snail

snail（共4篇）

snail 篇1

上皮细胞间质变 (epithelial-mesenchymal transitions, EMT) 是指在特定的生理和病理情况下, 具有极性的上皮细胞向间质细胞转化的现象。EMT这一概念是GREENBURG等[1]在1982年提出的, 他们发现胚胎期和成年期晶状体的上皮细胞在三维胶原凝胶中培养可形成伪足并转变为间质样细胞。上皮细胞表型的丧失和间质细胞特性的获得是EMT发生的主要特征。具体包括: (1) 以E-钙粘素为主的细胞间黏附分子表达减少, 而N-钙粘素表达增多, 从而导致上皮细胞失去细胞间的黏附作用而变得更加疏松; (2) 以角蛋白为主的细胞骨架转变为以波形蛋白为主的细胞骨架, 从而使多角形的上皮细胞转化成纺锤状细胞[2]。这种表型的转化使肿瘤细胞摆脱细胞间黏附, 从而表现得更为疏松而更具侵袭与转移能力。最新的研究报道, EMT是癌细胞获得迁移能力, 从而导致癌细胞转移的始发因素之一。因此, 认为EMT在肿瘤的侵袭与转移过程中发挥着重要的作用, 成为目前解释肿瘤细胞获得侵袭转移能力的机制之一[3,4,5,6]。

然而, 关于EMT的具体分子机制目前尚未完全阐明, 研究表明锌指转录因子Snail家族分子具有促进细胞迁移与转移的作用, 其中最重要的机制是Snail能促进肿瘤细胞发生EMT的改变, 从而参与多种肿瘤的发生发展与转移, 这对肿瘤防治的基础研究具有非常重要的价值, 也是近年来肿瘤研究的热点之一[7]。因此, 本研究拟通过构建Snail启动子荧光素酶报告基因载体, 以期为阐明Snail在调控EMT过程的关键作用提供研究工具, 同时用于体外筛选以snail为靶标的抗肿瘤药物, 实现抗肿瘤药物的快速高通量的筛选目标。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌菌株DH5α和人鼻咽癌细胞株CNE2由中山大学药学院微生物与生化药学实验室保存;质粒p GL3-Basic购自Promega公司, 该质粒能表达绿色荧光蛋白;内参质粒p RL-TK购自Promega公司, 该质粒能表达海肾蛋白。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Omega公司;荧光素酶双报告基因检测试剂盒购自Promega公司;Taq Premix、核酸分子量标准1 Kb plus DNA ladder Marker和DL2000 DNA Marker均购自Ta Ka Ra公司;限制性内切酶Kpn I和BglⅡ, T4连接酶均购自Ta Ka Ra公司;琼脂糖粉购自Shanghai Yito Enterprise Company;转染试剂Lipofectamine 2000购自invitrogen公司;其余试剂为国产分析纯以上。

1.2 方法

1.2.1 人血液基因组DNA提取

取人血液并分离白细胞用4℃的冷冻PBS冲洗一遍, 然后用0.25%的胰酶裂解, 收集于离心管中, 用4℃的冷冻PBS冲洗一遍, 2 000 g/min离心5 min, 弃除上清, 最后用200μL的冷冻PBS重悬细胞, 按照基因组DNA提取试剂盒说明提取人血液基因组DNA。

1.2.2 PCR扩增人Snai1启动子序列

取上述人血液细胞中提取出来的基因组DNA为模板进行PCR扩增, 根据文献报道, Snai1的部分启动子序列-78/+59即能完全启动Snai1基因的转录表达[8]。因此, 综合考虑, 本组拟扩增Snai1启动子的部分序列-797/+59构建荧光素酶报告基因载体。从人血液基因组中扩增Snai1的该部分启动子序列, 用于扩增该序列的上游引物为5'-CGGGGTACCCAAAGCAC ACTTCCCTTTGC-3', 包含KpnⅠ酶切位点;下游引物为5'-GGAAGATCTTGGTCGAGGCACTGGGGTC-3', 包含BglⅡ酶切位点, PCR扩增后, PCR产物进行DNA定量, -20℃保存备用。

1.2.3 Snail启动序列荧光素酶报告基因表达载体的构建

首先, 取PCR扩增的Snai1启动序列分别用Kpn I和BglⅡ双酶切, 同时质粒小提试剂盒小提质粒p GL3-Basic Vector, 并经Kpn I和BglⅡ双酶切, 利用凝胶回收试剂盒回收并纯化酶切产物。将上述制备纯化的Snai1启动序列与线性化双粘性末端的p GL3-Basic载体片段以3∶1摩尔比的比例用T4 DNA连接酶于16℃循环水浴连接反应过夜, 连接产物于60℃灭活10 min后转化至感受态大肠埃希菌DH5α, 经氨苄霉素抗性筛选, 挑取阳性克隆提取重组质粒p GL3-Basic-Snai1-luc并进行双酶切鉴定。

