OCT4

OCT4（精选4篇）

OCT4 篇1

Oct4(POU5f1)是POU转录因子家族成员之一,是只在多能细胞中表达的转录因子,其通过与外源性信号分子白血病抑制因子等介导的信号传导通路以及与内源性转录因子Nanog等共同组成基因调控网络维持细胞的多能性,被认为是控制细胞多能性的决定性因素,并在胚胎干细胞(ES细胞)等的全能性维持和自我更新方面起着关键作用[1]。S.L.Palmieri等[2]和Y.I.Yeom等[3]研究表明,Oct4基因的表达在小鼠胚胎8细胞之前就已被激活,在整个桑椹胚阶段Oct4在所有的卵裂球中都有十分丰富且均匀的表达[4]。在囊胚阶段,Oct4在滋养层(trophectoderm,TE)中的表达被抑制,只在内细胞团中有表达[5]。胚胎着床后,Oct4表达逐渐停止,并被限制在生殖系细胞(germ line cell)中,在已分化的成体细胞中没有表达[6]。

研究表明,Oct4的启动子位于转录起始位点开始的250 bp序列内,该区域还包含一些重要的结合位点,包括Sp1/Sp3结合位点和激素应答元件(HRE)。HRE可被类固醇/甲状腺受体家族的视黄酸、视黄醇类X受体以及孤儿核受体超家族因子识别并结合,这些因子在Oct4基因表达下调中起到重要作用[7,8]。增强子位于Oct4基因的上游区域中,它们对Oct4的表达调控具有细胞类型特异性。其中,远端增强子负责调控桑椹胚、内细胞团、原始生殖细胞、胚胎生殖细胞及着床前胚胎中Oct4的表达;而近端增强子主要负责调控外胚层中Oct4的表达[6,9]。Oct4是迄今人们发现最早也是最重要的维持胚胎干细胞多潜能性和自我更新的关键基因[10]。在以往的研究中,人和小鼠的Oct4基因启动子的研究已有报道,但绵羊的相关研究还很少。本研究构建由Oct4启动子驱动并携带有报告基因的真核表达载体,通过转染成纤维细胞、胚胎干细胞和早期胚胎检测启动子表达活性,以期为绵羊Oct4基因表达调控和绵羊i PS诱导提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物、细胞及菌株

性成熟的ICR小鼠,购自吉林大学实验动物中心;Trans 5α感受态细胞,购自全式金(Trans Gen)公司;小鼠ES细胞,为东北林业大学生命科学学院动物发育研究室自存。

1.2 主要试剂、药品及载体

DNA MarkerⅢ、限制性内切酶(Bam HⅠ、NdeⅠ、BglⅡ)及T4 DNA连接酶,购自宝生物工程(大连)有限公司(Ta KaRa);质粒小提试剂盒,购自北京百泰克生物技术有限公司;胶回收试剂盒和无内毒素质粒提取试剂盒,购自OMEGA公司;胎牛血清(FBS),购自Gibco公司;DMSO、丙酮酸钠、β-ME和BSA及其他试剂,购自Sigma-Aldrich公司;脂质体转染试剂盒(Lipofect Transfection),购自天根生化有限科技公司;p Ac GFP1-N1载体,为东北林业大学生命科学学院动物发育研究室自存。

1.3 绵羊Oct4基因启动子的克隆

此前,笔者根据Gen Bank中已发表的人、鼠、兔、牛Oct4启动子中的保守序列设计了1对引物SPOct4-1、SPOct4-2,对绵羊Oct4基因进行了PCR扩增,并获得了长度为1 206 bp的产物(结果图未显示),并构建了克隆载体p MD18-T-SPOct4,其引物序列如下:SPOct4-1 5'-CATATGAAGGGTTGAGCACTT-GTTT-3',SPOct4-2 5'-GGATCCCACTAGCCTT-GACCTCTGG-3'。

1.4 绵羊Oct4启动子真核表达载体的构建

设计引物时,在引物上游分别引入了酶切位点NdeⅠ和Bam HⅠ。

利用NdeⅠ和Bam HⅠ对p MD18-T-SPOct4质粒进行大量酶切,获得绵羊Oct4启动子的目的基因,并命名为SPOct4-NB;p Ac GFP1-N1载体自身存在NdeⅠ和Bam HⅠ这两个酶切位点,因此同样利用NdeⅠ和Bam HⅠ对p Ac GFP1-N1载体进行大量酶切,回收大片段,并命名为p Ac GFP1-N1-NB。

将上述获得的SPOct4-NB基因片段与p Ac G-FP1-N1-NB进行连接,连接体系为绵羊Oct4启动子目的基因产物7.5μL,线性p Ac GFP1-N1载体1μL,10×Buffer 1μL,T4连接酶0.5μL,4℃连接过夜;随后对该连接产物进行转化,挑取单克隆扩大培养,并采用质粒小提试剂盒提取质粒。对获得的重组质粒进行PCR鉴定,并采用Bam HⅠ和BglⅡ进行双酶切鉴定,测序正确后将重组质粒命名为SPOct4-p Ac GFP1-N1。

1.5 胚胎成纤维细胞的培养

1.5.1 小鼠胚胎成纤维细胞的培养

挑选性成熟的雄性和雌性ICR小鼠,晚上进行合笼,第2天早上见栓,见栓13.5 d后取胚胎进行小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养,当原代细胞达到90%左右汇合度时,使用0.05%的胰酶对其进行消化和传代培养。

1.5.2 绵羊胚胎成纤维细胞的培养

取龄胎120天左右绵羊胎儿的耳尖组织,使用常规方法进行绵羊胚胎成纤维细胞(SEF)的原代和传代培养。

1.6 小鼠ES细胞的培养

选择第2代或第3代的MEF作为饲养层细胞,调整MEF细胞密度,使其在ES细胞接种前24小时汇合度达到90%,向MEF培养基中加入丝裂霉素C,使其终浓度为10μg/m L,作用3 h后用PBS清洗3次,然后使用0.05%的胰酶消化,计数后,接种在0.1%明胶包被的培养皿上。ES细胞复苏后将其接种在饲养层上。

