DGGE

DGGE（精选6篇）

DGGE 篇1

0引言

蓝藻是一类具有光合产氧能力的革兰氏阴性原核微生物,全球生物量高达103Tg[1],是生态系统的重要组成部分[2]。蓝藻大约27亿年前出现在地球上[3],随着蓝藻的进化,逐步分化成具有固氮作用的异形胞和抗逆性强的原垣孢子[4]。一些蓝藻具有固氮能力被视为潜在的生物氮肥生产者[5],如单歧藻属( Tolypothrix) 、念珠藻属( Nostoc) 、鱼腥藻( Anabaena) 、节球藻属( Nodularia) 和眉藻属( Calothrix) 等[6,7,8,9,10]。

目前,关于不同环境中蓝藻多样性的研究很多, 如生物结皮、富营养化的湖泊等环境中。黄土高原的生物结皮中颤藻( Oscillatoriaceae) 为优势蓝藻[11]; 发生“水华”的鄱阳湖中鱼腥藻和微囊藻( Microcystis) 为优势蓝藻[12]。而对于稻田环境来说,蓝藻多样性研究的报道相对较少,相关报道主要集中在日本、印度和我国福建等地区[13,14,15],发现稻田土壤中主要以丝状蓝藻为主,且随时间发生菌群结构的演替。

我国的水稻产区主要在南方,但随着种植结构的调整,东北已成为我国重要的水稻产区之一。关于我国东北稻田生态环境微生物结构组成研究很少,特别是针对东北稻田蓝藻群落结构组成研究还未见报道。 为此本研究采用PCR - DGGE和克隆测序技术对水稻生长季的稻田土壤和田面水体中蓝藻群落结构进行了研究,初步解析了东北稻田蓝藻群落结构,旨在进一步明确不同稻田环境对蓝藻群落结构的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料

2012年分3次在水稻生长季采集稻田土壤和田面水样品。采集地点分别是吉林省的大安( 45°36' N,123°50' E) 、黑龙江省的牡丹江( 44°26' N,129°29' E) 、阿城( 45°28' N,126°58' E) 、建三江( 47°18' N, 132°33' E) 、绥化( 46°43' N,126°59' E) 和林甸( 47° 17' N,124°37' E) 。三次采样时间分别是6月12日 ~ 18日、6月26日 ~ 7月2日和7月8日 ~ 14日。

在每个采样点,随机选择3 ~ 5个点收集田面水和表层5 cm左右的稻田土壤。水样经过孔径为0. 4 μm和0. 2 μm的滤膜过滤,滤膜保存在 - 20℃ 冰箱中备用,滤液用于测定p H值和氨态氮、硝态氮含量; 取少量土壤样品装入1. 5 m L灭菌离心管中,放置于 - 80℃ 冰箱中保存备用。其它土壤样品风干,备用。

1.1.2试剂

Fast DNA SPIN Kit for Soil( Qbiogene Inc. ,Carlsbad,CA,USA ) 试剂盒; QIAEX Ⅱ 试剂盒 ( QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit,德国) ; PCR相关试剂购自北京全式金生物技术有限公司; 聚碳酸酯滤膜( Whatman,英国) ; p MD 18 - T、大肠杆菌感受态细胞DH5α( Ta KaRa,大连) ; 超纯水、TAE缓冲液等为实验室自备。

1.1.3仪器

DGGE仪、凝胶成像系统和Quantity One - 1 - D ( Version 4. 5) 软件( Bio. Rad,美国) ; PCR仪( GeneAmp PCR system 9700,Applied Biosystem) ; 元素分析仪( Vario EL Ⅲ,德国) ; 连续流动 分析仪 ( Skalar San++,荷兰) 。

1.2方法

1.2.1理化性质测定

稻田土壤和田面水的p H值测定分别采用土壤悬浊液和过滤液直接测定法; 土壤样品中全碳、全氮含量用元素分析仪测定,过滤液中氨态氮和硝态氮含量用连续流动分析仪测定。本研究中不同地点稻田土壤和田面水基本理化性状如表1所示。

1. 2. 2 PCR- DGGE

土壤微生物DNA采用试剂盒提取。水样微生物总DNA提取参考荆瑞勇[16]方法。采用蓝藻特异性引物对GC - Cya - b - F371 /Cya - R783对提取的总DNA进行PCR扩增[17]。

DGGE检测: 变性剂梯度为35% ~ 55% ,在60℃ 和100 V的条件下电泳16 h。

对DGGE条带进行数字化分析,用条带灰度值 ( Ni) 代替每个DGGE条带的扩增量进行计算[18],同时结合样点的理化性状进行冗余分析( Redundanc Analysis,RDA) 。计算公式如下:

式中: Pi= Ni/ N,Ni是样品上单各个条带的灰度值,N是每个泳道中条带灰度值的总和。

式中: S是丰富度,即每个泳道的条带数目 。

1.2.3条带测序及同源性分析

为了快速检测稻田中蓝藻类群,本研究通过构建DGGE Maker,在对marker条带测序 基础上,通过DGGE图谱上不同样点稻田条带位置与marker的比对,明确蓝藻的结构组成。采用分子克隆技术构建DGGE Maker。

将测序所得25条序列提交Gen Bank,获得登录号为KM892885 - KM892909。在NCBI网站上,采用BLAST检索测序测得不同条带基因信息归属,采用CLUSTALX 1. 81软件进行 同源性比 对[19],采用MEGA 4. 0软件构建系统进化树[20]。

2结果与分析

2.1供试稻田的基本理化性状

a ) Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 分别代表采样时期为 6 月 12 ~ 18 日 、6 月 26 日 ~ 7 月 2 日 7 月 8 日 ~ 7 月 14 日 。 Ⅰ , Ⅱ and Ⅲ represent the sampling data during the range of 12 - 18 June , 26 June - 2 July , 8 - 14 July , respectively.

供试样点的基本理化性状见表1。土壤p H值在7. 06 ~ 9. 35之间,土壤全碳值在10. 6 ~ 48 g·kg- 1之间,全氮值在0. 68 ~ 2. 94 g·kg- 1之间,碳氮比值在13. 1 ~ 36. 1之间; 田面水p H值在5. 26 ~ 8. 03之间, 氨态氮含量在1. 02 ~ 2. 29 g·kg- 1之间,硝态氮含量在0. 07 ~ 1. 28 g·kg- 1之间。表明供试样点间基本理化性状差别较大。

2.2蓝藻DGGE图谱及其RDA分析

所构建的DGGE marker可以表征土样和水样中绝大多数条带的位置( 图1b) ,而图1a和图1c分别是marker与土样和 田面水水 样同时进 行电泳得 到DGGE图谱。由图可知,同一地点稻田土壤和田面水DGGE图谱差异明显,表明稻田土壤和田面水中蓝藻群落结构存在较大差异。

由图1a可知,不同地点间及相同地点的不同时期间土壤样品DGGE图谱存在一定的相似性,有许多共有条带,如2A、6D、9A、14A、15D、15A、17A,但也有一些是特殊条带,如条带22A在建三江、绥化和林甸存在,条带26D在建三江和绥化存在,条带19A在阿城、林甸和绥化存在,11A在大安、绥化和林甸存在。 该结果表明,不同地点的稻田土壤中蓝藻群落结构存在一定的差异。对图谱进行RDA分析,所有样品按采样点聚成6个集团,每个集团又包含3个不同采样时期的样品( 图2a) ,表明不同样点蓝藻群落结构存在明显的差异,而采样时期对蓝藻群落结构影响不明显。土壤环境因子对蓝藻群落结构影响由图2a中箭头长短表示,箭头越长,说明影响越大,反之越小。本研究中发现土壤碳氮比值( C /N值) 是影响稻田土壤蓝藻群落结构的主要环境因子。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 分别代表采样时期为 6 月 12 ~ 18 日 、6 月 26 日 ~ 7 月 2 日和 7 月 8 日 ~ 14 日 。Ⅰ , Ⅱand Ⅲ represent the sampling data during the range of 12 - 18 June , 26 June - 2 July , 8 - 14 July , respectively.

图1c可知,不同地点及同一地点的不同时期田面水蓝藻DGGE图谱条带位置、强弱表现出很强的随机性,多数条带没有规律可循,表明不同样点间田面水蓝藻群落结构组成无明显差异,同样采样时期也对田面水蓝藻群落结构组成影响无规律可循。对图谱进行RDA分析,在仅测得的3个环境因子中,发现p H值对水体蓝藻群落结构的影响大于氨态氮,而后者又大于硝态氮( 图2b) 。

2.3土壤和田面水体蓝藻多样性指数

不同样点土壤的DGGE条带数差别不大,在15 ~ 22条之间,但远高于稻田田面水的条带数( 4 ~ 15条) ,土壤中蓝藻多样性指数在2. 675 ~ 3. 058之间, 也远高于田面水多样性指数1. 385 ~ 2. 693,表明稻田土壤中蓝藻的种类明显高于田面水,多样性更丰富。比较同一个样点不同采样时期蓝藻多样性指数发现,采样时期对多样性指数影响无规律可循,表明采样时期对蓝藻多样性指数变化影响不大。比较所有样品的均匀度指数E发现,该指数变化不大,表明所采样点土壤和田面水中不同种类蓝藻分布均匀 ( 表2) 。

小圆圈代表样点依次是大安( 1、2 和 3 ) 、 牡丹江( 4、5 和 6 ) 、 阿城( 7、8 和 9 ) 、 建三江( 10、11 和 12 ) 、 绥化( 13、14 和 15 ) 和林甸( 16、17 和 18 ) 。The circle number of 1 , 2 and 3 represent Da’an ; 4 , 5 and 6 represent Mudanjiang ; 7 , 8 and 9 represent Acheng ; 10 , 11 and 12 represent Jiansanjiang ,; 13 , 14 and15 represent Suihua ; 16 , 17 and 18 represent Lindian.