1.2.4 重组质粒转染CNE2细胞

转染前一天, 以2×104个/m L的细胞密度接种到96孔培养板上。待细胞汇合率到达80%~90%时进行转染。以25μL无血清培养基+0.5μL Lipofectamine 2000每孔 (温育5 min) 配制溶液1;以25μL无血清培养基+0.2μg质粒每孔 (检测质粒:内参质粒=5∶1) 配置溶液2;将溶液1与溶液2混合, 室温下置20 min。与此同时, 将96孔板中的细胞用无血清培养基冲洗两遍后, 每孔加入50μL RPMI 1640无血清无抗生素培养基。将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中, 摇动培养板, 轻轻混匀。在37℃, 5%的二氧化碳中培养4~6 h后把培养基更换为含血清和双抗的完全培养基, 同时加入10 ng/m L的TGF-β1刺激, 并设阴性对照组, 在37℃, 5%的二氧化碳中培养24 h后检测荧光素酶的表达情况。

1.2.5 荧光定量PCR

为了在转录水平检测Snail的表达情况, 我们通过荧光定量PCR的方法对其进行检测。首先对培养的CNE2细胞进行不同浓度的TGF-β1刺激处理, 并设阴性对照。然后收集细胞, 利用TRIZOL提取细胞总m RNA, 然后利用逆转录试剂盒 (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 进行合成c DNA, 并对其进行定量。通过SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japan) 方法进行荧光定量PCR检测, 从而在转录水平检测Snail在TGF-β1诱导作用下的表达情况。用于荧光定量PCR的Snail的引物如下:上游引物, 5'-GACCACTATGCCGCGCTCTT-3';下游引物, 5'-TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3';用做内参的引物如下:上游引物, β-actin, forward 5'-TGGCACCC AGCACAATGAA-3';下游引物, 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

1.2.6 蛋白免疫印迹

细胞按照实验要求处理后, 弃去细胞培养基, 细胞用冷PBS洗2次, 加入三去污细胞裂解液, 冰上放置15~20 min。收集细胞裂解液于EP管, 最大转速离心20 min, 上清收集于-20℃保存。检测时, 取-20℃保存的蛋白溶液冰上融解后, 用Bio-Rad Protein Assay蛋白定量试剂确定浓度, 以每孔10~20μg蛋白上样量, 电压80~100V进行10%SDS-PAGE电泳分离, 在以100 V, 90min的条件电转到甲醇预处理的PVDF膜上, 5%脱脂奶粉 (PBST配制) 封闭1 h后, 检测抗体以1∶1 000比例与封闭液混合, 加入膜, 4℃孵育过夜, PBST洗涤3次后, 加入HPR标记的羊抗兔Ig G二抗 (1∶10 000) 室温摇床振荡1 h。PBST洗涤3次, 加入ECL发光液用X光片曝光。曝光后洗掉PVDF膜上的发光液后, 加入stripping buffer, 50℃加热45min, PBST洗3次, 5%脱脂奶粉室温封闭1 h, β-actin抗体以1∶5 000比例与封闭液混合, 加入膜, 4℃孵育过夜, PBST洗3次后, 二抗 (羊抗兔-HRP) 以1∶10 000比例加入, 室温摇床振荡1 h, PBST洗三次后, 加入ECL发光液用X光片曝光。

1.2.7荧光素酶活性检测

将96孔板转染了荧光素酶报告基因的细胞培养上清吸弃, 每孔加裂解液75μL, 裂解15 min后, 转移至96孔板白板中, 将96孔板置于荧光检测仪中读板, 保存所读取的数据, 做柱状图并进行统计学分析。

1.2.8 数据统计分析

所有数值均以三次独立实验的平均值±标准差 (±s) 表示。两组间的比较采用双尾不配对学生t检验, 多重比较采用邦弗朗尼检验后进行单向方差分析。这些数据处理使用Graph Pad Prism软件版本4.0 (Graph Pad软件公司) 。P<0.05为差异具有显著性。

2 实验结果

2.1 目的基因PCR扩增结果

用从人血液中提取出来的基因组DNA为模板, 含有Snai1启动子引物的扩增体系中经过PCR扩增后, 发现在Marker DL2000的750~1000 bp中间有一条比较特异的条带。而我们预扩增的Snai1启动子部分大小为856 bp (加两端酶切位点大约为876bp) 。因此, 从图片结果可以看出, PCR扩增出来的条带大小与预扩的Snai1部分启动子大小一致, 从而证明Snai1启动子已经成功扩增出来 (图1) 。

1:Marker DL2000;2:Snai1启动子PCR扩增结果

2.2 载体p GL3-Basic的双酶切结果

载体p GL3-Basic经Kpn I和BglⅡ双酶切后, 取部分酶切体系进行凝胶电泳, 如图显示 (图2) , 在5Kb大小附件, 发现一条明亮的条带, 与载体预期大小一致。