1.7 小鼠原核期胚胎的获得

选择性成熟的雌性ICR小鼠进行超数排卵,17:00点左右注射10 IU的PMSG,48小时后注射10 IU h CG,然后将其与雄性小鼠进行合笼。第2天早上见栓,取见栓0.5 d的母鼠,颈椎脱臼法处死后取卵巢和输卵管,并使用注射器冲出输卵管内的胚胎,显微镜下收集形态正常的原核期胚胎,随后将胚胎转移到培养滴中,37℃培养,备用。

1.8 细胞的转染和胚胎的转染

细胞的转染:采用阳离子脂质体法转染细胞,利用脂质体转染试剂分别对MEF、SEF、ES细胞转染SPOct4-p Ac GFP1-N1质粒和p Ac GFP1-N1质粒,其中p Ac GFP1-N1质粒为阳性对照。转染前12小时更换无抗培养基,并使细胞密度转染时达到90%~95%汇合。分别使用50μL DMEM稀释0.4μg DNA和2μL脂质体试剂,温和混匀,室温放置5 min后将稀释的DNA和稀释的脂质体混合(总体积为100μL),室温放置20 min后加入到每孔中,混匀后在CO2培养箱37℃孵育12 h,更换合成培养基。

胚胎的转染:用浓度为1.5 mol/L的盐酸消化处理,去除原核期的小鼠胚胎的透明带,将去除透明带的胚胎转移至100μL的微滴中,用50μL DMEM分别稀释0.8~1.0μg SPOct4-p Ac GFP1-N1质粒和2μL脂质体,混匀后室温静置5 min;将两者混合混匀,室温静置20 min;在每滴中加入5μL的DNA-脂质体复合物,轻轻晃动培养基,37℃、5%CO2培养。

转染24,48,72小时后,在蓝光激发条件下,于倒置荧光显微镜下观察转染后细胞和胚胎荧光发生情况。

2 结果

2.1 绵羊Oct4基因启动子的序列分析结果

利用Primer Premier5.0软件对克隆获得的绵羊Oct4启动子分析的结果表明:该克隆Oct4启动子335位点有1个CAAT box,但未发现TATA box。另外,该序列还在1 211位点含有一个GC_SP1序列或SP1序列以及一些其他功能区段。见表1。

2.2 绵羊Oct4基因启动子真核表达载体的构建结果

重组表达载体SPOct4-p Ac GFP1-N1经PCR、酶切鉴定、测序,结果表明SPOct4片段未发生突变。使用限制性内切酶NdeⅠ和Bam HⅠ对p MD18-T-SPOct4重组质粒进行双酶切电泳后胶回收绵羊Oct4启动子的目的基因小片段SPOct4-NB,同时,p Ac G-FP1-N1载体经NdeⅠ和Bam HⅠ酶切胶回收,获得大片段p Ac GFP1-N1-NB,将两者连接获得重组质粒SPOct4-p Ac GFP1-N1,对其进行酶切和PCR鉴定,结果(见图1)在约1 200 bp处观察到目的条带;对重组质粒使用BglⅡ和Bam HⅠ进行双酶切鉴定,结果表明,在约600 bp和4 500 bp处观察到与预期结果相一致的2条条带。

2.3 绵羊Oct4基因启动子在细胞中的表达活性检测结果

2.3.1 成纤维细胞中的表达活性

使用脂质体转染法将SPOct4-p Ac GFP1-N1质粒和p Ac GFP1-N1质粒(阳性对照)分别对小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞进行共转染,48小时后观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况,结果表明:在转染p Ac GFP1-N1质粒的试验组小鼠胚胎成纤维细胞和绵羊胚胎成纤维细胞均出现绿色荧光蛋白表达(见291页彩图2A和2C);而转染SPOct4-p Ac GFP1-N1质粒的试验组小鼠胚胎成纤维细胞和绵羊胚胎成纤维细胞均未观察到绿色荧光蛋白的表达(见291页彩图2B和2D)。

1.PCR鉴定结果;M.MarkerⅢ;3.BglⅡ和Bam HⅠ酶切鉴定结果。

2.3.2 小鼠胚胎干细胞中的表达活性

将SPOct4-p Ac GFP1-N1质粒转染到小鼠胚胎干细胞中,并在转染后48小时,在倒置荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的情况,结果表明,在克隆状生长状态下的小鼠胚胎干细胞中观察到表达绿色荧光蛋白细胞(见291页彩图3)。

2.4 绵羊Oct4基因启动子在胚胎中的表达活性检测结果

使用SPOct4-p Ac GFP1-N1质粒对小鼠原核期胚胎(共16枚)进行转染,每隔24 h对胚胎细胞中绿色荧光蛋白的表达情况进行观察,结果表明:转染24小时后,16个胚胎中有3个可观察到微弱荧光;转染36~48 h后,荧光强度逐渐增强;转染72小时后(囊胚期),9个胚胎内细胞团出现明显的绿色荧光,而其滋养层细胞中未观察到绿色荧光(见291页彩图4)。

3 讨论

2006年K.Yamanaka等[11]首次利用4个因子OSKM(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)将小鼠成纤维细胞诱导成为多能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PS)。而后J.Yu等[12]利用OSNL(Oct4、Sox2、Nanog和Lin28)4个因子将人的体细胞诱导为具有多向分化潜能的i PS细胞,这两组诱导因子中都包含了Oct4,表明Oct4在诱导重编程中发挥着重要作用。

