mTOR

mTOR（共4篇）

mTOR 篇1

肝癌包括原发性肝癌和转移性肝癌两种,一般多指原发性肝癌。原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,死亡率较高,发生发展受细胞内多条信号传导通路的精密调控[1,2]。PI3K/Akt/mTOR通路是一条调节细胞生长和存活的重要通路[3],在许多肿瘤中,这条通路的组成部分失调,使得癌细胞无限制地生长、繁殖并逃避凋亡,从而促进了肿瘤的发生[4,5,6]。针对该通路已经存在一系列的药物,这些药物有的是从天然物质中提取的,有的则是在提取物的基础上修饰加工而成的,有的是直接根据天然物的核心成分人工合成的[7]。

AZD8055是最新研发出的一种口服ATP竞争性m TOR激酶抑制剂。对m TOR活性具有很强的抑制作用和选择性[8,9]。前不久,AZD8055治疗复发性胶质瘤已被美国FDA批准应用,针对其它多种肿瘤也已进入一、二、三期临床阶段[10,11,12]。在科研领域,对AZD8055的研究主要局限于神经系统肿瘤,但在消化系统肿瘤中尚未见报道。因此,本研究利用最常用的人肝癌细胞系HepG2作为实验材料,研究新型m TOR抑制剂AZD8055对肝癌的潜在治疗作用及机制,具有一定的创新性,为AZD8055在消化道尤其是肝癌的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2细胞由本实验室提供,AZD8055购自美国Sigma公司,MTT购自美国Hyclone公司,细胞周期检PI检测试剂盒与TUNEL凋亡检测试剂盒购自南京凯基,抗体均购于美国Jackson公司。

1.2 MTT法测定细胞活力

将HepG2细胞按5×103个/孔接种于96孔板,24 h后更换培养基,实验分为四组,分别在三个孔中加入DMEM稀释的AZD8055,使其终浓度为10 nM。以未加药组为对照。每组共设置三个平行孔,置于5%二氧化碳37℃培养箱中分别培养12、24、48 h。终止培养前4 h加20μL的MTT于各孔中,然后吸去培养液,加入150μL DMSO后室温振荡10 min,490 nm波长下测定各孔A值,对结果进行统计学分析。

1.3 TUNEL法检测细胞凋亡

将HepG2细胞以1×104个/孔接种于事先放置无菌玻片的24孔板,24 h加药使终浓度为10nM。以未加药组为对照。取出玻片,PBS漂洗2次。用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗1次后自然风干。将玻片置于于冰上,加入含0.1%TritonX-100、0.1%枸橼酸钠的渗透液,浸润5 min,PBS洗3次。滴加50μL TUNEL反应液(45μL TdT反应液+5μL荧光素标记的dUTP),37℃水浴共孵60min。用中性树胶封片。利用荧光显微镜,在450～500 nm波长范围激发荧光,并以细胞核出现强烈荧光作为判断TUNEL阳性细胞的标准。

1.4 细胞周期检测

用浓度为10 nM的AZD8055分别处理HepG2细胞12、24和48 h,胰蛋白酶消化收集细胞,体积分数70%的乙醇固定24 h,细胞周期试剂4℃避光孵育30 min,上流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.5 免疫印迹法

用浓度为10 nM的AZD8055分别处理HepG2细胞12、24及48 h,预冷PBS洗3次,细胞裂解液充分裂解细胞,离心收集上清,BCA试剂盒测总蛋白浓度。常规质量分数10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、一抗4℃孵育过夜、TBST洗膜、二抗室温孵育1 h、TBST洗膜,然后化学发光法检测目的蛋白表达情况。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17统计软件进行统计学分析,计算用均数±标准差表示。比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结果

2.1 AZD8055对Hep G2细胞生长的影响

用浓度为10 nM的AZD8055分别处理HepG2细胞12、24及48 h后,细胞存活率随着作用时间的延长而减少(图1)。

1)与对照组比较,P<0.05;2)与对照组比较,P<0.01

2.2 TUNEL法检测细胞凋亡

AZD8055对细胞进行处理后,HepG2的细胞凋亡水平明显提高,且细胞凋亡的增加与AZD8055作用时间的延长呈正相关性,即作用时间越长,细胞凋亡水平越高(附表)。这说明,AZD8055对HepG2的细胞凋亡有一定的促进作用,提示这种m TOR抑制剂可能通过促进肝癌细胞的凋亡,从而抑制肝癌细胞的增殖。其中A为阴性对照组,B-D分别为处理12、24及48 h组。

(x±s)

