HPV16

HPV16（精选7篇）

HPV16 篇1

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一, 目前我国的宫颈癌发病年轻患者呈增加的趋势。研究证实人乳头瘤病毒 (human papilloma virus, HPV) 感染与宫颈癌有着十分密切的关系, 在宫颈癌的发生发展中起重要作用[1,2]。因此, 研究宫颈癌和HPV的关系对于宫颈癌的防治具有重要意义。本文根据检测结果, 结合临床和流行病学探讨HPV16, 18与宫颈癌的关系。

1 材料与方法

1.1 组织标本与临床资料

收集2009年8月—2012年8月我院妇科178例宫颈癌及宫颈上皮内瘤变 (CIN) 标本, 所有病例诊断前均未做治疗。标本均用10%福尔马林固定, 石蜡包埋组织, 采用HE染色及免疫组化SP法标记宫颈上皮病变中HPV16, 18, 确定细胞内免疫表达阳性率。并取同期10例正常宫颈组织作对照。

所有标本经病理组织学确诊, 其中宫颈浸润癌138例 (鳞癌97例, 腺癌41例) , CIN 40例。

1.2 临床特点

发病年龄:宫颈浸润癌患者年龄为25岁~72岁, 中位年龄41.2岁。临床表现:包括不规则阴道出血、阴道排液、月经紊乱等。宫颈组织学分型:鳞癌97例, 腺癌41例;病理分级:Ⅰ~Ⅱ级65例, Ⅲ级73例。

1.3 免疫组化染色及结果判定

免疫组化染色:将石蜡切片用二甲苯脱蜡, 梯度乙醇水化, 修复抗原, 三步SP法染色, DAB显色, 苏木素复染, 脱水, 透明, 封片。细胞中有棕黄色颗粒的为阳性细胞。高倍镜下随机计算100个病变细胞中阳性细胞所占百分比, ≥25%为阳性病例, <10%为阴性。免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司, 用PBS代替一抗作为阴性对照, 用已知的尖锐湿疣切片作为阳性对照。

1.4 统计学方法

计数资料采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在138例宫颈癌标本中, HPV表达阳性率为70.

3%, 其中<55岁年龄组宫颈癌102例, HPV (+) 为92例, 阳性率为90.2%;≥55岁年龄组36例, HPV (+) 为5例, 阳性率为13.9%, 组间阳性率比较有显著差异 (χ2=10.235, P<0.01) 。HPV16 (+) 组共52例, 其中宫颈鳞癌47例, 腺癌5例;HPV18 (+) 45例, 宫颈鳞癌11例, 腺癌34例, 组间阳性率比较有显著差异 (χ2=12.348, P<0.01) 。见表1。

2.2 HPV在宫颈癌、CIN及正常宫颈上皮中的表达见表2。

注:χ2、P为正常宫颈上皮与宫颈浸润癌比较检验值, χ12、P1为正常宫颈上皮与CIN比较检验值。

3 讨论

宫颈癌的病因十分复杂, 近几年研究表明高危型人乳头状瘤病毒感染与宫颈肿瘤关系密切。分子学和临床证据表明, HPV感染可影响宫颈肿瘤的发病机制, HPV可分为高、中、低度危险型三类, 从生殖道分离出的HPV有25种, HPV16, 18为高度危险型[3,4]。临床研究发现, 宫颈癌患者中有99%以上合并HPV感染, 其中约70%为HPV16和18型感染, 其中HPV18型多见于宫颈腺癌, 而16型感染多见于宫颈鳞癌[5]。

本研究结果显示, 宫颈癌中HPV16, 18表达阳性率为70.3%, CIN组HPV表达阳性率为42.5%, 与正常宫颈HPV表达比较差异均有统计学意义。这与国内外文献报道是一致的, 提示HPV感染与宫颈癌及CIN关系密切。此外, 本研究结果显示:在HPV18阳性组中宫颈腺癌为75.6%, 而在HPV16阳性组及HPV阴性组为9.6%, 4.9%, HPV18型多见于宫颈腺癌。

本研究结果还表明HPV16, 18型感染在宫颈癌 (<55岁年龄组) 阳性率为90.2%, 而年龄较大的女性 (≥55岁年龄组) HPV16, 18阳性率为13.9%, 提示在年轻女性宫颈癌患者中, 高危型HPV病毒感染在宫颈癌的发生、发展可能起更重要的作用。因此预防和及时治疗HPV感染 (尤其是高危型HPV16, 18) 对年轻女性宫颈癌的防治有重要意义, 会有效地降低宫颈癌的发病率和病死率。

循证医学研究表明, 人群筛查和子宫颈癌的早期发现、早期治疗是降低子宫颈癌发病率和病死率最有效的方法。但宫颈癌的筛查却不能阻止HPV的感染, 尽管其可以降低宫颈癌发生的危险。我国在研究HPV与宫颈癌发生关系方面, 近年来进展也很快。目前对HPV感染尚无确切的治疗方法, 但在预防宫颈癌的发生研究上有很大进展, 目前已有研究采用HPV疫苗来预防和治疗该病毒的感染, 现已有许多研究预防性疫苗, 如病毒外壳蛋白疫苗、合成多肽疫苗和核酸疫苗的报道。有大规模研究证实, 应用HPV疫苗的获益大于风险[6,7,8], 其中理想的预防性疫苗是针对HPV外壳蛋白L1设计的病毒样颗粒疫苗, 具有良好的抗原性和免疫原性[9]。希望在不久的将来人类可以通过接种HPV疫苗来降低与HPV相关宫颈癌的发生率。

摘要：目的 结合临床和流行病学探讨HPV16, 18与宫颈癌的关系。方法 将178例宫颈癌及宫颈上皮内瘤变 (CIN) 标本采用HE染色及免疫组化SP法, 标记宫颈上皮病变中的HPV16, 18, 并取同期10例正常宫颈组织作对照。结果 138例宫颈癌标本的HPV16, 18平均阳性率为70.3%, 其中<55岁年龄组宫颈癌102例, HPV阳性率为90.2%, ≥55岁年龄组36例, 阳性率为13.9%, 组间阳性率比较有显著差异 (P<0.01) 。HPV16 (+) 组共52例, 其中宫颈鳞癌47例, 腺癌5例;HPV18 (+) 45例, 宫颈鳞癌11例, 腺癌34例, 组间阳性率比较有显著差异 (P<0.01) 。结论 HPV的感染与宫颈癌相关, HPV16型感染多见于宫颈鳞癌, 而18型多见于宫颈腺癌。

关键词：宫颈癌,HPV16,HPV18,流行病学

参考文献

[1]R.Sharma.HPV vaccine:A breakthrough in prevention of cervical cancer[J].Apollo Medicine, 2012, 9 (2) :87-90.

[2]Zappacosta R, Caraceni D, Ciccocioppo L, et al.Implementing specificity of HPV-DNA primary screening in a successful organised cervical cancer prevention programme[J].Gynecologic Oncology, 2013, 128 (3) :427-432.

[3]Kinney W, Fetterman B, Cox JT, et al.Characteristics of 44 cervical cancers diagnosed following Pap-negative, high risk HPV-positive screening in routine clinical practice[J].Gynecologic Oncology, 2011, 121 (2) :309-313.

[4]Smith JS, LindsayL, Hoots B, et al.Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical lesions:a meta-analysis update[J].Int J Cancer, 2007, 121 (3) :621-632.

[5]Kang WD, Kim CH, Cho MK, et al.HPV-18 is a poor prognostic factor,unlike the HPV viral load, in patients with stage IB-IIA cervical cancer undergoing radical hysterectomy[J].Gynecol Oncol, 2011, 121 (3) :546-550.

[6]张颖, 郎景和.人乳头状瘤病毒疫苗在子宫颈病变预防与治疗中的应用[J].中华妇产科杂志, 2006, 41 (3) :214.