作为一种重要的转录因子以及诱导i PS的主要因子之一,Oct4是由POU5f1编码,属于POU(PitOct-Unc)转录因子家族成员。Oct4主要表达于受精卵、囊胚内细胞团、原始生殖细胞、体外培养的ES细胞、胚胎生殖细胞和胚胎癌细胞等未分化或分化程度较低的组织细胞中,在已分化的细胞及成体组织中的表达量非常低。研究结果表明,敲除Oct4基因时,小鼠胚胎不能形成内细胞团,导致胚胎不能正常着床而使得发育终止[13,14],说明Oct4基因是胚胎发育早期过程中形成多能性细胞所必不可少的。而体外研究发现,只有Oct4基因表达水平维持在一定范围时,ES细胞才能够保持其未分化状态,并维持自我更新;Oct4基因表达水平高于正常水平2倍时,ES细胞会向原始内胚层和中胚层方向分化;而当其表达水平低于正常水平一半以下时,则导致ES细胞向滋养层和原始内胚层分化[15,16]。

小鼠、人和猪等的Oct4基因已被成功克隆,并已利用相应Oct4因子相继建立起了获得i PS的方法。但迄今为止,尚未见到有关绵羊Oct4基因的相关研究报道。已知获得的绵羊i PS,主要是利用其他物种来源的异源因子诱导绵羊体细胞而产生[17,18]。为了便于观察判断体细胞是否发生完全的重编程,目前的研究手段主要使用Oct4启动子带动GFP基因表达的体细胞作为靶细胞来诱导产生i PS。已有研究证实,由于Oct4诱导因子在动物间具有比较高的同源性和相似转录因子结合位点;因此,Oct4具有在不同种间多能干细胞中的表达活性[19]。为了检测所克隆的绵羊Oct4启动子的活性和细胞特异性,本研究将真核表达载体SPOct4-p Ac GFP1-N1分别转染小鼠和绵羊成纤维细胞、小鼠ES细胞和小鼠胚胎,并观察GFP的表达情况,结果表明:转染后小鼠早期胚胎及未分化的ES细胞中均有GFP表达(见291页彩图3、图4),其中小鼠胚胎在转染72小时后达到最大荧光强度,且仅在内细胞团中表达,滋养层细胞中未见有GFP的表达;在已分化的小鼠和绵羊成纤维细胞中未观察到报告基因GFP的表达(见291页彩图2B和2D)。这些结果说明克隆获得的绵羊Oct4基因启动子具有在多能干细胞中特异表达的活性。

OCT4 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

腺癌组织芯片临床病理资料:腺癌组织芯片由中国医学科学院肿瘤医院病理科吕宁教授提供。芯片共包含150例腺癌患者的组织样本,就诊时间为2002~2003年。乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肠癌、子宫内膜癌各30例(芯片处理过程中有个别样本脱落现象,以获得实际结果的样本数为准),每种系统肿瘤均包括5例癌旁组织。

1.2 试剂

兔抗人Oct4多克隆抗体(abcam,ab19857),第二代通用型二步法检测系统(PV9000,北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色步骤

采用免疫组织化学通用型二步法。PBS代替一抗作为阴性对照,山羊IgG按照5μg/ml稀释代替一抗作为同型对照,精原细胞瘤组织作为阳性对照。组织芯片常规脱蜡至水,EDTA抗原修复液(pH=8.0)行热修复,3%H2O2孵育30 min,山羊血清封闭10 min。滴加Oct4(1∶250)4℃过夜,滴加增强剂室温孵育25 min,滴加二抗室温孵育25 min,DAB显色,苏木素复染,盐酸乙醇分化,脱水,封片。镜检。

1.3.2 免疫组织化学评分

Oct4在细胞核、细胞浆中均有表达,分别评分。评分标准如文献[4]所述,按阳性细胞数分为:阳性细胞数<5%为0分;阳性细胞数5%~25%为1分;阳性细胞数26%~50%为2分;阳性细胞数51%~75%为3分;阳性细胞数>75%为4分。按染色强度分为:基本未着色、着色与背景相似者为0分;着色浅略高于背景者为1分;中度着色、明显高于背景者为2分;强染、呈深棕色者为3分。对每一组织点来说,用阳性细胞数评分与染色强度的乘积为最终评分,0~4分为弱表达,5~8分为中等表达,9~12分为强表达。综合染色强度和细胞数量进行分级,取表达最强的部分。

1.4 统计学分析

所得数据采用SPSS 16.0软件进行分析,差异采用非参数检验,相关性分析采用秩相关,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Oct4在不同肿瘤组织中的表达情况(图1)

Oct4在乳腺癌肿瘤组织内有表达,而癌旁组织未见表达。胃癌的癌旁组织的表达高于肿瘤组织,差异有统计学意义(P<0.05),肠癌、子宫内膜癌、胰腺癌肿瘤组织与癌旁组织Oct4的表达差异无统计学意义。

2.2 Oct4的表达与肿瘤临床分期的关系(表1)

5种腺癌的肿瘤组织内,未发现Oct4的表达与临床分期相关,并且早期(Ⅰ~Ⅱ期)与进展期(Ⅲ期)患者Oct4的表达无差异。

2.3 Oct4的表达与淋巴结转移的关系(表1)

5种腺癌的肿瘤组织内,乳腺癌、肠癌未出现淋巴结转移患者比出现淋巴结转移患者Oct4的表达高,Oct4的表达与淋巴结转移情况无相关性。胃癌、胰腺癌及子宫内膜癌患者Oct4的表达无差异。

2.4 Oct4在细胞核、细胞浆的表达情况(表2、图2)

Oct4在不同肿瘤中的核/浆表达模式不完全相同。乳腺癌患者肿瘤组织细胞核表达而细胞浆不表达者3例,占10.00%(3/30),细胞浆表达而细胞核不表达者2例,占6.67%(2/30),癌旁组织不表达。胰腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织细胞浆表达明显高于细胞核(P<0.05)。胃癌患者肿瘤组织内,细胞核、细胞浆均表达者11例,占36.67%(11/30),癌旁组织仅表达于细胞浆,且癌旁组织表达高于肿瘤组织。肠癌患者肿瘤组织内细胞浆、细胞核均表达者18例,占60.00%(18/30),而癌旁组织中腺管组织内细胞核、细胞浆均有表达,间质组织中仅细胞核表达。子宫内膜患者癌肿瘤组织细胞核、细胞浆均有表达者21例,占70.00%(21/30),癌旁组织只在细胞核表达,细胞浆不表达。