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与对照组比较,P<0.01

2.3 AZD8055对Hep G2细胞周期的影响

用10 nM的药物分别处理细胞12、24及48 h后,与对照组细胞相比,药物作用组G0/G1期的细胞明显增多,而S期和G2/M期的细胞相应减少(图2)。

2.4 AZD8055对信号通路中关键激酶下游靶蛋白磷酸化水平的影响

经10 nM AZD8055分别处理12、24及48 h后,AKt和S6K的磷酸化水平随作用时间的延长逐渐下降(图3)。

1)与对照组比较,P<0.05;2)与对照组比较,P<0.01

3 讨论

PI3K/Akt/mTOR信号转导途径因在多种恶性肿瘤中检测到其调节失常而在肿瘤研究中备受关注[13]。该通路的活化在肿瘤的形成中扮演着重要角色,并参与肿瘤的侵袭和转移甚至耐药的发生[14]。因此,研究信号通路的特异性抑制剂对癌症的临床治疗具有重要的意义。AZD8055是最新研发出的一种口服ATP竞争性m TOR激酶抑制剂,对m TOR活性具有很强的抑制作用。目前,关于AZD8055对肝癌的治疗效果尚未见报道。

本研究结果显示:AZD8055对HepG2细胞有明显的生长抑制作用,而且具有时间依赖性,说明AZD8055在肝癌细胞中有明显的抗肿瘤活性;随着AZD8055作用时间的延长,HepG2的细胞凋亡明显增加,且细胞凋亡率与时间呈一定的正相关性。可见,AZD8055促进HepG2的细胞凋亡;AZD8055的生长抑制作用主要是把HepG2细胞阻滞在G0/G1期;AZD8055处理HepG2细胞后,抑制了磷酸化的AKt和S6K的表达,且随着时间的延长,磷酸化水平降低,说明AZD8055特异性抑制PI3K和m TOR两种激酶的表达。

总之,本研究利用多种分子生物学方法探索了m TOR抑制剂AZD8055对人肝癌细胞系HepG2的治疗作用,并初步探索了其分子机制,为AZD8055应用于肝癌的临床治疗提供了理论基础。

摘要：目的 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂AZD8055抗肝癌活性及其作用机制。方法 分别采用MTT法和流式细胞术测定AZD8055对HepG2肝癌细胞生长和细胞周期的影响;用TUNEL染色检测细胞凋亡;通过免疫印迹法检测信号通路中关键激酶下游靶蛋白磷酸化水平变化。结果 AZD8055对HepG2细胞有明显的生长抑制作用,且随着作用时间的延长,细胞增值率逐渐降低,细胞凋亡率逐渐增加;其生长抑制主要是阻滞G0/G1期。AZD8055下调蛋白激酶B(AKt)和核糖蛋白S6激酶(S6K)的磷酸化水平。结论 AZD8055对人肝癌细胞HepG2的生长具有显著的抑制作用。

关键词：AZD8055,肝癌,细胞生长,细胞凋亡

mTOR 篇2

多发性硬化 (Multiple sclerosis, MS) 是一种慢性自身免疫性疾病, 累及中枢神经系统, 由神经炎症引起脱髓鞘和神经退行性变, 导致感觉、运动、认知和情感障碍等[1]。在大多数患者中, 早期通常为间歇性MS (replasing-remitting MS) , 数年后约15%发展为继发性进展型MS (secondary progressive MS) [2]。继发性进展型MS的特征为由神经退行性变引起的重度运动损害和痉挛等不可逆的临床缺陷。炎症和脱髓鞘直接引起轴突损伤, 导致神经退行性变[3]。

1.1 治疗现状

目前对MS的治疗方案包括抗炎、免疫调节或免疫抑制治疗, 以及克拉屈滨 (cladribine) , 阿仑单抗 (alemtuzumab) 和利妥昔单抗 (rituximab) 等新药, 对疾病早期阶段具有一定疗效, 但对于进展期MS患者则效果有限[4]。这些治疗方案的局限性可能在于无法有效作用于MS中的某些炎性成分, 而炎性成分在MS进展期极为活跃, 如小胶质细胞和树突状细胞 (Dendritic cell, DC) [5];此外, 进展期MS患者的血脑屏障下也存在区域化的炎性细胞, 而大多数药物不能有效通过血脑屏障, 因此无法对这些细胞发挥作用[6]。介于上述原因, 需要更早期和更为主动的免疫调节或免疫抑制治疗, 从而对MS实现早期干预, 延缓疾病进展, 这就需要发现能够有效通过血脑屏障、并且对固有免疫和适应性免疫系统均有作用的药物。

