胃蛋白酶

胃蛋白酶（精选11篇）

胃蛋白酶 篇1

胶原作为一种细胞外基质,主要存在于动物的血管、韧带、肌腱、软骨以及皮肤中,属于结构蛋白质,约占哺乳动物总蛋白的三分之一[1,2]。同时,由于胶原蛋白所具有的独特结构,表现出较低的免疫原性、良好的生物相容性、可生物降解性[3,4]以及促进细胞生长[5]等诸多特性,因而已在生物医学、食品等领域中得到广泛的应用。

长期以来,从动物皮中提取胶原备受人们的关注,已成为研究热点。迄今为止,胶原蛋白的提取方法主要有酸法、碱法、酶法和结合法[6]等。酸法是采用低离子浓度的酸性条件,破坏胶原多肽键间的盐键和Schiff键,引起纤维的膨胀、溶解,其溶解量很少。碱法则容易造成肽键水解,所得到的水解产物分子质量较低,同时可能会产生具有毒副作用的DL氨基酸消旋混合物。酶法水解则具有水解快、无污染以及产量高等优点。前人所做的对比研究表明,酶法是比较理想的胶原提取方法,其提取产物可应用于生物医学领域。胃蛋白酶作为酶法提取胶原的主要酶制剂,其p H值为1.5~2.5时活性最强,酶用量为底物的1%~5%较为合适[1]。

过去,医用胶原的研究主要集中在牛腱、人的尸体皮、鼠尾腱等原料上。这些原料不仅来源有限且有感染重大疾病病毒的危险[7]。然而,猪皮作为我国资源最为丰富的一种动物皮,其一些天然优势却被忽视,未受到应有的重视。同时以猪皮为原料制备医用胶原的报道也十分有限。因此,以猪皮为原料提取胶原蛋白的研究,具有重要的实际意义[1]。

1 试验部分

1.1 主要试剂与仪器

胃蛋白酶(1∶3000),Sigma公司;

对二甲氨基苯甲醛,上海三爱思试剂有限公司;

三羟甲基氨基甲烷,成都科龙化工试剂厂;

氯胺T,上海佘山化工试剂厂;

纯化猪皮,实验室自制;

其它试剂无特殊说明均为市售分析纯。

酸度计pHS-3B,上海雷磁仪器厂;

磁力搅拌器RCT-basic,广州仪器实验室技术有限公司;

高速离心机LG10-24A,北京医用离心机厂;

真空冷冻干燥机Free Zone 6,Labconco公司;

紫外可见分光光度计UV751GD,上海分析仪器总厂;

电泳仪Powerpac basic,美国Bio-Rad公司;

凯式定氮仪399Distillation,瑞士BüCHI公司。

1.2 研究思路与方法设计

酶法是目前普遍采用的胶原提取方法之一。对于酶促反应,不同底物的影响是十分明显的。采用胃蛋白酶水解猪皮制备胶原的过程亦是如此。前期的探索试验表明,影响胃蛋白酶水解反应的因素主要有水解温度、pH值、酶用量、液比及水解时间[8]。同时,由于胶原具有较低的热稳定性,温度超过其稳定值后即发生变性。虽然各文献报道的胶原变性温度因来源不同而略有差异,但都不超过40℃。因此,猪皮胶原的提取要保持在较低温度下进行。有文献报道[9],整个过程应保持在低于10℃下进行。因各因素的影响交错,难以将某个条件抽离出来。于是为了方便起见,且根据前期研究的成果,在本项研究中主要以胃蛋白酶的用量、水解pH值、水解温度以及液比4个因素为考察对象,且根据本实验室前期研究的成果,确定了每个影响因素的水平数为3个,采用正交设计法得到酶法水解的正交试验安排一览表(详见表1、表2),然后,按照表2进行试验,并对结果进行了统计分析,从中找出了酶法提取猪皮胶原蛋白的最佳条件[8,10]。最后根据正交试验的结果,再设计试验对胃蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的过程进行研究,以获得更多的水解过程信息,从而为优化工艺提供数据基础。根据酶促单底物反应的动力学原理,特定反应条件下的反应速率仅与底物浓度有一定的函数关系,而与酶的用量、酶的浓度无关,即米氏方程:v=Vmax×[S]/(Km+[S]),其中Vmax为最大反应速度,Km为米氏常数,[S]表示底物浓度[10]。因此,以酶用量为主要参数(酶用量分别为1.5%、2.0%、2.5%)安排试验,同时对水解过程进行跟踪检测,以统计学的方法进行数据处理得出最佳水解时间,同时用数学方法对该过程进行了模拟分析。

1.3 提取猪皮胶原的工艺过程

参考本研究室前期提取胶原的方法[10]提取猪皮胶原。

(1) 预处理与浸酸：

准确称取一定质量的干燥皮块(质量记为M0,约5g),用大约20倍质量的pH值7.4的Tris-HCl缓冲液浸泡2h,低温保存(4℃),间隔搅拌。2h后皮块稍有膨胀感,细小颗粒悬浮物能明显地看到。然后倒去清液。加入一定量的0.5mol/L的HAC溶液,检测调节pH值并保证一定的液比后静置浸泡2h。

(2) 酶水解:

准确加入相应质量的进口胃蛋白酶(1∶3000),于设定温度下连续搅拌26h(在水解过程中,每隔4h取样离心,用来测定羟脯氨酸变化和电泳)。

(3)盐析:

酶消化完成后,离心分离(8000r/min,15min),小心吸取上清液,用NaOH溶液调pH值为弱碱性(7.50左右),根据试样体积,以(NH4)2SO4最终浓度为1.5mol/L计,在10~15min内缓慢加入(NH4)2SO4,然后连续搅拌使之溶解,此后,静置过夜(10~12h)。

(4) 酸溶解:

盐析后，在8000r/min条件下离心15min，取沉淀，弃上清液，用适量0.5mol/LHAC溶液将沉淀洗脱下来，在4℃下搅拌30min后，得到胶原蛋白溶液母液。

(5) 透析与干燥

将试样倒入透析分子质量为8~10kDa的透析袋中,先用0.04mol/L和0.02mol/LNa2HPO3溶液透析2d,然后用蒸馏水透析3d。紧接着,将试样冷冻干燥,得到固体胶原蛋白,包装称重(质量记为M1)后密封

(6)纯化(在优化条件下完成):

在得到胶原蛋白母液后,将母液的pH值缓慢调为2.2左右,在转速为8000r/min时离心15min,取上层清液,根据溶液体积,在10~15min内边搅拌边缓慢加入一定量的(NH4)2SO4。然后将试样清液的pH值调为7.00左右,低温(4℃),静置过夜(10~12h),离心分离取沉淀(8000r/min,15min)弃上清液,将沉淀用适量0.5mol/LHAC溶液洗脱,低温(4℃)搅拌30min,最后将胶原蛋白如上步骤透析干燥[8]。

1.4 酶法水解提取胶原蛋白的评价指标

(1)胶原蛋白的水分含量测定[11]:

采用烘箱法,准确称取适量胶原蛋白海绵,于100~105℃干燥至恒重,由此计算其水分含量。

(2)羟脯氨酸的测定[10]:

采用标准曲线法检测,试样经浓盐酸高温条件水解,与氯胺T作用后对二甲氨基甲醛显色,于558nm条件下测定吸光值,再由标准曲线求羟脯氨酸含量。

(3)分子质量分布的测定:

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析胶原蛋白试样,胶原蛋白溶液与含有β巯基乙醇的样品缓冲液混合后,于沸水中煮沸3~5min,可以使胶原蛋白的α-、β-等异构体分离[12]。由于样品缓冲液中十二烷基磺酸钠(SDS)的影响,胶原蛋白在电泳凝胶中的移动只与其分子质量相关,且由于胶原蛋白-SDS复合物总电荷呈阴性而往阳极移动,据此测定分子质量的分布。

(4)蛋白质含量的测定[11]:

采用凯式定氮法定量检测试样中的总氮含量,是一种在行业中采用的蛋白质含量标准测定方法[13]。蛋白质作为一种含氮的有机化合物,当蛋白质与浓硫酸和催化剂一起加热时,其所含的氮能转化为铵盐,在碱性条件下可蒸馏分离为氨气,经硼酸吸收可采用标准硫酸滴定,根据标准酸的浓度和消耗量,推算出样品的含氮量,乘换算系数以此计算蛋白含量。

(5)统计学处理:

采用Mean±standard error的形式表示。

2 结果与讨论

2.1 酶法提取猪皮胶原的正交试验

以产率为评价指标,对正交试验结果进行分析评价。胶原酶法提取的正交试验结果如表3所示,各因素效益曲线图如图1所示。

从中可以看出:酶用量的极差值最大,说明酶用量对产率的影响程度最大,pH和温度的影响程度次之,而液比的影响程度是最小的。就酶用量而言,适量的胃蛋白酶用量可以使酶促反应朝正反应方向移动,太少的酶用量不足以使底物深入反应;而当酶浓度较高时,随着反应的进行,反应液中水解出的胶原蛋白的量、非胶原蛋白的量等逐渐增多,这些大分子物质的存在,阻止了酶分子向皮中的扩散或需要更长的时间,表现在水解效果上即胶原产率在较高酶浓度的条件下降低。在较低pH值时产率较低,这可能有2点原因,一是因为pH值过低,使胶原过度水解生成较多的小分子多肽,这些小分子多肽在操作过程中易损失掉,使得产率降低;二是由于pH值太低,酶的活力受到抑制。而当pH处于较高水平时,可能还不足以使胃蛋白酶发挥最大水解能力,产率也受到抑制。温度对胃蛋白酶的活力影响很明显,这也直观地反应到其产率上。然而,在较高温度条件下提取胶原有较大的变性风险,不利于高质量胶原的制备。液比对产率的影响在4个因素中虽然是最小的,但也是不可忽视的。随着水解反应的进行,反应液的黏度会逐步增加,因此小液比情况下酶作用的传递也急剧减慢,而液比较大时一方面降低酶和底物的浓度,使两者接触作用的几率变小,另一方面大液比使搅拌的机械作用受到削弱,从而影响最终的产率。

不难看出单就产率而言,胃蛋白酶提取猪皮胶原的pH值2.2、16℃、2.0%的酶用量以及50倍的液比,可得到较高的产率。

2.2 提取胶原的分子质量及其分布

胃蛋白酶提取猪皮胶原正交试验所得试样的SDS-PAGE电泳如图2所示。由图2可知,不同温度条件下提取胶原的分子质量水平是有差异的。在低温条件下制备的胶原试样浓度较低但分子质量分布较窄(图中条纹2和条纹3),温度较高时试样中胶原蛋白浓度有一定的提高但分布明显加宽(图中条纹1、4、5、6)。因此,选择低温条件进行水解反应,将更有利于控制和获得高质量的产品。