[7]de Sanjose S, Quint WG, Alemany L, et al.Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer:a retrospective cross-sectional worldwide study[J].Lancet Oncol, 2010, 11 (11) :1048-1056.

[8]Kawana K, Adachi K, Kojima S, et al.Therapeutic Human Papillomavirus (HPV) Vaccines:A Novel Approach[J].The Open Virology Journal, 2012, 6 (Suppl 2:M12) :264-269.

[9]郭天棋, 李诚信.人乳头状瘤感染与宫颈癌[J].中国实用妇科与产科杂志, 2001, 17 (11) :641-643.

HPV16 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

57例食管癌手术切除标本取自漯河医学高等专科学校第三附属医院、郑州大学医学院第一附属医院、第二附属医院 (2009年6月至2010年7月) , 其中男35例, 女22例;年龄42～79岁, 平均 (58.41±7.63) 岁。病理组织学证实57例食管癌均为鳞状细胞癌, 其中Ⅰ级15例, Ⅱ级20例, Ⅲ级22例;合并有淋巴结转移27例, 手术清扫的食管周围淋巴结中发现癌转移;无淋巴结转移30例, 食管周围淋巴结中未发现癌转移。浸润深度分2组, 浅层组9例, 肿瘤浸润深度在黏膜层、黏膜下层或浅肌层;深层组48例, 肿瘤浸润深度在深肌层或纤维膜层。所有病例术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。所有标本均在手术切除后2h内收集。

1.2 方法

快速导流杂交法检测HPV基因型试剂盒为中国凯普生物化学有限公司产品, 采用快速导流杂交法检测16、18两种HPV基因型, 将上述样本按常规方法DNA提取, PCR扩增, 快速导流杂交, 显色后, 对样本进行结果判断, 具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3 数据处理

采用配对χ2检验 (chi-square test) , 检验水准取α=0.05, 数据处理采用SPSS 13.0统计软件处理。

2 结果

2.1 高危型HPV (HPV16、18) 在食管磷癌组织中扩增结果

高危型HPV (HPV16、18) 在食管鳞癌组织中的阳性率为56.14% (32/57) 。男女患者高危型HPV阳性率为57.14% (20/35) 和54.55% (12/22) , 差异无统计学意义, χ2=0.04, P>0.0 5;淋巴结转移组感染率77.78% (21/27) 明显高于无淋巴结转移组36.67% (11/30) , 差异显著, χ2=9.75, P<0.01 (表1) ;总体上, HPV16阳性率 (36.84%, 21/57) 明显高于HPV18 (19.30%, 11/57) , 差异有统计学意义, χ2=4.34, P<0.05;同样, 淋巴结转移组, HPV16阳性率 (55.56%, 15/27) 明显高于HPV18 (22.22%, 6/27) , 差异有统计学意义, χ2=6.31P<0.05;相反, 无淋巴结转移组, HPV1 6阳性率 (2 0.0 0%, 6/30) 和HPV18阳性率 (16.67%, 5/30) 之间差异无统计学意义, χ2=0.11, P>0.05;HPV在I、II、III级分化程度中的阳性率为60% (9/15) 、50% (1 0/20) 、59.0 9% (1 3/22) , 差异无统计学意义, χ2=0.4 7, P>0.0 5 (表2) ;同样, H P V表达与患者年龄、性别及浸润程度均无相关性, P均>0.05。

2.1 高危型HPV (HPV16、18) 在癌旁组织中扩增结果

57例癌旁组织中, 高危型HPV的阳性率为24.56% (14/57) 。男女患者高危型HPV阳性率为22.86% (8/35) 和27.27% (6/22) , 差异无统计学意义, χ2=0.14, P>0.05;HPV16和HPV18阳性率为57.14% (8/57) 和54.5 5% (6/5 7) , 差异无统计学意义, χ2=0.3 3, P>0.0 5;同样, HPV表达与患者性别、年龄及浸润程度均无相关性, P均>0.05。

2.2 高危型HPV (HPV16、18) 在食管磷癌和癌旁组织中扩增结果比较

高危型HPV在食管鳞癌组织中的检出率为56.14% (32/57) , 明显高于癌旁组织检出率24.56% (14/57) , 差异有统计学意义, χ2=1 1.8 1, P<0.0 5。

3 讨论

食管鳞癌组织HPV感染率在不同地区或者同一地区研究结果差别较大 (0%～84%) , 综合已有文献分析导致上述结果的原因除取材方法以及取材地区、种族的差异外, 研究方法不一也是一个重要影响因素。主要的HPV检测方法有传统杂交法、型特异PCR、通用引物PCR、实时荧光PCR、杂交捕获法、导流杂交基因微阵列分型检测等。这些方法存在着或操作繁琐, 或费时耗力, 或只能进行分组鉴定而不能进行基因分型等缺点。本研究采用导流杂交方法检测HPV分型, 具有其它检测方法不具备的优点: (1) 快速, 即在PCR扩增后产物只需30min就可得到杂交结果; (2) 可分型, 可一次性检测21种HPV亚型感染, 既可以显示具体某种亚型HPV感染, 也可以显示混合型多重感染; (3) 有质控对照, 可在同一张低密度基因芯片薄膜上同时完成扩增对照和杂交对照, 对整个实验过程实行全面质量控制。因而本实验结果更加真实可信, 有现实意义。

利用导流杂交方法对河南地区食管癌及癌旁组织样本进行HPV16、18检测, 结果显示食管鳞癌高危型HPV阳性率明显高于癌旁组织 (56.14%vs24.56%) , 提示高危型HPV16、18与该地区食管鳞癌的发生存在明显关联。与有文献所报道的安阳地区34例HPV18阳性的食管鳞癌组织检出24例HPV16阳性不同, 本次研究的标本中均未检测出HPV16、18双重感染。但由于本次研究存在样本量较小, 取材和检测方法单一等不足, HPV16、18双重感染与食管鳞癌的关系尚有待进一步讨论。

研究表明HPV16、18感染与食管鳞癌组织分化程度、肿瘤浸润程度、患者性别及年龄无明显相关性, 提示HPV感染可能仅作为食管鳞癌发生的危险因素。

有文献[3]报道HPV16表达与淋巴结转移无相关性, 与之不同, 本次研究中 (表1) HPV16、18在淋巴结转移组感染率明显高于无淋巴结转移组 (77.78%vs36.67%) , 提示样本中HPV16、18可能参与了食管鳞癌的进化步骤和淋巴结转移的过程, HPV与癌细胞的转移关系有待进一步的研究。

与Li et al和刘红彦等报道相似, 本研究发现河南地区食管鳞癌中HPV16总体表达率明显高于HPV18 (36.84%vs19.30%) , 同样的情况也出现在淋巴结转移组 (55.56%vs22.22%) , 提示HPV16与食管鳞癌发生与发展的关联程度高于HPV18。

食管鳞癌的发生受到多重因素影响, 如遗传、饮食习惯、地理位置等, HPV作为环境中的生物致癌因素越来越受到人们的关注, 本研究检测了河南食管鳞癌及癌旁组织高危型HPV的感染情况, 这为进一步开展预防HPV感染, 减低食管癌的发病率有着重要的意义, 同时在治疗过程中检测HPV病毒的感染, 进行干预治疗, 对降低食管癌复发有着积极的临床意义。

参考文献

[1]崔金环, 杨光, 苏锡康, 等.宫颈癌和食管癌组织中人乳头状瘤病毒基因型的检测[J].肿瘤学杂志, 2009, 15 (3) :182～184.

[2]曹邦伟, 于晶琳, 荷欢.中国人群中HPV感染与食管癌发生关联的Meta分析[J].首都医科大学学报, 2010, 31 (2) :258～263.

