PCR法

PCR法（共10篇）

PCR法 篇1

随着现代分子生物学发展,分子生物学实验技术已经渗透到了生命科学的各个领域中。到20世纪末,DNA重组技术最大的应用领域在医药方面,包括活性多肽、蛋白质和育苗的生产,疾病发生机理的研究,疾病的诊断和治疗,新基因的分离以及环境检测与净化。DNA重组技术又称基因工程,它的的出现不是偶然的,是许多技术方法发展的结果[1]。而质粒是基因工程研究中的一种常用载体,近年来,伴随着分子生物学的进一步发展,经常要进行一些细菌转化、细胞转染、PCR扩增、酶切分析和DNA重组等试验,这就需要获得大量纯化的质粒DNA分子,有很多工作涉及到质粒DNA的提取[2]。质粒DNA提取是分子克隆操作中一项最基本的技术[3]。 本研究采用常规的碱裂解法提取大肠杆菌重组质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,看是否与预计相符合。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

宿主菌大肠杆菌DH5α为本实验室保存,而载体pMD18-T购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2试剂和溶液

溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-C1,pH 8.0;溶液Ⅱ(现用现配):0.2mol/L NaOH,1.0% SDS;溶液Ⅲ:5mol/L KAc 60mL,冰醋酸11.5mL,水28.5mL;TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 8.0);70%乙醇;10μg/μl RNA酶,氨苄青霉素,IPTG,X-Gal等。以上所需试剂药品除SDS、RNA酶、氨苄青霉素、IPTG、X-Gal购自上海生物工程有限公司外,其它均为国产生化试剂。

1.1.3 仪器

冰箱、纯水仪、制冰机、高速冷冻离心机、旋涡混合器、PCR仪、Gene Spec核酸检测仪、DYCP-33A型水平板电泳槽、紫外凝胶成像系统UVP GDS-8000等。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒DNA提取方法

①常温下用接种环随机挑取蓝白斑筛选转化板上的白色菌落,每个平板平均挑取5个,将得到的白色菌落接种到25mL液体LB(含有终浓度为60μg/mL的氨苄青霉素)培养基中,37℃摇床过夜培养。

②取上述菌液1.5mL于Eppendorf(Ep)管中,10 000r/min离心4min,收集菌体;弃上清,控尽后,加溶液Ⅰ130μl,漩涡振荡器上振荡混匀1min左右,重悬菌体;加溶液Ⅱ260μl,轻柔颠倒Ep管数次,混匀,冰上放置2~3min,直至管内液体呈黏稠状;加溶液Ⅲ195μl,微震颠倒Ep管数次,混匀,冰上放置3~5min,直至出现絮状白色沉淀,10 000r/min离心4min。

③转移上清至另一Ep管中,加等体积氯仿振荡混匀,10 000r/min离心4min;小心吸取上清,并转移至另一Ep管中,勿将蛋白质层吸出。

④重复上述两步的操作一次,以便完全去除蛋白质等杂质。

⑤加2倍体积无水乙醇,颠倒混匀,室温静止3~5min,12 000r/min离心5min。

⑥弃上清,留沉淀,70%乙醇轻轻洗涤1次,控干沉淀,加适量含有RNase抑制剂的灭菌双蒸水溶解沉淀,-20℃保存备用。

1.2.2 质粒DNA含量及质量分析

1.2.2.1 琼脂糖凝胶电泳法

采用不用的溶剂溶解质粒沉淀,各取5μl在1%琼脂糖凝胶上以5V/cm的电压电泳15~20min,然后在紫外凝胶成像系统上照相,根据条带亮度粗略判定DNA的浓度,同时判别RNA和蛋白质是否除尽。

1.2.2.2 Genespec核酸检测仪检测

采用Genespec核酸检测仪对上述所提质粒效果好的进行检测,以灭菌的双蒸水为对照,50倍稀释测定质粒DNA样品的OD230、OD260、OD280,以及所提质粒的浓度,每个样品测定3次,从OD260/OD230、OD260/OD280比值分析质粒DNA质量。

1.2.2.3 PCR验证性实验

为验证所提质粒DNA的正确性,需对质粒DNA进行PCR验证性实验,由于前期实验是将450bp大小的片段与载体pMD18-T(2 692bp)连接转化进行克隆后再提取质粒,所以进行质粒PCR时应采用与前期片段PCR时相同的引物,并做一个不加模板的对照,1%琼脂糖凝胶电泳检测看两次PCR后片段大小是否相符合。

2 结果与分析

2.1 质粒电泳检测结果

采用常规的碱裂解法提取的重组质粒如图1所示,每个样重复1次,从图中可以看出用TE和无菌双蒸水溶解质粒,结果所提质粒拖尾现象严重,并且有RNA的干扰,而用含有RNase抑制剂的无菌双蒸水溶解质粒效果非常好,无拖尾现象产生,并且可以很好地去除RNA污染,无蛋白质的干扰,DNA超螺旋结构完整,条带单一且清晰,大小在3 000bp左右,与前期重组质粒连接大小相一致。

Note: Dissolve the No.1 and No.2 with TE, No.3 and No.4 with sterile water, No.5 and No.6 with sterile water which containing RNase inhibitor; M = Marker 3000.