由图3可以看出:试样在电泳凝胶上主要有3条分子质量谱带,与标准蛋白的带相比,其中2条谱带的分子质量在116.0kDa附近,另一条谱带在205k Da附近,这与文献中报道的I型胶原蛋白分子质量水平基本一致[14]。

2.3 酶法水解过程的分析

当胃蛋白酶用量分别为1.5%、2.0%、2.5%时,对水解过程进行实时取样,以研究溶液中羟脯氨酸含量随水解时间的变化规律。检测得到的羟脯氨酸含量随时间的变化值如表4所示,图4为与之相对应的羟脯氨酸含量随时间的变化曲线。

从图4可知:随着水解时间的增加,3组试样中羟脯氨酸的含量随之增加。且在0~8h内,羟脯氨酸含量急剧增加,此后增速明显减缓。而在8~28h内,3组平均增幅只有13%左右,综合考虑,提取时间控制在8h左右较为合适,该结论也可在后续图表中得到佐证。同时,发现3组试样中羟脯氨酸的含量并非一直随着酶用量的增加而增加,相反酶用量最高的第3组试样(2.5%)出现了和第1组试样(1.5%)曲线部分重叠、交错的现象,这可能是第1组的酶用量只有1.5%,太低的酶用量难以对底物进行充分水解,从而使得水解过程进行缓慢。而第3组由于酶的浓度过高,导致了酶促反应的发生[10]。由此可以推测,第2组的酶用量(2%)更为接近实际最佳的酶用量,这也再一次证明了正交试验所得到的结论。

注:1st为1.5%;2nd为2.0%;3rd为2.5%。

对水解过程的羟脯氨酸含量用一阶Hill方程进行了拟合[8],从表5和图5可以发现:拟合后方程的曲线与3组试样中羟脯氨酸随时间的变化趋势趋于一致。因此可以证明,用一阶Hill方程对该过程进行模拟是较为合适的。

注:1st为1.5%;2nd为2.0%;3rd为2.5%。

再者,我们知道Chyp(溶液中羟脯氨酸含量)=∫vdt[10](v:水解速率,t:水解时间),因此,在求出Chyp(溶液中羟脯氨酸含量)随t变化曲线的微分之后,即可得到v随t变化的函数关系,进而找出酶法提取猪皮胶原蛋白的最为合理的水解时间,图6即为3组试样中相应的v随t变化的曲线图。从中可以看出,反应初期酶的反应速率较大,然而随着时间的进行迅速减慢直至基本丧失活力,这与传统的酶促反应理论是一致的[8,10]。3组试样的水解速率对水解时间变化曲线的具体参数如表6所示,同时利用软件计算出速率降为最大值20%(即反应进行到80%)的时间。

从表6可以看出:试样二的理论水解速率最大,而其它2组相对较低,因此反应时间也是第2组最少。所以,用2.0%的酶提取时效率是最高的。经过计算可以知道,约7h过后,反应基本上达到总反应的80%。所以在实际生产中,我们应该将水解时间定为8h,这样可以提高生产效率。

3 结论

本研究可以得出以下结论:

(1)优化的工艺条件为温度4℃,pH值2.2,酶用量2.0%,液比50。

(2)胃蛋白酶是一种十分有效的提取猪皮胶原的酶制剂。采用一阶Hill方程能够很好地模拟胃蛋白酶水解提取猪皮胶原蛋白的过程,且拟合程度较高(R2>0.95)。对溶液中羟脯氨酸含量对时间的变化曲线进行微分处理后,用一阶指数衰减方程能够很好地模拟胃蛋白酶水解提取猪皮胶原蛋白过程的速率变化。再者,通过方程拟合后的试验结果表明,2.0%的胃蛋白酶用量,水解作用8h较为理想。

(3)通过分析检测,所提取的胶原海绵的水分含量为(7.98±1.26)%,总蛋白质含量为(80.62±2.03)%,羟脯氨酸含量为8.65%±0.76%,这与报道的I型胶原的特征指标相符。

注:1st为1.5%,2nd为2.0%,3rd为2.5%;t80为反应进行到总反应的80%所需的时间。

摘要：采用酶法提取猪皮胶原,找出最佳工艺条件。在此基础上,以酶用量为主要参数设计试验,对水解过程进行了在线检测,同时用数学方法对该过程进行了模拟分析。结果表明,酶法水解的最佳条件是:酶用量2.0%、pH值2.2、液比50及4℃条件下水解作用8h最为理想。所得到的胶原海绵的总蛋白质含量为(80.62±2.03)%,羟脯氨酸含量为(8.65±0.76)%。

关键词：胃蛋白酶,猪皮,胶原蛋白,酶法,提取

哪些蛋白是优质蛋白 篇2

优不优，看氨基酸

人体所需要的蛋白质来源于多种食物，凡是蛋白质氨基酸模式与人体蛋白质氨基酸模式接近的食物，其必需氨基酸在体内的利用率就高，反之则低。例如：动物蛋白质中的蛋、奶、肉、鱼等以及大豆蛋白质的氨基酸模式与人体氨基酸模式比较接近，所含的必需氨基酸在体内的利用率就高，因此被称为优质蛋白质。

一句话，蛋白质优不优，关键在于它的氨基酸模式与人体氨基酸模式是否接近。

高蛋白不等于优质蛋白

有商家宣传的时候常说：某某商品富含蛋白质。富含蛋白质就一定好吗？答案是未必。首先，高蛋白不一定好，蛋白质摄入过高还会引起疾病；其次，高蛋白也不等于是优质蛋白。比如：牛奶的蛋白质含量并不高，只有3%左右，但是牛奶的蛋白质却是优质蛋白；相反，有的谷类中含蛋白质为10%左右，但是谷类的蛋白质为植物蛋白，其氨基酸模式与人体的氨基酸模式差异较大，因此不是优质蛋白。

利用率不是简单的消化吸收

牛奶、蛋类、大豆蛋白都属于优质蛋白，但部分人吃了牛奶、鸡蛋或者豆类制品就不消化，可这并不能否定它们作为优质蛋白质的身份。能否消化，与个体很多因素有关，比如疾病、先天因素。

再说肉，过多摄入肉类可能引起心血管疾病，因此需要控制量，但肉类含的蛋白质因为氨基酸模式与人体氨基酸相近，是优质蛋白质的主要来源。

合理利用，优上加优

蛋类、奶、肉、鱼等动物性食物中的蛋白质以及植物性食物中的大豆蛋白质属于优质蛋白。这些食物的蛋白质必需氨基酸含量齐全，比例适当，能够维持人体健康和儿童生长发育。需要注意选择优质蛋白的人群包括：生长发育期的小孩、老年人、疾病恢复期的患者、蛋白质营养不良患者等。

对于张师傅来说，首先要了解哪些食物蛋白质是优质蛋白，然后，要学会利用蛋白质互补作用的原理进行配餐。

所谓蛋白质互补作用，是指两种或两种以上的食物蛋白质混合食用，其中所含有的必需氨基酸取长补短，相互补充，达到较大的比例，从而提高蛋白质利用率。比如：玉米、小米、大豆单独食用时，其生物价分别为60、57、64，如果混合食用则生物价可以提高到73；进一步，如果在植物性食物基础上再添加少量含有优质蛋白的动物性食物，则蛋白质的生物价还会提高，如面粉、小米、大豆、牛肉单独食用时，其蛋白质生物价分别为67、57、64、76，混合食用则蛋白质生物价提高到89。

注：生物价是反映食物蛋白质消化吸收后，被机体利用程度的一项指标。生物价越高，说明蛋白质被机体利用率越高，即蛋白质的营养价值越高，最高值为100。

小知识

蛋白质和氨基酸

所有的蛋白质都是由氨基酸构成。

氨基酸 组成蛋白质的基本单位。

氨基酸模式 是指某种蛋白质中各种必需氨基酸的构成比例。

固定化胃蛋白酶的工艺优化 篇3

本试验主要研究影响海藻酸钠固定化胃蛋白酶的几个因素,确定胃蛋白酶固定化的最佳条件,并对固定化酶的稳定性进行研究,为固定化胃蛋白酶的应用提供理论依据。

1 实验

1.1 材料

胃蛋白酶、壳聚糖:北京索莱宝科技有限公司;海藻酸钠:青岛明月海藻集团有限公司,实验中所用其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 制备固定化胃蛋白酶[5,6,7]

将一定量的海藻酸钠溶于p H 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液中,加入稀释的胃蛋白酶溶液,冰浴环境下持续搅拌30 min,静置。用1%的醋酸溶液溶解壳聚糖,加入无水氯化钙。用注射器将含有胃蛋白酶的海藻酸钠溶液逐滴加到氯化钙溶液中,搅拌0.5 h,置于4℃冰箱中固定化一段时间。反应结束后,用缓冲液反复冲洗即得固定化酶。

1.2.2 单因素实验

以固定化胃蛋白活性回收率为指标,探讨不同的氯化钙浓度、固定化时间、游离胃蛋白酶稀释倍数、海藻酸钠浓度对固定化胃蛋白酶效果的影响。

1.2.3 响应面实验设计[8,9,10]

在单因素实验的基础上,依据Box-Benhnken中心组合设计原理,设计三因素三水平的响应面试验,如表1所示。

1.2.4 游离蛋白酶与固定胃蛋白酶活力的测定

采用福林-酚法测定胃蛋白活力,即GB/T 23527-2009(蛋白酶制剂)

1.2.5 固定化酶活回收率的计算方法

1.2.6 固定化胃蛋白酶性质的研究方法

(1)游离酶与固定化酶最适温度的研究

在不同的温度(30~60℃)下反应,测定游离酶和固定化酶的活力。

(2)游离酶与固定化酶最适p H的研究

在不同的p H(p H 1.0~5.0)下反应,测定游离酶和固定化酶的活力。

(3)固定化酶操作稳定性研究

按照酶活测定方法,在条件不变的情况下,连续反应五次,测定固定化酶的活力。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 氯化钙浓度对固定化酶的影响

如图1,固定化酶活力随氯化钙浓度的增加而增大,当氯化钙浓度达到3%时,固定化酶活性回收率最大,为46.25%。

2.1.2 固定化时间对固定化酶的影响

如图2所示,1.5 h时,固定化酶活性回收率最大,为65.03%。时间越长,固定化酶活性回收率逐渐下降。

2.1.3 游离酶稀释倍数对固定化酶的影响

如图3所示,固定化酶活力随游离酶稀释倍数的增加而逐渐增大,当稀释15倍时,固定化酶活性回收率最大为53.73%。

2.1.4 海藻酸钠浓度对固定化酶的影响

如图4,固定化酶活力随海藻酸钠浓度增加而增大,当浓度为1.0%时,固定化酶活性回收率最大,为53.05%。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应值固定化酶活回收率与影响因素间数学模型的建立