HPV16 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

2007至2010年在深圳市观澜人民医院共收集到120例病理诊断为AIM、LSIL及HSIL的患者及其病理蜡块, 年龄34～62岁, 平均年龄 (54.3±5.3) 岁, 其中AIM组36例, LSIL组44例, HSIL组40例。AIM组、LSIL组和HSIL组的基本情况如年龄、性别、病程等各项指标经统计学分析, 差异均无统计学意义, 具有可比性。

1.2 入选标准

(1) 经病理诊断为AIM、LSIL及HSIL的患者的病理蜡块; (2) 以上病例均根据宫颈上皮内病变的诊断标准及Crum对AIM的定义进行分组[3];排除标准: (1) 合并肝、肾功能不全等其他严重的全身性疾病; (2) 患有其他严重的急性或慢性疾病; (3) 合并女性除宫颈癌之外的肿瘤患者, 如乳腺癌、卵巢癌等; (4) 合并其他病毒性感染等[2]。

1.3 检测方法

(1) p16INK4及CK17表达检测:常规制片后采用免疫组织化学及原位杂交方法检查120例宫颈病变中p16INK4A及CK17蛋白表达[1,2]; (2) HPV16/18的检测:采用核酸分子快速杂交仪检测, HPV16、HPV18是HPV感染的高危型别[3]。

1.4 判定标准

p16INK4A:细胞核中出现棕褐色染色为阳性细胞;CK17:以胞质棕黄色为阳性;按阳性细胞所占的百分数分为: (-) :0%～1%; (+) :1%～5%; (++) :5%～25%; (+++) :>25%[1,2,3]

1.5 研究方法

采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析, 率的比较采用卡方检验, 计量资料二者之间的比较采用t检验, 计量资料以均数±标准差 (χ—±s) 表示。

2 研究结果

2.1 CK17表达情况的比较

采用免疫组织化学及原位杂交方法检查120例宫颈病变中CK17蛋白表达情况, 结果详见表1, AIM组阳性率较高, 为100%, CIN病变组 (LSIL组+HSIL组) 阳性率较低, 为13.1% (11/84) , 经过卡方检验, χ2=17.9, P<0.01, 差异有统计学意义;LSIL组和HSIL组阳性率分别为11.4%、15%, 经过卡方检验, χ2=1.9, P>0.05, 差异无统计学意义。即AIM组阳性率明显高于CIN病变组 (LSIL组+HSIL组) , 且LSIL组和HSIL组阳性率无明显差异。

2.2 p16INK4表达情况的比较

采用免疫组织化学及原位杂交方法检查120例宫颈病变中p16INK4蛋白表达情况, 结果详见表2, AIM组阳性率较低, 为11.1%, CIN病变组 (LSIL组+HSIL组) 阳性率较高, 为100%, 经过卡方检验, χ2=18.3, P<0.01, 差异有统计学意义;LSIL组和HSIL组阳性率均为100%, 即AIM组阳性率明显低于CIN病变组 (LSIL组+HSIL组) 。

2.3 HPV16/18感染情况的比较

采用核酸分子快速杂交仪检测120例宫颈病变中HPV16/18感染情况, 结果见表3, AIM组阳性率较低, 为22.2%, CIN病变组 (LSIL组+HSIL组) 阳性率较高, 为80.8% (68/84) , 经过卡方检验, χ2=12.6, P<0.01, 差异有统计学意义;LSIL组和HSIL组阳性率分别为79.5%和82.5%, 经过卡方检验, χ2=1.3, P>0.05, 差异无统计学意义。即AIM组检出率明显低于CIN病变组 (LSIL组+HSIL组) , 且LSIL组和HSIL组检出率无明显差异。

3 讨论

目前对宫颈癌的病因并不明确, 大量流行病学资料研究了多种高危因素, 主要与女性体内激素等内分泌水平、病毒感染等密切相关。有大量流行病学资料表明HPV与女性宫颈癌的发生密切相关, 其阳性率可高达90%[3], 尤其是高危型的HPV16/18与宫颈病变的关系更为密切。宫颈癌的发生是一个多因素、多阶段的长时间病变, 初期是不典型不成熟鳞状化生 (AIM) , 细胞逐渐分化成熟, 呈子宫颈上皮内病变 (CIN) , 包括低级别鳞状上皮内病变 (LSIL) 及高级鳞状上皮内病变 (HSIL) 。在形态学中AIM和CIN的表现相似, 容易导致误诊。但各病变中p16INK4A、CK17蛋白表达情况各不相同, 因此p16INK4A、CK17蛋白的阳性表达率和HPV16/18的检出率对诊断宫颈病变有重要的意义。由本次研究结果显示, AIM组CK17表达阳性率明显高于CIN病变组 (LSIL组+HSIL组) , 且LSIL组和HSIL组阳性率无明显差异;AIM组p16INK4A表达阳性率明显低于CIN病变组 (LSIL组+HSIL组) ;AIM组HPV16/18检出率明显低于CIN病变组 (LSIL组+HSIL组) , 且LSIL组和HSIL组检出率无明显差异。

在宫颈中, CK17主要表达于宫颈储备细胞, 是细胞分化不成熟的标志, 成熟细胞中不会表达, 因此AIM组中阳性率较高, LSIL组和HSIL组阳性率较低。p16INK4A是位于人染色体9p21区的一种抑癌基因, 主要参与细胞周期调节, 阻止细胞从G1期进入S期, 从而抑制细胞增殖。在人正常宫颈鳞状上皮中, 绝大多数上皮细胞呈阴性[4,5], 因此AIM组中阳性率较低, LSIL组和HSIL组阳性率较高。高危型HPV (HPV16/18) 持续感染是宫颈癌及其癌前病变发病的主要危险因素, 感染人体后可以产生癌蛋白E6和E7, 通过E6蛋白与p53结合, E7蛋白与pRb结合, 使p53降解和pRb失活, 从而细胞周期控制失常, 发生癌变[6], 因此AIM组中阳性率较低, LSIL组和HSIL组阳性率较高。综上所述, 在宫颈病变的连续过程中, 可借助CKl7、p16INK4A的表达和HPV16/18的检出率来认识AlM和CIN的细胞分子特征, 同时进行二者的鉴别诊断。

参考文献

[1]丁岚, 杨永国, 梅霞.CKl7和p16在宫颈鳞状上皮不成熟化生和宫颈上皮内瘤变中的表达及意义[J].临床病理学杂志, 2009, 16 (3) :174-175.

[2]徐秋霞, 关红琼.p16INK4A、p14ARF和Ki67在宫颈癌中的表达特点[J].海南医学院学报, 2010, 16 (1) :17-18.

[3]范丽萍, 丁宇, 李静, 等.不同宫颈病变组织HPV6/11、HPV16/18、p53、Ki67表达的临床意义[J].山东医药, 2010, 50 (37) :81-82.

[4]梁艳芳, 胡新荣.HPV和p16INK4A与宫颈癌的关系研究进展掌[J].西南军医, 2009, 11 (4) :731-732.

[5]张松灵, 张立红, 钟艳平, 等.人宫颈癌组织中CK17和P63蛋白的表达及意义[J].吉林大学学报 (医学版) , 2009, 35 (5) :914-915.