2.2 核酸检测仪检测结果

用该方法提取的质粒DNA质量及含量结果见表1。在质粒DNA提取过程中,主要污染物为蛋白质、RNA及脂类等,OD260/OD230、OD260/OD280比值可以很好地反映出所提质粒DNA样品的纯度,从表1中可以看出OD260/OD280比值介于1.8~2.0之间,OD260/OD230比值大于2.0,而50倍稀释后的浓度都在50~80μg/mL之间,表明DNA的纯度和浓度都比较高,能够满足常规分子生物学实验的要求,如PCR、酶切、连接、转化大肠杆菌等,也可以用于植物遗传转化[4]。

2.3 PCR验证结果

将进行重组质粒连接前的片段及本实验所提的质粒一起采用相同的引物组合进行PCR,1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,二者PCR出来的片段大小相一致,都在500bp左右。且未加模板的对照无带产生,说明引物本身没有发生自连和形成引物二聚体,PCR反应验证与预计相一致。

Note: CK is a contrast, No.1 is recombine plasmid PCR before connection, No.2 is recombine plasmid, No.3 and No.4 are recombine plasmid PCR; M=Marker DGL 2000.

3 讨论

已经建立了多种从细菌中提取质粒DNA的方法,这些方法无一例外都包括以下三个步骤:(1)培养细菌使质粒扩增;(2)收集和裂解细胞;(3)分离和纯化质粒DNA[5]。提取质粒时应尽量保护大多数质粒的一级结构的完整性,采取简化操作步骤,缩短提取过程等方法,以减少各种有害因素对质粒的破坏[6]。用含一定浓度葡萄糖的溶液Ⅰ悬浮菌体,采用碱性SDS(十二烷基磺酸钠)溶液即溶液Ⅱ裂解菌体的细胞壁,使质粒缓慢释放出来。经溶液Ⅱ处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着与细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成大小不同的线性片段。溶液Ⅲ是使质粒DNA复性并与染色体DNA分离,加入后置冰上放置3~5min可以提高质粒DNA的质量和产量[7]。

我们在经典“碱裂解法"的基础上进行了优化改进,可以获得质量较高的质粒DNA。经典“碱裂解法"的溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的比例(μl)为100:200:150[8],而经过我们反复实验后发现,提取1.5mL菌液时,溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ比例为(μl) 130∶260∶195效果会更好。与经典的比例相比,优化后的比例使得菌体裂解更充分,蛋白质和基因组DNA 沉淀更彻底,并且不易产生降解的质粒DNA。质粒提取过程中值得注意的是:溶液Ⅱ要现用现配,而且加入溶液Ⅱ前后时间不能过长,否则易掺杂有基因组DNA,所以严格遵守操作规定的时间。

当用酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA的两条链不会分离,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段由于分子量很大难以复性,与变性蛋白质或细胞碎片缠绕一起,而质粒DNA分子量小,环状超螺旋结构容易复性[9],并以可溶状态存在于液相中。在细菌细胞内,共价闭合环状质粒以超螺旋形式存在。在质粒提取过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其他形式的质粒DNA。如开环DNA和线状DNA。对提取的质粒DNA进行电泳时,超螺旋质粒DNA的泳动速度比开环和线状分子的泳动速度快,所以在所提目的质粒的上方分别为线状DNA和开环DNA。

质粒DNA经质量和浓度检测后,可以将完整性好符合要求的质粒进行PCR或酶切等常规分子生物学实验验证。本研究中采用了PCR验证,因为该方法不需要使用特殊试剂,在很大程度上节约了实验经费,其结果和重复性都很令人满意。

摘要：目的:筛选获得高质量质粒,为进一步克隆、测序奠定基础。方法:采用常规的碱裂解法从大肠杆菌重组质粒中提取质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,并对电泳图谱加以分析和鉴定。结果:利用常规的碱裂解法提取重组质粒,通过酚和氯仿的抽提,可以有效地去除蛋白质杂质,用含有RNase抑制剂的无菌水溶解质粒提取效果最好,得到的质粒DNA无RNA污染,纯度比较高,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间,OD260/OD230比值大于2.0,经PCR反应验证后与预计相符。结论:通过该方法获得的重组质粒纯度和浓度都比较高,且PCR验证与预计相一致,可以满足后续分子生物学实验的要求。

关键词：碱裂解法,重组质粒,PCR,琼脂糖凝胶电泳

参考文献

[1]吴建平.简明基因工程与应用[M].北京:科学出版社,2005:47-48.