表2显示出不同条件对应的固定化酶活回收率,利用软件Design expert分析实验数据可得到固定化酶活回收率(Y)对自变量氯化钙浓度(A)、海藻酸钠浓度(B)及游离胃蛋白酶稀释倍数(C)的二次多项回归方程为:

通过分析回归模型方差及显著性检验,得到该回归方程的P=0.0004(<0.01),说明该模型具有极显著性,使用该回归模型代替实验点可以有效地进行分析;失拟项F值为5.69>0.05,说明失拟项不显著,该方程对实验拟合情况好,实验误差小。相关系数的平方(R2)为0.9605,说明该方程的回归效果显著,该模型可以很好地反映响应值固定化酶活回收率与氯化钙浓度(A)、海藻酸钠浓度(B)及游离胃蛋白酶稀释倍数(C)变化关系。

2.2.2 响应面交互作用分析与优化

图5显示的是两个因素交互作用对胃蛋白酶固定化效果的影响,如图5(A),不同的氯化钙浓度,海藻酸钠的浓度增加,固定化酶回收率先上升后下降;不同的海藻酸钠浓度,氯化钙的浓度增加,固定化酶回收率先无变化后减小。

如图5(B),不同的氯化钙浓度,游离酶稀释倍数逐渐增大,固定化酶回收率先增加后不变;不同的游离酶稀释倍数,氯化钙浓度的逐渐增加,固定化酶回收率先增加后减小。

如图5(C),不同的海藻酸钠浓度,游离酶稀释倍数的增加,固定化酶回收率先增加后下降;不同的游离酶稀释倍数,海藻酸钠浓度逐渐增加,固定化酶回收率先增加后不变。

通过响应面分析法得出最优实验方案为:海藻酸钠浓度0.9%,游离酶稀释10倍,氯化钙浓度3.6%,固定化1.5 h,3次平行实验后平均值为73.42%。响应值的实验值与回归方程预测值吻合度良好,该模型能够较好地预测实际固定化效果。

2.3固定化胃蛋白酶的性质研究

2.3.1游离与固定化胃蛋白酶最适温度的研究

如图6(A),游离胃蛋白酶的最适温度为40℃,固定化胃蛋白酶的最适反应温度为50℃。固定化胃蛋白酶的耐热能力有所提升。

2.3.2游离与固定化胃蛋白酶的最适pH的研究

如图6(B),游离胃蛋白酶的最适pH为2.0,固定化之后胃蛋白酶的最适pH为3.0。固定化胃蛋白酶最适pH有所提高。

2.3.3固定化酶操作稳定性研究

固定化酶可以重复使用,在相同的条件下,连续反应5次,测定其相对酶活力,将第一次的测定的酶活力设定为为100%,结果如图6(C)所示,固定化胃蛋白酶的相对酶活力仍为61.20%。

3 结论

通过单因素和响应面实验,得到最优的固定化酶制备工艺为海藻酸钠浓度0.9%,游离酶稀释10倍,氯化钙浓度3.6%,固定化时间1.5 h,在该条件下固定化酶的酶活回收率为73.42%。该工艺制备的固定化胃蛋白酶的最适温度为50℃,其耐热性有了很大提升;固定化酶最适p H为3.0,比游离酶最适p H的耐受度有所提高;固定化胃蛋白酶连续反应5次,相对酶活力仍为61.20%,可知该方法制备的固定化胃蛋白酶反应具有良好的稳定性。

参考文献

[1]李彦峰,李军荣,伏莲娣.固定化酶的制备及应用[J].高分子通报,2001(2):13-23.

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芦笋菠萝蛋白酶胶囊说明书 篇4

【拼音全码】LuSunBoLuoDanBaiMeiJiaoNang

【主要成份】芦笋菠萝蛋白酶胶囊为复方制剂，其组分为：每粒含芦笋粉0.25g，菠萝蛋白酶1.5万单位。

化学名：芦笋菠萝蛋白酶

【性状】芦笋菠萝蛋白酶胶囊为硬胶囊剂，内容物为棕黄色粉末。

【适应症/功能主治】芦笋菠萝蛋白酶胶囊具有软坚散结，消炎镇痛作用。适用于乳腺囊性增生病和男性乳腺发育症。

【规格型号】100s

【用法用量】成人4-6粒每次，每日3-4次。

【不良反应】尚不明确。

【禁忌】1、对芦笋菠萝蛋白酶胶囊成分过敏者禁用。2、严重肝、肾疾病患者禁用。3、血凝功能不良者禁用。

【注意事项】肾炎、胃溃疡病者慎用。

【儿童用药】儿童慎用。

【老年患者用药】在医生指导下服用。

【孕妇及哺乳期妇女用药】孕妇禁用。

【药物相互作用】如与其他药物同时使用可能发生药物相互作用，详情请咨询医师或者药师。

【药物过量】尚不明确。

【药理毒理】芦笋中主要成份为天门冬酰胺，在体内对恶变细胞生长建立一种生化障碍，能防止健康细胞恶变菠萝蛋白酶是巯基酶，能选择性地水解纤维蛋白，将阻塞于组织内的纤维蛋白血凝块溶解，改善病灶局部体液循环。芦笋菠萝蛋白酶胶囊具有软坚散结，消炎镇痛作用。

【药代动力学】尚不明确。

【贮藏】密闭，干燥处保存。

【包装】100s/盒。

【有效期】24月

【执行标准】化学药品地标升国标12册

【批准文号】国药准字H44025162

【生产企业】广东彼迪药业有限公司

胶原蛋白与胶原蛋白肽 篇5

随着年龄的增长，人体内的胶原蛋白会逐渐流失。女性从25岁开始进入胶原蛋白流失的高峰期，40岁时，含量不到18岁时的一半。胶原蛋白的流失导致支撑皮肤的胶原肽键和弹力网断裂，其螺旋网状结构随即被破坏，皮肤组织被氧化、萎缩、塌陷，肌肤就会出现干燥、皱纹、松弛无弹性等衰老现象。老年人脸上深深浅浅的皱纹，正是因为胶原蛋白和水分流失而造成的。所以，要保持年轻体态，补充胶原蛋白是十分必要的。

猪蹄、鸡爪、鱼皮、软骨中都属于胶原蛋白含量丰富的食物，然而，胶原蛋白是一种大分子的蛋白质，分子量约为30万，进入人体之后，必须被消化、分解为游离氨基酸才能被人体吸收、利用。所以，如果靠吃脂肪含量较高的猪皮、鱼皮这种食补的方法来补充胶原蛋白，不仅利用率低，还只会越吃越胖。

为了提高胶原蛋白在人体中的利用率，必须将大分子的胶原蛋白进行热变性后提炼成明胶，再用蛋白分解酶对明胶进行加水分解，形成分子量在数百至数千范围内（小分子）、易溶解的胶原蛋白肽。因此，对胶原蛋白产品来说，其原料来源是判定产品优劣的首要指标。

研究表明，鱼鳞是生产优质胶原蛋白肽的最佳来源。采用先进的酶解技术生产出来的鱼鳞胶原蛋白肽不含任何脂肪和嘌呤，其灰分、脂肪、糖分等均低于鱼皮胶原蛋白肽，且对人体的亲和性最好。

胶原蛋白肽在医疗领域中，广泛应用于人工角膜、烧伤的敷料、手术时预防粘连的薄膜、止血剂、手术用线、人工血管等产品。目前市面上可食用的胶原蛋白产品中，大部分都使用的是经酶解的小分子的胶原蛋白肽，但大家仍将其称为“胶原蛋白”。

近些年，人们主要关注胶原蛋白在皮肤美容方面的作用，不少化妆品和功能性食品都将含胶原蛋白作为卖点。实际上，随着对胶原蛋白认识的不断深入，人们发现，胶原蛋白肽对增加骨密度、减轻关节疼痛、减少紫外线伤害、改善脆甲症等方面都有着很重要的作用。

日本的胶原蛋白肽市场发展迅速，据统计，2003年日本的胶原蛋白肽在各领域的总使用量为1 300吨。之后市场急速扩大，到2010年总使用量达到5 400吨，其中5 100吨用于食品领域，占绝大部分，80吨用于医疗领域，80吨用于工业领域，出口量为130吨。

（本文内容由日本日皮株式会社胶原蛋白研究所提供）

胃蛋白酶 篇6

天冬氨酸蛋白酶的活性中心一般是由两个天冬氨酸残基所组成, 主要包括胃蛋白酶 (pepsin) 、胃亚蛋白酶 (gastricsin) 、凝乳酶 (chymosin) 、溶酶体 (组织蛋白酶D和E) 、肾素 (renin) 、蛋白酶A (proteinase A) 及艾滋病病毒 (HIV) 蛋白酶等[2]。

实验选择胃蛋白酶为靶酶筛选对其有抑制效果的蛋白酶抑制剂, 结果发现:云芝发酵土豆汁可产生一种蛋白酶抑制剂, 其对胃酶有很强的抑制作用, 有开发成胃溃疡治疗药物的潜力。肾素 (血管紧张肽原酶) 及HIV蛋白酶也都属于天冬氨酸蛋白酶, 相对应的抑制剂的研究意义重大, 本文研究此抑制剂的抑制作用机理和动力学性质, 将能够更好地揭示和开发其药理价值和应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

菌种:云芝 (Coriolus versicolor) 购自华中农业大学菌种实验中心。

1.1.2 试剂

胃蛋白酶:购自国药集团化学试剂有限公司;血红蛋白:购自上海丽珠东风生物技术有限公司;其余试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器

台式冷冻离心机 (Heraeus, 德国) ;DEAE-52离子交换色谱柱 (20cm×2.2cm) 、Ultro Gel ACA-54凝胶色谱柱 (80cm×1.4cm) 购自安法玛西亚生物技术有限公司;紫外检测器 (上海沪西仪器厂) ;示差检测器串联、进口双针记录仪 (德国Hettich公司) 。

1.1.4 培养基

斜面培养基:采用PDA培养基。

种子培养基:95%土豆汁, 5%麸皮, 玻璃珠 (30粒/瓶) 。

摇瓶发酵培养基:纯土豆汁, 玻璃珠 (20粒/瓶) 。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶发酵产胃蛋白酶抑制剂:

活化的菌株接种于纯土豆汁培养基 (pH 6.2, 1×105Pa, 20min) , 于180r/min摇床、28℃培养120h。

1.2.2 胃蛋白酶活力测定:

采用常规蛋白酶测定法[4]。

酶活单位定义:在最适条件下, 每分钟分解底物产生1μg的酪氨酸定义为一个酶活单位, 即1u。

抑制活力单位定义:在测定胃蛋白酶活力的条件下, 定义抑制率每下降10%为一个抑制活力单位, 即1U。

1.2.3 蛋白质浓度测定:

采用Lowry法[5], 以牛血清白蛋白作标准曲线。

1.2.4 糖浓度测定:

采用苯酚—硫酸法[5], 以葡萄糖为对照制作标准曲线。

1.2.5 细胞破碎前后云芝发酵液成分及抑制活性比较

取经过3次反复冻融处理的云芝发酵液, 进行超声波细胞破碎:超声时间10min、超声功率300W、处理量40mL、超声温度20℃。破碎后12 000r/min离心20min, 取上清液, 比较细胞破碎前后组分变化及抑制活性。

1.2.6 蛋白酶抑制剂的提取流程

云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂:发酵液→超声细胞破碎→离心、透析→DEAE-52离子交换→透析、浓缩→Mono Q离子交换→浓缩→UltroGelACA-54凝胶过滤→胃蛋白酶抑制剂。

土豆汁中的天冬氨酸蛋白酶抑制剂:马铃薯→去皮、切块、匀浆→离心、取上清液→DEAE-52离子交换→透析、浓缩→UltroGelACA-54凝胶过滤→天冬氨酸蛋白酶抑制剂。

1.2.7 蛋白酶抑制剂相对分子质量测定:

采用Ultro Gel ACA-54凝胶过滤法[6]。

1.2.8 云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂的动力学性质:

将抑制剂稀释到一定浓度与胃蛋白酶混合, 以质量浓度分别为0.2g/dL、0.25g/dL、0.3g/dL、0.4g/dL、0.6g/dL、1.2g/dL的血红蛋白作底物进行反应[7]。

1.2.9 蛋白酶抑制剂的反应机理:

将云芝发酵所产胃蛋白酶抑制剂、土豆汁中的天冬氨酸蛋白酶抑制剂分别与胃蛋白酶混合, 于冰箱中静置60min, 用Ultro Gel ACA-54凝胶过滤分别检测抑制剂反应前后层析图谱变化情况。

2 结果与分析

2.1 胃蛋白酶抑制剂为胞内产物的分析

通过对云芝发酵液超声细胞破碎前后的组分和抑制活性进行分析, 结果如表1。

由表1看出:云芝发酵液细胞破碎前对胃蛋白酶抑制活性很小, 而破碎后对胃蛋白酶的抑制活性有相当显著的提高, 表明胃蛋白酶抑制剂为胞内产物。

2.2 胃蛋白酶抑制剂的成分及抑制活性分析

通过对云芝发酵液进行一系列提纯, 最终得到胃蛋白酶抑制剂, 结果如表2。

抑制剂经过多次透析, 已去除有机小分子等杂质, 最终成分只含有大分子的蛋白质。随着蛋白质的多次提纯, 糖浓度逐步降低至0, 而由表2可以看出, 其比抑制活力随着蛋白质的纯化而明显升高, 说明其抑制活性来自蛋白质。

2.3 蛋白酶抑制剂相对分子质量测定

通过UltroGelACA-54凝胶过滤测定胃蛋白酶抑制剂分子量为23 100Da, 经测定已不含糖。资料报道从土豆汁中已经分离出多种蛋白酶抑制剂, 其中与此抑制剂最相近的一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂分子量为19 987Da[8], 在与本实验条件和方法相同的情况下, 测得其分子量为18 900Da, 糖含量为21.3%。

2.4 胃蛋白酶抑制剂的动力学性质研究

用Lineweaver-Bunk双倒数法作图[7], 得图3、图4。

由图4可计算出, 不加抑制剂时Km=75.5 (μmol/L) , Vm=4.87×103 (u/L·min) , 加抑制剂后Km′=47.9 (μmol/L) , Vm′=1.564×103 (u/L·min) , 一方面在抑制剂存在下Km、Vm下降, 类似于反竞争性抑制作用;另一方面, Vm下降了67.9%, Km下降了36.6%, Vm下降幅度大于Km类似于非竞争性抑制作用, 因此称这种抑制类型为非竞争性与反竞争性混合型。

Km/Vm× (1+[I]/Ki) =0.0306, 其中[I]=0.97 (μmol/L) , 计算可得蛋白酶抑制剂对胃蛋白酶的Ki=0.996 (μmol/L) 。

2.5 蛋白酶抑制剂的反应机理探讨

由图5、图6表明, 反应后胃蛋白酶抑制剂与胃蛋白酶结合形成复合物。

注:峰1-胃蛋白酶;峰2-胃蛋白酶抑制剂抑制剂。

图7可看出, 天冬氨酸蛋白酶抑制剂与胃蛋白酶反应前后图谱没有变化, 但经凝胶过滤后测得天冬氨酸蛋白酶抑制剂对胃蛋白酶已无抑制效果, 说明抑制剂与胃酶结合不牢固, 凝胶过滤后两者分离。

注:峰1-胃蛋白酶;峰2-天冬氨酸蛋白酶抑制剂。

蛋白酶抑制剂与靶酶的结合作用方式分为三类:第一, 抑制剂深入到靶酶的催化位点, 占据底物的结合部位;第二, 抑制剂与靶酶活性中心附近的区域结合, 阻碍底物分子向活性中心靠近;第三, 抑制剂与靶酶并列相伴, 在酶的活性基团形成氢键并封锁酶与底物的结合部位[9]。

由动力学性质研究表明:云芝发酵所产胃蛋白酶抑制剂对胃酶的抑制类型不是竞争性抑制, 因此其与胃酶的结合方式可排除属于第一类, 由于胃蛋白酶抑制剂与胃酶形成复合物, 推测结合类型可能属于第三类。

由以上实验结果得到两种抑制剂的的分子量和反应机理不同, 并且经实验证明云芝发酵所产抑制剂对胃酶有很强的特异性抑制作用, 当抑制剂达到对胃蛋白酶抑制率85%的浓度时, 对其它蛋白酶基本无抑制作用, 因此定义为胃蛋白酶抑制剂。从土豆汁中分离得到的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的抑制作用有一定的广谱性, 对天冬氨酸族的胃蛋白酶和PrA均有一定抑制作用, 并且对PrA的抑制作用较强。由此分析得出二者不是同一物质。

3 讨论

3.1 2005年, 田亚平、李屹松等曾从灵芝发酵全粉中提取出GLPIA1和GLPIA2两种蛋白酶A抑制剂[10];2006年, 徐鹏等进行了添加中药的灵芝发酵及其酪氨酸酶抑制活性的研究[11];2007年, 李泉从马铃薯块茎中提取得到一种蛋白酶A抑制剂[12]。

3.2 本实验从云芝发酵液中提取得到一种胃蛋白酶抑制剂, 该抑制剂本身不具备蛋白酶活性, 也不会被胃蛋白酶水解, 而是通过自身与胃蛋白酶结合 (且结合在非活性部位) , 使其活性发生改变, 表现出非竞争与反竞争混合型抑制的动力学模型。

胃蛋白酶 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

整群选取2014年8月—2015年12月因消化道症状在南平市第一医院就诊的住院患者共216例。其中正常组患者50例, 男19例, 女31例, 年龄22~84岁, 平均年龄56.26±12.98岁;慢性浅表性胃炎患者70例, 男36例, 女34例, 年龄21~77岁, 平均年龄 (53.30±10.29) 岁;慢性萎缩性胃炎患者22例, 男8例, 女34例, 年龄36~75岁, 平均年龄 (59.09±10.25) 岁;胃癌患者74例, 男44例, 女30例, 年龄37~65岁, 平均年龄 (60.32±7.93) 岁。经过比较分析, 实验组与对照组在年龄、性别等各方面差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。且这项研究协议遵循1975年的《赫尔辛基宣言》的伦理学指南, 同时经过福建医科大学附属南平第一医院伦理委员会的批准同意。

1.1.1 排除及入选标准

无严重的心脑血管疾病等胃镜检查禁忌症;最近1个月内未使用抑酸剂、抗生素、胃黏膜保护剂及非甾体抗炎药;排除合并全身其它系统及器官恶性肿瘤, 排除严重肝肾功能不全患者。根据胃镜及病理组织学检查结果将入选病例分为如下4组:慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎组、胃癌组、正常组。

1.2 原理与方法

1.2.1 标本采集

受检者禁食8 h后采集血液标本, 收集于血浆抗凝试管中, 2000 g离心5 min, 血浆标本贮存于-70℃低温冰箱中待测。

1.2.2 检测方法

以酶联免疫吸附试验 (ELISA) 定量检测血浆PGⅠ、PGⅡ和G-17水平, 定性检测H.pylori Ig G抗体。

1.2.3 仪器与试剂

PGⅠ、PGⅡ和G-17 ELISA试剂盒由芬兰Biohit公司提供, 批号分别为11PA1503、11PB1502、23GC1508。用于酶免疫测定试验的PGⅠ、PGⅡ和G-17单克隆抗体具有高度特异性, PGⅠ和PGⅡ试剂之间无交叉反应。G-17抗体只能检测酰胺化胃泌素G-17, 不能检测其他任何胃泌素分子或片段。H.pylori Ig G抗体试剂盒由艾康生物技术 (杭州) 有限公司提供, 批号201509123, 在微孔板上按试剂盒说明进行操作。反应步骤:TECAN全自动多功能洗板机洗涤微孔板, 以AUT-OBIO酶标仪在450 nm处测定吸光度值, 应用芬兰Biohit二项式计算软件根据标准浓度曲线自动计算标本PGⅠ、PGⅡ和G-17的浓度。

注: (2) (3) (4) 与正常对照组比较, #P<0.01; (3) (4) 与慢性浅表性胃炎比较, ☆P<0.05、△P<0.01; (4) 与慢性萎缩性胃炎比较, ※P<0.05。

1.3 统计方法

用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学分析比较, 用 (±s) 表示计量资料, 两组间使用独立样本t检验来比较, 用[n (%) ]表示计数资料, 采用χ2检验对率进行比较, 以α=0.05作为检验标准, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆PG和G-17水平

该研究中PGⅠ、PGⅡ和G-17水平在慢性浅表性胃炎[ (176.50±128.55) μg/L、 (17.77±15.75) μg/L、 (12.54±16.39) pmol/L]明显高于正常组[ (107.78±25.48) μg/L、 (8.13±2.79) μg/L、 (4.34±3.33) pmol/L]和胃癌组[ (79.59±83.37) μg/L、 (9.42±10.83) μg/L、 (5.20±9.91) pmol/L], 组间t检验差异有统计学意义 (P<0.01) 。PGR水平在慢性浅表性胃炎 (12.90±6.50) μg/L高于萎缩性胃炎 (9.29±5.80) μg/L, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。PGⅠ水平在胃癌 (79.59±83.37) μg/L明显低于正常组 (107.78±25.48) μg/L, 两组间t检验差异有统计学意义 (P<0.01) 。PGⅠ、PGⅡ水平在胃癌[ (79.59±83.37) μg/L、9.42±10.83) μg/L]低于萎缩性胃炎[ (165.40±144.77) μg/L、23.40±28.89) μg/L], 差异有统计学意义 (P<0.05) 见表1。