3 讨论

Oct4是多潜能性的标志,表达于人类胚胎干细胞[5],在分化组织内其表达量下降[6]。Oct4是少数能够使成体细胞重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的细胞因子[7]。Kim[8]甚至用Oct4单个基因就能够从成年小鼠神经干细胞诱导出多能干细胞。Hochedlinger等[1]的研究显示Oct4本身就可能引起上皮异常增生,在成年小鼠体内,诱导Oct4的过表达可以抑制细胞分化,进而引起肠道发育异常。进一步研究显示胰腺细胞分化过程中检测到Oct4的表达,当胰腺干细胞分化为内分泌细胞时则检测不到Oct4的表达。

Oct4在肿瘤形成过程中也发挥一定的作用。不仅在生殖细胞瘤中检测到Oct4的表达[9],在膀胱癌[10]、肺癌[11]、视网膜母细胞瘤[12]、前列腺癌[13]及许多肿瘤细胞株内均检测到其表达。在用Oct4诱导iPS细胞时会有相当的机会产生有致瘤能力的癌变细胞。

为了明确Oct4在肿瘤、尤其是腺癌发生中的作用,我们首先对多种腺癌中Oct4的表达进行了免疫组织化学研究。我们在实验中发现Oct4在多种腺癌组织中均有不同程度的表达,并且在部分腺癌的癌旁组织内检测到Oct4的表达。提示其表达可能在肿瘤的发生过程中起了重要作用。有研究显示[14],Oct4阳性肿瘤患者其死亡率高于阴性患者。

而且,我们未发现Oct4的表达与临床分期之间的相关性,这与Wang等[15]的结果一致,但是他们发现Oct4与肿瘤的组织学分级有明显的相关性,可能与其去分化有关。同样我们也未发现Oct4与淋巴结转移之间的相关性。提示Oct4可能只是肿瘤发生的一个早期事件,一旦启动肿瘤发生以后会有更多的因素参与肿瘤的进展。

人类Oct4基因有3种剪切体[16]:Oct4A、Oct4B及Oct4B1。Oct4A主要定位于胚胎干细胞的细胞核,维持细胞的自我更新及分化潜能。在生殖细胞瘤及胚胎性肿瘤中均检测到Oct4A表达的上调,提示其可能参与了肿瘤的形成[9,17],而在正常体细胞中Oct4A只有较低表达,在其相应的肿瘤组织内其表达量会明显增加[17]。Karoubi等[18]在肺腺癌中发现Oct4A在细胞核、细胞浆均有表达,并且肿瘤组织内的表达明显高于正常组织。Oct4B则定位于实体瘤细胞的细胞浆,不具有自我更新能力[19]。Oct4B只在细胞浆表达,并且肿瘤组织与正常组织的表达无差异。Oct4B1不仅表达于实体瘤细胞,也高表达于ES细胞,但是在分化的细胞中其表达迅速下降[16]。Asadi等[20]在胃腺癌中检测到Oct4B1的高表达,其作为抗凋亡因子,与肿瘤的进展有关。

我们也发现Oct4在5种腺癌患者肿瘤组织的细胞核、细胞浆中均有表达。乳腺癌患者的癌旁组织不表达,子宫内膜癌患者癌旁组织Oct4只表达于细胞核而细胞浆不表达,肠癌患者癌旁组织中腺管组织内细胞核、细胞浆均有表达,间质组织中仅表达于细胞核。胃癌患者癌旁组织主要表达于细胞浆,细胞核有少量表达。推测Oct4可能首先在细胞核表达,然后随着细胞的去分化细胞浆内出现表达,进而导致肿瘤的发生及进展。

本研究首次检测Oct4在多种腺癌中的表达情况,发现不同腺癌组织中Oct4的表达情况不完全相同,并且Oct4在细胞核、细胞浆的定位表达情况也有差异。但由于我们所收集患者例数有限,及患者临床资料不够完整,所以Oct4作为腺癌诊断及治疗指标的价值,尚需更深入的研究证实。根据其不同剪切体表达部位及功能的不同,也有待进一步的研究,明确其在肿瘤发生、发展过程中的作用,筛选出可靠的用于临床筛查、诊断及治疗的特异性分子标志,为肿瘤的早期诊断、治疗及预后监测提供新的思路。

摘要：目的:研究5种人腺癌中Oct4的表达情况,为进一步探索其在肿瘤发生中的机制提供基础。方法:应用乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肠癌、子宫内膜癌5种腺癌的组织芯片,通过免疫组织化学染色研究Oct4蛋白在组织中的表达情况,并与癌旁正常组织进行比较。结果:Oct4在5种腺癌肿瘤组织内均有表达,胃癌组织内Oct4的表达高于癌旁正常组织(P<0.05),其他腺癌组织中Oct4的表达与癌旁组织差异无统计学意义;在乳腺癌和肠癌中,无淋巴结转移患者的肿瘤组织中Oct4表达高于淋巴结转移患者的肿瘤组织(P<0.05),而在胃癌、胰腺癌及子宫内膜癌患者中未观察到这种差异;5种腺癌的肿瘤组织内,未发现Oct4的表达与临床分期有关。Oct4在癌旁正常组织中(子宫内膜癌除外)主要定位于细胞浆,而在腺癌组织中既表达于细胞核,也表达于细胞浆。结论:Oct4的表达可能是肿瘤发生过程中的早期事件,不同腺癌组织中Oct4的表达情况不完全相同,Oct4的核/浆表达模式可能与其在肿瘤发生中的作用有关。

