丸中的丹酚酸B进行含量测定。方法:采用高效液相色谱法, 以乙腈-0.1%磷酸水液 (21.5:78.5) 为流动相;检测波长为286nm。结果:丹酚酸B在0.196～1.960μg范围内均与色谱峰面积呈良好的线性关系, r为0.99996, 平均加样回收率为97.83% (N=5) , RSD=3.33%。结论:本方法快速简便, 灵敏度和稳定性高, 为心可宁滴丸的质量标准奠定了良好的基础。
关键词：高效液相色谱,心可宁滴丸,丹酚酸B
参考文献
[1]刘东辉, 李军, 黄意甜.高效液相色谱法测定心可宁胶囊中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量[J]·中国实验方剂学, 2005, 11 (6) :26.
丹酚酸B 篇7
丹酚酸B (salvianolic acid B, Sal B) 是来自唇形科植物丹参的干燥根及根茎中提取的有效成分[5]。丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成, 是目前研究较多的丹酚酸之一, 对心、脑、肝等器官均具有重要的药理作用[6]。丹酚酸B的抗肝纤维化作用已经得到肯定[7,8], 为进一步验证并探讨丹酚酸B对肝细胞的保护作用, 本研究以四氯化碳 (CCl4) 诱导大鼠肝纤维化模型, 观察丹酚酸B对肝纤维化的影响, 为其临床应用与新药开发提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型及防治
SD大鼠50 只, 雄性, 无特定病原体级 (SPF) , 体质量 (150±20) g, 北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 许可证号SCXK (京) 2007-0001。大鼠适应性饲养1 周后随机分为4 组:正常组、模型组、丹酚酸B低剂量治疗组和高剂量治疗组。除正常组外, 其他组采用CCl4 灌胃制模[9], 剂量为1 m L/kg (CCl4Vol︰橄榄油Vol=1︰1) , 每周3 次, 持续9 周。CCl4分析纯购自天津凯通化学试剂有限公司;橄榄油购自鲁花集团。丹酚酸B (本实验室制备) 低剂量治疗组和高剂量治疗组于造模第2 周开始分别给予丹酚酸B 100 mg和200 mg/ (kg·bw) 灌胃, 每天1 次, 持续8 周, 正常组同时给予相同体积的注射用水。实验结束后对全部大鼠采用乙醚麻醉安乐死。
1.2 标本采集
大鼠麻醉后经下腔静脉采血, 收集血清。在同一肝叶相近组织取肝组织, 固定于10%甲醛溶液。其余肝组织立即放入-80℃冰箱冻存。
1.3 生化指标检测
丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 检测试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 检测试剂盒、超氧化物歧化酶 (SOD) 检测试剂盒、丙二醛 (MDA) 检测试剂盒和谷胱甘肽 (GSH) 检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所, 按照使用说明书操作。
1.4 肝组织病理学检查
H&E染色制作病理切片观察大鼠肝组织损伤情况, 并参照文献方法对肝脏病理学改变进行半定量评价[10]:0 期为正常肝脏, 无明显胶原纤维增生;I期:胶原纤维增生, 中央静脉和门静脉区有少量星状胶原纤维束放散, 但无间隔形成;Ⅱ期:胶原纤维增生, 中央静脉和门静脉区结缔组织变厚, 由此向四周伸出纤维索, 形成不完全间隔;Ⅲ期:胶原纤维大量增生, 有个别菲薄的完全间隔形成, 或较厚的不完全间隔即将形成假小叶;Ⅳ期:完全纤维间隔, 假小叶形成。肝组织胶原沉积观察采用苦味酸天狼星红染色[3], 石蜡切片厚度5μm, 二甲苯脱蜡至水洗;置0.1%苦味酸天狼星红染液中1 h;自来水流水冲洗4 min;各级浓度乙醇脱水;二甲苯透明, 中性树胶封片。苦味酸和天狼星红均购自Sigma公司。用图像分析系统 (IPP 5.0 软件) 测量胶原阳性面积百分比[11]。