1:1kb ladder marker;2:质粒p GL3-Basic双酶切结果;3:质粒p GL3-Basic

2.3 重组质粒的双酶切鉴定结果

通过限制性内切酶Kpn I和BglⅡ双酶切的Snai1启动子与双酶切的p GL3-Basic Vector在含连接酶的10μL的连接体系中16℃连接过夜, 连接产物热激转化入DH5α感受态细菌中, 在含氨苄的细菌培养平板上涂板过夜。分别挑取3个单克隆菌落, 接入5 m L LB培养基中, 250 r/min摇荡过夜, 分别提取质粒, 并以Kpn I和BglⅡ双酶切, 结果如图所示 (图3) , 可以看出克隆1所提取的质粒能切出大小为5 kb左右和800 bp左右大小的两个片段, 而克隆2和3所提取的质粒经Kpn I和BglⅡ双酶切后只见单一片段, 从而说明, 克隆1是构建成功的p GL3-Basic-Snai1-luc重组质粒, 而克隆2和3则为p GL3-Basic自连所导致的假阳性克隆。为了进一步鉴定克隆1是否是真阳性克隆, 笔者将克隆1所提取的质粒送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序, 经BLAST比对, 序列完全正确测序, 从而表明克隆1确实是构建成功的p GL3-Basic-Snai1-luc。重组质粒p GL3-Basic-Snai1-luc构建成功。

2.4 重组质粒p GL3-Basic-Snai1活性鉴定

为了进一步证明本研究构建好的重组质粒p GL3-Basic-Snai1是否具有生物活性, 我们将重组质粒p GL3-Basic-Snai1-luc质粒与内参质粒p RL-TK按5∶1的比例 (摩尔比) 转染入CNE2细胞, 在37℃, 5%的二氧化碳细胞培养箱中培养4~6h, 然后更换为完全培养基后加入10 ng/m L的TGF-β1刺激, 并设阴性对照组, 在37℃, 5%的二氧化碳细胞培养箱中培养24 h后检测荧光素酶的表达情况。结果显示 (附表, 图4) , TGF-β1能显著地增强p GL3-Basic-Snai1-luc荧光素酶的表达活性, 说明Snai1启动子序列已经准确插入到了荧光素酶基因上游, 本研究已经成功地构建了有生物活性的重组质粒p GL3-Basic-Snai1-luc, 该重组质粒可以用于后续的实验研究。

1:1kb ladder marker;2:克隆1未酶切;3:克隆1双酶切;4:克隆2未酶切;5:克隆2双酶切;6:克隆3未酶切;7:克隆3双酶切

2.5 TGF-β1诱导CNE2细胞Snai1的表达

为了进一步证实p GL3-Basic-Snai1的生物活性, 笔者进一步地通过检查TGF-β1是否通过诱导Snail的转录来诱导Snail蛋白的表达。对CNE2细胞进行不同浓度的TGF-β1处理, 并设阴性对照, 药物作用24 h后, 提取细胞总m RNA进行荧光定量PCR检测, 提取细胞总蛋白进行Western Blotting检测, 从而在转录水平和翻译水平检测Snai1的表达情况。结果发现, 经过TGF-β1作用后, Snai1的m RNA和蛋白水平的表达量远远高于阴性对照组 (图5和6) 。因此, 表明TGF-β1可以通过激活Snail的启动子序列而诱导Snail的m RNA与蛋白的表达。

覮P<0.01;1:对照组;2:TGF-β110 ng/m L;3:TGF-β120 ng/m L

1:TGF-β10 ng/m L;2:TGF-β110 ng/m L;3:TGF-β120 ng/m L

3 讨论

恶性肿瘤的演进是一个多步骤的复杂过程, 包括正常细胞恶性转化、肿瘤细胞恶性增殖、肿瘤细胞的侵袭和转移。上皮细胞来源的癌症在肿瘤中占非常多的比例, 而肿瘤细胞发生转移是肿瘤患者致死的主要原因之一。肿瘤细胞的侵袭是肿瘤发生转移的第一步, 但是目前对其认知尚少。在肿瘤发生发展过程中, EMT能使没有迁移与转移能力的细胞获得浸润的能力并最终是肿瘤细胞转移到其他组织和器官, 从而使肿瘤形成局部浸润和远处转移, 并再次通过间质细胞向上皮细胞转化, 从而形成固定的转移灶。在肿瘤的转移过程中, 肿瘤组织中发生EMT改变的肿瘤细胞数目直接与病变组织的侵袭转移程度密切有关。在动物和人的肿瘤中, Snail参与了肿瘤细胞发生EMT的过程, 是导致EMT的关键性转录因子, 从而促进肿瘤细胞发生侵袭与转移[9,10,11], 目前研究发现Snail通过促进肿瘤细胞发生EMT改变而引起多种肿瘤的转移[12,13,14,15], 此外, 国内学者利用重组腺病毒载体p Ad Easy OSNAI1高效感染Hep G2肝癌细胞株, 诱导外源性Snai1蛋白过表达, 结果表明外源性Snai1蛋白过表达能诱导Hep G2细胞出现EMT样变化, 并且细胞运动、侵袭转移能力明显增强[16]。以上研究均表明, Snail高表达能促进癌细胞发生EMT改变, 使得肿瘤细胞运动及侵袭力增强, 而抑制Snail的表达则能抑制肿瘤细胞发生EMT改变, 从而抑制肿瘤细胞的侵袭与转移, 表明Snail在肿瘤转移过程中发挥着非常重要的作用。目前Snail转录因子已经作为一种肿瘤治疗靶标成为抗肿瘤转移研究的热点之一。