2.4条带克隆测序及系统进化分析

对marker上25条DGGE条带进行测序,序列长度在440 ~ 445 bp之间。在NCBI网站上同源性比对结果显示,这些序列与已知序列的最高相似性在92% ~ 99% 之间,其中有9个条带序列与不可培养的细菌克隆或蓝藻克隆的相似性在97% 以下( 表3) , 表明在东北稻田生态系统中存在一些未被认知的蓝藻种类。

图3为本研究得到的25条序列与从Gen Bank下载的可培养蓝藻和蓝藻克隆基因序列,以及3株非蓝藻细菌( Outgroup) 序列构建的系统进化树。该进化树可划分为10个进化簇( Cluster) ,Cluster Ⅰ - Ⅵ中的已知序列属于颤藻亚纲( Oscillatoriophycideae) ,包含本研究获得的76% 的序列。比对分析发现,约56% 的序列属于丝状蓝藻,主要位于进化树的Cluster Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅵ中; 约28% 的序列属于球状蓝藻,主要位于进化树的Cluster Ⅳ、Ⅴ和Ⅷ中。

3讨论

稻田是一个独特的生态系统,在水稻生长季处于浸水状态,在水稻收获季后处于落干状态,即包含田面水和土壤两部分。袁伟玲[21]发现稻渔共作降低了田面水中蓝藻优势度,而稻鸭共育对田面水中蓝藻无明显影响[22]。Asari N等[13]、Kumari T等[14]和Song T等[15]仅研究了稻田土壤的蓝藻群落结构。由于试验目的不同,他们均未对田面水和稻田土壤中蓝藻群落结构同时进行解析。本研究首次对东北稻田土壤和田面水蓝藻群落结构同时进行对比研究,发现土壤中蓝藻多样性较田面水体更加丰富,土壤与田面水蓝藻群落结构差异明显( 图1) ,说明在稻田生态系统中土壤和田面水中生存着不同的蓝藻种群,这也从一个侧面佐证了稻田土壤和田面水中侵染蓝藻的细菌病毒基因群集的不同[23]。

福建稻田中存在鞘丝藻( Leptolyngbya) 、念珠藻、 伪枝藻 ( Scytonema) 等蓝藻类群,大部分是丝状蓝藻[15],与本研究结果一致。而本研究发现东北稻田中存在织线藻( Plectonema) 、浮丝藻( Planktothrix) 等和一些未知的蓝藻类群,说明我国南北方稻田中蓝藻群落结构可能受到气候等环境因素的影响而产生差异。

土壤类型、养分和p H值能够改变土壤细菌结构[24]。张巍和冯玉杰[25]报道了松嫩平原不同类型盐碱土中蓝藻组成存在一定的差异,暗示着蓝藻群落组成可能受到土壤因子的影响。本试验的6个采样点来源于不同的土壤类型,其中建三江是白浆土、林甸是黑钙土、绥化和阿城是黑土、大安是盐碱土、牡丹江是暗棕壤。本研究发现不同样点土壤中蓝藻群落结构组成差异显著,表明土壤类型是影响稻田土壤蓝藻结构的主要因素,其中土壤C /N值是最主要土壤因子( 图2a) ,而3个采样时期对同一样点土壤蓝藻组成影响不明显,说明针对同一土壤而言,其蓝藻群落稳定,随时间演替变化小。但需要指出的是,本研究的3个采样时期间隔较短,随着采样时期间隔延长,在时间尺度上稻田土壤蓝藻群落结构可能会存在变化,相关研究有待进行。

在温度适宜的湖泊中,水体的N/P值是影响蓝藻群落变化的主要环境因子[26]。而Cai H等[27]发现切萨皮克湾( Chesapeake Bay) 在冬夏转变的过程中, 温度是影响蓝藻群落变化的主要环境因子。本研究采样期在6月 ~ 8月间,温度差异不大,因此可以忽略温度的影响。这段时间属水稻分蘖和抽穗期,对氮素的需求较高,为此本研究主要分析田面水体的p H值、铵态氮、硝态氮对蓝藻群落结构的影响,其中p H值是影响水体蓝藻群落结构的主要环境因子 ( 图2b) 。本研究发现不同样点间田面水体蓝藻群落结构变化无规律可循,这与我们预期的结果不同。分析导致这种结果的原因可能与采集的样品是野外田间样品有关,不同地点在田间管理模式存在差异,如排水灌溉、农药使用和追肥等,这些农业管理措施均直接作用在田面水上,从而导致不同地点田面水微生物,包括蓝藻群落结构组成变化无规律可循。由此,我们建议如若研究不同土壤类型发育成的稻田田面水微生物群落结构时应在可控条件下进行,如盆栽试验。