HPV16 篇4

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集2005年1月～2011年1月我院普外科乳腺癌患者手术切除标本86例,所有病例均经病理证实为乳腺癌,年龄35～69岁,平均年龄(54.3±13.2)岁,相应病例另取癌旁约1.3 cm非癌乳腺组织作为正常对照。所有病例术前均未行放、化疗或内分泌治疗等其他与肿瘤相关的治疗。

1.2 主要试剂

Trizol为美国分子探针公司产品,RT-PCR和SYBR Green荧光定量检测Real-Time PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 组织总RNA提取及cDNA第1链的合成

取50～60 mg肿瘤或癌旁,液氮中研磨匀浆,加入1 m L Trizol提取细胞总RNA,严格按照试剂盒说明书操作,简述如下:加入0.2 m L氯仿,12 000r/min×15 min,吸取上清,加入0.5 m L异丙醇,12000 r/min×10 min,75%乙醇洗涤沉淀2次,加入DEPC水溶解,紫外分光光度计在260 nm和280 nm处测定细胞总RNA的光密度值(OD),计算样品的纯度和含量,-70℃冻存备用。

反转录合成c DNA第1链:2μg RNA,2μL Olig(dT)15,1 m M dNTP mixture,5 m M DTT,200 u TIANScript M-MLV,40u RNasin,4μL 5×First-Strand Buffer,加DEPC处理灭菌蒸馏水至总反应体系20μL。40℃孵育1 h,95℃孵育5 min中止反应,样品-70℃冻存。

1.4 RT-P CR

PCR反应扩增目的片段:2μL c DNA,0.2μLPrimer F(50μΜ),0.2μL Primer R(50μΜ),12.5μL 2×Taq Plus MasterMix,加ddH2O至总反应体系25μL。

扩增片段:HPV16:Sence:5'-CACGTAGAGAAAC CCAGCTGTAA-3';Antisence:5'-GCAGGATCAGCCA TGGTAGATT-3';P16:Sense:5'-ATATGCCTTCCCCC ACTACC-3',antisense:5'-CCCCTGAGCTTCCCTAGT TC-3';GAPDH:Sence:5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3',Antisence:5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'。

扩增反应条件:94℃预变性4 min,94℃30 s,58℃30 s,72℃1 min,扩增35个循环,最后72℃延伸10 min。100V 1.5%琼脂糖凝胶电泳45 min,凝胶成像仪拍照。

1.5 荧光定量P CR

按照SYBR Green Real-time PCR检测试剂盒说明书操作,使用ABI Prism7500荧光定量PCR仪检测HPV16和P16基因的表达。0.2 m L PCR反应管加入上下游引物,反应条件为:95℃预变性2 min;95℃变性15 s,60℃退火1 min,35个循环。以GAPDH基因作为内参照。Ct值说明基因扩增达到阈值的循环数,故Ct值越小说明该基因的表达就越多,根据内参的Ct值可以计算出△Ct值,△Ct值=目的基因Ct值-内参基因Ct值,△Ct值可以间接反映出目的基因的相对表达水平,△Ct值越小也说明该基因的表达就越多,目的基因的表达量采用2-△Ct评估。

1.6 统计学分析

实验数据连续性资料以均数±标准差(x±s)表示,分类变量用频率表示,应用SPSS12.0统计软件处理数据,两样本均数比较采用t检验,计数资料采用χ2检验,相关关系用Spearman等级相关分析,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 HP V16和P 16基因在乳腺癌及周围正常对照组织中的表达

RT-PCR结果显示86例乳腺癌标本中有54例检出HPV16病毒的感染,占62.8%,癌旁正常对照组织亦有48例检出HPV16病毒的感染,占55.8%,经统计学分析二者之间差异无显著性(P>0.05)。乳腺癌标本中有23例检出P16基因的表达,占26.7%;而癌旁正常对照组织有71例检出P16基因,表达率高达82.6%,统计学分析显示两组之间差异有显著性(P<0.01),见表1及附图。

注:覮与对照组比较,P<0.01

2.2 乳腺癌组织中HP V16和P 16基因表达量的改变

荧光定量PCR结果显示乳腺癌标本中HPV16和P16基因的表达量分别为(0.774±0.162)和(0.247±0.085),而正常对照组织的的表达量分别为(0.451±0.137)和(0.781±0.242),统计学分析显示两组HPV16和P16基因的表达量之间差异有显著性(P<0.01)。

2.3 乳腺癌组织中HP V16和P 16基因表达量与临床病理指标的关系

注:1)不同临床指标两组之间比较,P<0.05;2)不同临床指标两组之间比较,P<0.01

从表2可以看出HPV16和P16基因的表达量在肿瘤有无淋巴结转移和临床不同分期之间差异存在显著性(P<0.05),而在肿瘤的大小之间差异无显著性(P>0.05)。

2.4 乳腺癌组织中HP V16和P 16基因表达的相关性分析

Spearman等级相关分析显示乳腺癌组织中HPV16和P16基因的表达呈负相关(r=-0.614,P<0.01)。

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个逐步的多阶段的过程,与多种基因的活化密切相关。病毒感染导致肿瘤的发生已在多个肿瘤中所证实,例如人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)在宫颈癌、结直肠癌等肿瘤中的恶行转化作用[6,7]。HPV是一个小分子双链闭合环状的DNA病毒,因其与与肿瘤发生、发展的密切关系已成为近年来研究的热点。HPV有一百多个表型,其中约30.0%与性传播疾病有关,根据其恶性转化活性分为低危型HPV和高危型HPV,低危型HPV引起良性乳头瘤样病变,例如HPV6、7;高危型HPV常引起恶性肿瘤的发生,例如HPV16、18、31、33、45,其中HPVl6是临床上最常见的高危型HPV病毒[8]。HPVl6可以表达多种蛋白,其中E6和E7是HPV16病毒发挥恶性转化活性的主要蛋白。因此,本研究设计了扩增E6基因的引物,结果显示乳腺癌组织与正常对照组织表达率之间差异没有显著性,但是荧光定量PCR结果显示两组HPV16病毒E6基因表达量之间差异却存在显著性(P<0.01),说明了HPV16病毒的激活参与了乳腺癌的发生。随后的显示HPV16病毒E6基因的表达水平在乳腺癌组织中会随着淋巴结转移和临床分期的进展而逐渐的增加(P<0.05),提示HPV16 E6基因可以预示乳腺患者的预后。

P16是与细胞周期相关的抑癌基因,cyclin D1与CDK4/6形成复合物磷酸化Rb蛋白,导致Rb蛋白的泛素化降解释放转录因子E2F入核调控蛋白的表达,使细胞周期从G0/G1期过渡到S期,P16可以与INK4形成复合物阻止cyclin D1和CDK4/6复合物对Rb蛋白的磷酸化,起着阻止细胞增殖的作用[5]。本研究结果显示P16基因在正常对照组织的表达率显著高于乳腺癌组织,差异有显著性(P<0.01),并且其表达量与肿瘤淋巴结转移和临床分期密切相关(P<0.05),因此可认为P16基因的失活与乳腺鳞癌的发生有关,并可作为判断肿瘤临床进展的指标。

HPV感染乳腺组织的途径可以是通过血液和淋巴传播或者手的接触传播[9],病毒感染所引起的炎症使组织内的活性氧水平升高,活性氧可以损伤机体的DNA,导致机体的DNA修复概率增加,有利于病毒整合到基因组内部,HPV16的E6或E7基因就有可能整合到P16基因的调控区域抑制P16基因的表达[10,11]。本研究显示在乳腺癌组织中HPV16感染和P16基因的表达之间呈显著的负相关性(r=-0614,P<0.01),暗示了二者之间存在着一定的调控关系,但其具体的调控机制还有待进一步的研究来明确。

综上所述,HPV16感染和P16基因失活在乳腺癌的发生发展中起到一定的作用,可以用于肿瘤的鉴别诊断、临床分级以及判断预后等方面,具有显著的临床意义。

摘要：目的 检测乳腺癌组织中HPV16和P16基因的表达,探讨其相关的临床意义。方法 收集2005年1月～2011年1月该院普外科乳腺癌患者手术切除标本86例,所有病例经病理确诊,对照为癌旁非癌乳腺组织。病变大小、有无淋巴结转移、临床TNM分期分组对照HPV16和P16基因的表达。RT-PCR检测HPV16和P16 mR NA的表达,荧光定量PCR检测HPV16和P16基因的表达量。结果 HPV16基因在乳腺癌组织中的表达率与对照组差异无显著性(P>0.05),但荧光定量PCR结果显示乳腺癌标本中HPV16基因的表达量显著高于正常对照组织(P<0.01)。P16基因在乳腺癌组织中的表达率为明显低于对照组(P<0.01),同时荧光定量PCR检测也显示了P16基因的表达量在肿瘤组织也明显低于对照组织(P<0.01)。HPV16和P16基因的表达量在肿瘤有无淋巴结转移、临床不同分期之间差异存在显著性(P<0.05),但与肿瘤的大小无显著性相关(P<0.05)。相关性分析显示乳腺癌组织中HPV16和P16基因的表达呈负相关(r=-0.614,P<0.01)。结论HPV16感染和P16基因失活在乳腺癌的发生发展中起到一定的作用,HPV16和P16基因的联合检测有可能用于乳腺癌的临床分级以及判断预后等方面。

关键词：乳腺癌,人乳头瘤病毒-16,P16

参考文献

[1]JEMAL A,SIEGEL R,XU J,et al.Cancer statistics,2010[J].CA Cancer J Clin,2011,60(5):277-300.