1.5 肝组织TGF-β1水平检测
取大鼠肝组织, 经预冷的生理盐水洗涤后用眼科剪剪碎, 加入4 倍体积的裂解液, 匀浆后提取肝组织总蛋白, 然后转入EP管, 4℃冰箱静置30 min, 12000 r/min、4℃离心30 min, 取上清液。同组肝组织蛋白样品合并成一个混合样品, 各混合蛋白样品按Bradford法进行蛋白质定量。肝组织TGF-β1检测采用双抗体两步夹心ELISA法, 试剂盒购自武汉博士德公司, 具体操作按试剂盒说明书进行。
1.6 统计学方法
采用SPSS 16.0 软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 行单因素方差分析, 以P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠一般情况及肝脾比值情况
正常组大鼠健康状态良好, 首次灌胃CCl4 后, 模型组和治疗组大鼠健康状态变差, 食欲减低, 体质量下降, 大便变稀。从第2 周两治疗组给予药物干预后, 大鼠体质量有所回升。各组大鼠肝脾比值见表1。
2.2 肝功能检测结果
与正常组比较, 对照组AST、ALT活性均明显升高, 差异有统计学意义 (P <0.01) , 表明肝纤维化建模成功。与对照组相比, 两剂量组均能不同程度抑制AST及ALT活性升高, 差异有统计学意义 (P <0.05) 。表明不同剂量丹酚酸B均能预防CCl4 所致大鼠肝损伤的血清转氨酶含量升高。见表2。
2.3 大鼠肝组织病理情况
光镜下H&E染色显示正常组大鼠的肝小叶结构完整, 肝细胞形态正常。对照组肝脏小叶中心部明显坏死, 其坏死区周围可见脂肪变性的肝细胞, 有明显的点状和灶状坏死。而高低剂量组大鼠肝脏病变程度较模型组均明显减轻。各组大鼠肝组织胶原增生程度分期见表3, 肝纤维化评分分值由高到低依次为模型组、低剂量治疗组、高剂量治疗组和正常组。
(±s)
注:1) 与正常组比较, P <0.01;2) 与正常组比较, P <0.05;3) 与对照组比较, P <0.05
(u/L, ±s)
注:1) 与正常组比较, P <0.01;2) 与对照组比较, P <0.05;3) 与正常组比较, P <0.05
例
注:1) 与正常组比较, P <0.01;2) 与对照组比较, P <0.05
2.4 大鼠肝组织胶原沉积情况
天狼星红染色 (sirius-red staining) 结果显示, 正常组大鼠肝脏切片只有静脉等少数结缔组织被染成红色;肝纤维化 (对照组) 大鼠肝脏切片胶原大量沉积, 形成结节;两个治疗组大鼠肝脏切片中胶原含量明显减少, 尤其高剂量组胶原含量减少更为明显 (见图1) 。胶原沉积定量分析结果见图2。
2.5 大鼠肝组织TGF-β1检测情况
由表4 可见, 与正常组比较, 对照组肝组织TGF-β1的含量高于正常组 (P <0.01) 。经过8 周的治疗, 两个治疗组大鼠的肝组织TGF-β1的含量与对照组比较, 明显减少 (P <0.05) 。说明导致纤维化产生的TGF-β1的生成被抑制, 纤维化进程在一定程度上被阻断。
2.6 大鼠肝组织脂质过氧化指标检测情况
由表5 可见, 与正常组比较, 对照组肝组织MDA的含量高于正常组 (P <0.01) , SOD活性和GSH含量均低于正常组。经过8 周的治疗, 两个治疗组大鼠的肝组织脂质过氧化指标均有改善, 说明肝损伤在一定程度上得到修复。
A:对照组;B:高剂量治疗组 (放大倍数×40)
天狼星红染色, 各组n=10, 每张图片随机选5个不同位置, 取平均值。1) 与正常组比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.05;3) 与对照组比较, P<0.01