4结论

采用蓝藻特异性引物扩增16S r DNA基因序列, 采用DGGE和克隆测序相结合技术解析了东北稻田不同地点蓝藻群落结构组成。结果发现,不同地点稻田土壤蓝藻群落结构差异明显,而田面水蓝藻群落结构变化无规律; 稻田土壤蓝藻组成比田面水丰富、复杂; 稻田蓝藻组成以丝状蓝藻为主; 颤藻亚纲蓝藻 ( Oscillatoriophycideae) 是主要的蓝藻类型; 稻田土壤C / N值是驱动土壤蓝藻群落结构的主要影响因子, 而p H值是驱动水体蓝藻群落结构的主要影响因子。测序结果发现一些DGGE条带序列与已知序列相似度低,说明在东北稻田中生存着迄今为止尚未明晰的蓝藻种类。

DGGE 篇2

水体微生物多样性PCR-DGGE分析方法的比较研究

PCR-DGGE法是一种分析微生物群落和微生物多样性的分子生物学技术.阐述了在应用PCR-DGGE分析水体微生物多样性研究当中进行优化菌体收集、DNA 提取、凝胶染色的`方法,结果表明:用过滤法收集菌体更具完整性,用CTAB法提取环境总DNA最佳,用16 h电泳更具可信度,银染法优于EB法.

作 者：向少能 陈琳 何晓丽 陈章宝 XIANG Shao-neng CHEN Lin HE Xiao-li CHEN Zhang-bao  作者单位：西南大学,重庆,400715 刊 名：重庆工学院学报（自然科学版）  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF CHONGQING INSTITUTE OF TECHNOLOGY 年，卷(期)：2007 21(7) 分类号：Q938 关键词：PCR-DGGE   微生物多样性   水体   条件优化  

DGGE 篇3

本研究通过非培养方法揭示了大豆内生细菌的种群多样性特征信息及动态分布, 发现不同大豆品种内生细菌的种群存在差异, 揭示了各个大豆品种不同生长期植株根、茎、叶不同部位内生细菌种群结构以及动态变化情况, 将有利于开发植物内生细菌这个巨大的微生物资源宝库, 带来巨大的社会效益[3,4]。

1 实验方法

1.1 样品总DNA的提取与纯化

采用TIANamp Bacteria DNA Kit基因组提取试剂盒 (TIANGEN) 提取基因组, 提取大豆植株样本总DNA。

利用Universal DNA Purification Kit总DNA纯化回收用试剂盒 (TIANGEN) , 按说明书操作。

1.2 大豆内生细菌16S r DNA片段的PCR扩增

大豆植株样本内生细菌的16S r DNA片段PCR扩增利用巢式PCR方法, 以大豆样本总DNA为模板, 细菌通用引物799F (AACAGGATTAGATACCCT G) 和1492R (GGTTACCTTGTT ACGACTT) 扩增细菌16S r DNA片段, 这样可以免去大豆植株体细胞中线粒体及叶绿体遗传物质的干扰。将扩增产物中分子量为740 bp左右的片段回收, 并将其作为模板, 选用引物968F (AAC GCG AAG AAC CTT AC) 和1378R (CGG TGT GTA CAA GGC CCG) 扩增细菌16S r DNA的V6-V8高变区[5]。引物合成时, 在引物968F的5'端加上40个碱基的GC夹 (GCCGGGCCGGGG GCACCGCGCGGG GCGGCGGGGCCGCGCGG) , 引物由宝生物有限公司合成, 扩增试剂均购自TIANGEN公司。

PCR扩增方法、反应体系及回收方法参照文献[6]。

1.3 DGGE对大豆内生细菌多样性分析

根据DGGE条件优化的结果, 制备聚丙烯酰胺凝胶, 变性剂浓度为25%~75%, 预电泳条件为55℃, 120 V电泳10 min, 然后取各样品15μL加入各点样孔, 在120 V电压下, 电泳10 h。

电泳完成后采用银染法对凝胶进行染色, 并采用Quantity One分析软件对各个样品的DGGE分离条带进行分析。主要分析各个条带的迁移速率、灰度指数及数量关系。分析各样品在DGGE图谱中的各个参数, 采用Shannon-Weiner指数 (H) , 丰富度指数 (S) 和均匀度指数 (E) 等指标比较各个样品内生细菌的多样性[7]。