1.2 研究进展

实验性自身免疫性脑脊髓炎 (Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 是广泛应用于T细胞介导的中枢神经系统脱髓鞘研究的动物模型, 能够用于研究MS的疾病机制及治疗手段。通过利用髓鞘抗原 (如髓鞘碱性蛋白 (myelin basic protein, MBP) 、蛋白脂质蛋白 (proteolipid Protein, PLP) 、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG) ) 对动物进行免疫, 或给予髓鞘反应性T细胞, 可以建立EAE动物模型。EAE模型能够呈现间歇性EAE和慢性EAE, 分别模拟间歇性MS和原发性进展型MS。慢性EAE模型与间歇性EAE模型的病理表现的主要区别在于:与间歇性EAE相比, 慢性EAE模型出现持续加重的髓鞘丢失、轴突损伤等病变, 以及趋化因子、细胞因子表达升高, 对髓鞘抗原特异性的CD8+T细胞也更多[7]。

2 mTOR

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR) 是一种保守的丝/苏氨酸蛋白激酶, mTOR属于磷脂酰肌醇3激酶 (PI3K) 家族, 在细胞生长和代谢调节中发挥重要作用, 目前已知以mTor为核心可形成两种不同的蛋白复合体:mTORC1和mTORC2[8]。

mTORC1特有mTOR调节相关蛋白 (regulatory-associated protein of mTOR, Raptor) 和40kD的富含脯氨酸的AKT底物 (proline-rich AKT substrate of 40 kda, PRAS40) [9], mTORC1可被激素、细胞因子和生长因子等通过不同受体激活, 同时也受其上游的AMP激酶 (AMP kinase, AMPK) -结节性硬化复合体2 (tuberous sclerosis complex 2, TSC2) 信号调控, mTORC1主要通过调节其下游的4E结合蛋白1 (4E-BP1) 和核糖体S6蛋白激酶1 (ribosomal S6 protein kinase 1, p70S6K) 调控转录过程, 从而实现对细胞生长和代谢的调控[10];mTORC2特有雷帕霉素非敏感性蛋白伴侣 (rapamycin-insensitive companion of mTOR, rictor) 和应激活化的蛋白激酶相互作用蛋白1 (stress-activated protein kinase-interacting protein 1, Sin1) [11], 主要介导AKT的473位丝氨酸磷酸化[12], 从而调控细胞对营养物质的摄取[13]、细胞骨架形成[14]等过程。

m TOR对细胞代谢的调控能够直接影响T细胞的增殖、分化和功能[15], 雷帕霉素等mTOR抑制剂则能够显著抑制T细胞的增殖[16]。

3 m TOR抑制剂在EAE中的神经保护作用

通过抑制m TOR, 能够抑制CD4+效应T细胞分化, 促进Treg细胞生成, 并且直接作用于中枢胶质细胞产生抗炎作用, 这些作用对于MS的治疗具有重要意义。

早在1977年, Martel等[17]就发现mTOR的强力抑制剂雷帕霉素 (rapamycin) 能够完全阻遏EAE的进展, 这可能与雷帕霉素对外周免疫系统的作用有关。在用小鼠脊髓和结核分枝杆菌匀浆进行免疫的EAE模型中, 雷帕霉素单用或与1, 25-二羟基维生素D3合用均显著降低了病变的严重程度[18]。在慢性EAE小鼠模型中, 雷帕霉素能够延缓临床症状的发生[19], 同时处理组小鼠的T细胞对于MOG35-55的反应性降低[20]。

此外, 雷帕霉素还能够抑制间歇性EAE的发生和进展, 这可能是通过抑制效应T细胞的作用以及增加Treg细胞的比例而实现的[21]。在另一项研究中, 在间歇性EAE小鼠出现临床症状后, 通过口服给予雷帕霉素3mg/kg共28天, 治疗组小鼠的症状和组织病理学改变明显较对照组轻, 其脾脏Treg细胞比例上升, 而脾脏CD8+T细胞则减少[22]。

Delgoffe等[23]特异性敲除T细胞中的Rheb, 发现m TORC1参与Th1和Th17的分化, 另外, 利用MOG35-55免疫的T-Theb-/-小鼠的病变较对照组更轻, 其脊髓白细胞浸润以及Th1和Th17克隆扩增减少[23], 这些发现表明mTORC1的选择性敲除促进Th2分化。而特异性敲除m TORC2的T细胞仍具有分化为Th1和Th17的能力, 但不能分化为Th2细胞[23]。Procaccini等[24]在EGFP-Foxp3小鼠中的研究发现, 在给予小鼠自身抗原免疫前12h, 用雷帕霉素处理EGFP-Foxp3小鼠能够通过促进Treg细胞增殖从而改善小鼠的临床症状。