(±s)
注:1) 与正常组比较, P <0.01;2) 与对照组比较, P <0.05
(±s)
注:1) 与正常组比较, P <0.01;2) 与对照组比较, P <0.05
3 讨论
肝纤维化是肝组织对肝脏慢性刺激的病理修复反应, 而肝组织细胞的炎症损伤则往往是肝纤维化的前期病理[12]。本实验采用CCl4 灌胃的肝纤维化大鼠模型, 发现Sal B可明显减轻肝组织炎症损伤, 较少胶原纤维沉积, 改善肝纤维化大鼠血清肝功能, 降低大鼠肝细胞脂质过氧化水平和TGF-β1含量。CCl4 在肝内代谢活化生成三氯甲基自由基 (·CCl3) , 诱发脂质过氧化, 是肝脏毒性机制中的重要环节[13]。
SOD是超氧阴离子自由基的清除剂, 可抑制自由基启动的脂质过氧化反应。MDA为脂质过氧化的最终产物, 可严重破坏细胞膜结构, 导致细胞肿胀、坏死, 其含量反映了组织过氧化损伤的程度。GSH在拮抗氧化性毒物中毒中发挥重要作用, 通过氧化还原反应降低毒物过氧化损伤[3,4]。本研究结果表明, 经过Sal B治疗, 大鼠血清中AST、ALT较对照组含量明显降低, 同时还可提高CCl4 所致肝损伤大鼠肝组织匀浆中SOD活性和GSH含量, 降低其MDA的水平。提示Sal B可通过提高机体抗氧化酶的生物合成而增加酶活力, 清除自由基抑制脂质过氧反应, 降低脂质过氧化主要产物MDA的产生, 进而拮抗CCl4引起的氧化损伤, 发挥其预防性保护肝脏的作用。H&E染色和天狼星红染色肝组织的病理检验结果也证实了这一点。近年来很多实验都直接或间接证明Sal B可通过细胞氧化应激水平来改善细胞功能[14,15]。
当各种致病因子作用于肝脏, 受损肝细胞通过产生氧自由基、脂质过氧化物、细胞因子和生长因子等, 直接或间接地损害邻近的肝脏细胞, 并引起肝库普弗细胞、肝窦内皮细胞、血小板和肝细胞分泌更多种细胞因子, 这些致纤因子会激活HSC[16,17]。HSC是肝脏产生ECM的主要细胞来源, 肝纤维化发生的中心环节是HSC的激活。在病理状态下, HSC活化, 合成Ⅳ型及Ⅰ型胶原沉积于Disse间隙, 逐渐形成门静脉高压并阻碍肝细胞与肝血窦之间的营养物质交换[18]。HSC激活的机制较为复杂, 目前认为TGF-β1在促进HSC由静息型转变为激活型中起到关键作用[19,20,21]。本研究表明, 经过Sal B的治疗, 治疗组大鼠肝脏致纤因子TGF-β1含量显著减少。提示Sal B可降低氧化应激水平, 进而减少致纤因子TGF-β1含量, 最终在一定程度上抑制或阻断HSC细胞的激活。至于实验中的HSC是发生凋亡和/ 或从激活型转变为静息型, 无法得知, 需要进一步的实验来验证。在肝脏中, TGF-β1的合成主要由一些非实质细胞产生, 如枯否细胞 (KC) 、肌成纤维细胞及内皮细胞等, 它的合成受核转录因子如核转录因子-κB (NF-κB) 等的调控[22]。文献报道NF-κB在CCl4 肝纤维化过程中介导TGF-β1产生或活化发挥一定的作用[23], 结合本实验结果, 推测在CCl4 肝纤维化过程中, NF-κB转录激活HSC、KC等, HSC、KC等再分泌大量TGF-β1, TGF-β1又通过自分泌和旁分泌激活HSC, 激活的HSC产生大量的细胞外基质, 最终导致肝纤维化。经过Sal B的治疗, 阻断了以TGF-β1为核心的肝纤维化形成的信号转导通路。接下去将在此基础上, 拟通过酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定和定量PCR (RT-PCR) 法检测NF-κB p65, 并给予肝纤维化大鼠NF-κB抑制剂, 进一步明确肝纤维化大鼠肝组织NF-κB与TGF-β1产生、HSC激活之间的关系。
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