2 结果与讨论

2.1 大豆基因组DNA的提取

内生细菌基因组总DNA的提取是分析其种群多样性的关键。通过实验结果可以看出图1, 基因组主条带清晰且没有弥散条带, 只有部分RNA存在, 可以通过纯化回收避免对下一步PCR实验的影响。

M:marker G:基因组样品

2.2 DGGE对大豆内生细菌多样性分析

2.2.1 大豆不同组织部位内生细菌多样性比较

大豆同一时期不同组织部位内生细菌16S r DNA PCR产物的变性梯度凝胶电泳结果如图2所示。不同的样品经变性梯度凝胶电泳后, 都分离得到数目不等的电泳条带, 并且每个条带的染色强度和迁移率各不相同, 有一些条带染色强度较高, 也有一些条带染色强度较弱。由图2可以看出, 根部和茎部内生细菌DGGE图谱较为相似, 存在很多共有条带, 说明根部和茎部存在很多共有内生细菌类型。而叶片的内生细菌条带数量要明显少于根部和茎部, 说明叶片中的内生细菌多样性要小于根部和茎部。

细菌多样性指数是用来分析细菌物种数和个体数量以及均匀度分布的综合指标[8]。根据电泳图谱中每个条带的强度, 采用Quantity One软件对大豆不同组织部位中细菌多样性指数 (H) 、均匀度 (E) 和丰富度 (S) 进行分析, 结果如表1。结果显示, 大豆根部和茎部的内生细菌多样性指数 (H) 相似, 分别为3.57和3.32, 而叶片中的内生细菌多样性指数 (H) 仅为1.89, 远小于根部和茎部。

2.2.2 大豆不同品种内生细菌多样性比较

分别于同一生长时期, 取黑农59和合丰55两个品种大豆的同一部位内生细菌进行16S r DNA PCR-DGGE分析, 电泳图谱如图3所示。由图谱可以看出, 黑农58和合丰55存在很多共有条带, 如k1、k2、k3、k4、k6、k7、k8, 说明大豆不同品种间存在很多共有内生细菌类型。除共有条带外, 不同大豆品种均具有各自特有的条带, 如h1和h2只有在黑农58存在, 而k5只在合丰55中存在, 说明每个品种都具有各自特有的细菌类型。

对大豆不同品种内生细菌多样性指数 (H) 、均匀度 (E) 和丰富度 (S) 进行分析, 结果如表2。黑农58和合丰55的“香农———维纳”多样性指数分别为3.44、3.49, 说明这两个大豆品种内生细菌都具有丰富的多样性。

2.2.3 大豆不同生长时期内生细菌多样性比较

同一品种不同生长时期大豆内生细菌16S r DNA PCR产物的变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 结果如图4所示。其中大豆分枝期和开花期的内生细菌条带要多于出苗期和结荚期。大豆分枝期和开花期共有的内生细菌条带最多, 出苗期特有的内生细菌条带较多, 如m1、m2, 结荚期内生细菌条带数量最少。

1:出苗期2:分枝期3:开花期4:结荚期

对大豆不同生长时期内生细菌多样性指数 (H) 、均匀度 (E) 和丰富度 (S) 进行分析, 结果如表3。“香农-维纳”多样性指数显示, 随着大豆的出苗期、分枝期以及开花期的出现, 内生细菌多样性逐渐增加, 而在结荚期内生细菌多样性最小, 大豆内生细菌多样性在分枝期、开花期最丰富。

3 结论

本研究选用的巢氏PCR法适合进行大豆内生细菌多样性研究, 可以获得大豆内生细菌16S r DNA的V6、V7、V8三个高变区的目的片段。采用PCR-DGGE分析大豆内生细菌多样性发现, 大豆叶片中的内生细菌多样性要小于根部和茎部;大豆不同的品种间存在很多共有条带, 而每个不同品种又存在各自特有的条带;在大豆的各个不同生长时期内生细菌多样性逐渐增加, 而在结荚期内生细菌多样性最小。

参考文献

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[5]夏冬亮.毛竹根部内生细菌多样性研究[D].保定:河北大学, 2009.

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DGGE 篇4

PCR-DGGE技术在水解酸化-缺氧法处理采油废水的微生物研究中的应用

采用PCR-DGGE技术直接从水解酸化和缺氧反应器中的污泥样品提取DNA,测定部分菌种的16S rDNA V3区片段序列,通过NCBI基因库比对,初步确定不同生物反应器内优势菌种,并进行了多样性指数分析.结果表明,水解酸化反应器中的.生物膜与缺氧反应器中悬浮污泥微生物种群结构存在较大的差异,显示了在不同环境条件下,微生物群落结构的连续动态变化过程.