上述研究表明, mTOR在EAE的发生、维持和进展中起着重要作用, 而mTOR抑制剂雷帕霉素则能够延缓和改善相应症状。

雷帕霉素对于EAE的治疗作用可能是由于其能够穿过血脑屏障, 并且作用于中枢胶质细胞而起到的抗炎作用。然而, 雷帕霉素对于反应性星形胶质细胞的活性却没有显著影响[25], 研究发现, 雷帕霉素处理小鼠的胼胝体脱髓鞘情况有明显改善, 这可能是小胶质细胞炎性反应减轻和雷帕霉素作用的结果[20]。这种髓鞘保护作用可能与EAE动物症状改善有关。

神经病理性痛是MS患者常见的也是最难治的症状, 而雷帕霉素能够减轻这一症状[26]。雷帕霉素能够提高感觉阈值, 从而减少MS中的触诱发痛[20]。

4 小结

mTOR 篇3

关键词：mTOR,p70S6K,上皮性卵巢癌

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一, 发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位[1]。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位, 对妇女生命造成严重威胁[2], 明确其发病机制, 可为有效治疗卵巢上皮癌提供帮助。雷帕霉素靶蛋白 (m TOR) 是近年来研究的一种丝/ 苏氨酸蛋白激酶, 其可通过整合能量状态, 激素、细胞、氨基酸、细胞氧化应激等信号, 通过影响蛋白质的合成, 调节细胞生长、增殖、凋亡、自噬等多个生物学过程[3]。p70S6 激酶 (p70S6K) 作为m TOR蛋白的下游底物, 被磷酸化的m TOR激活后可以调控细胞内p70S6Km RNA的翻译[4]。研究表明, m TOR/p70S6K信号通路的激活与乳腺癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关[5], 但m TOR/p70S6K信号通路是否在上皮性卵巢癌组织中有表达, 国内外尚无相关报道。本研究拟探讨m TOR/p70S6K信号通路在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义, 为卵巢上皮癌的治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料采用天津市中心妇产医院2011 年1-6 月手术标本共120 例, 其中包括正常卵巢组 (Ⅰ组) 、上皮性良性卵巢肿瘤组 (Ⅱ组) 、上皮性卵巢癌组 (Ⅲ组) , 每组各40 例。所有病例为初发, 术前未行任何治疗且肝肾功能正常, 无合并妊娠或近期妊娠史。上皮性卵巢癌组患者年龄为35~70 岁。按国际妇产科联盟FIGO分期2009 年标准:Ⅰ~Ⅱ期14 例, Ⅲ~Ⅳ期26 例。腹膜转移27 例, 无腹膜转移13 例。组织学分级 (世界卫生组织WHO, 2003) :G1 级12 例, G2 级17 例, G3 级11 例。病理类型:浆液性腺癌22 例, 黏液性腺癌18 例。均取卵巢癌原发灶组织进行试验。40 例上皮性良性卵巢肿瘤标本均为同期在该院手术获得。对照组为随机选取的同期围绝经期女性因子宫肌瘤接受手术要求切除双附件治疗获得的正常卵巢组织标本, 共40 例。标本离体5min内经液氮速冻后置-80 ℃冰箱保存备用, 所有组织用10% 甲醛固定, 常规石蜡包埋。术后进行随访至2015 年6 月1 日。

1.2 试剂BIOZOL总RNA提取试剂盒 (杭州博日科技有限公司) , BIORT逆转录扩增试剂盒 (杭州博日科技有限公司) , m TOR引物 (上游引物批号02116, 下游引物批号02117) 、p70S6K弓I物 (上游引物批号02118、下游引物批号02119) 以及B.actin内参引物 (上游引物批号37496、下游引物批号37495) 均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品, 焦碳酸二乙脂 (DEPC, BBI公司, 批号DB0154) 溴化乙锭 (EB, Ta Ka Ra公司) 琼脂糖, 无水乙醇, DNAMark (DL2000, Ta Ka Ra公司) , Gene Amp 5700 型PCR仪 (美国应用生物系统公司) , 凝胶电泳成像系统 (Transilluminator公司) , 紫外分光光度计 (Cary-50) (澳大利亚Varian公司) 。

1.3 免疫组化染色检测m TOR、p70S6K在上皮性卵巢组织中的表达参照文献[6] 采用SP法进行免疫组化染:每批染色均设阴性对照。阴性对照采用磷酸盐缓冲液 (PBS) 代替一抗。以细胞质出现黄色或棕黄色颗粒者为阳性细胞, 根据阳性细胞所占百分比及阳性细胞染色强度进行评分, 具体如下, (1) 阳性细胞所占百分比评分:无阳性细胞者记0 分, ≤ 5% 者记1 分, >5%~25% 者记2 分, >25%~50% 者记3 分, >50% 者记4 分; (2) 染色强度评分:未着色记0 分, 淡黄色记1 分, 黄色记2 分, 棕黄色记3 分;两种评分相加为总分:总分0~1 分为阴性 (-) , 2~3 分为弱阳性 (+) , 4~5 分为中等阳性 (++) , ≥ 6 分为强阳性 (+++) 。 以+~+++ 为阳性标本, 计算阳性表达率。