OCT4 篇3

1 临床资料

质粒和细胞:慢病毒表达载体穿梭质粒pGC-FU Vector、慢病毒结构质粒p Helper 1.0、慢病毒包膜蛋白质粒p Helper2.0、Oct4基因表达质粒、Sox2基因表达质粒、c-Myc基因表达质粒、Klf4基因表达质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司;293T细胞购自Invitrogen公司;试剂:质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司;Lipofectamine200购自Invitrogen公司;胎牛血清、胰酶和DMEM培养基为Gibco公司的产品, M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司, OligodT购自上海生工, Marker购自Fermentas公司;AgeI酶购自NEB公司。

2 方法

2.1 引物设计及合成

根据pGC-FU Vector要求在引物中加入AgeI酶切位点。

M:Marker 5 kb, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 Kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp

ACCGGT于PCR扩增Oct4基因F5-CGGGTACCGGTCGCCA CCATGGCGGGACACCTGGC-3R5-CCGGAATTCTCACTTGT CATCGTCATCCTTGTAGTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3, PCR产物大小:1134bp;同理以下是其余3个基因扩增引物Sox2基因F5-CGGGTACCGGTCGCCACCATGTACAACATGATG GAGACGG-3R5-CCGGAATTCTCACTTGTCATCGTCATCC TTGTAGTCCATGTGTGAGAGGGGCAG-3, PCR产物大小:1005bp;c-Myc, F5-CGGGTACCGGTCGCCACCATGGATTTTTTT CGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCTCCCGCGACGA-3R5-C CGGAATTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCCGCAC AAGAGTTCCGTAGC-3, PCR产物大小:1416bp;Klf4 F 5-CG GGTACCGGTCGCCACCATGGCTGTCAGCGACGC-3R5-CCG GAATTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCAAAATGC CTCTTCATGTGTAA-3, PCR产物大小:1464bp。PCR鉴定目的基因重组连接的阳性克隆菌落, 其中Oct4 F5-CCTGGTGCCG TGAAGCTG-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAACATAG-3, PC R产物大小798bp;Sox2 F5-GAGCGCCCTGCAGTACAAC-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAACATAG-3, PCR产物大小467Bp;c-Myc, F5-CCACACATCAGCACAACTACG-3R5-AGCGTA AAAGGAGCAACATAG-3, PCR产物大小531bp;Klf4 F5-CA ATTACCCATCCTTCCTGC-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAAC ATAG-3, PCR产物大小521bp。上述引物设计与合成均由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。

2.2 重组慢病毒载体质粒的构建

采用PCR技术分别从4个含目的基因表达质粒中扩增目的基因, 用AgeI酶分别酶切载体pGC—FU Vector和上述PCR产物, 琼脂糖电泳分离纯化。将酶切回收载体DNA、酶切回收的PCR产物、In-Fusion交换酶及buffer与ddH20加入反应体系, 于23℃反应15min, 再于42℃反应15min制备克隆交换液, 转化DH5a。PCR鉴定细菌阳性克隆, 分别命名为p GC-FU-Oct4、p GC-FU-Sox2、pGC-FU-c-myc、pGC-FU-Klf4送往上海吉凯基因化学技术公司测序。

2.3 慢病毒包装

制备的各DNA溶液 (pGC-FU-Oct4 20μg, pHelper 1.0载体15μg, pHelper 2.0载体10μg) , 与相应体积的Opti-MEM混合。取100μL Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4mL Opti-MEM混合。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合以形成pGC-FU-Oct4 DNA-Lipofectamine 2000复合物。同样按照上述方法制备pGC-FU-Sox2的DNA-Lipofectamine 2000复合物、pGC-FU-c-Myc的DNA-Lipofectamine 2000复合物、pGC-FU-Klf4的DNA-Lipofectamine 2000复合物。DNA-Lipofectamine 2000混合, 室温下温育20min, 混合液转移至293T细胞的培养液中, 于37℃, 5%CO2细胞培养箱中培养。培养8h后倒去含有转染混和物的培养基, 加入含10%血清的细胞培养基25mL, 于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48h。收集293T细胞上清液, 4℃, 4000×g离心10min, 以0.45μm滤器过上清液于40m L超速离心管中。于4℃, 25 000r/min, 离心20min, 冰PBS液重旋病毒沉淀, 于4℃溶解过夜。以10μL每管分装病毒液置于-80℃冰箱中保存。

2.4 慢病毒滴度测定

慢病毒液按10倍梯度稀释为5个浓度后, 分别感染293T细胞, 细胞培养于含有5ug/mL稻瘟菌素 (Blastieidin, BSD) 的DMEM培养液, 约2周左右去除培养液, PBS漂洗后, 结晶紫溶液进行染色, 最后在倒置显微镜下计数细胞克隆数。

3 结果

3.1 4个目的基因克隆PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 (图1) , 与设计的克隆片断大小一致。

3.2 慢病毒转移质粒的构建及鉴定结果

pGC-FU-Oct4重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2A) , PCR片段大小为7 9 8 Bp, 测序结果与Ge n eb a n k中正常NM_002701.4序列一致;pGC-FU-Sox2重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2B) , PCR片段大小为467Bp, 测序结果与Genebank中正常NM_003106.2序列一致;pGC-FU-c-Myc重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2C) , PCR片段大小为531Bp, 测序结果与Genebank中正常NM_002467.3序列一致;pGC-FU-Klf4重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2D) , PCR片段大小为521Bp, 测序结果与Genebank中正常NM_004235.4序列一致。

3.3 重组慢病毒的包装及滴度测定

将获得的病毒液梯度稀释后接种于293T, 经Blastieidin筛选, 约2周左右各转染组均已长出大小不等的细胞克隆, 而对照组则无克隆形成。在倒置显微镜下计数细胞克隆, 并计算出所获重组慢病毒的最终滴度。Oct4基因重组慢病毒、Sox2基因重组慢病毒、c-Myc基因重组慢病毒的滴度均为1×109TU/mL, Klf4基因重组慢病毒的滴度为1.9×109TU/mL。