作 者：裘湛 闻岳 黄翔峰 王峰 章非娟 Qiu Zhan Wen Yue Huang Xiangfeng Wang Feng Zhang Feijuan  作者单位：同济大学环境科学与工程学院,上海,92 刊 名：环境污染与防治  ISTIC PKU英文刊名：ENVIRONMENTAL POLLUTION AND CONTROL 年，卷(期)： 28(6) 分类号：X7 关键词：PCR-DGGE   水解酸化-缺氧   采油废水  

DGGE 篇5

1.1 湖泊水体系微生物多样性

(1) 藻类, 常见的藻类约56个属138个种, 包括:硅藻、裸藻、金藻、甲藻、小球藻属, 栅列藻属, 以及蓝细菌等。 (2) 细菌, 在被研究水体中BOD符合负荷值比较低、维持好氧状态的富营养话水体中, 常见的优势菌群有芽孢杆菌属、假单胞菌属、产甲烷菌属、光和细菌属、硫酸盐还原菌等。 (3) 原生动物及微型后生动物, 富营养化水体中常见固着型纤毛虫、鞭虫、甲壳类、摇蚊幼虫等。

1.2 湖泊水体系微生物间的相互关系

位于食物链中的各种生物与其生存环境间通过一系列的能量和物质的转移与循环保持着相互依存的稳定关系, 即生态平衡。但当湖泊水体系中大量累积N、P等营养元素时, 生态系统的平衡就被破坏, 主要表现为藻类通过大量繁殖, 数量明显增多, 进而导致水体透明度下降和臭阈值增加。经过反复试验验证, 向湖泊水体系中投加复合细菌能与原有水体中微生物形成共生增殖关系, 从而使藻类优势种群无法形成, 起到了强化水体生物自净能力, 恢复湖泊生态平衡的作用。

2 微生物多样性分析的常用方法

2.1 水体微生物多样性的传统研究方法

水体微生物多样性的传统研究方法是先将被检测水体样品中的微生物进行分离培养, 经过纯培养后获得纯菌株, 再研究纯菌株的特征及细胞性质, 最后总结特性。但由于微生物形态简单, 个体较小, 仅依靠外观形态观察无法获得太多信息, 且自然界中大多数微生物无法依靠纯培养分离, 也不能精确鉴定分离物, 进而揭示分离物间的系统发育关系。

2.2 分子生物学技术

应用分子生物学技术研究水体微生物生态学, 能够在一定程度上避免微生物多样性丢失及种群构成变化等问题的发生, 有利于被研究水体微生物中新的菌株、新菌种的发现, 进一步提高对环境微生物多样性的认知水平。

3 应用PCR-DGGE技术进行水体微生物多样性检测的原理、步骤和主要优缺点

3.1 应用PCR-DGGE技术进行水体微生物多样性检测的原理

本论文拟采用基于凝胶中不同DNA片段电泳迁移率差异的变性梯度凝胶电泳DGGE技术分离被研究水体系微生物的DNA。

如图1将尿素和甲酰胺等DNA变性剂添加到聚丙烯酰胺凝胶中, 使溶液呈现线性的变性剂浓度梯度变化。在电泳过程中水体微生物的DNA双链分子在变性凝胶中逐步进行解链, 形成解链区域, 此接连区域的形成增大了DNA分子的迁移阻力。当到达一定变性剂浓度, 水体微生物的DNA分子在变性凝胶中的解链程度恰好合适, DNA分子所受到的迁移阻力与周围电场力互相平衡时, DNA分子便停留在该变性浓度的聚丙烯酰胺凝胶中。DNA双链分子由于碱基排列顺序不一样解链区域及解链行为也不相同, 导致虽然处于同种变性凝胶电泳环境中, 其迁移行为也不一致, 因此可以在其周围电场作用下得到分离。

为了提高被研究水体样品中微生物多样性的检验精确度和检出率, 能够更好的反映被检测水体微生物的实际情况, 彻底分离DNA片段, 在PCR扩增过程时将GC发夹结构添加到正向引物的5'端, 使其在PCR过程中, 通过扩增连接到目的DNA双链分子片段的一端上[1], 使其在含有变性剂的电泳凝胶中难以完全解链而形成DNA单链。由于单链DNA在DGGE凝胶中的电泳行为完全取决于DNA的分子大小, 而与DNA的碱基排列顺序无关, 因此DGGE电泳无法将其完全分离。因此, 可以说只要将检测过程中的电泳条件设置合适且其满足条件足够细致, 哪怕仅有一个碱基区别的DNA片段也可以被区分。

应用PCR-DGGE技术在水体微生物多样性研究中具有以下优点:检测极限低;检测速度快;检测费用低;结果有较强的客观性;能够针对多个样品及多种微生物进行同时检测;可以结合其他检测方法提高检测质量。