2.2 血浆H.pylori Ig G抗体

慢性浅表性胃炎H.pylori Ig G抗体阳性率为57.14% (40/70) , 而胃癌H.pylori Ig G抗体阳性率为35.13% (26/74) , 慢性萎缩性胃炎H.pylori Ig G抗体阳性率为27.27% (6/22) , 慢性浅表性胃炎的抗体阳性率高于胃癌组和慢性萎缩性胃炎组 (P<0.05) 见表2。

3 讨论

胃蛋白酶原 (pepsinogen, PG) 是胃液中无活性前体的胃蛋白酶, 是一种特殊的胃体分泌功能生物学标志, 依据它的免疫活性特征和生化的差异可区分为PGⅠ和PGⅡ两类。PGⅠ是人体惟一由胃粘膜腺体合成分泌的生物活性物质, 其主要由胃体主细胞和胃底腺黏液颈细胞合成分泌, PGⅡ除了由主细胞、泌酸腺黏液颈细胞、幽门腺、贲门腺和黏液细胞合成分泌之外, 十二指肠的Brunner腺也具有分功能, 在不同发育阶段其分泌水平会发生较大变化。一旦胃黏膜发生病变时, 分泌PG细胞相应受累, 血浆PG水平也发生相应改变, 因此有学者称血浆PG检测为胃底腺黏膜血浆学活检较为敏感生物学指标。在调节消化道功能和维持其结构完整具有重要作用的胃泌素, 是由十二指肠G细胞和胃窦分泌的一种胃肠道激素。人体中有生物活性的胃泌素主要由胃窦部G细胞分泌并直接进入血液循环, 其中95%以上为α-酰胺化胃泌素, 5%~10%是G-34, 80%~90%是G-17, 是G细胞分泌功能的一种较为特殊生物学标志[1]。

此研究发现慢性浅表性胃炎组PGⅠ、PGⅡ水平[ (176.50±128.55) μg/L、17.77±15.75) μg/L]与正常对照组[ (107.78±25.48) μg/L、8.13±2.79) μg/L]相比均呈显著升高 (P<0.01) , 说明PGⅠ和PGⅡ进入血液循环增多, 血浆浓度明显增加是因为胃黏膜发生糜烂或者溃疡时, 胃黏膜通透性增加引起。慢性浅表性胃炎组G-17水平 (12.54±16.39) pmol/L与正常对照组 (4.34±3.33) pmol/L相比也显著升高 (P<0.01) , 提示PGⅠ、PGⅡ水平和G-17水平检测可作为慢性浅表性胃炎筛查辅助指标[2]。

胃癌是一种最为常见的人类恶性肿瘤, 在我国发病率及死亡率均较高。慢性活动性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和异型增生是胃癌的演变重要发展过程。在这个长期变异累积的过程中, 迫切需要定期随访监测慢性萎缩性胃炎患者病变状况, 以提高胃癌的早期诊断率, 进而降低病死率[3]。该研究发现慢性萎缩性胃炎组PGR水平 (9.29±5.80) 低于慢性浅表性胃炎组 (12.90±6.50) (P<0.05) , 由于PGⅠ和PGⅡ水平与胃窦、胃体慢性胃炎活动性及炎症程度呈正相关, 但因PGⅡ增高较PGⅠ明显, 因此PGR与炎症活动呈负相关。慢性萎缩性胃炎时, 胃黏膜萎缩, 胃体腺病变、胃底腺细胞数量减少或被幽门腺上皮细胞所取代 (即假幽门腺化生) 。因幽门腺无主细胞和颈黏液细胞, 故不分泌PGⅠ, 导致PGⅠ水平下降, 而PGⅡ是由多种胃腺体分泌产生的, 所以PGⅡ浓度可分泌正常或者较高, 同时PGR浓度则进一步下降。表明PGR可反映萎缩及肠上皮化生的程度, 可通过检测PG水平, 依据PGR水平进行慢性萎缩性胃炎的初步筛查。胃癌组PGⅠ水平 (79.59±83.37) μg/L明显低于正常组 (107.78±25.48) μg/L和慢性萎缩性胃炎组 (165.40±144.77) μg/L (P<0.01) , 这或许与致癌症因子致使胃体主细胞和胃底腺黏液颈细胞中的胃蛋白酶原基因受到损伤而突发变异, 从而失去了分泌PGⅠ的能力密切相关, 由于80%以上的胃癌伴有萎缩性胃炎, 而萎缩性胃炎可以导致胃黏膜主细胞的丢失, 从而影响其分泌功能。因此对萎缩性胃炎患者的PGⅠ水平进行定期监测, 有助于胃癌的早期发现;PGⅡ水平低于萎缩性胃炎组 (P<0.05) , 这可能与胃发生癌变时, 胃体主细胞、泌酸腺黏液颈细胞、贲门腺和幽门腺的黏液细胞受到破坏, 导致PGⅡ分泌减少密切相关。

该研究还发现胃癌组PGⅠ、PGⅡ和G-17水平[ (79.59±83.37) μg/L、 (9.42±10.83) μg/L、 (5.20±9.91) pmol/L]显著低于慢性浅表性胃炎组[ (176.50±128.55) μg/L、 (17.77±15.75) μg/L、 (12.54±16.39) pmol/L] (P<0.01) 。因为其中G-17分泌到循环过程中水平受到较多因素的影响, 如胃底腺泌酸减少, 胃体萎缩性胃炎, 促使胃窦G细胞合成分泌G-17水平明显增加。在以胃窦萎缩为主的萎缩性胃炎患者中, G-17水平的分泌减少, 大多是由于胃窦黏膜细胞萎缩导致G细胞数量明显减少, 从而导致进入血液循环的G-17分泌水平降低。该研究中胃癌的G-17表达水平均较低, 刘中娟等[4]学者研究表明, PGⅠ、PGR在胃癌患者组中随胃粘膜萎缩严重性增加而逐渐降低, spearman相关性比较显示, 血清PGⅠ与胃粘膜萎缩程度具有负相关关系 (r=-0.3260P<0.05) , PGR也这样 (r=-0.3563 P<0.01) 。反之, 当同时患有胃体萎缩性胃炎时, 血浆G-17浓度伴随胃窦萎缩程度的增加而下降 (r=-0.4120 P<0.05) , 当无胃体萎缩时, 血浆G-17浓度与胃窦萎缩之间无关联。伴有较低水平G-17的患者患胃癌的风险最高, 这可能与胃癌的浸润及复发转移紧密联系, 可继续收集相关病例, 分不同部位进一步比较分析。过低的PGⅠ水平应注意早期胃癌的可能性, 由于血浆胃蛋白酶原的含量直接反映胃黏膜细胞的分泌功能, 胃癌患者血浆PGⅠ水平明显下降, 表明胃癌患者胃黏膜分泌能力减低。正如前所述胃癌的演变需要经过多个病变过程, 对慢性浅表性胃炎患者的血浆PG水平和G-17水平进行定期随访监测, 观察各项指标的变化, 有助于使可能向胃癌方向转变的高风险患者得到早期发现、早期诊断。

此外, 由于幽门螺杆菌生物学作用会将硝酸盐转变成亚硝酸盐或亚硝胺等化学物质, 从而导致人体癌变;或者人们在感染幽门螺杆菌后会造成胃黏膜的慢性炎症过程, 再加上环境因素联合影响会加快胃黏膜上皮细胞的过度恶性增殖病变, 幽门螺杆菌是一种常见癌病原体导致人体细胞病变引起胃癌变[5]。该研究发现血浆H.pylori Ig G抗体在慢性浅表性胃炎组阳性率高于胃癌组和慢性萎缩性胃炎组 (P<0.05) , 从而证实了H.pylori感染是慢性浅表性胃炎发病的重要生物因子[6]。

在以往诊断胃部相关疾病时, 钡餐X线片透视是作为普查的一种主要初筛手段, 但是此种方法隐藏着射线暴露的高风险[7]。对于胃肠道患者来说, 通过电子内窥镜检查来直接观察可能是诊断癌症等病变最好的一种方法, 而且方便采集粘膜标本用来做组织病理学检测。但是内镜检查是侵入性的, 不仅需要较高的医疗成本而且会给患者带来较大的痛苦[8,9,10]。血浆PG和H.p Ig G抗体检测作为非侵入性诊断方法, 对于慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和胃癌的筛查提供了具有简便、经济的优势。因此, 联合测定血浆PG和H.p Ig G抗体进行慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和胃癌大规模人群普查具有重要临床意义, 并可以此筛查出需要定期做胃镜及病理活检的高风险人群, 以期提高胃癌患者的早诊率, 使患者得到早诊断、早治疗。

摘要：目的通过测定血浆胃泌素17 (G-17) 、胃蛋白酶原Ⅰ (PGⅠ) 、胃蛋白酶原Ⅱ (PGⅡ) 、和H.pylori Ig G (Hp) 抗体来探讨其在胃部疾病中的联合诊断价值。方法 整群选取2014年8月—2015年12月在南平市第一医院216例住院患者, 根据胃镜和组织病理学检查结果将受检者分为胃癌组 (74例) 、慢性萎缩性胃炎组 (22例) 、慢性浅表性胃炎组 (70例) 、正常对照组 (50例) 。每一例均用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 定量测定空腹血浆PGⅠ、PGⅡ和G17水平, 定性测定H.pylori Ig G抗体。结果1PGⅠ、PGⅡ和G-17水平在慢性浅表性胃炎[ (176.50±128.55) μg/L、17.77±15.75) μg/L、 (12.54±16.39) pmol/L]明显高于正常组[ (107.78±25.48) μg/L、 (8.13±2.79) μg/L、 (4.34±3.33) pmol/L]和胃癌组[ (79.59±83.37) μg/L、 (9.42±10.83) μg/L、 (5.20±9.91) pmol/L], 组间t检验差异有统计学意义 (P<0.01) ;2PGR (PGⅠ/PGⅡ比值) 水平在慢性浅表性胃炎 (12.90±6.50) 高于慢性萎缩性胃炎 (9.29±5.80) , 差异有统计学意义 (P<0.05) ;3PGⅠ水平在胃癌 (79.59±83.37) μg/L明显低于正常组 (107.78±25.48) μg/L, 组间t检验差异有统计学意义 (P<0.01) 。PGⅠ和PGⅡ水平在胃癌[ (79.59±83.37) μg/L、 (9.42±10.83) μg/L]低于慢性萎缩性胃炎[ (165.40±144.77) μg/L、 (23.40±28.89) μg/L], 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 血浆PGⅠ、PGⅡ与胃黏膜炎性病变密切相关, 可作为慢性浅表性胃炎初步筛查和动态疗效评价的重要辅助诊断手段;PGR可用于慢性萎缩性胃炎的筛查;PGⅠ水平显著低下可做胃镜进行胃癌筛查, 有助于提高胃癌的早期诊断率。

关键词：胃蛋白酶原,H.pylori Ig G抗体,慢性浅表性胃炎,慢性萎缩性胃炎,胃癌

参考文献

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[5]董红霞, 梁浩.不同国家人群幽门螺杆菌感染与结直肠癌相关性的Meta分析[J].解放军医学杂志, 2015, 40 (3) :236-240.