本研究通过PCR技术从人血液基因组中钓出所需要的具有启动子活性的Snai1片段, 双酶切后与双酶切的p GL3-Basic空载体连接成重组体p GL3-Basic-Snai1-luc, 通过转化扩增, 筛选出阳性克隆, 并通过酶切, 测序鉴定及生物学活性的检测, 结果表明, 本组成功地构建了p GL3-Basic-Snai1-luc荧光素酶报告基因载体, 并在CNE2细胞内鉴定了其在TGF-β1的诱导下, 能启动荧光素酶的表达。此外, 通过荧光定量PCR和Western blotting检测表明TGF-β1能显著性的诱导Snail的转录与表达。因此, 充分证明了本组构建的p GL3-Basic-Snai1-luc是具有生物学功能的, 为Snai1在EMT过程中的调控机制研究和以snail为靶标的抗肿瘤药物快速高通量的筛选提供了非常重要的研究工具。

摘要：目的 构建Snail启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-Snai1-luc并对其进行生物活性的鉴定及其初步的应用研究。方法 通过PCR技术从人血液基因组中钓出我们需要的具有启动子活性的Snail片段, 双酶切后与双酶切的pGL3-Basic空载体连接成重组体pGL3-Basic-Snai1-luc, 通过转化扩增, 筛选出阳性克隆, 并通过酶切, 测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果 成功地构建了pGL3-Basic-Snai1-luc荧光素酶报告基因载体, 并在CNE2细胞内鉴定了其在TGF-β1的诱导下, 能启动荧光素酶的表达。此外, 笔者通过Western blotting检测表明TGF-β1能显著性的诱导Snail蛋白的表达, 充分证明了我们构建的pGL3-Basic-Snai1-luc是具有生物学功能的。结论 具有生物活性的pGL3-Basic-Snai1-luc的构建成功为研究Snai1在EMT过程中的调控机制研究和以snail为靶标的抗肿瘤药物快速高通量的筛选提供了非常重要的研究工具。

关键词：上皮细胞间质变,Snail,肿瘤转移,启动子

snail 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

胃癌细胞株BGC823购自博士德生物技术有限公司, AntiSnail pc DNA3.1质粒构建及引物合成委托上海生工合成部完成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

BGC823含10%胎牛血清、RMPI-1640培养基于37℃.含5%CO2孵箱中培养。

1.2.2 摇菌提取质粒

常规方法摇菌, 按Omega去内毒素质粒提取试剂说明, 进行Anti-Snail pc DNA3.1质粒和空白质粒抽提, 琼脂糖凝胶电泳, 回收质粒测序。

1.2.3 药物、质粒干预

取对数生长期细胞, 调整细胞密度为5×104/cm2, 0.2 m L/孔接种于96孔板中, 配制5-Aza (sigma) 终浓度为0.1 m M (0.1 mmol/L) 、2.5 m M、5.0 m M的培养基, 200 u L/孔加入96孔板, 每个浓度设5个复孔。质粒混合物:分别将lul Antisnail质粒 (1 ug/u L) 、1 u L空白质粒和X-terem Gene HP (Roch公司) 按1∶3比例配制, 与1 00 u L无血清培养基混匀, 逐滴加入培养孔中, 每组设5个复孔, 设空白对照。将96孔板置于37℃含5%CO2孵箱中培养分别作用12、24、48 h。

1.2.4 MTT法

终止培养前4 h, 加入MTT (sigma) (5 mg/m L) 20 u L/孔, 继续培养4 h后小心吸取上清, 加DMSO150 u L孔, 置酶标仪上读数, 记录各孔光吸收值, 以时间为横坐标, 吸光度A值作为纵坐标绘制肿瘤细胞生长曲线。

1.2.5 Real-time PCR测E-cadherin和Snail m RNA表达

瞬时转染Antisnail-pc DNA3.1和2.5M 5-Aza处理12 h、24 h、48 h时收集BGC823细胞, RNasio (Takara) 提取各组m RNA, 反转录为c DNA, 分别进行q RT-PCR反应, 3组引物序列:

Snail:上游5’TTCTTCTGCGCTACTGCTGCG3’;下游5’GGGC AGGTATGGAGAGGAAGA3’;

E-cad:上游5’GGATGTGCTGGATGTGAATG3’;下游5’AG-CAAGAGCAGCAGAATCAG3;

GAPDH上游5’GATGAGATTGGCATGGCTTT3’;下游5’CACCTTCACCGTTCCAGTTT3’