4 讨论

胚胎干细胞被誉为“万能细胞”, 但一直以来, 获取人体胚胎干细胞必须摧毁胚胎, 这一点颇受非议。iPSC不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与胚胎干细胞非常相似, 而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与胚胎干细胞几乎完全相同。iPSC的研究, 回避了长期以来围绕人类胚胎使用问题的政治和伦理争论, 并为新药筛选, 药物毒理研究和再生医学等领域提供了广阔的研究和应用前景。

这4个基因, 按其功能不同分为胚胎干细胞特异转录因子Oct4、Sox2, 肿瘤上调基因c-Myc、Klf4。Yamanaka等[1]认为Oct4、Sox2是维持细胞多能性必需的转录因子, c-Myc可以激活下游基因, Klf4则通过抑制P53表达来激活NANOG和其它胚胎干细胞特异性因子表达, 从而提高转化率。Takahashi研究小组[2]去除c-Myc转录因子, 利用慢病毒载体分别携带Oct4、Sox2、Klf4 3个转录因子转染小鼠胚胎成纤维细胞, 同样也获得iPSC, 但此方法的诱导效率约低于4个转录因子共同作用10倍;Huangfu等[3]借助助抑制组蛋白去乙酰基酶活性的小2种转录因子转染人成纤维细胞, 也成功获得ips, 诱导率明显低于3个因子共同作用;Vittorio等[4]用反转录病毒载体只携带Oct4转录因子转染小鼠神经干细胞获得iPSC, 诱导成功率为0.014%, 明显低于2个因子转染效率, 由此可见这个4个基因对于iPSC的最终形成都起着重要的作用。

本研究所采用的慢病毒载体是近年来出现的一种新的基因转移工具, 在多项研究中表现出具有转染分裂期和非分裂期细胞、容载外源目的基因片断大、能够将目的基因整合至靶细胞的染色体在体内长期表达、免疫反应小等独特优点[5]。此外, 研究人员还采用了腺病毒载体法、质粒载体法等方法进行iPSC诱导。Stadffeld等[6]使用腺病毒为载体通过反复转染小鼠肝实质细胞, 诱导产生小鼠iPSC, 对其进行PCR和Southern杂交检测, 没有发现腺病毒的整合。但是这种方法重编程的效率却比逆转录病毒转染要低得多。对于这种低效率, 一种可能的解释是使用腺病毒载体本身使用寿命较短, 不能维系一定的感染力, 转染细胞只能维持3～8d外源基因的表达, 在小鼠成纤维细胞中, 转基因的表达至少需要8d才能产生iPSCs。Okita等[7]建立包含Oct4、Sox2、Klf4的多顺子质粒载体 (polycistroni vector) 和包含c-Myc的质粒载体将小鼠胚胎成纤维细胞诱导为iPSC, 但其诱导率却更低, 说明病毒基因的整合对iPSC克隆形成率有影响。

由于慢病毒载体源于Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (HIV-1) 为保证其作为载体的安全性, 我们采用三质粒包装系统, 包括转移质粒、包装质粒及壳蛋白质粒。慢病毒三质粒系统各质粒单独存在时既不能形成病毒颗粒, 也不具备转导能力[8]。转移质粒将HIV3ˊ端LTR中的U3部分切短, 使之丧失启动病毒复制的功能, 同时插入CMV启动子, 成为复制缺陷型病毒载体;包装质粒去除了HIV包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列;壳蛋白质粒用单纯疱疹病毒来源的VSVG基因提供病毒包装所需要的衣壳蛋白, 大大提高了其安全性, 同时包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围, 而且增加了载体的稳定性, 允许通过高速离心对载体进行浓缩, 提高了滴度。病毒的滴度是进行后续实验研究的重要条件, 为了提高慢病毒滴度, 本实验采用共转染包装法, 这种方法[9]与传统方法 (即先将293FT细胞种植于培养板上, 再用DNA一脂质体复合物转染) 相比, 可提高病毒产量3～4倍, 与传统的脂质体2000转染方法的主要区别是:首先制备DNA-脂质体2000复合物, 然后将其加入含生长培养基的板上, 最后加入293FT细胞, 让细胞转染复合物与充分接触, 孵育过夜。结果显示提取含目的基因病毒滴度都较高, 可以达到满足后续实验的要求。本研究旨在构建慢病毒载体转载4个目的基因, 通过运用基因重组、3质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒共转293T细胞包装出高滴度的LV-Oct4、LV-Sox2、LV-c-Myc、LV-Klf4为下一步实验奠定了基础。

参考文献

[1]Takahashi K, Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell, 2006, 126 (4) :663～676.

[2]Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, et al.Generation ofinduced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts[J].Nat Biotechnol, 2007, 26 (1) :101～106.

[3]Huangfu D, O safune K, Maehr R, et al.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4and Sox2[J].Nat Biotechnol, 2008, 26 (11) :1269～1275.

[4]Kim JB, Vittorio S, Wu G, et al.Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells[J].Cell, 2009 (136) :411～419.

[5]Naldini L, Blomer U, Gage FH, et al.Efficient transfer, intgration and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 92 (21) :11382～11388.

[6]Stadffeld M, Nagaya M, Utikal J, et a1.Induced Pluripotent Stem Cells Generated without Viral Intergation[J].Science, 2008, 322 (5903) :945～499.

[7]Okita K, Nakagawa M, Yamnaaka S, et a1.Generation of Mouse In-duced Pluripotent Stem Cells without Viral Vectors[J].Science, 2008, 322 (5903) :949～953.

[8]Bartosch B, Cosset FL.Strategies for retargeted gene delivery using vectors derived from lentiviruses[J].Curr Gene Ther, 2004, 4 (4) :427～443.