[2]张伟,李贵玲,齐静,等.质粒DNA提取方法优选试验[J].浙江农业科学,2007,(6):724-727.

[3]Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual[M].2nd Ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993:16-23.

[4]Yao W,Yu AL,Xu JS,et al.Analysis andidentificationfor transgenic sugar-cane of ScMV-CPgene[J].Mol Plant Breeding,2004,1(2):13-18.

[5]陈德富,陈喜文.现代分子生物学实验原理与技术[M].北京:科学出版社,2006:70-78.

[6]魏春红,李毅.现代分子生物学实验技术[M].北京:高等教育出版社,2006:3-9.

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[8]张林琳,李磊,李翔,等.一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用[J].西安交通大学学报:医学版,2007,27(1):106-108.

[9]李潇,王明强,王滨友.质粒提取及酶切图谱鉴定[J].黑龙江医药,2005,4(18):253-255.

PCR法 篇2

班》心得

本人于2015年3月10至15日参加了广东省临检中心举办的临床基因扩增实验室技术人员上岗培训班。通过学习，除了取得广东省临检中心颁发的培训证书外，还极大的提高了理论和实验操作水平，现总结如下。

此次培训包括理论培训和实验操作。在理论培训课程当中，卫生部临床检验中心的李金明教授为我们详细讲解了《临床基因扩增实验室设计及质量管理体系的建立》、《临床基因扩增检验的质量保证》等内容。通过学习，了解到临床PCR实验室设计必须遵循各区独立、注意风向、因地制宜，方便工作的原则。质量管理的内涵：写你所做的，做你所写的，记录你已做的，分析你已做的。认识到临床标本的正确采集、运送、保存的重要性，是临床检验的质量保证的关键性环节，是解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一。同时通过病例分析，对于临床基因扩增检验的检验前，检验中，检验后的质量控制，还有实验的结果处理和分析有了重新认识。对于实验室是否出现污染的鉴别，以及出现污染的处理措施有了深刻了解。

临床实验医学的发展现在经历了三个时代，分别是生化诊断时代，免疫诊断时代，和和现在的分子（基因）诊断时代，而现今时代的标志性技术正是PCR技术，是反映疾病本质的实验。正是有临床基因扩增检验技术在癌症等疾病的诊断方面有了多方应用，通过驱动基因的选择，为靶向治疗患者延长了生存期。为个体化诊疗中对疾病的鉴别诊断，诊治方案的设定提供重要的参考依据，同时也为治疗过程中临床对于治疗方案的调整提供依据。临床基因扩增检验技术在个体化诊疗中是不可或缺的一部分，是其重要的组成部分，具有强大的发展潜力和前景。

实验操作内容为EGFR突变基因检测。实验操作过程中，通过认真学习和细致听讲带教老师的规范实验操作，了解到了实验的关键操作，纠正了平常在临床实际工作操作上的一些不良习惯，为日后规范检验操作提供了基础。通过分组亲自操做实验，分析和判断自己的实验结果，做实验记录笔记，基本掌握EGFR突变基因检测。

PCR法 篇3

【关键词】 肝炎病毒，乙型；DNA，环状；聚合酶链式反应；单核细胞

【中图分类号】R51216 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0048-02

乙型肝炎病毒（HBV）复制有其独特的地方，首先形成共价闭合环DNA（covlently closed circular DNA，cccDNA），然后转录成前基因组RNA，最后在逆转录酶的作用下合成病毒基因组DNA，故cccDNA是HBV复制的突出标志[1]。cccDNA主要存在宿主的细胞核，既往均采用肝组织检测DNA，但取材困难，限制了临床应用。研究发现外周血淋巴细胞同样存在HBV感染复制现象[2，3]，故检测外周血HBV cccDNA同样能反映HBV复制状况及评价药物疗效，且比肝组织更方便，只是外周血cccDNA浓度较低，易出现假阴性。为了评估巢式-实时荧光定量PCR法在检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HVB cccDNA的实用性，笔者拟利用巢式-实时荧光定量PCR法同时检测慢性乙肝患者肝组织和PBMC中HVB cccDNA的含量，以期为临床检测HCV复制状况及评价药物疗效提供简便有效的方法。