Realtime-PCR反应条件:

0.2 m LPCR薄壁管分别编号, 加入2×q PCR Master Mix (Omega公司) 12.5 u L, 正反向引物混合物各0.5 u L, c DNA 1 u L。一管不加模板作阴性对照, 补加DEPC水至25 u L混匀。95℃5 min预变性后, 95℃15s→58℃20s→72℃20s, 40cycles。反应结果经Max-Pro软件分析。

1.3 统计方法

采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析, 所有数据用均数±标准差表示, 各组间采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 转染反义snail质粒与5-Aza分别作用对BGC823生长的抑制作用

3组浓度5-Aza、转染Anti-snail pc DNA3.1分别作用12 h、24 h、48 h时, 各组对低分化胃腺癌细胞株生长均具有抑制作用, 且药物干预具有浓度时间依赖性, 5-Aza浓度为2.5m M, 作用48 h肿瘤生长抑制作用最明显。

2.2 各干预组对E-钙粘素m RNA表达的影响

2.5A、5.0A、转染Anti Snail pc DNA3.1组及2.5A与转染Antisnail pc DNA3.1联合分别作用48 h后均使细胞E-粘素基因m RNA重新高表达, 5-Aza同时使上调Snail表达, 转染空白质粒组较对照组无明显变化。药物干预呈浓度-时间依赖性, 2.5A作用48 h, E-钙粘素表达明显增加, 转染Antisnail-pc DNA3.1组48 h最大上调E-钙粘素基因表达。

2.3 5-Aza对转录调节因子Snail基因表达的影响

转染Anti-snail pc DN3.1组Snail m RNA表达明显降低, 与DMSO比较2.5A作用于低分化胃腺癌细胞株48 h, Snail基因m RNA表达显著增高 (图2.3) , 差异有统计学意义。

图2.2显示:0.1A、2.5A、5.0A分别作用于胃癌细胞株BGC82348 h Snail、E-cad m RNA含量的变化。

3 讨论

甲基化[6]和转录调节子在调节E-钙粘素转录中发挥重要作用, 转录调节子snail在多种肿瘤细胞中的过表达, 如肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠癌等肿瘤与E-cadherin的表达呈负相关[7]。启动子甲基化能抑制E-钙粘素的表达, 但甲基化并不总是伴有E-钙粘素表达缺失, 如在结直肠癌细胞中, 甲基化与E-钙粘素表达增高有关, 提示其他表观机制如脱乙酰化与E-钙粘素调节相关[8,9,10]。甲基化与Snail的关系报道较少, 早期在鼠的皮肤癌研究发现, Snail基因的表达也与甲基化有关[11]。2012年Ying Chen[12]等在滋养层细胞的实验表明:Snail基因第一个内含子区甲基化与Snail的转录调节有关, 同时E-钙粘素邻近启动子甲基化参与下调其表达, 提示异常甲基化与胚胎形成时疾病发生相关。

该实验对低分化胃腺癌细胞株BGC823的研究证实:去甲基化药物5-Aza-2’-Cd R能重新诱导低分化胃腺癌细胞株E-钙粘素的表达, 去甲基化作用也使Snail基因表达增加, 反义Snail的过表达显著上调低分化胃腺癌细胞E-cadherin的表达, 与Ying Chen等在滋养层和多功能干细胞的研究比较, 研究了胃癌细胞内而甲基化作用在Snail基因表达抑制和E-钙粘素的表达下调过程中发挥双重作用。同时, 由该组数据得出:5-Aza与反义Snail均能抑制低分化胃腺癌细胞的生长, 5-Aza在2.5 m M 48 h对低分化胃腺癌的生长抑制达最大值。

snail 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

肝癌细胞株MHCC97-H购自中科院细胞库;兔抗人Twist抗体、兔抗人Snail抗体、兔抗人Slug抗体购自于Absun公司;MTT购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MHCC97-H肝癌细胞株在含有10%的胎牛血清, 100U/mL青霉素, 100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中生长, 并置于37℃, 饱和湿度, 5%CO2的条件下培养, 实验细胞均处于对数生长期。

1.2.2 MTT法检测VEGF-B活化肝癌细胞株MHCC97-H的最适浓度

取对数生长期细胞制成细胞数为10×104/mL的细胞悬液, 接种96孔板, 每孔100μL, 96孔板中加入含不同浓度的VEGF-B培养基100μL, 每组设6个复孔, VEGF-B从高到低的浓度分别为:200ng/mL, 100ng/mL, 50ng/mL, 20ng/mL, 10ng/mL, 5ng/mL, 2ng/mL, 1ng/mL, 0.5ng/mL, 0.2ng/mL, 0.1ng/mL, 0.05ng/mL, 0.02ng/mL, 0.01ng/mL, 0.005ng/mL, 0ng/mL。