[2]HUANG MX ZHONG FX,GUO SH,et al.On malignant tumorin young trend analysis[J].Chinese Journal of Postgraduates ofMedicine,2006,29(9):53-54.

[3]KANG JH,SONG KH,JEONG KC,et al.Involvement of Cox-2in the metastatic potential of chemotherapy-resistant breast cancercells[J].BMC Cancer,2011,11:334-346.

[4]KAN CY,LACOPETTA BJ,LAWSON JS,et al.Identification ofhuman papillomavirus DNA gene sequences in human breastcancer[J].Br J Cancer,2005,93(8):946-948.

[5]JUNG JK,ARORA P,PAGANO JS,et a1.Expression of DNAmethyltransferase 1 is activated by hepatitis B Virus X proteinvia a regulatory circuit involving the p16 INK4a-cyclinD1-CDK4/6-pRb-E2Fl pathway[J].Cancer Res,2007(11):5771-5778.

[6]STANLEY MA,PETT MR,COLEMAN N.HPV:from infectionto cancer[J].Biochem Soc Trans,2007,5(6):1456-1460.

[7]GRAY E,PETT MR,WARD D,et al.In vitro progression ofhuman papillomavirus 16 episome-associated cervical neoplasiadisplays fundamental similarities to integrant-associated carcino-genesis[J].Cancer Res,2010,70(10):4081-4091.

[8]WILLIAMS VM,FILIPPOVA M,SOTO U,et al.HPV-DNA in-tegration and carcinogenesis:putative roles for inflammation andoxidative stress[J].Future Virol,2011,6(1):45-57.

[9]MANAVI M,BAGHESTANIAN M,KUCERA E,et al.Papillo-mavirus and c-erbB-2 expression in diseases of the mammarynipple[J].Anticancer Res,2001,21(4):797-801.

[10]WINDER D,PETT M,FOSTER N,et al.An increase in DNAdouble-strand breaks,induced by KU70 depletion,is associatedwith human papillomavirus 16 episome loss and de novo viralintegration events[J].J Pathol,2007,213(1):27-34.

HPV16 篇5

关键词：宫颈上皮内瘤变,P16,Ki-67,人乳头状病毒

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,居女性生殖系统恶性肿瘤的第2位,呈逐年上升趋势。而对于宫颈癌的防治,“三早”是关键,即早预防、早诊断与早治疗,这就要求只有对宫颈癌的早期病变(即宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelical neoplasia,CIN))做出准确的诊断,为临床医生的治疗提供依据。因此,CIN的准确诊断在宫颈癌防治中起到了关键作用。研究表明[1,2],在CIN病变中,多肿瘤抑制因子1(MTS1)基因的蛋白产物P16INK4a(P16)表达随着CIN的级别升高而增高,且与高危型人乳头状病毒(HR-HPV)感染密切相关。我们采用免疫组织化学方法检测P16和增殖细胞核蛋白(Ki-67)在CIN中的表达,分析P16、Ki-67表达与HR-HPV的相关性,探讨其在CIN诊断中的价值,以提高CIN的诊断准确率,避免误诊和漏诊。

1 材料与方法

1.1 材料

选取我院2013年1月—2014年12月活检或手术切除的子宫颈组织标本共360例。其中正常宫颈黏膜上皮60例,CIN 1级100例,CIN 2级100例,CIN 3级100例。患者均经病理明确诊断,标本采集前均未接受放疗、化疗及免疫治疗。

1.2 检测方法

选取标本均用10%中性甲醛固定,常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋,4μm厚度连续切片,常规进行HE染色,光学显微镜下行组织形态学观察,确定病理诊断及分组。P16和Ki-67检测采用免疫组化SP法,全部实验操作严格按照试剂盒说明书进行,一抗工作浓度均是1∶100,以已知阳性片分别做P16和Ki-67阳性对照,以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。鼠抗人P16单克隆抗体、鼠抗人Ki-67单克隆抗体及SP法超敏试剂盒等均为福州迈新生物技术开发公司生产。

采用杂交捕获Ⅱ代(hybrid capture,HC2)法测定对照组及实验组宫颈脱落细胞中HR-HPV DNA。

1.3 结果判断

P16表达于细胞核伴胞质,Ki-67表达于细胞核,阳性表达为细胞核或细胞质内出现棕黄色颗粒,检测结果判定依据切片中阳性细胞着色强度及阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比两项指标,进行半定量判断结果;显色量化指标:无色0分,浅黄1分,棕黄色2分,棕褐色3分;阳性细胞比例量化指标:无阳性细胞0分,阳性细胞所占比例<10%为1分,10%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分;综合判定结果为显色与阳性细胞比例量化指标乘积:0~3分为阴性(-),4或5分为弱阳性(+),6或7分为中度阳性(++),8~12分为强阳性(+++)。HC2检测结果判定标准:阳性者HC2 HPV DNA≥1.0 pg/ml(5 000 copies/ml);阴性者HC2 HPV DNA<1.0 pg/ml(5 000 copies/ml)。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理,所有数据均采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 年龄的分布情况

300例CIN样本中,患者年龄25~74岁,平均年龄43岁,高发年龄在30~50岁;60例正常对照组中,年龄29~75岁,平均年龄45岁;对以上CIN的病理分型均由2位高年资病理医师阅片确定。

2.2 P16、Ki-67在CIN中的表达

CIN组P16、Ki-67阳性表达率明显高于正常对照组,差异有统计学意义(χ2=158,P<0.01;χ2=76.77,P<0.01);P16和Ki-67在宫颈低级别上皮内瘤变(CIN 1级)与宫颈高级别上皮内瘤变(CIN 2、3级)中的表达,经比较,差异有统计学意义(χ2=45.63,P<0.01;χ2=15.09,P<0.01)。见表1。P16在对照组及宫颈低级别上皮内瘤变中呈不连续、片状或斑片状分布,多位于上皮下1/3以内,阳性强度相对弱,见图1。在宫颈高级别上皮内瘤变中呈连续、强阳性表达,见图2。Ki-67在宫颈对照组中,阳性细胞数很少超过10%,而且主要分布在近基底层,见图3。而在宫颈高级别上皮内瘤变中,阳性细胞散在分布于上皮1/3以上至上皮全层,阳性细胞数量多少不等,<10%或>90%均可见到,见图4。

图1 P16在CIN 1级中的表达(SP×200)

图2 P16在CIN 2-3级中的表达(SP×200)

图3 Ki-67在CIN 1级中的表达(SP×200)

图4 Ki-67在CIN 2-3级中的表达(SP×200)