[6]李晓庆, 郑奎城, 林曙光.福建省沿海地区居民PG、G-17及H.pylori抗体血清流行病学调查[J].现代预防医学, 2014, 41 (9) :1543-1546.

[7]付明生, 潘淑贤, 朱金水.血清胃蛋白酶原比值和CA724对胃癌的诊断价值及相关性分析[J].胃肠病学和肝病学杂志, 2014, 3 (3) :256-258.

[8]汪畅, 王凤超.血清胃蛋白酶原检测及其在胃癌筛查中的应用进展[J].中华全科医学, 2013, 11 (8) :1280-1281.

[9]M Dinis-Ribeiro.G Yamaki.1K Miki.A Costa-Pereira.M Matsukawa and M Kurihara.Meta-analysis on the validity of pepsinogen test for gastric carcinoma, dysplasia or chronic atrophic gastritis Screening[J].Journal of Medical Screening, 2004, 11 (3) :141-147.

胃蛋白酶 篇8

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

抗PGⅠ单克隆抗体8003#和8009#，抗PGⅡ单克隆抗体8101#和8103#均购自Medix Biochemia公司。发光微粒由博阳生物科技(上海)有限公司提供。LICA通用液系LICA HT光激化学发光检测仪的配套试剂。二奎啉甲酸(BCATM)法蛋白质定量检测试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司。相关性分析样本，来自于上海中医药大学附属曙光医院住院及门诊病人新鲜血液，分离血清冷冻保存。LICA HT高通量均相发光免疫分析仪、LICA SP全自动移液器由上海博阳医疗仪器有限公司提供；粒径仪为NICOMP380激光衍射式粒度分布测量仪。96孔微孔板为LICA HT高通量均相发光免疫分析仪配套专用板。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫发光微粒的制备

依照参考文献[5]，取适量200nm左右表面为活性醛基的发光微粒2支，离心处理，超声分散至0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.0)中，以10∶2(W/w)的比例分别加入单克隆抗体8003#和8101#，分别加入适量三氢硼氰化钠(NaCNBH3)催化，37℃旋转混合反应48h，进行离心，清洗未反应的单抗，之后将其分别定容至10mg/mL,4℃保存备用。

1.2.2 抗体的生物素标记

取适量单克隆抗体8009#和8103#，将其溶液的p H值调整为8.5，以1∶30(摩尔比)的比例加入生物素(Biotin)，4℃混合反应过夜，之后将未反应的生物素进行透析处理，将其定容至1mg/m L,4℃保存备用。

1.2.3 标准品的制备

将两份经Abbott Architect系统定值的PGⅠ、PGⅡ混合样本用分别小牛血清系列稀释，配制成0、5、35、70、200、500ng/mL的PGI标准液和0、5、10、20、50、100ng/mL的PGⅡ标准液。再使用Abbot Architect系统对每个稀释液进行标定，标定合格后，分装成每管1mL，保存在-20℃备用。

1.2.4 检测方法

在96孔微孔板中，每孔依次加入标准品或者待测样本25µL、免疫发光微粒试剂25µL、生物素标记试剂25µL，将微孔板置于LICA HT光激化学发光检测仪内，仪器程序设定为37℃温育1200s，然后仪器自动加入LICA通用液175µL,37℃温育900s后，读取光信号RLU值。

1.2.5 检测方法性能评价

1.2.5. 1 分析灵敏度

方法参考EP17-A[6]程序：质控在控的情况下，同批试剂一次运行空白样本或零值校准品20次，计算均值及SD，以空白均值±2SD来计算方法的分析灵敏度。

1.2.5. 2 回收率

待测样本等体积分为3份，取2份分别以等体积与高低质控品（QC H和QC L）等体积混合，分别测定待测样本、混合后样本、QC H和QC L各测3次，取均值，计算回收率。回收率=实际检测浓度/理论浓度×100%。

1.2.5. 3 精密度

参考EP5-A2[7]程序：采用同一批试剂、校准品，以各自配套的质控血清作为测试标本，一次运行对标本重复测定至少20次。计算均值、SD及CV。

1.2.5. 4 稳定性

37℃加速稳定性实验，将试剂在37℃存放7d，然后对其进行物理检查，并在线性、灵敏度、精密度方面考察其稳定性。

1.2.5. 5 方法学相关性分析

取65份患者血清样本，分别用建立的LICA和Abbott Architect试剂(化学发光法)进行检测，并对2种方法的检测值进行比较，得到相关性曲线。

2 结果

2.1 分析灵敏度

光激化学发光法PGⅠ、PGⅡ试剂盒的分析灵敏度分别为0.8ng/m L和0.6ng/m L。

2.2 批内精密度

光激化学发光法PGⅠ、PGⅡ试剂盒QC L的批内精密度分别为4.1%和4.3%，QC H的批内精密度分别为0.93%和1.2%。

2.3 回收率

样本与QC L等体积混合后的样本为样本1，与QC H等体积混合后的样本为样本2，回收率=实际检测浓度/理论浓度×100%。结果见表1。

2.4 稳定性

将37℃存放7d的试剂取出，对其进行物理检查，并考察试剂的线性、灵敏度、精密度，结果见表2。

2.5 与化学发光法检测结果的相关性

分别用LICA法和Abbott化学发光法检测65份患者血清样本的PGⅠ和PGⅡ的浓度，相关结果见图1和图2，相关性方程分别为YPGI=1.004XPGI-0.147,r=0.977;YPGII=0.885XPGII+2.311,r=0.951；对二相关系数做统计分析，r>r0.05(63)，P<0.05，说明相关系数有统计意义。

3 讨论

已有报道证实[8,9]，血清胃蛋白酶原的水平可动态地反映胃黏膜的状态和组织功能：在发生基底腺黏膜萎缩性胃炎时，会伴随着血清PGⅠ含量的显著下降，PGⅠ/PGⅡ的比值降低，这提示了胃癌的可能；在胃溃疡时，PGⅠ会异常增高；比较溃疡组、慢性萎缩性胃炎组、胃癌组和正常组的PGⅠ值和PGⅠ/PGⅡ值，其大小顺序如下：溃疡组>正常组>萎缩性胃炎组>胃癌组。由于PGⅠ、PGⅡ检测成本相对低廉且操作简便，适合大批量的标本检测，对胃黏膜疾病的大规模筛查具有实用价值，因此可作为慢性萎缩性胃炎的胃黏膜萎缩程度筛查指征。

对PG的检测目前已经报道的方法有免疫比浊分析、化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析等，但这些方法分别存在敏感性差、定量范围窄、需要反复清洗与分离、检测耗时长、自动化程度不高等缺点。光激化学发光是继LOCI[10]（Luminescent oxygen channeling immunoassay）技术问世之后，在国内建立、发展并应用于临床检测的一种新型检测技术。在均相条件下将内部带有染料的LICA通用液微粒以及包被有活性分子并且内部带有发光化合物的发光微粒混合物和检测样本混合。此时LICA通用液微粒和包被有活性分子的发光微粒可迅速有效地捕捉靶分子并形成免疫夹心复合物。经680nm激发光照射后，LICA通用液微粒中的染料被诱导激活，并释放高能态的单线态活性氧。该高能态的活性氧被近距离的发光微粒俘获，传递能量以激活所述发光微粒中的发光化合物。数微秒后，发光微粒中的发光化合物将释放出高能级610nm红光，用光子计数器计数得到相对光量子单位(RLU)值。该法反应为均相反应，既可加快反应速度，又可避免反复分离与清洗，同时，由于微粒表面积的增加，也提高了检测的灵敏度。

本研究采用LICA的双抗体夹心法，建立了测定PGⅠ和PGⅡ的方法，并考察了分析性能。结果表明，LICA法测定PGI和PGII的本底低、灵敏度高、特异性强、准确性和重复性好、分析时间短(仅为25min)。在37℃7d的加速稳定性实验中，试剂的外观目测无沉淀，粒径分布均一，在线性、灵敏度、精密度方面也和4度试剂无明显差异，试剂的稳定性佳。

LICA测定PGⅠ和PGⅡ的分析灵敏度分别为0.8ng/m L和0.6ng/m L，同市场上同类产品雅培的灵敏度1ng/m L和0.5ng/m L近似；本法的回收率高，在90%～110%之间；质控血清的批内和批间CV均<5%，具有很好的准确性和重复性，与化学发光法的相关性好，可适用于临床。该方法的建立有助于进一步进行长期稳定性试验和相应的检测试剂盒的研制。

参考文献

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[2]Samloff IM,Liebman WM(1973).Cellular localization of thegroup II pepsinogens in human stomach and duodenum by imm-unofluorescence[J].Gastroenterology,1973,65(1):36-42.

[3]孙丽萍,袁嫒.胃蛋白酶原含量检测及其在胃疾病诊治中的应用[J].世界华人消化杂志,2001,9(10):1174-1176.

[4]高云朝.光激化学发光技术研究进展及应用[J].中华检验医学杂志,2009,32(4):474-476.

[5]Hermanson GT.Bioconjugate Techniques[M].2nd ed.Anaheim:Academic Press,2008:890-892.

[6]Clinical and Laboratory Standards Institute(Formerly NCCLS).Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits ofQuantitation;Approved Guideline-Second Edition[S].EP17-A,NCCLS,2004.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute(Formerly NCCLS).Evaluation of Precision Performance of Quantitative MeasurementMethods[S].EP5-A2,NCCLS,2004.

[8]吴志成,何敏,夏勇.血清胃蛋白酶原检测与慢性萎缩性胃炎相关研究[J].齐齐哈尔医学院学报,2010,31(13):2027-2028.

[9]姜智敏,戈之铮.胃蛋白酶原在慢性萎缩性胃炎和胃癌筛查中的价值[J].胃肠病学,2009,14(12):754-756.