96孔板置于37℃, 饱和湿度, 5%CO2的条件下培养, 24h, 48h, 72h分别用MTT法570nm处测吸光值, 以VEGF-B0ng/mL的吸光值进行校正, 结果发现VEGF-B浓度1ng/mL为适宜肝癌细胞株MHCC97-H生长的最低浓度。按VEGF-B1ng/mL的浓度配制含有10%的胎牛血清, 100U/mL青霉素, 100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基, 并进行细胞培养, 选取对数生长期的细胞进行实验。最后采用Western-Blot分析蛋白的表达。

1.3 统计学处理

数据以均值±标准差表示。采用SPSS13.0软件系统对数据进行t检验, P<0.05有统计学意义。

2 结果

对Snail, Slug, Twist在VEGFR-1活化前、后与β-actin的光密度值比较。以内参β-actin的光密度值对目的蛋白Snail, Slug, Twist进行校正得到相对光密度值见表1。

从上表可证实Snail, Slug, Twist的表达在有高转移潜能的肝癌细胞株MHCC97-H的受体VEGFR-1活化后均较活化前明显增加 (P<0.05) , 有统计学意义。

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤最本质的生物学特征, 最近大量的实验证明, EMT在恶性肿瘤原位侵袭和远处转移中发挥重要的作用, 肿瘤转移初期的重要事件之一。EMT是以上皮细胞特性丧失及间质特性获得为主要特征的, 主要表现为E-CD的表达下调从而发生侵袭和转移[3], 研究表明, Snail和E-CD在很多上皮性癌中存在明显的反向表达。在对E-CD表达调控的研究中发现锌指转录因子Snail, Slug在转录水平对E-CD的调节是EMT的中心环节[1]。近来, Yang等发现了一个新的诱导EMT的转录因子Twist[4,5], 它通过下调E-CD的分子机制可能与snail, slug相似。本实验中, 用VEGFR-1的特异性配体VEGF-B活化VEGFR-1高表达的肝癌细胞株MHCC97-H, 对Snail, Slug, Twist在肝癌细胞株MHCC97-H的受体VEGFR-1活化前后的Western-blot图像的光密度值分析所得结果为:Snail, Slug, Twist在VEGFR-1活化后表达均高于活化前的, 这与国内外的一些相关研究结果一致, 在蛋白水平上证明了VEGF-B活化VEGFR-1能诱导肝癌细胞株MHCC97-H发生EMT, 使肝癌细胞株MHCC97-H的侵袭和转移能力增加。下一步可以通过RNA干扰等技术沉默转录因子Snail, Slug, Twist来进行肝癌细胞的侵袭和转移进一步研究。但是转录因子Snail, Slug, Twist如何诱导EMT的发生, Snail, Slug, Twist的上游及下游是否还存在更为特异的因子在肝癌转移和侵袭中发挥作用, 这些分子机制还有待进一步研究。

关键词：上皮间质转化 (EMT) ,Snail,Slug,Twist,Western-blot

参考文献

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snail 篇4

蛋白激酶B(protein kinase B,PKB或Akt)和磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p Akt)在前列腺癌中过表达,Akt/p Akt蛋白表达与前列腺癌生化复发相关[3,4]。尽管目前发现前列腺癌中钙黏蛋白E(E-cadherin)表达缺失[5,6],但目前尚未见关于E-cadherin表达缺失与前列腺癌生化复发相关性的研究报道。此外,目前也未见关于桥粒芯糖蛋白2(desmoglein 2,DSG2)在前列腺癌中表达情况的研究报道。以往研究表明,PI3K/Akt信号通路活化可通过上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关转录因子Snail抑制前列腺癌E-cadherin转录。本研究检测前列腺癌组织标本中DSG2、活化Akt和Snail表达情况及其相关性,并分析E-cadherin及DSG2和生化复发的相关性,探讨E-cadherin和DSG2作为前列腺癌侵袭性有效预测因子的潜力。

1资料与方法

1.1研究对象

128例前列腺癌组织标本均为2001年1月-2005年12月南华附属第一医院泌尿外科前列腺癌手术后样本。用于m RNA提取的所有组织均是经尿道前列腺电切术及耻骨弓上前列腺切除术中迅速收集,然后投入已经准备好的液氮中,冷冻保存。切取组织直接用包埋剂进行包埋,制作冷冻切片。所有病例均经HE染色确定,并进行Gleason评分及临床分期。术后均经病理证实为前列腺癌。

1.2主要方法

所有标本均经10%中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,应用组织芯片制备仪制备芯片。首先每个组织制作1张HE切片,由病理专家在显微镜下将病变的典型部位进行定位,并在切片上标记相关区域,然后将该切片和石蜡组织块进行比较,依靠HE切片上标记在石蜡组织块同一部位也做一标记,这样就可以做到准确定位。制备长36 mm×宽26mm×高15 mm大小的空白蜡块,在此蜡块26 mm×21 mm范围内打孔(1.5 mm)制成12×9共108点阵芯片的模块。穿刺事先标记的目标组织(直径1.5mm),准确放入空白蜡块的小孔内。每例标本均编号,从空载体芯片腊块第1排第3孔开始,依次按序操作直至将所有标本均种植于空白蜡块中,最后用石蜡切片机进行连续切片。建立布有250个阵列(样本)不同级别的前列腺临床标本的组织芯片,正常前列腺组织标本10例。