2.3 P16和Ki-67在CIN组中表达的相关性

在CIN组中P16和Ki-67两项指标共同阳性者234例,二者比较差异有统计学意义(χ2=30.72,P<0.01)。见表2。另外,在对照组中P16和Ki-67的阳性表达细胞均在内基底细胞着色,而在CIN组中阳性细胞多弥漫分布,在CIN 3级中阳性细胞可以表达于上皮全层。

2.4 HPV DNA在CIN中的表达

CIN组中HPV DNA阳性表达率明显高于正常对照组,差异有统计学意义(χ2=158,P<0.01);HPV DNA在宫颈高级别上皮内瘤变中的阳性率高于宫颈低级别上皮内瘤变,差异有统计学意义(χ2=9.21,P<0.01)。见表3。

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率有逐年上升和年轻化的趋势。由于宫颈癌存在着一个较长、可逆的癌前病变区,即CIN。因此,CIN的诊断一直受到人们的关注。宫颈细胞学作为CIN的基本筛查方法应用已有50余年历史,在妇女宫颈癌的防治中发挥了重要作用。但由于其取样受检细胞少、敏感性低及假阴性率均较高,使其准确性受到影响。而阴道镜活检组织病理检查是诊断CIN的金标准。但因受到观察者的主观因素与技术水平上的差异,加上病理医生对诊断标准掌握上的差异,往往造成较大差异。因此,期待通过一些特异性标志物的检测来协助病理医生对CIN做出更准确、更客观的诊断。

P16是近年来发现的一种肿瘤抑制基因,它参与细胞周期的调控,控制细胞的生长与分化,直接参与肿瘤的形成与进展。资料表明,P16在宫颈癌和癌前病变中异常表达,而这种表达与宫颈的HR-HPV感染有关[3,4,5]。BENEVOLO等[6]认为P16可作为高级别CIN特异性标志物,其阳性预测值达100%。GALAGANO等[7]认为,P16弥漫强阳性对CIN 3级和CIN 2级高度敏感,但对CIN 1级不敏感。马袁英等[8]研究也显示,随着CIN级别的增高,P16蛋白表达逐渐增强,呈线性相关,提示免疫组织化学检测可作为CIN 3级和鳞癌的一个有价值的标志物。但O’NEILL和MCCLUGGAGE[9]认为,单独应用P16标记不具备100%的特异性和敏感性,只有结合其他标志物的P16阳性这才可以确定诊断。本组资料显示,CIN组中P16阳性表达率明显高于正常对照组,差异有统计学意义;P16在宫颈高级别上皮内瘤变阳性表达率高于宫颈低级别上皮内瘤变,差异有统计学意义。HPV DNA在CIN组中阳性表达率明显高于正常对照组,在宫颈高级别上皮内瘤变中的阳性率高于宫颈低级别上皮内瘤变,差异有统计学意义,提示在HPV阳性CIN组中检测P16可作为辅助诊断CIN的一个有效的生物学标记。

Ki-67是表达于增殖期细胞的核杭原,参与细胞周期的调控,Ki-67主要用于判断细胞的增殖活性,可在除GO期外的活动周期(Gl、S、G2和有丝分裂期)中表达,可全面可靠地反映细胞群体增殖活性。其表达与多种肿瘤的发生发展、浸润转移均有密切联系,因此,被广泛用于评估肿瘤细胞增殖能力。本组资料显示,CIN组中Ki-67阳性表达率明显高于正常对照组,在宫颈高级别上皮内瘤变阳性表达率高于宫颈低级别上皮内瘤变,均表现为差异有显著性。在正常宫颈鳞状上皮中表达限于基底层及副基底层;而在CIN病变中,瘤细胞呈强阳性表达,且伴随病变层次的增加而表达强度和面积增加,能够明确显示瘤细胞在鳞状上皮中所占的比例,协助病变的分级,对临床治疗和预后提出客观的参考依据。与P16相比,Ki-67对CIN 3级和CIN 2级同样敏感,但特异性较差,不能单独用于诊断[10]。本组资料也显示,P16与Ki-67在CIN中的表达呈正相关,提示联合P16与Ki-67检测可以辅助CIN的病理诊断,提高其准确性。

综上所述,CIN是多基因、多因素协同作用所导致的,准确客观地诊断肿瘤和分级对临床进一步治疗以及预后评价是至关重要的。本研究结果显示,在HPV阳性CIN组中联合检测P16和Ki-67,可以辅助CIN的病理诊断,有效区分宫颈低级别上皮内瘤变和宫颈高级别上皮内瘤变,提高CIN的诊断准确率,避免误诊、漏诊。

作者声明本文无实际或潜在的利益冲突

参考文献

[1]ELEUTERIO JJR,GIRALDO PC,GONCALVES AK,et al.Prognostic markers of high-grade squamous intraepithelial lesions:the role of p16INK4a and highrisk human papillomavirus[J].Acta Obstet Gynecol Scand,2007,86(1):94-98.

[2]EGAUER S,REICH O.CK17 and p16 expression patterns distinguish atypical immature squamous metaplasia from high-grade cervica intraepithelial neoplasia CINⅢ[J].Histopathology,2007,50(5):629-635.

[3]BOSCH FX,LORINCZ A,MANOZ N,et a1.The causal relation between human papillomavims and cervial cancer[J].J Clin Path,2002,55(41):244-265.

[4]Sano T,Oyama T,Kashiwabara K,et a1.Expressin status of p16protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential incervical and gential carvinoma[J].Am J Pathol,1998,153(6):1741-1748.

[5]邹先进,蔡兰,刘颖,等.子宫颈癌前病变与子宫颈癌组织中P16I NK4A蛋白检测及其与人乳头状瘤病毒感染的关系[J].中华妇产科杂志,2004,39(9):625-626.

[6]BENEVOLO M,MOTTOLESE M,MARANDINO F,et al.Immunohistochemical expression of p16(INK4a)is predictive of HR-HPV infection in cervical low-grade lesions[J].Mod Pathol,2006,19(3):384-391.

[7]GALGANO MT,CASTLE PE,ATKINS KA,et al.Using biomarkers as objective standards in the diagnosis of cervical biopsies[J].AM J Surg Pathol,2010,34(8):1077-1087.

[8]马袁英,叶枫,陈晓瑞,等.通过子宫颈脱落细胞中p16INK4a的表达预测子宫颈高级别病变的价值[J].中华医学杂志,2010,90(43):3040-3044.

[9]O’NEILL CJ,MCCLUGGAGE WG.p16 expression in the female genital tract and value in diagnosis[J].Adv Anat Pathol,2006,13(1):8-15.

HPV16 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

以我院病理科提供的2008年1月至2013年10月在我院进行治疗的73例宫颈病变患者和30例正常患者的宫颈组织作为研究材料。73份病理性宫颈组织中最终确定为CINⅠ15份, CINⅡ14份, CINⅢ12份, 原位4癌份以及浸润癌28份。分型的确定为我院病理科经验丰富的专家以备份病理组织进行切片和HE染色观察。

1.2 方法

组织芯片技术:对将分析的病理组织分别切片, HE染色, 目标组织标记, 石蜡微阵列设计和打孔, 随后再是将预先备好的目标组织放入已经打孔的石蜡微阵列中, 再是进行切片裱褙于APES预先处理的玻片。原为杂交技术:首先是探针内源性灭活, 待标记探针变性后立即冰冻处理, 随后按照探针和杂交液1∶9比例配置混合后加于标准上, 再将标准进行烘烤, 目的是使RNA变性。然后分别按SSC 2.0倍、SSC 0.5倍、SSC 0.2倍进行充分洗涤, 37℃下放置30 min左右滴加Strep-AP, 再30 min左右通过NBT/BCIP显色。免疫组化:分别将病理切进行脱蜡、水化、抗原修复, 完成后滴加适量双氧水, 再加抗体, 最后加增强剂和酶标, 观察显色反应并记录。