1.4反转录 (RT) -PCR法测m TOR、p70S6Km RNA的表达按BIOZOL总RNA提取试剂盒说明进行提取组织总RNA, 逆转录合成c DNA按BIORT逆转录扩增 (RT-PCR) 试剂盒说明进行, 引物设计参考文献[7], m TOR上游引物为5’-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3’, 下游引物为5’-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3’, 共537 bp, p70S6K上游引物为5’-TACTTCGGGTACTTGGTAA-3’, 下游引物为5’-GATGAAGGGATGCTTTACT-3’, 共188 bp, 内参选用β-actin:上游引物为5’-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3’, 下游引物为5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’, 共302 bp, 反应总体积25μL.10×PCR Buffer 2.5μL, d NTPMixture (10 mmol/L) 0.5μL, 每管加入m TOR上下游引物或者p70S6K上下游引物各0.5μL, 上下游内参各0.5μL, Taq mix DNA polymerase0.5μL, RT产物2.5μL, dd H2O 17μL。PCR反应条件:94℃3 rain预变性:94℃30 s, 60℃30 s和72℃90 s, 共经过35个循环反应。所得PCR产物在含溴化乙锭的1.5 g/L的琼脂糖凝胶中电泳分离, 然后用凝胶成像系统分析结果。

1.5随访以电话或来院复查形式对40例卵巢癌患者进行随访, 随访始于卵巢癌确诊后, 随访截止时间为2015年6月, 随访时间为1~50个月 (中位随访时间25个月) 。

1.6 统计学处理采用SPSS 19.0 统计学软件进行分析, 计量资料用 (±s) 表示, 随机区组设计的计量资料采用单因素方差分析, 重复测量设计的计量资料采用重复测量设计的方差分析, 计数资料以率 (%) 表示, 比较采用字2检验或Fisher确切概率法、最小显著差数法 (LSD) 检验。用Kaplan-Meier法计算生存率, 对生存率曲线比较采用log-rank法进行显著性检验, 以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色检测m TOR、p70S6K在上皮性卵巢组织中的表达从免疫组化染色检测结果可以看出, m TOR蛋白定位于胞浆, p70S6K蛋白定位于细胞核, 在Ⅰ组卵巢组织中表达很低, Ⅱ组卵巢组织中表达次之, 而在Ⅲ组卵巢组织中却高表达。Ⅰ组患者卵巢组织中m TOR、p70S6K蛋白的阳性率表达分别为2.5%、2.5%, Ⅱ组患者卵巢组织中m TOR、p70S6K蛋白的阳性率表达分别为12.5%、20.0%, Ⅲ组患者卵巢浆液性腺癌组织中m TOR、p70S6K蛋白的阳性率表达分别为45.5%、59.1%, 黏液性腺癌组织中m TOR、p70S6K蛋白的阳性率表达分别为66.7%、61.1%, 详见图1~2、表1。

2.2 反转录 (RT) -PCR法测m TORm RNA、p70S6Km RNA的表达与Ⅰ组比较, Ⅱ组、Ⅲ组的m TORm RNA、p70S6Km RNA的表达增加, 与Ⅱ组比较, Ⅲ组m TORm RNA、p70S6Km RNA的表达增加, 见表2。

2.3 m TOR、p70S6K蛋白表达与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系非参数分析显示, 上皮性卵巢癌组织中m TOR、p70S6K蛋白表达水平与手术病理分期 (P=0.039、0.022) 和病理分级 (P=0.047、0.037) 相关, 与患者年龄、病理类型、腹膜转移均无关 (P>0.05) , 见表3。

2.4 m TOR、p70S6K蛋白的表达水平与上皮性卵巢癌患者预后比较单因素生存分析显示, m TOR、p70S6K蛋白的表达阴性与阳性的总生存时间比较, 差异有统计学意义 (P=0.021) , 见图3。