OCT4 篇4

1资料与方法

1.1一般资料

选取2010年1月~2013年12月于河北北方学院附属第一医院(以下简称“我院”)就诊的肺癌患者60例,所有患者均经病理检查确诊。 其中男38例,女22例,年龄34~72岁,平均(53.9±19.2)岁。依据2004年WHO制订的肺癌分类标准进行病理 分型及分 期 , 60例患者中鳞癌30例 、腺癌20例、小细胞癌5例和大细胞癌5例;TNM分期:Ⅰ期19例,Ⅱ期15例,Ⅲ 期17例,Ⅳ期9例。 所有患者均为首次发病且术前未进行化疗、放疗及免疫治疗。 另取我院同期经肺部手术切除并蜡块存档的正常肺组织20例作为对照,均来自我院行健康检查且诊断结果为正常的健康者。 包括男12例,女8例;年龄35~71岁,平均(53.2±19.1) 岁。 所有研究对象均为自愿参与并签署知情同意书, 两组性别 、年龄一般 资料差异 无统计学 意义 (P > 0.05),具有可比性。

1.2免疫组化检测Oct4、Sox2的表达

用4%多聚甲醛的固定组织标本,常规石蜡包埋, 常规脱蜡,用水浴法修复抗原,用3%的双氧水抑制内源性过氧化物酶活性,封闭内源性非特异性抗原,加入Oct4、Sox2多克隆抗体,4℃下过夜,滴加二抗,二氨基联苯胺(DAB)显色反应,用苏木精复染封片。 所用抗体均购自Abcam公司,二抗试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1.3结果判读及评分标准

光镜下进行观测,阳性反应:细胞核内发现有棕黄色、黄色或褐色颗粒。 依据查看到的阳性细胞所占比例及染色深浅评定阳性反应的强度。 观察时按照视野中阳性细胞所占比例进行评分:百分比≤5%为0分, >5%~25%为1分 ,>25%~50%为2分 ,>50%~75% 为3分,在>75%以上者为4分。按照染色强度进行评分: 不着色为0分;淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。 最后按两种评分乘积分成阴性:0~2分;阳性:3~12分[4,5,6]。

1.4统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示 ,组间比较采用 χ2检验 ,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Sox2、Oct4在肺癌组织及正常肺组织中的表达情况

Sox2、Oct4在20例正常肺组织中表达均为阴性, 在60例肺癌组 织中 ,Sox2阳性28例 , 阳性表达 率为46.7%;Oct4阳性43例,阳性表达率为71.7%。 与正常组比较,差异有统计学意义(χ2=5.924,11.377;均P < 0.05)。

2.2肺癌组织中Sox2、Oct4的表达与临床病理参数的关系

病理分期、病理类型与分化程度不同的肺癌组织中Sox2、Oct4的阳性表达率比较差异均有统计学意义(P < 0.05);而不同年龄、性别的肺癌组织中Sox2、 Oct4的阳性表达率比较差异无统计学意义(P > 0.05)。 见表1。

2.3肺癌组织中Sox2与Oct4表达的关系

Sox2与Oct4在肺癌组织中的阳性表达率比较差异无统计学意义(P > 0.05)。 见表2。

3讨论

肿瘤的发生与很多原因有关,目前认为,恶性肿瘤是一种干细胞疾病,源自组织成体干细胞的恶性转化。 研究证明[7],肿瘤细胞与未分化的胚胎细胞都具无限增殖的能力、自我更新以及侵袭性,因此二者之间存在某些相似性,提示了在肿瘤细胞中也可能会出现某些胚胎干细胞因子。 肺癌是当今世界上对人类生命健康威胁最大的恶性肿瘤,其具有较高的发病率及死亡率,目前对疾病发生发展的探索并寻求有效的治疗方法是医学界关注的热点。 肿瘤干细胞理论指出,肿瘤中存在一小群肿瘤的启动细胞,它们所具备的自我更新及抵抗治疗等特点是肿瘤治愈率低、治疗复杂且复发性高的根源。 近年来人们对干细胞的研究较为深入,越来越多学者经研究证实了肿瘤起源于干细胞这一观点[8]。 多数学者指出,干细胞的分子印迹决定着肿瘤的预后[9]。 Oct4与Sox2是早期胚胎发育及细胞特征维持所必须的转录因子,在肿瘤的发生发展及消化道器官发育中发挥着重要作用。 另外,这两种因子还参与到中枢神经系统、呼吸道、泌尿生殖系统等各类肿瘤的发展过程当中。 它们在维持、调节肿瘤干细胞自我更新、侵袭力等特性方面均发挥着重要作用并逐渐成为研究肿瘤干细胞作用机制和防治的直接通道。 为进一步支持这些理论,研究人员对肿瘤干细胞进行了Sox2与Oct4基因的敲除。 结果显示,这些肿瘤启动细胞在去除二者后失去了自我更新、无限增殖及形成肿瘤的能力,最终导致肿瘤细胞的凋亡。 两者的突变和异常表达与许多肿瘤有关。 这些基因表达的特异性与病理类型、临床分期、分化程度及其与肺癌发生发展的关系都需要进行进一步研究,其结果对肺癌的早期诊断及治疗有巨大的临床意义[10]。