3.2 PCR-DGGE技术分析微生物多样性的主要实施步骤:

(1) 环境样品微生物DNA的提取; (2) 环境样品微生物DNA的纯化; (3) Touch-down PCR[2]; (4) GC发夹; (5) 染色和测序。

3.3 PCR-DGGE技术分析研究水体系微生物多样性的局限性

如同任何检测分析技术一样, PCR-DGGE技术分析微生物多样性也存在一定的局限性, 其局限性主要表现在如下几个方面: (1) 存在DNA片段检测的最理想长度一般在200~500bp之间, 所以能够提供的生物系统发育信息具有局限性[3]。 (2) 在湖泊水体系微生物多样性检测中, 由于被研究水体样品中个别种类的微生物16S r DNA在复制时的异质性问题及异源核酸双链分子的检出影响, 会导致检测结果偏离真实值略高。 (3) DNA片段扩增后的PCR产物由于受到具有不同序列的DNA共迁移问题的影响, DGGE电泳图谱中可能出现同一条带中含有不同种类的微生物, 这将导致对湖泊水体环境微生物的多样性估计偏低。同时受到电泳条件的影响, 也不能保证具有序列差异的DNA片段完全分离。 (4) 无法还原被研究水体中微生物在生活环境中的真实图景, 也无法提供微生物数量、群落新陈代谢活性和基因水平等研究信息, 需要进一步结合微电极测量或荧光原位杂交等其他技术方法对被研究水体系中的微生物进行更详尽地群落的复杂性分析。 (5) DGGE凝胶电泳技术虽然可以检测到占有超过全部研究水体系的整个群落微生物数量1%的优势菌群的存在, 但仍无法将被研究水体样品中环境微生物群落的复杂性完整地体现出来。对于以上技术方法中存在的检测缺陷, 可以从改善PCR扩增及DGGE电泳条件着手;同时将与其他传统的技术检测方法与DGGE电泳技术进行有机的结合、相互补充, 这样将被研究水体系微生物群落的代谢、数量、结构和功能等情况的动态变化更贴近实际地反映出来, 并进一步将原位生理等环境中微生物的多样性信息进行表达, 从而不断提高分析微生物生态学的研究水平。

4 总结

本文拟使用PCR-DGGE分子生物技术分析研究水体微生物群落多样性, 使用该方法的研究较少目前仍然没有明确出一种具体的、行之有效的方法来对微生物群落多样性研究进行实验, 实验的后续性研究拟从传统培养方法上对各种菌体进行更全面的研究, 进而将分子生物技术在水体微生物群落多样性上建立起一套快捷、可靠的分析方法, 在对水体微生物处理以及富营养化水体的治理研究中起到相应的作用。

摘要：微生物无论在地表水生物圈物质循环还是能量流动中的地位都是不可替代、举足轻重的, 在湖泊生态系统中也起着非常重要的作用, 是表征水体富营养化的主要原因之一。本文主要讨论拟将基于16S rDNA的PCR-DGGE (变性梯度凝胶电泳) 技术应用于水体微生物多样性研究, 进而控制预防水体富营养化。

关键词：微生物多样性,变性梯度凝胶电泳 (DGGE) ,16S rDNA

参考文献

[1]曾薇, 杨庆, 张树军等.采用FISH、DGGE和Cloning对短程脱氮系统中硝化菌群的比较分析[J].环境科学学报, 2006, 26 (5) .

[2]刑德峰, 任南琪, 宋业颖等.DG-DGGE分析产氢发酵系统微生物群落动态及种群多样性[J].生态学报, 2005, 25 (7) .

DGGE 篇6

1 土壤微生物多样性

土壤微生物多样性指土壤微生物在遗传、种类和生态系统层次上的变化。包括微生物种类、数量、分布以及群落结构的变异性、相互作用的复杂性和功能多样性在内的生态多样性, 反映了土壤生态机制和土壤胁迫对微生物群落总体的影响。微生物多样性的研究可以分为3个层次:物种多样性、遗传多样性、结构多样性以及功能多样性[4]。在土壤中存在的大部分细菌为G+细菌, 并且G+细菌的数目要比淡水和海洋生境中的G+细菌数目高。放线菌占土壤细菌群体的10%~33%。在土壤中还有许多化能异养菌能对无机物进行转化, 这对于维持土壤肥力是必要的。在土壤中还存在一部分的真菌, 土壤真菌可以以游离的状态存在或与植物根形成菌根关系。