1.3免疫荧光双重染色(FITC-CY3)和激光扫描共聚焦显微镜观察

取组织芯片石蜡切片(4μm),58℃烤18 h,常规脱蜡,PBS洗3遍。柠檬酸缓冲液抗原修复20min,室温冷却20 min,PBS洗3遍。滴加20%蛋清,室温静置30 min,PBS洗3遍。滴加10%正常羊血清,室温静置20 min。加鼠E-cadherin/DSG2/p Akt/Snail(1∶50)和CK8/18(1∶100)混合物,室温孵育4 h,PBS洗3遍。加羊抗鼠Ig G-FITC(1∶30)和生物素化羊抗兔Ig G(1∶100)混合物,避光室温孵育1 h,PBS洗3遍。加Streptavidin.Cy3,室温孵育1 h,PBS洗3遍,蒸馏水洗3 min,以防荧光碎灭剂封片。Leica TCS SP2激光扫描共聚焦显微镜下扫描,计算机采集数据,数字成像。CK8/18阳性细胞可见细胞核内绿色荧光,E-cadherin/DSG2/p Akt/Snail阳性细胞核内可见红色荧光。

1.4统计学方法

应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。率的比较采用χ2检验和确切概率法,等级资料比较采用秩和检验,等级资料的关联分析采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫荧光分析原发性前列腺癌组织芯片中E-cadherin、DSG2、p Akt和Snail的表达

128例前列腺癌患者组织标本用福尔马林固定和石蜡包埋后,分别提取直径约为2 mm圆柱状核心组织,并将这些组织嵌入到同一张切片,用于构建前列腺癌组织芯片,以便能同时测定各蛋白在多个样本中表达情况。前列腺癌组织芯片由上海芯超生物科技有限公司制作完成。前列腺癌组织芯片构建时,首先由两名病理科教授检测各患者组织标本,以确定肿瘤细胞高密度区,供公司参考。构建好后,从前列腺癌组织芯片石蜡包埋中切取5μm组织用于免疫荧光分析。蛋白表达计分方法为发生免疫反应的肿瘤细胞占组织核的百分比(见图1)。然后对每个样本组织核的平均值进行统计学分析。患者的临床学特征见表1。

2.2前列腺癌组织中E-cadherin、DSG2、p Akt和Snail蛋白的表达情况

免疫组织化学结果表明前列腺癌组织中E-cadherin和DSG2表达明显低于前列腺组织,肿瘤高分化区细胞边缘E-cadherin和DSG2蛋白高水平表达,而肿瘤低分化区域E-cadherin和DSG2表达下降(见图2A、2B)。p Akt在前列腺癌细胞质和细胞核中均表达,且在肿瘤高分化区和低分化区内均有较高表达(见图2C)。此外,前列腺癌Snail核表达水平较正常组织也略有上升(见图2D)。见表2。

2.3前列腺癌蛋白表达和临床病理学特征的关系

斯皮尔曼秩相关法统计发现,E-cadherin和DSG2表达呈显著正相关,p Akt表达升高同时Snail水平也升高,p Akt和Snail表达之间呈弱显著正相关。此外,p Akt与E-cadherin表达成弱显著正相关。p Akt与DSG2表达相关性要比p Akt和E-cadherin表达相关性还要弱,而且无统计学意义。这些结果表明E-cadherin和DSG2随着p Akt表达增强而增强,E-cadherin和Snail之间存在微弱负相关,但相关性无统计学意义。此外,DSG2和Snail表达呈微弱正相关,相关性也无统计学意义,提示前列腺癌中Snail表达并不影响DSG2表达。

统计还发现E-cadherin表达和所有检查临床病理特征之间存在负相关,尽管其相关性无统计学意义。而DSG2表达和所有临床病理特征也呈负相关,DSG2表达分别与血清PSA浓度、Gleason评分呈显著负相关,并且其相关性稍强于E-cadherin表达与血清PSA浓度、Gleason评分的相关性。总之,本结果表明,E-cadherin和DSG2表达下降提示前列腺癌患者血清PSA浓度含量增加、Gleason评分较高及病理分期更高。见表3。

2.4蛋白表达的临床影响

E-cadherin表达70%处最接近于前列腺癌标本E-cadherin表达平均值,因而选取该处为阈值,将患者分为E-cadherin高表达组(≥70%)与E-cadherin低表达组(<70%),比较两组患者生存期,结果发现E-cadherin表达≥70%组患者无复发生存率高于E-cadherin表达<70%组患者,差异有统计学意义(见图3A,P=0.043)。E-cadherin表达<70%组患者生化复发中值时间为104个月,而E-cadherin表达≥70%组患者120个月随访期结束后尚未达到生化复发中值时间。同样选取DSG2表达60%水平处为阈值,DSG2表达≥60%组患者无复发生存率高于DSG2表达<60%组患者,差异有统计学意义(见图3B,P=0.01);DSG2表达<60%患者生化复发中值时间为104个月,而DSG2表达≥60%患者在120个月随访期结束后尚未达到生化复发中值时间。总之,钙E-cadherin和DSG2表达降低与前列腺癌生化复发有关,有望成为前列腺癌侵袭性的预后因子。