1.3 结果评定

注:与正常宫颈组织比*P<0.05;与CIN相比#P<0.05;与原位癌相比, △P<0.01

将每个标本组织于高倍镜下选定3个视野进行观察, 每视野计数200个细胞。HPV感染阳性判定依据为在视野中观察的细胞其细胞核出现紫蓝色。h TERT、Ki67阳性判断依据为所观察的细胞其核现棕黄色为标准。均以观察的反应细胞出现特定表象占每视野总计数细胞个数>50.00%为 (+++) , 25.00%~50.00%为 (++) , 10.00%~25.00%为 (+) , <10.00%为 (-) 。

1.4 统计学方法

将所有观察数据录入统计学分析软件SPSS19.0进行数据处理与分析。计数资料的比较差异卡方检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义。相关性分析采用Speaman等级相关分析, 以P<0.05为具有相关性。

2 结果

正常宫颈组织、CIN、SCC中与HPV16感染、Ki67、h TERT的表达情况具体见表1。统计学分析发现, 病变宫颈组织中检测出的HPV16阳性率均比正常宫颈组织高 (除CINⅠ以外) , 差异有统计学意义 (P<0.05) 。病变宫颈组织中CINⅡ、CINⅢ、原位癌、宫颈浸润鳞癌的h TERT表达以及Ki67表达与正常宫颈组织中上述两种标志物结果差异均有统计学意义 (P<0.05) 。还有, 浸润鳞癌组织中的h TERT表达量显著高于原位癌组织中的h TERT表达量, 差异具有显著统计学意义 (P<0.01) 。此外, 浸润鳞癌、原位癌的Ki67表达量比正常宫颈组织中的Ki67表达量检测值高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。

病理宫颈组织HPV16感染情况与h TERT、Ki67表达的相关性分析结果具体见表2。结果显示, HPV16感染情况 (阴性和阳性) 与h TERT表达差异具有显著统计学意义 (χ2=11.974, P=0.007<0.01) , 即HPV16阳性患者h TERT表达显著高于HPV16阴性患者, 且HPV16感染情况与h TERT表达情况呈显著正相关关系 (r=0.372, P=0.001<0.01) 。HPV16感染情况与Ki67表达差异也存在统计学意义 (χ2=9.494, P=0.023<0.05) , 而HPV16感染情况与Ki67表达无相关性 (r=0.092, P=0.483>0.05) 。

注:*χ2=11.9 7 4, P=0.0 0 7;r=0.3 7 2, P=0.0 0 1。#χ2=9.4 9 4, P=0.023;r=0.092, P=0.483

hTERT表达与K i 6 7表达的关系分析具体见表3。统计学分析发现, 在病理宫颈组织中h TERT表达与Ki67表达有统计学意义 (χ2=17.869, P=0.037<0.05) , 但相关性分析发现, 这两种标志物在病理宫颈组织中的表达却存在显著正相关关系 (r=0.396, P=0.001<0.01) 。

3 讨论

CIN的发生及SCC的演变可能与HPV16感染有着非常密切的联系[1]。但直接对HPV16感染情况的检测也不足与说明其与CIN的发生有密切的关系。目前较多的研究集中于肿瘤标志物的检测以探讨HPV16感染与CIN发生的关系以及CIN演变为SCC的相关性。

注:*χ2=17.869, P=0.037<0.05;r=0.396, P=0.001<0.01

目前的研究主要认为, 端粒酶的激活与宫颈癌变早期有密切关系, 并且因为在病变后期端粒酶表达更强, 这就可能预示着CIN与SCC的病变过程与端粒酶的激活有关系[2]。而关键的就在于HPV编码的E6蛋白能通过myc与Sp1cis元件激活端粒酶[3]。此外, h TERT与端粒酶的活性相关[4]。那么就可以说一方面E6蛋白激活端粒酶, 另一方面h TERT可决定端粒酶的活性。也就是说端粒酶激活是诱导宫颈组织细胞发生变化的直接因素[5], 而这个因素的源头就是HPV。CIN进一步发展演变为SCC, 在这个过程中Ki67的检测就十分有意义, 因为Ki67能衡量细胞的增生程度。也就是说通过Ki67表达水平的检测, 能有效判断细胞的癌变进展情况。本研究标准结果显示, 各型病变宫颈组织检出的HPV16阳性均比正常宫颈组织偏高, 也能说明宫颈病变一定与HPV16感染存在关联。此外, 除CINⅠ以外其他各型病变宫颈组织的h TERT水平与Ki67水平均比正常宫颈组织高, 也就是说通过检测病变组织中h TERT水平与Ki67水平对判断宫颈癌的发展有重要的参考意义。

综合分析, 可以认为HPV16感染是导致CIN发生的重要因素。通过检测组织Ki67、h TERT水平有助于判断病变的发展情况和预后的判断。参考文献

参考文献

[1]Wolf JK, Ramirez PT.The molecular biology of cervical cancer[J].Cancer Invest, 2001, 19 (6) :621-629.

[2]Nagai N, Oshita T, Murakami J, et al.Semiquant it ative analysis of telomerase activity in cervical cancer and precancerous lesions[J].Oncol Rep, 1999, 6 (2) :325-328.

[3]Oh ST, Kyo S, Laimins LA.Telomerase activation by human papillomavirus type 16 E6 prot ein:induction of human telomerase reverse transcriptase expression through Myc and GC-rich Sp1binding sites[J].J Virol, 2001, 75 (12) :5559-5566.

[4]Veldman T, Horikawa I, Barrett JC, et al.Transcriptional activation of the telomerase h TERT gene by human papillomavirus type 16E6 oncoprotein[J].J Virol, 2001, 75 (9) :4467-4472.

HPV16 篇7

1资料与方法

1. 1一般资料选择2011年5月至2013年7月, 重庆市妇幼保健院确诊的CIN患者177例为研究组, 其中CINⅠ32例, CINⅡ53例, CINⅢ 92例, 采用宫颈环形电切术 ( loop electrosurgical excision procedure, LEEP) 治疗或冷刀锥切。选择同期因良性病变行全子宫切除的宫颈正常患者42例为对照组, 所有患者在行手术治疗前均采用第二代杂交捕获法 ( hybrid captureⅡ, HC-2) 检测宫颈分泌物中HR-HPV病毒载量。入选病例既往均无放疗、化疗及激素或宫颈局部物理治疗史, 排除妊娠及合并免疫系统疾病等。所有病例按照李玉林主编第6版 《病理学》进行组织学诊断。研究组患者年龄21 ~ 54岁, 平均年龄33. 36±6. 73岁, 对照组患者年龄31 ~ 52岁, 平均年龄40. 48±5. 51岁, 两组间年龄比较差异无统计学意义 ( P>0. 05) 。

1. 2研究方法

1. 2. 1免疫组织化学方法采用S-P二步法检测P16蛋白, 所有石蜡标本4 μm切片备用, 染色步骤严格按照试剂盒说明书操作, 以PBS代替一抗作阴性对照, 乳腺癌组织切片为阳性对照。即用型抗体及SP试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

1. 2. 2 HC-2法检测采用HC-2法检测HR-HPV病毒载量, 所有标本由专业妇产科医师以专用细胞采集器采取, 定量检测13种HPV-DNA含量 ( 包括HPV16、18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型) 。主要检验试剂包括裂解液、HPV Probe b、DR1 ( detection reagent 1) 、 DR2 ( detection reagent 2) 及主要实验仪器基因杂交信号扩大仪DML2000均购自美国Digene公司。

1. 3结果判定标准

1. 3. 1 P16蛋白表达P16阳性细胞为胞核和 ( 或) 胞浆出现棕黄色颗粒。参照文献[4]半定量方法, 按照染色强度及阳性细胞百分率进行评分后分级, 其表达强度从低到高共分为4级: 无表达 ( -) ; 弱表达 ( +) ; 中等表达 ( ++) ; 强表达 ( +++) 。