胃蛋白酶 篇9

关键词：胃蛋白酶,分离,纯化,应用

1 生物提取法生产胃蛋白酶

1.1 工艺路线 (图1)

1.2 工艺过程

(1) 原材料的选择和预处理:胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部, 采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2mm~3mm的胃基底部粘膜最适宜, 每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。 (2) 自溶、过滤:在夹套锅内预先加水100升及盐酸3.6~4升, 加热至50度时, 在搅拌下加入200千克猪胃黏膜, 快速搅拌使酸度均匀, 保持45~48度, 消化3~4小时, 得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白, 收集滤液。 (3) 脱脂、去杂质:将滤液降温至30℃以下, 加入15%~20%氯仿或乙醚, 搅匀后转入沉淀脱脂器内, 静置24~48小时, 使杂质沉淀, 分出弃去, 得脱脂酶液。 (4) 浓缩、干燥:取清酶液, 在40℃以下减压浓缩至原体积的1/4左右, 再将浓缩液真空干燥。球磨过80~100目筛, 即得胃蛋白酶粉。

2 胃蛋白酶的分离技术

2.1 有机溶剂法

可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮, 其沉淀蛋白质的能力为:丙酮>异丙酮>乙醇>甲醇。当然此顺序也不是一成不变的, 因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好, 但挥发损失多, 价格较昂贵, 所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。

2.2 盐析法

盐析法是酶制剂工业中常用方法之一, 硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂, 其中用的最多的是硫酸铵。美国专利 (2, 701, 228) 改进后, 用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇 (或酮) 在50%~55%、pH在5.0~5.2时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀, 沉淀物为胃酶的锌盐, 然后用金属螯合剂除去锌盐, 得15000~16000倍活力的酶, 收集率为5.0%~5.5%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。

2.3 底物亲和法

底物亲和法是利用酶 (胃蛋白酶) 与其底物 (酪蛋白) 的亲和性, 从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸缓冲液中充分结合, 然后调pH至4 (底物的等电点) 沉淀底物和酶的结合物, 随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中, 添加低浓度的SDS将底物和酶分离, 得到酶-SDS复合物, 再进一步分离纯化。陈躬瑞 (2001) 成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离, 得率大约为30%。与传统的分离方法比较, 此法具有简单高效的优点, 为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用, 同时具有较高的特异性。[2]

2.4 透析法

胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程, 如果袋内外的盐浓度相等, 扩散就会停止, 因此要经常换溶剂, 一般一天换2~3次。如在冷处透析, 则溶剂也要预先冷却, 避免样品变性。透析时的盐是否除净, 可用化学试剂或电导仪来检测。[1]

3 胃蛋白酶的纯化技术

3.1 凝胶过滤法

美国在20世纪60年代研究结晶为蛋白酶的生产工艺时, 是将75mg的胃蛋白酶原样本溶解在8mL的蒸馏水中 (pH5.0~6.0) , 在14℃±1, pH2.0下, 保持20min激活。然后用磺乙基Spandex G-25层析, 最后用羟基磷灰石进行色谱层析。结果表明用层析法得到的胃蛋白酶为单一物质纯品。

3.2 离子交换层析法

陈躬瑞等人在纯化蕲蛇胃蛋白酶时将SDS沉淀后的上清液上样到预先用0.05mol/L乙酸缓冲液 (pH5.0) 平衡的DEAE—TOYOPEARL离子交换色谱柱 (4.6mm X100mm) 上, 用0~0.25mo1/L氯化钠梯度洗脱, 流速为1ml/min。得到的酶在50℃30min有较高的活性, 有望应用于高温食品加工中。[2]

基于以上对胃蛋白酶的分离纯化技术的比较分析可以看出, 长期以来分离提取技术一直没有取得较大的突破, 用有机溶剂、盐析等技术得到的天然胃蛋白酶产品, 纯度、生物活性愈将不能满足医药品和工业日益增长的需要。随着分离科学技术的不断发展, 采用新型分离技术分离胃蛋白酶已势在必行。因此, 大多数学者认为以下几种技术是胃蛋白酶分离纯化的方向。

3.2.1 有机溶剂与盐析共沉淀

有机溶剂和盐析法都是分离纯化胃蛋白酶的传统方法, 有其各自的特点。如果将有机溶剂和盐析配合使用, 不仅可以降低盐的用量, 而且可以不同程度的消除各自分离纯化所带来的问题, 得到的胃蛋白酶纯度和活性也会有所增加。

3.2.2 膜分离技术

分离膜是一种特殊的、具有选择性透过功能的薄层物质, 能利用分子大小实现分离, 从而起到浓缩和分离纯化的作用。由于其可在维持原生物体系环境的条件下实现分离, 并可高效地浓缩、富集产物, 有效地去除杂质, 加之操作简单, 结构紧凑、能耗低, 过程简化, 无一次污染, 也将成为胃蛋白酶分离纯化工艺的研究方向。

3.2.3 等电点沉淀法与底物亲和法

胃蛋白酶具有极低的等电点 (如猪胃蛋白pH1.0) , 但胃蛋白酶的分离纯化技术中等电点沉淀法未见报道, 如果此方法可实现, 那将大大缩短分离纯化的时间。底物亲和法是分离纯化胃蛋白酶的新亮点, 但其工艺条件还不成熟, 尤其是在分离底物和酶的复合物时, SDS的添加量有待研究。

4 结语

有人预言, 21世纪将是生物技术的世纪, 尤其是生物制药技术的世纪。生物制药被誉为21世纪的“朝阳产业”。得益于生物制药技术的酶类药物也日趋成熟。高效的胃蛋白酶分离纯化工艺、技术和设备的出现, 人们必将开发出高效的胃蛋白酶提取工艺。这对于提高功能性胃蛋白酶产品、提高生产率、降低生产成本和改善人民生活水平起着举足轻重的作用。而胃蛋白酶单一组分的制备分离, 可为胃蛋白酶的研究开发提供标准品, 同时能为后期胃蛋白酶单一组分生理活性的研究提供必要的物质保障。

参考文献

[1]张继平, 郭照良, 唐东生, 等.暗纹东方纯胃蛋白酶的分离纯化及部分性质研究[J].湖南农业大学学报, 2004 (30) :526～529.

[2]陈躬瑞, 柯李晶, 赵恒裕, 等.底物亲和法分离纯化薪蛇胃蛋白酶[J].中国食品学报, 2001 (1) :50～55.

海参蛋白酶解工艺初步研究 篇10

【关键词】海参；蛋白；酶解；工艺

【中图分类号】R284.2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）19-0016-02

自古以来，海参就是名贵的滋补珍品，具有延缓衰老和防治肿瘤的作用[1]。海参体内含有蛋白质、维生素、多种微量元素、胶质、海参皂苷、酸性粘多糖等成分，且不含胆固醇。而蛋白质是海参中重要的营养成分，因此加工过程中得到更多的可溶性蛋白成为了技术关键。本实验以外观性状、味道、腥味等为指标，考察不同海参处理方式和酶解条件对海参酶解的影响，为制备色香味俱全的海参膏提供技术支持。

1仪器与材料

1.1仪器HH-4电热恒温水浴锅（国华电器有限公司）；C21-ST2106电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司）；JYL-C022豆浆机（九阳股份有限公司）；JYT-5天平（上海医用激光仪器厂）。

1.2材料海参药材购于亳州药材市场；风味蛋白酶、碱性蛋白酶（瑞士Novozymes公司）；蜂蜜（江西省养蜂研究所）。

2方法与结果

2.1前处理取干海参样品，加10倍水浸泡2～3d，每天换一次水，去内脏和筋膜，切块，粉碎成粗颗粒状，即得生海参。取生海参蒸煮1h，放冷，即得熟海参。

【摘要】目的：以外观性状、味道、腥味等为指标，考察不同海参处理方式和酶解条件对海参酶解的影响，为制备色香味俱全的海参膏提供技术支持。方法：用风味蛋白酶和碱性蛋白酶对生、熟海参进行酶解，观察不同时间、不同温度、不同加酶量条件下海参膏性味。结果：以风味蛋白酶制备的海参膏性味较好，以熟海参为底物酶解速度明显快于以生海参为底物酶解速度，按酶与海参比0.03ml/g加入风味蛋白酶制备的海参膏性味较好，60℃时酶解速度快于其他温度下酶解速度，酶解7h海参即可酶解完全。结论：海参酶解的最佳工艺条件：以熟海参为底物，采用风味蛋白酶，加酶量0.03ml/g，温度60℃，时间7h。

【关键词】海参；蛋白；酶解；工艺

【中图分类号】R284.2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）19-0016-02

自古以来，海参就是名贵的滋补珍品，具有延缓衰老和防治肿瘤的作用[1]。海参体内含有蛋白质、维生素、多种微量元素、胶质、海参皂苷、酸性粘多糖等成分，且不含胆固醇。而蛋白质是海参中重要的营养成分，因此加工过程中得到更多的可溶性蛋白成为了技术关键。本实验以外观性状、味道、腥味等为指标，考察不同海参处理方式和酶解条件对海参酶解的影响，为制备色香味俱全的海参膏提供技术支持。

1仪器与材料

1.1仪器HH-4电热恒温水浴锅（国华电器有限公司）；C21-ST2106电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司）；JYL-C022豆浆机（九阳股份有限公司）；JYT-5天平（上海医用激光仪器厂）。

1.2材料海参药材购于亳州药材市场；风味蛋白酶、碱性蛋白酶（瑞士Novozymes公司）；蜂蜜（江西省养蜂研究所）。

2方法与结果

2.1前处理取干海参样品，加10倍水浸泡2～3d，每天换一次水，去内脏和筋膜，切块，粉碎成粗颗粒状，即得生海参。取生海参蒸煮1h，放冷，即得熟海参。

【摘要】目的：以外观性状、味道、腥味等为指标，考察不同海参处理方式和酶解条件对海参酶解的影响，为制备色香味俱全的海参膏提供技术支持。方法：用风味蛋白酶和碱性蛋白酶对生、熟海参进行酶解，观察不同时间、不同温度、不同加酶量条件下海参膏性味。结果：以风味蛋白酶制备的海参膏性味较好，以熟海参为底物酶解速度明显快于以生海参为底物酶解速度，按酶与海参比0.03ml/g加入风味蛋白酶制备的海参膏性味较好，60℃时酶解速度快于其他温度下酶解速度，酶解7h海参即可酶解完全。结论：海参酶解的最佳工艺条件：以熟海参为底物，采用风味蛋白酶，加酶量0.03ml/g，温度60℃，时间7h。