Sox基因家庭最早发现于小鼠体内,随后在鸟类、 鱼类、哺乳类以及人类等生物体内发现大量该家族的基因片段。 根据染色体的组成和基因序列的相似性可以将其分为10个亚群。 在早期胚胎的形成与发育、神经发育、性别形成、肿瘤发生等重要生物学过程中,所编码的蛋白起到不可替代的作用。 该基因参与维持胚胎干细胞的多样性并在各类器官发育过程中发挥着重要作用,其中包括支气管的形成。 在肿瘤基因表达的研究中,通过分析分化中激活的基因结果表明 , Sox2在低分化的肿瘤中高表达 ,将该因子与Oct4等转录因子共同转入成纤维细胞或肿瘤细胞后能够建立多能分化干细胞或多能分化肿瘤细胞。 许多研究指出,Sox2主要是通过参与调解复杂的转录因子网络以维持干细胞特性及肿瘤干细胞的抗凋亡特性[11]。 因此,靶向Sox2是治疗肿瘤的良好政策。 但尽管许多针对肿瘤组织的研究报道了该因子在前列腺、乳腺癌等方面的高表达且阐明Sox2的发生对肿瘤发生的重要性但该因子在调控肿瘤发生的作用机制尚不完全清晰。 研究指出,在人与鼠的体细胞中将该因子与Oct4等因子转入细胞后可使机体细胞发生多能干细胞转化。 而该因子与OCT4/NANOG以及LIN28这4个因子的公转 ,可使人的体细胞发生多能干细胞化并具有胚胎干细胞的特性[12]。 ESCs基因Oct4也称Oct3/4,位于染色体的6p21.31位置。 该因子属于Ⅴ类POU转录因子家族 ,由Pou5fl基因码产生 ,最初发现于胚胎肿瘤细胞。 后来发现该因子的表达严格局限于小鼠生命周期全程或多功能细胞中。 它与Sox2等转录因子能对胚胎干细胞进行自我更新并保持胚胎干细胞的多潜能性,是生殖细胞和胚胎干细胞的标志物[13]。 目前可以确定的是,Oct4作为公认的胚胎干细胞标志物,在卵母细胞、胚囊的内细胞团、早期分裂期胚胎、卵圆柱期胚胎的原始生殖细胞及原始外胚层中均有表达且随着细胞的不断分化,其表达水平会逐渐下调,说明它能够保持细胞发育中的多能性。 有研究显示,Sox2在消化道肿瘤中表达量高,该表达因子对患者肿瘤组织的存在意义为促进细胞凋亡周期、抑制细胞生长。 而Oct4最初发现于胃癌及胃溃疡等胃部疾病患者病灶组织中,该类患者病灶组织中Oct4表达量较高,对癌症表达和预后密切相关,调控患者治疗及预后。 肺癌的发生起源是一个多因素、多阶段的过程,其发病机制较为复杂。 目前已经证明[14],未分化的胚胎细胞与肿瘤细胞都有自我更新、无限增殖的能力及侵袭性。 近年来各类研究发现,Oct4可表达于造血及间充质干细胞、胰岛、外周血、肠上皮、子宫内膜、脐带血、肺脏、甲状腺、肾脏及羊 水和脐带 血等组织的祖细胞[15,16,17]。 这些结果提示,Oct4可能在胚胎组织、成体干细胞及胚胎癌组织里表达。 目前对该因子的分子调节机制研究较少,但部分研究发现,相对于生殖细胞及胚胎干细胞而言,该因子的表达会随着细胞的分化而下降[18]。 实验研究也指出 ,分化的滋养外胚层细胞比内细胞群Oct表达低30倍,其表达水平上调与下调分别与维持细胞多能性及细胞的分化有关。 胚胎干细胞内Oct的水平决定胚胎干细胞3种不同命运,其表达水平保持在特定水平才能使胚胎干细胞处于不断自我更新的状态[19]。 当它的水平是正常的2倍时,可分化为中胚层细胞和原始内胚层;当其表达水平降低至正常的1/2时转为滋养层。 因此,其表达水平需保持在较窄范围内以维持细胞多能性的表型。 本研究结果显示,Sox2、Oct4在20例正常肺组织中表达全部为阴性,在60例肺癌中,Sox2阳性28例,阳性表达率为46.7%,Oct4阳性43例,阳性表达率为71.7%。 病理分期、病理分型与分化程度不同的患者Sox2、Oct4的表达存在明显差异(P < 0.05),而不同年龄、性别的患者Sox2、Oct4的表达无明显差异(P > 0.05),说明Sox2、Oct4的表达会加速肿瘤细胞的转移和分化,对肿瘤的预后有严重影响。 研究认为肺癌的发生、发展与Sox2与Oct4密切相关,且通过协同作用共同促进肿瘤的发生与发展[13], 但对Sox2和Oct4在肺癌组织中的交叉表达分析结果显示,两者并无明显相关性,由于作用机制尚未明确,尚不能排除它们之间的协同作用,需要有大量的后续研究进一步对其进行分析探索。

综上所述,Sox2与Oct4在肺癌组织中呈明显高水平表达,并与肿瘤的病理分型、分期及分化程度密切相关,因此Sox2、Oct4可能在肺癌的发生、发展过程中起着重要的作用,在肺癌的诊断及预后评价中有着重要意义。

摘要：目的 探讨干细胞关键转录因子Sox2和Oct4在肺癌患者中的表达情况及其临床意义。方法 选取2010年1月2013年12月于河北北方学院附属第一医院(以下简称“我院”)就诊的肺癌患者60例,同时以同期我院存档的20例正常肺组织作为对照,分别采用免疫组织化学法检测肺癌组织与正常肺组织中的Oct4和Sox2的表达情况。比较不同病理分期、分型、年龄、性别的肺癌患者肺组织中Sox2、Oct4的表达,分析肺癌组织中二者的关系。结果 Sox2、Oct4在20例正常肺组织中表达均为阴性,在60例肺癌组织中,Sox2阳性28例,阳性表达率为46.7%,Oct4阳性43例,阳性表达率为71.7%。病理分期、病理分型与分化程度不同的患者其Sox2、Oct4的阳性表达率不同,差异均有统计学意义(P<0.05),而不同年龄、性别的患者Sox2、Oct4的阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05);Sox2与Oct4在肺癌组织中的阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Sox2与Oct4在肺癌组织中呈明显高水平表达,并与肿瘤的病理分型、分期及分化程度密切相关,Sox2、Oct4在肺癌的发生、发展过程中可能起着重要的作用。