1. 3. 2 HR-HPV病毒载量以每份检测样本的相对发光单位 ( relative light unit, RLU) 与标准阳性对照临界值 ( CO) 的比值 ( RLU/CO) 表示样本中HPV-DNA含量[5], 检测值≥1为阳性, 参照文献[4]将HR-HPV病毒载量由低到高分为5级: 阴性、低载量、中低载量、中高载量及高载量。

1. 4统计学方法采用SPSS 11. 0统计软件进行分析, 计数资料采用卡方检验, 两者相关性检验采用Spearman等级相关分析, 以P<0. 05为差异有统计学意义。

2结果

2. 1 P16蛋白表达情况正常宫颈组织中仅基底层和旁基底细胞层可见少量P16阳性细胞, 着色浅, 表层细胞无表达。在CIN组织中, P16阳性细胞分布范围与病变细胞相关性明显, 随着病变级别的增高, P16阳性细胞增多, 染色强度增强。P16蛋白在正常宫颈及不同级别CIN组织中的表达情况见表1。

将病变级别与其对应的P16评分进行Spearman等级相关分析, 结果表明CIN级别与P16蛋白表达二者之间呈正相关性 ( rs= 0. 3633, P<0. 01) 。

2. 2 HR-HPV病毒载量情况从正常宫颈、CIN Ⅰ、 CINⅡ到CINⅢ, 宫颈组织中HR-HPV阳性率逐渐增高, 差异有统计学意义 ( χ2= 81. 50, P <0. 01) 。在不同级别CIN组织中, HR-HPV病毒载量分别呈正态分布, 并随病变级别增高, 病毒载量中位数呈增高趋势, 但病毒载量与病变级别之间无相关性 ( rs= 0. 1412, P > 0. 05) 。见表2。

2. 3 P16蛋白表达与HR-HPV病毒载量的关系在不同级别CIN组织中, P16蛋白表达强度随HR-HPV病毒载量增加而增强, 经Spearman等级相关分析, 二者之间呈正相关性 ( rs= 0. 4781, P<0. 01) 。

3讨论

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一, 近年来, 我国宫颈癌发病呈上升趋势[6]。研究表明, HR-HPV持续感染是宫颈癌发生的必要条件。针对人群HPV感染开展的流行病学调查是目前研究热点, 检测HPV的方法主要有: 聚合酶链式反应 ( PCR) 技术、杂交捕获技术、基因芯片导流杂交技术等。美国食品药物管理局 ( FDA) 于2003年批准HC-2检测用于30岁以上妇女人群的宫颈癌筛查, 其阴性预测值高, 敏感性高, 但特异性低[7]。随着对HPV自然病程的研究逐渐加深, 认为80% 以上的HPV感染可在2年内自行清除, 仅5% ~ 10% 发展为持续性感染[2], 但目前尚缺乏有效的检测手段来预测哪些人群可能发展为持续感染甚至进展为宫颈癌。

我国是世界上HPV感染率较高的国家之一, 人群感染率约为15%[8]。尽管大部分HPV感染不需要治疗, 但HPV检测阳性的妇女会有明显的焦虑抑郁。 HPV病毒载量的增加早于宫颈细胞学改变, Ylitalo等[9]的研究认为, 在宫颈癌确诊前10年表现出HPV病毒高负荷量者患病的危险性较HPV阴性者高至少30倍。但病毒载量与宫颈病变严重程度的关系存在争议。近年的研究认为, 尽管随着宫颈病变程度增加, HPV阳性率增加, 但HPV-DNA病毒载量并不与宫颈病变程度呈正比[10]。我们的研究也表明, 随着宫颈病变程度增加, HR-HPV阳性率逐渐增高, 差异有统计学意义 ( χ2= 81. 50, P<0. 01) , 但HR-HPV病毒载量并不呈单向递增趋势, 病毒载量与病变级别之间无相关性 ( P>0. 05) , 而是随病变级别增高, 各组中病毒载量中位数呈增高趋势, 提示高病毒载量对发生宫颈癌前病变有警示作用, 但不能作为临床治疗的依据。 因此, 寻找简便有效的分子标记物预测HPV感染患者的预后, 在避免过度治疗的同时减少漏诊, 对临床诊疗方案的选择具有极其重要的意义。

P16基因又称多肿瘤抑制基因MTS1、CDKN2或INK4I, 定位于人染色体9p21, 编码P16蛋白, 通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶 ( cyclin dependent kinase, CDK) 对细胞周期起负调控作用。研究表明, 宫颈组织中P16的强阳性表达往往提示HPV在宿主细胞中的整合[11]。本研究中, 随着宫颈病变级别的增高, P16阳性细胞增多, 且染色加深, P16蛋白表达强度和HR-HPV病毒载量呈正相关性 ( rs= 0. 4781, P <0. 01) , 且与CIN病变级别呈正相关性 ( rs= 0. 3633, P < 0. 01) , P16蛋白过度表达显示了HR-HPV感染后导致宿主细胞发生变异, 提示P16可作为宫颈癌变程序启动的重要分子生物学标志, 其用于宫颈癌前病变的早期诊断具有较高的临床价值。

国外已有学者将P16免疫组化染色检查方法成功地应用于宫颈细胞学[12], 认为其诊断高级别宫颈癌前病变的敏感性及特异性皆较高, 我们也正在开展更大样本量的相关临床研究, 随着宫颈细胞学检查的日益普及, P16有望成为用于宫颈细胞学异常和HPV阳性人群分流的敏感指标。

参考文献

[1]Moyer AV, LeFevre ML, Siu AL, et al.Screening for cervical cancer:U.S.preventive services task force recommendation statement[J].Ann Intern Med, 2012, 156 (12) :880-891.

[2]刘从容.HPV感染的宫颈病理学进展[J].现代妇产科进展, 2011, 20 (5) :337-339.

[3]Eleuterio J Jr, Giraldo P C, Goncalves A K, et al.Prognostic markers of high-grade squamous intraepithelial lesions:the role of p16INK4a and high-risk human papillomavirus[J].Acta Obstet Gynecol Scand, 2007, 86 (1) :94-98.

[4]杨君, 王彬, 周德平, 等.Ⅰ级宫颈上皮内瘤变中HPV病毒载量与P16蛋白表达的相关性及预后意义[J].第三军医大学学报, 2012, 34 (15) :1556-1559.

[5]易为, 王建六, 李杏红, 等.高危型HPV负荷量与宫颈上皮内瘤样变级别、Ki-67和P16~ (ink4a) 表达的关系及随访观察[J].癌症, 2008, 27 (5) :520-524.

[6]李霓, 郑荣寿, 张思维, 等.2003~2007年中国宫颈癌发病与死亡分析[J].中国肿瘤, 2012, 21 (11) :801-804.

[7]张友忠.HPV的检测方法及利弊[J].现代妇产科进展, 2011, 20 (5) :339-341.

[8]李霓, 代敏.中国妇女人乳头状瘤病毒感染的多中心横断面研究[J].中华疾病控制杂志, 2008, 5 (12) :411-415.

[9]Ylitalo N, Sorensen P, Josefesson AM, et al.Consistent high viral load of human papillomavirus 16 and risk of cervical carcinoma in situ:a nested case-control study[J].Lancet, 2000, 355 (9222) :2194-2198.

[10]黄国琴.人乳头瘤病毒负荷量与宫颈病变程度的相关性研究[J].中国妇幼保健, 2012, 27 (30) :4707-4709.

[11]Samir R, Asplund A, Tot T, et al.High-risk HPV infection and CIN grad correlates to the expression of c-myc, CD4+, FHIT, E-cadherin, Ki-67, and P16ink4[J].Low Genit Tract Dis, 2011, 15 (4) :280-286.