2 PCR-DGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳 (d e n a t u r i n g g r a d i e n t g e l electrophoresis, DGGE) 技术最早是由Fischer等人用于检测DNA突变的一种电泳技术[5]。基本原理:DNA分子在含有线性浓度梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中电泳时, 当DNA分子迁移到一定的变性剂浓度并且开始部分DNA片段的解链, DNA分子的空间构型就会发生改变, 导致部分解链的DNA分子在凝胶中的迁移速率急剧下降。

变性梯度凝胶电泳由于其具有准确性高、重复性好、速度快等特点, 被广泛应用于微生物的生态学研究。目前, DGGE电泳技术已经成为微生物群落多样性和动态分析的非常好的技术手段。首先, 分析自然生态系统中土壤微生物的群落结构多样性, 由于自然条件、土壤条件和其它一些环境因素的影响, 土壤中的微生物群落也会有很大的差异[6]。DGGE电泳技术还应用于人为干扰对于土壤微生物群落结构的影响[7]。

3 BIOLOG微平板分析法在土壤微生物多样性研究中的应用

1991年, BIOLOG微平板分析法开始应用于土壤微生物多样性的研究[8]。BIOLOG测试板含有96个小孔, 除一个对照外, 其余95孔内含有不同的有机碳源和一种指示剂, 通过接种菌悬液, 根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性[9]。杨永华等应用BIOLOG技术研究农药污的土壤中的微生物群落结构, 结果显示, 土壤微生物的各方面指数都低于无污染的土壤微生物, 说明在农药污染的土壤中微生物多样性下降, 同时微生物的种类也在减少[10]。

4 PCR-DGGE技术与BIOLOG微平板分析法在土壤微生物多样性研究中的比较

PCR-DGGE技术与BIOLOG微平板分析法从不同生态层面上揭示了土壤微生物群落结构及多样性变化, 但每一种研究方法都有自身的优点和局限性。

目前, PCR-DGGE技术在微生物的多样性研究中应用比较广泛。DGGE直接利用DNA及RNA对微生物遗传特性进行表征, 不但避免了传统上耗时的菌种分离, 更可进而鉴定出无法利用传统方法分离出来的菌种。DGGE的优点: (1) 无需进行微生物培养; (2) 突变检出率高; (3) 可将突变分子同野生型分子分开; (4) 无须标记; (5) 操作简便、快速、重复性好等。缺点: (1) 只能分离较小的片段 (<500 bp) ; (2) 图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株; (3) DGGE通常显示群落中优势种类; (4) 可能导致自然群落中细菌数量的过多估计; (5) 若数据库中基因序列信息不够丰富, 将会限制DGGE的使用; (6) 需要专门设备; (7) 含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶; (8) 无法确定突变在DNA片段中位置。

而BIOLOG微平板分析法是以群落水平碳源利用类型为基础研究土壤微生物群落功能多样性。能够快速的检测出土壤微生物的多样性, 而且重复性较好, 获得的数据变化较大。BIOLOG方法主要依赖于群体的生理活性, 作为一种研究微生物群落功能多样性的方法仍然存在一些问题。比如BIOLOG方法较适用于检测和鉴定土壤中快速生长型或富营养微生物类群的活性, 不适用于反映土壤中生长缓慢或不能培养的微生物信息。土壤微生物在BIOLOG板内生长时, 由于湿度、渗透压和p H值等的变化, 引起微生物对碳底物实际利用能力的改变。因此, BIOLOG反应的特征只能粗略地代表实际土壤微生物的多样性。

5 结语

随着人类对土壤生态系统的不断研究和探索土壤微生物在物质循环、能量流动和维持生态系统多样性与稳定性方面的重要性被人们广泛认可并展开深入研究, 土壤微生物是一个丰富的微生物资源库, 加强对土壤微生物多样性的理解, 能对微生物资源进行合理的开发和利用。

PCR-DGGE技术与BIOLOG微平板分析法在土壤微生物多样性研究中的比较可以看出, BIOLOG得到的数据较PCR-DGGE技术得到的数据变化更大, 而PCR-DGGE技术在检测群落组成和群落结构方面比BIOLOG方法更敏感, 反映的信息更多, 标准偏差更小。因此, 为了获取较为全面的微生物多样性信息, 应尽可能用多种研究方法将微生物群落在生长, 生理和遗传信息等各个层次上的数据有机结合起来, 并不断设计更简单、准确的研究方法, 提供更加全面、准确的微生物变化信息。为微生物资源开发利用提供更有效的方法。

摘要：DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 技术, 能直接分离土壤微生物的DNA片段, 从分子水平上分析微生物的多样性。BIOLOG微平板分析方法是一种群落水平的生理特性分析方法, 评价不同样品微生物群落的结构组成。本文对DGGE和BIOLOG技术的原理及其在土壤微生物多样性研究中的比较进行了介绍。

关键词：土壤微生物,多样性,PCR-DGGE,Biolog,比较

参考文献

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