3 讨论

目前, 卵巢恶性肿瘤死亡率居妇科恶性肿瘤的首位, 上皮性卵巢癌约占90%, 所以上皮性卵巢癌成为最受关注的妇科恶性肿瘤之一, 其发生发展非常隐匿, 通常患者没有特异性症状, 仅到病情发展到一定程度才呈现出腹胀、腹部包块等症状和体征。因此多数患者确诊时已属晚期, 手术和辅助治疗的效果不理想, 预后差, 5 年生存率低[8]。所以有必要了解卵巢癌发生发展的机制, 为寻找遏制肿瘤细胞的致瘤能力的方法奠定基础。目前, 信号传导系统的缺陷和异常活化与肿瘤发生、发展及预后的关系已成为肿瘤分子生物学的研究热点, 同时通过干预信号传导途径治疗肿瘤也成为生物治疗的新兴领域。

m TOR是一种编码2549 个氨基酸的丝/ 苏氨酸蛋白激酶, 分子量约289 k Da, 其C末端与PI3K的催化结构域具有高度同源性, 故而属于PI3K蛋白家族成员。由于m TOR信号转导通路在细胞周期进程中发挥了重要作用, 而细胞周期进程的异常调节与癌症有关, 因此m TOR信号通路在癌症的发生、发展中处于核心地位[9]。Murayama等[10]发现细胞质中m TOR的表达与胃肿瘤浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期明显正相关。另有研究报道, 在手术切除的胰腺导管癌标本中, 胰腺癌细胞中m To R被激活, 而且, m To R抑制剂对胰腺癌具有潜在的抗癌活性[11]。综上可见, m TOR在许多恶性肿瘤组织中高表达, 提示m TOR可能参与了恶性肿瘤的发生和发展过程。

p70S6K作为m TOR下游的主要靶蛋白之一, 是m TOR下游底物中目前研究较为广泛的关键调节因子, 具有核糖体蛋白激酶的活性, 活化后能够磷酸化激活核糖体40S小亚基S6 蛋白, 而S6 蛋白可提高含5’-TOP的m RNA的翻译效率[12], 当其第389 位苏氨酸残基 (Thr389) 被磷酸化后, 活性上升, 促进核糖体及其他调节蛋白的合成, 介导细胞生长和增殖[13], 同时, m TOR的主要生物学功能也是通过p70S6K来实现的。因此本研究观察m TOR和p70S6K蛋白表达。

本研究通过免疫组化染色检测发现m TOR、p70S6K在正常上皮性卵巢组织中表达很低, 而在上皮性卵巢癌组织中却高表达;m TOR、p70S6Km RNA的表达增加并且与病理分级相关, 其机制可能是上皮性卵巢癌中LKB1 激活[14], 使其下游m TOR激活, m TOR是大多数细胞分裂增殖信号传导的中枢可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡, 促进细胞周期进展, 促进细胞的生存和增殖。m To R信号通路不仅对正常细胞生长增殖起着重要作用, 而且与正常细胞向癌细胞转化以及癌细胞的生长、增殖密切相关, 同时参与血管形成, 在肿瘤的形成中扮演重要角色, 并参与肿瘤的侵袭和转移[15]。m TOR激活后, 使其下游p70S6K激活, 促进p70S6Km RNA翻译活性增强, 协同刺激癌细胞蛋白质及核糖体合成, 从而控制细胞从G1 期到S期, 促进癌细胞生长及增殖[16]。

mTOR 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2004年1月1日 -2009年6月30日扬州大学临床医学院妇产科住院手术治疗并经病理诊断证实的宫颈鳞癌组织标本48例,年龄33~76岁,中位年龄为45.3岁。临床分期按国际妇产科联盟(FIGO)制定的标准,Ⅰ、Ⅱ期20例,Ⅲ、Ⅳ期28例。组织学分级:高分化6例,中分化28例,低分化14例。随机选择本院同期宫颈上皮内瘤样病变病理切片60例,其中CINⅠ20例,CINⅡ20例,CINⅢ20例。随机选择同期宫颈糜烂伴鳞化切片20例,正常宫颈切片10例作为对照组。患者术前均未接受放疗、化疗或激素治疗,所有组织均经病理学诊断证实。

1.2 免疫组织化学染色及结果判断

所有标本经10%甲醛固定,石蜡包埋,切片(4μm),分别进行HE染色核实诊断和免疫组织化学染色。免疫组织化学分析采用链霉素亲生物蛋白 / 过氧化物酶连接法(SP法)。试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供,染色步骤按操作说明书进行。DAB显色,自来水充分洗涤,苏木素复染10 min,稀盐酸淡化30 s,冲洗5 min,脱水,透明,封片,镜检。PBS代替一抗作阴性对照,相同染色条件下已知宫颈癌阳性片作为阳性对照。一抗分别为兔抗人PI3K单克隆抗体(1∶200)、兔抗人Akt单克隆抗体(1∶200)、兔抗人m TOR单克隆抗体(1∶100)、兔抗人p70S6K单克隆抗体(1∶100)。