前列腺癌组织中p Akt表达水平(67%)高于正常前列腺组织(38%)。p Akt阴性前列腺癌患者无复发存活率高于p Akt阳性前列腺癌患者(见图3C,P=0.038),差异有统计学意义。p Akt阳性患者生化复发中值时间为106个月,而p Akt阴性患者在120个月随访期结束后尚未达到生化复发中值时间。采用同样方法测定Snail表达,结果发现前列腺癌组织Snail表达略高于正常前列腺组织(64%vs 60%);Snail阴性前列腺癌患者无复发存活率比阳性患者要高,但差异无统计学意义(见图3D,P=0.263)。Snail阳性患者生化复发中值时间为106个月,而阴性患者在120个月随访期接受后尚未达到生化复发中值时间。综合上述结果发现p Akt表达与前列腺癌生化复发有关,且这种相关性具有统计学意义,表明p Akt能够作为前列腺癌侵袭性的预后因子。尽管如此,综合本次结果表明E-cadherin和DSG2是更为有效的前列腺癌预后因子。

A:E-cadherin;B:DSG2;C:p Akt;D:Snail;目的蛋白为红色;绿色为CK8/18蛋白;蓝色为胞核DAPI染色

3讨论

PI3K/Akt信号通路可能通过Snail介导前列腺癌E-cadherin转录抑制,而对DSG2表达无影响,此外,E-cadherin与DSG2表达调控无关[7]。本研究采用Spearman秩相关结果分析发现E-cadherin和Snail之间存在微弱负相关。这些结果提示Snail可能是前列腺癌E-cadherin表达的转录抑制因子,但与DSG2表达抑制无关。本研究p Akt和E-cadherin表达呈弱显著正相关,与以往研究结果不一致[8],提示PI3K/Akt通路虽然抑制E-cadherin转录,但是p Akt和E-cadherin表达确呈弱显著正相关,提示前列腺癌中还存在其他E-cadherin表达抑制机制。

虽然研究证实前列腺癌中E-cadherin表达缺失,但关于钙黏蛋白在前列腺癌侵袭性预测中的应用还没有大规模研究。此外,目前未见关于前列腺癌桥粒钙黏蛋白表达的研究报道。黏合连接和桥粒参与前列腺上皮细胞间黏连[9,10],因而了解典型钙黏蛋白和桥粒钙黏蛋白的表达将有助于深入探索锚定连接在前列腺癌发展过程中的作用。本研究发现与正常前列腺组织比较,前列腺癌组织中DSG2表达显著降低。此外,DSG2在肿瘤高分化区表达水平高,在肿瘤低分化区表达水平低,与E-cadherin分布相似。Spearman秩相关分析结果显示E-cadherin和DSG2表达呈显著正相关,E-cadherin及DSG2和血清PSA浓度、Gleason评分及病理分期呈负相关。Kaplan-Meier存活曲线结果进一步表明E-cadherin和DSG2等钙黏蛋白低表达肿瘤细胞更可能有侵袭性,比钙黏蛋白高表达细胞发生转移风险更高,这些发现证实E-cadherin和DSG2等钙黏蛋白在前列腺癌发展中发挥关键作用,E-cadherin和DSG2有望成为侵袭性前列腺癌的预后因子。

摘要：目的 探讨钙黏蛋白E(E-cadherin)、桥粒芯糖蛋白(2DSG2)、磷酸化Akt(pAkt)和转录因子Snail在前列腺癌发病进程中的作用;阐明E-cadherin、DSG2、pAkt和Snail对前列腺癌发病进程的影响及在临床预后中的作用。方法 组织芯片法检测E-cadherin、DSG2、pAkt和Snail在前列腺癌组织中的表达情况。结果 前列腺癌组织中E-cadherin表达明显低于正常前列腺组织,细胞质和细胞核中均可观察到pAkt表达,且在肿瘤高分化区和低分化区内均有较高表达。E-cadherin和DSG2表达呈显著正相关。E-cadherin和DSG2表达下降提示前列腺癌患者血清前列腺特异性抗原(PSA)浓度含量增加,Gleason评分较高及病理分期更高。结论 前列腺癌低分化细胞中钙黏蛋白表达降低,钙黏蛋白低表达提示肿瘤细胞侵袭性更强,转移发生率高。钙黏蛋白在前列腺癌发展中发挥关键作用,E-cadherin和DSG2有望成为侵袭性前列腺癌的预后因子。

关键词：前列腺癌,预后,组织芯片,E-cadherin,DSG2,pAkt,Snail

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