【关键词】海参；蛋白；酶解；工艺

【中图分类号】R284.2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）19-0016-02

自古以来，海参就是名贵的滋补珍品，具有延缓衰老和防治肿瘤的作用[1]。海参体内含有蛋白质、维生素、多种微量元素、胶质、海参皂苷、酸性粘多糖等成分，且不含胆固醇。而蛋白质是海参中重要的营养成分，因此加工过程中得到更多的可溶性蛋白成为了技术关键。本实验以外观性状、味道、腥味等为指标，考察不同海参处理方式和酶解条件对海参酶解的影响，为制备色香味俱全的海参膏提供技术支持。

1仪器与材料

1.1仪器HH-4电热恒温水浴锅（国华电器有限公司）；C21-ST2106电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司）；JYL-C022豆浆机（九阳股份有限公司）；JYT-5天平（上海医用激光仪器厂）。

1.2材料海参药材购于亳州药材市场；风味蛋白酶、碱性蛋白酶（瑞士Novozymes公司）；蜂蜜（江西省养蜂研究所）。

2方法与结果

胃蛋白酶 篇11

关键词：腺样体肥大,胃内容物反流,鼻咽反流,胃蛋白酶

腺样体肥大(adenoid hypertrophy,AH)是小儿的常见病、多发病,既往认为邻近器官病变刺激、病原微生物感染及变态反应等都是可能的病因[1]。近些年,胃内容物的食管外反流在上呼吸道、消化道病变中的致病作用有逐渐被认识,其中引起损伤的主要是胃酸和胃蛋白酶[2]。有研究提示,小儿鼻窦炎、分泌性中耳炎与胃内容物反流进入鼻腔、中耳腔有关[2,3,4,5]。由于胃内容物反流到鼻腔、中耳腔,必须经过腺样体表面,刺激淋巴组织免疫应答而导致增生,所以腺样体肥大与胃内容物反流的相关性也逐渐被认识[6]。由于胃蛋白酶仅存在于胃内,在其他部位检测到胃蛋白酶可以作为胃内容物反流的一种方法,本课题通过检测鼻咽部分泌物和腺样体组织内胃蛋白酶的表达,探讨胃内容物鼻咽部反流与腺样体肥大的关系。

1 资料与方法

1.1 病例资料

选取2013年5月-2014年10因鼻塞、张口呼吸、打鼾等症状就诊于本院,经鼻咽镜检查确诊为腺样体肥大的患儿(腺样体堵塞后鼻孔>50%)作为实验组。选取因耳前瘘管、耳鼻喉科外伤等需行全身麻醉手术的患儿,并排除合并腺样体和扁桃体肥大,无喉咽反流及胃食管反流症状作为对照组。排除标准:①近3个月内曾使用质子泵抑制剂等抑酸药物;②患有免疫系统疾病或有其他严重系统疾病;③2周内曾发生过上呼吸道感染。本实验的设计、实施通过遵义医学院附属医院伦理委员会通过,所有实验标本的获得及使用经患者家属书面同意。本研究中实验组患者43例,男性23例,女性20例;年龄2.5~10.0岁,平均5.4岁;病程3~52个月,平均16.3个月。对照组22例,男性14例,女性8例。年龄2.8~12.0岁,平均6.2岁。两组患儿在性别、年龄方面比较,差异无统计学意义(P=0.316和0.627)。

1.2 胃蛋白酶的检测

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosor bent assay,ELISA)可以定量检测唾液、中耳分泌物等胃液外体液中的胃蛋白酶浓度[7,8,9],本研究使用ELISA进行鼻咽部分泌和腺样体组织中胃蛋白酶浓度的定量测定。所有标本的收集于全身麻醉生效后进行,鼻内镜下用5 ml注射器连接鼻腔吸管收集鼻咽部分泌物2 ml,置于-80℃冻存备用。对腺样体肥大需行腺样体切除术的患儿,术中在鼻内镜直视下切除腺样体,在保证病理检查所需组织量后,留取约1 cm2组织置于-80℃冰箱冷冻备用。检测鼻咽部分泌物标本时,若分泌物黏稠,则先以0.1%二硫苏糖醇(dithiothreitol,DDT)4倍体积充分混匀,37℃水浴10 min。对于腺样体组织,用生理盐水反复冲洗掉分泌物及血迹,用眼科剪剪碎组织,匀浆,全程冰上操作。所有标本均4℃、5 000 r/min离心15 min,取上清液,加入到人胃蛋白酶ELISA试剂盒(北京永辉生物技术有限公司),用全自动酶标仪(美国Thermo公司)检测。绘制标准曲线并进行分析,结果显示,标准品浓度与标准曲线测得浓度呈现较好的一致性,R2=0.98。由于正常儿童也可能存在生理性的胃内容物反流,本研究先用对照组标本进行测定胃蛋白酶浓度调零,获得标本的最终胃蛋白酶浓度,根据工作曲线及参考已发表文献[9],检测阳性的分界值设为2.5 ng/ml,即浓度>2.5 ng/ml说明在标本中胃蛋白酶为阳性,提示可能存在病理性反流。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,满足正态分布和方差齐性的用t检验,不满足者则用Wilcoxon检验。计数资料以率表示,组间比较用Pearson’sχ2检验或者Fisher’s精确概率法(n<40或T<1),检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃蛋白酶的表达

实验组和对照组鼻咽分泌物中胃蛋白酶浓度和胃蛋白酶阳性率比较,差异有统计学意义(P=0.000)。实验组胃蛋白酶浓度和阳性率均高于对照组。实验组有3例腺样体组织中检测到胃蛋白酶,该3例患者的鼻咽分泌物中胃蛋白酶浓度与实验组的浓度比较,差异有统计学意义(P=0.030),腺样体组织中检测到胃蛋白酶的患者浓度更高。见表1和图1。

注:Ⅰ度:腺样体堵塞后鼻孔50%~75%;Ⅱ度:腺样体堵塞后鼻孔>75%

2.2 腺样体肥大胃蛋白酶表达的亚组分析

以扁桃体超出腭舌弓与悬雍垂连线的中线位置作为扁桃体肥大的标准,将实验组进一步分为两个亚组,即:腺样体肥大不伴扁桃体肥大(A组,21例);腺样体肥大伴有扁桃体肥大(B组,22例)。A组和B组胃蛋白酶平均浓度分别为(2.907±1.694)和(2.699±1.420)ng/ml,胃蛋白酶阳性率分别为57.1%(12/21),54.5%(12/22),亚组间比较,差异无统计学意义(P=0.568和0.864)。本研究进一步进行鼻咽部胃蛋白酶表达水平与腺样体肥大程度的亚组分析,根据腺样体堵塞后鼻孔的程度,腺样体肥大分为2度:Ⅰ度肥大堵塞后鼻孔50%~75%,35例;Ⅱ度肥大堵塞后鼻孔>75%,8例。腺样体Ⅱ度大亚组中胃蛋白酶浓度和胃蛋白酶阳性率均高于腺样体Ⅰ度大亚组,差异有统计学意义(P=0.000和0.046)。见表2和图1、2。

注:Ⅰ度:腺样体堵塞后鼻孔50%~75%;Ⅱ度:腺样体堵塞后鼻孔>75%。实验组与对照组比较,用Fisher’s精确概率法;腺样体Ⅰ度与Ⅱ度比较,用Pearson’sχ2检验

3 讨论

胃蛋白酶是由胃主细胞分泌的胃蛋白酶原在胃酸的作用下活化而来。正常生理状态下,胃蛋白酶仅存在于胃液内,而病理状态下可以进入上呼吸道和消化道,从而引起局部病变。有研究报道,在上呼吸道、消化道检测到胃内容物成分,如唾液、泪眼、中耳分泌物、鼻腔分泌物[3,7,8,9],说明胃内容物反流可能是引起耳鼻喉科多种疾病的可能病因。现在多数研究采用24 h p H酸度计检测上呼吸道、消化道反流,但是24 h p H酸度计为有创检查,多数患儿家属难以接受。此外,由于胃内容物反流包括酸性反流,胆汁(碱性)反流及中性反流,24 h p H酸度计对碱性反流或中性反流诊断意义较小。由于胃蛋白酶仅存在于胃内,在其他部位检测到胃蛋白酶可以作为胃内容物反流的一种方法,SAMUELS等[10]对文献综合回顾分析,认为检测胃蛋白酶是诊断胃内容物反流的敏感性高、无创、快速、方便的客观诊断方法,KNIGHT等[11]发现,胃蛋白酶的诊断敏感性为100%,特异性为89%,可以应用于监测咽喉部反流事件。本研究通过检测鼻咽部分泌物中胃蛋白酶来诊断胃内容物的反流,发现腺样体肥大患儿的鼻咽部胃蛋白酶阳性率为55.8%,与KELES等[12]报道的通过24 h p H酸度计检测的结果基本一致,证实检测鼻咽部分泌物中的胃蛋白酶表达是检测鼻咽反流事件简便、快捷的客观检查方法。

此外,本研究还发现胃蛋白酶的表达与腺样体的肥大程度相关,说明胃内容物的鼻咽部反流可能与腺样体肥大的发病相关。腺样体肥大往往可以导致小儿鼾症,而上呼吸道阻塞造成的呼吸努力产生过大的胸腔内压,加重胃内容物反流,而过度的胃内容物反流又可以进一步刺激腺样体增生,从而造成一个恶性循环[13]。本研究还发现,腺样体肥大合并扁桃体肥大患儿的胃蛋白酶表达低于腺样体肥大不合并扁桃体的患者,虽然由于纳入病例数的限制,结果差异无统计学意义,笔者推测可能是扁桃体肥大患者造成口咽部的阻塞,阻碍胃内容物进入到鼻咽部,具体原因仍需进一步研究明确。本研究还在3例腺样体组织中检测到胃蛋白酶的表达,提示胃蛋白酶可通过主动或被动转运的方式进入到腺样体组织中,进而激发一系列的炎症反应,从而造成淋巴细胞增生。腺样体上皮为假复层纤毛柱状上皮,包括M细胞、树突状细胞等,构成腺样体的上皮屏障。滞留在腺样体隐窝内的胃内容物反流物可以损伤腺样体上皮,从而形成持续炎症。JOHNSTON等[14]通过细胞实验发现,喉黏膜上皮细胞的囊泡中有共存的胃蛋白酶与转铁蛋白,证实胃蛋白酶可以通过受体介导的胞饮而进入喉黏膜上皮,阐明胃蛋白酶介导的喉黏膜损伤的机制,但是腺样体黏膜上皮是否也存在类似的机制仍需后续的研究进一步研究。也有研究在部分腺样体肥大患儿的腺样体组织中检测到幽门螺杆菌[4],所以胃蛋白酶是否与胃内容物中其他成分有协同致病效应尚不明确,仍需更进一步研究。