阳性判断标准:选择具有代表性的5个高倍视野进行观察计数,胞质呈棕黄色者为阳性,计算阳性细胞数的百分率。根据染色程度和染色细胞百分比进行评分:不着色为0分,淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分;着色细胞数≤5%为0分,6%~25%为1分;26%~50%为2分;≥51%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘,得分≤1分为阴性(-),2~3分为弱阳性(+),4~5分为中度阳性 ++,≥6分为强阳性(+++)。分析时归为阴性表达,+、++、+++ 均归为阳性表达。所有切片均采用双盲法由2位病理科医生阅片。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5软件进行统计学处理,两组阳性率差别的假设检验用χ2检验和Fisher确切概率法,两变量间的关系分析用Spearman相关分析,P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PI3K、Akt、m TOR、p70S6K 在各类宫颈病变组织中的表达

PI3K、Akt、mT OR、p70S6K阳性细胞均为细胞浆染成棕黄色颗粒,以细胞质为主(见附图)。正常宫颈上皮中PI3K、Akt、mT OR、p70S6K几乎不表达,宫颈鳞癌中PI3K、Akt、mT OR、p70S6K蛋白表达率均较CIN宫颈组织高,差异有统计学意义(P <0.05),其在正常宫颈、宫颈糜烂伴鳞化、宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率呈逐渐增高趋势(P <0.01)。见表1。

注:1)P <0.05;2)P <0.01

2.2 PI3K、Akt、m TOR、p70S6K 阳性表达与宫颈癌临床病理特征的关系

宫颈癌组织中PI3K、Akt和m TOR的表达率与淋巴转移、临床分期、分化程度有关(P <0.01)。PI3K、Akt和m TOR的表达率与原发灶大小、患者年龄无关(P >0.05)。p70S6K在宫颈癌中的阳性表达与临床分期、分化程度有关(P <0.05),淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组(P <0.01),与肿瘤大小、年龄无关(P >0.05)。见表2。

2.3 PI3K、Akt、m TOR、p70S6K 在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中表达的相关性

PI3K、Akt、m TOR与p70S6K在宫颈上皮内瘤变组织中的表达相关。采用二项分布统计学方法和Spearman秩相关分析发现,p70S6K的表达与PI3K、Akt、mT OR呈明显正相关(r1=0.313,P <0.05;r2=0.292,P <0.05;r3=0.337,P <0.01)。提示p70S6K阳性表达越强,则PI3K、Akt、m TOR阳性表达强度越高。见表3。

PI3K、Akt、m TOR与p70S6K在宫颈癌组织中的表达相关。采用二项分布统计学方法和Spearman秩相关分析发现,p70S6K的表达与PI3K、Akt、m TOR呈明显正相关(r4=0.437,P <0.01;r5=0.322,P <0.05;r6=0.455,P <0.01)。提示p70S6K阳性表达越强,则PI3K、Akt、m TOR阳性表达强度越高,见表4。

注:1)P <0.01;2)P <0.05

3 讨论

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病机制可能与原癌基因激活、抑癌基因失活以及细胞凋亡相关基因和肿瘤转移抑制基因异常等有关。因此,加强对宫颈癌分子病理学的研究,不仅有助于阐明其发生、发展的机制,而且更利于早期诊断和早期干预治疗。

PI3K是细胞内重要的蛋白激酶,当细胞受生长因子等刺激因子刺激后,细胞内PI3K活化,使其转化为第二信使3,4,5,三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3),PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和磷酸肌醇依赖激酶(PDK1)结合,改变Akt的蛋白结构,使之移位到细胞膜,可使膜上的PDK21和PDK2发生蛋白磷酸化,促使PDK1磷酸化的Ser308致Akt活化;活化的PI3K-Akt可进一步激活其下游分子雷帕霉素靶蛋白(m TOR)和核糖体蛋白p70S6激酶(p70S6K);PI3K通过Akt、m TOR将有丝分裂信号传递给p70S6K,使细胞周期主要蛋白,如细胞周期素的翻译上调,促进G1期进展,使细胞周期加速[3,4]。因此,PI3K/Akt/m TOR/p70S6K信号通路在细胞的生存、生长与增殖中起中心调控作用。

PI3K(phosphatidylinositol-3 kinase)是一类特异的催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶,是磷脂激酶家族中的一个重要成员,具有脂类激酶活性和蛋白激酶活性。PI3K的p85调节亚单位是许多细胞质和受体酪氨酸激酶的磷脂蛋白底物,当细胞外的配体与相应的受体结合后,受体被激活发生同源或异源寡聚化或者使受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)自身酪氨酸残基磷酸化或者导致与受体偶联激酶的酪氨酸残基磷酸化[5]。本研究免疫组织化学结果显示,宫颈癌组织中PI3K表达的阳性率(81.25%)比正常宫颈组织(0%)和宫颈上皮内瘤变组织(36.67%)均显著增高(P <0.01)。提示PI3K与宫颈癌的形成有关,可能主要通过2条途径发挥作用:1促进肿瘤细胞增殖;2抑制肿瘤细胞凋亡。BERTRAM等[6]研究发现,抑制PI3K活性可诱导凋亡的发生,这个过程主要被自分泌的Fas/Fas L凋亡机制调节。因此PI3K可能通过抑制Fas凋亡途径而抗凋亡,从而导致宫颈癌的发生。本研究发现PI3K蛋白在有淋巴结转移的宫颈癌中的阳性率为95%(19/20),与无淋巴结转移者阳性率[53.57%(15/28)]相比显著增高(P <0.01)。随着病理分级的增高,PI3K的表达也逐渐增高(P <0.01)。表明PI3K蛋白的表达与宫颈癌细胞的转化过程以及肿瘤细胞的侵袭转移有关。因此认为,PI3K有望作为判定宫颈癌淋巴结转移倾向的新指标。

Akt具有丝苏氨酸激酶活性,是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶,促进细胞的异常分化与增殖。本研究免疫组织化学结果显示,在宫颈癌中Akt的阳性率比正常宫颈、宫颈上皮内瘤变组织中明显升高。阳性率随着宫颈癌临床分期的进展逐渐增高,表明Akt与宫颈癌的恶性进展有关。病理分级Ⅲ、Ⅳ级的Akt阳性率较Ⅰ、Ⅱ级明显升高,可能与Akt蛋白的过度扩增促进肿瘤的进展有关。此结果与廖等[7]报道一致。另外,姚等[8]研究证实PI3K蛋白的高表达和Akt蛋白的高表达与宫颈癌细胞的增殖、浸润和转移有一定的相关性。YIH等[9]研究发现抑制Akt则能促进三氧化二砷诱导的宫颈癌细胞凋亡。由此可见,Akt对宫颈肿瘤的形成、诊断与治疗可能具有重要的意义。

活化的PI3K可激活下游的蛋白激酶B(Akt),激活的Akt使肿瘤细胞对凋亡诱导耐受、细胞生长代谢异常增加。过度活化的Akt激活其下游m TOR,可以引起肿瘤细胞的快速增殖、癌蛋白分泌增加、细胞周期加快、G1期时程缩短,利于肿瘤的迅速发生、发展[10]。在体内m TOR通过磷酸化多种底物蛋白来实现其生理作用,其中p70S6K是最重要的底物之一。p70S6K是核糖体40 S小亚基S6蛋白激酶,可激活S6; 而S6可以提高 含5'-TOR(5'-terminaloligopyrimidine tract)的一类m RNA的翻译效率。这类5'-TOR m RNA约占总m RNA的20%,它的翻译产物包括许多翻译元件成分,如核糖体蛋白、延伸因子EF1α等。有研究表明,m T0R可使p70S6K的第412位苏氨酸残基磷酸化,从而使p70S6K的活性上升100倍左右,从而显著促进蛋白质的生物合成。本研究结果显示,与正常的宫颈组织相比,CIN各级及宫颈癌中PI3K、Akt、m TOR与p70S6K的表达显著增高,且随着疾病的进展表达逐渐增强。本实验中m TOR在宫颈癌组织中表达高达91.67%,在宫颈鳞状细胞癌中,随着鳞癌病理分级的增加,m TOR的表达明显增强,但与患者年龄无明显相关。本研究发现m TOR并不是在正常宫颈完全不表达,相反它在基底细胞表达丰富,而在分化的正常宫颈上皮中几乎不表达。这可能是因为宫颈上皮基底细胞被认为“含有干细胞或是储备细胞”;也可能是宫颈上皮的反复脱落是因基底层细胞的不断增殖、分化而来,因此基底层细胞的增殖相对旺盛,DNA及蛋白合成多。m TOR的底物p70S6K在正常宫颈及宫颈癌中均有表达,但在宫颈癌表达的阳性细胞数(60.41)明显多于正常宫颈(28.33);在Ⅱ、Ⅲ期鳞状细胞癌中的表达明显高于正常宫颈。m TOR与其底物p70S6K的表达量有明显的相关性。宫颈癌与临床病理特征的相关分析表明,宫颈癌组织m TOR的表达率与淋巴结转移、临床分期、病理分级有关(P <0.01);m TOR的表达率与原发灶大小、患者年龄以及组织类型无关(P >0.05);p70S6K在宫颈癌中的阳性表达与临床分期、分化程度有关(P <0.05),淋巴结转移组的阳性表达率明显低于无淋巴结转移组(P <0.01),与肿瘤大小、年龄无关(P >0.05)。这些结果均提示在宫颈癌的发生、发展中m TOR / p70S6K通路的异常激活可能是众多致癌因素中不可忽视的环节。