1材料与方法

1.1标本 选取长沙市第一医院传染科确诊的慢性乙型肝炎患者20例，男13例，女7例，平均年龄46.8岁（28～65岁），所有患者均未进行任何治疗。每例病例分别采取全血10ml和行肝穿刺获取肝组织；全血采用密度梯度离心法分离PBMC，洗涤5次后检测上清液中HBV DNA，确认HBV DNA PCR结果为阴性后，计数细胞，取1×106细胞备用。肝组织用生理盐水清洗4次，入液氮保存备用。aywHBV全序列的pcp10质粒，采用p-GEM-T-Easy载体构建，用作检测HBV cccDNA的阳性参照定量标准品，提取阳性标准质粒，测定核酸浓度，倍比稀释为5.0×102～5.0×109拷贝/ml，作为阳性标准品对照。

1.2引物与探针的设计及合成 根据HBV cccDNA与松弛结构DNA（rcDNA）结构上的差异，跨HBV DNA双链缺口两侧选择区域设计2对内外引物，并在负链缺口下游设计TaqMan荧光探针。所有设计的引物能选择性地扩增HBV cccDNA，而不能扩增rcDNA。P1引物：5-CGC TTT CGG GTC CCT CAT GCG ACG TGC-3，P2引物：5-TCG CTT TCG GGT CCC T-3，P3引物：5-GCA CCT CTC TTT ACG CGG TC-3，P4引物：5-AAC TGA AAG CCA AAC AGT G-3，TaqMan荧光探针：5-FAM-CTC TGC C-TAA TCA TCT CAT GTT CAT-TAMRA-3，外引物扩增片段为385bp，内引物扩增片段为105bp。

1.3主要试剂 基因组提取试剂盒、HBV DNA荧光定量PCR检测试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自北京索奥生物技术公司，CR Master Mix试剂购自日本东洋坊公司。

1.4DNA抽提 利用质粒抽提试剂盒按说明书操作提取PBMC及肝组织中病毒DNA。

1.5巢式-实时荧光定量PCR扩增 取纯化模板2μl，用外引物进行第一轮常规PCR扩增。外引物P1和P2浓度为10μmol/L，各1μl，10mmoldNTP 0.5μl，Taq酶0.5μl，10×buffer 2μl，ddH2O 13μl；循环条件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；72℃ 5min。第二轮反应用内引物和荧光探针对第一轮PCR产物中的目的片段进行实时荧光定量扩增。反应体系为：第一轮PCR产物2μl，2×Taq PCR Master Mix 12μl，P3、P4引物各1μl，10μmol/L荧光探针0.5μl，反应总体积20μl；循环条件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；72℃ 5min。设阳性标准品对照为aywHBV全序列的pcp10质粒，阴性对照为3例健康献血员。

2结 果

2.1肝组织和外周血中PBMC中cccDNA检测结果 第一轮PCR产物电泳在385bp处见阳性条带，第4，6，7，8，10，12，13泳道呈阳性（图1）。20例血清HBV DNA均为阳性的慢性乙型肝炎患者肝组织中ccDNA阳性者10例，阳性率为50%（10/20）。cccDNA定量值为4.214×104～5.211×105拷贝/ml。外周血PBMC中cccDNA陽性者9例，阳性率45%（9/20）。cccDNA定量值为3.521×103～3.452×104拷贝/ml。3例健康献血员PBMC中cccDNA均阴性。

2.2外周血PBMC和肝组织中cccDNA阳性的符合率 9例外周血PBMC中cccDNA阳性患者的肝组织中cccDNA均阳性，但有1例肝组织中cccDNA阳性患者其外周血PBMC中cccDNA阴性，外周血PBMC和肝组织中cccDNA阳性的符合率高达90%（9/10）。

2.3方法的敏感性 检测pcp10阳性参照定量标准品，得到该方法的灵敏度为2log10拷贝/ml范围，随着模板量减少，对应CT值增大，呈线性相关，获得标准曲线（图2）。

3讨 论

临床上一般以HBV DNA载量作为抗病毒治療依据及判断乙肝病毒复制活力，HBV DNA包括rcDNA和ceeDNA。有学者认为单纯依靠血清HBV DNA检测是不够的，应结合HBV cccDNA的检测和临床来进行综合分析，才能更真实地反应患者体内乙肝病毒的复制，为临床治疗提供更为可靠的依据[4]。cccDNA的清除预示着HBV在宿主体内生命周期的终结，因此不少学者认为这是最佳的抗病毒参考指标之一[4]。HBV cccDNA的检测能够评价抗病毒药物的疗效，连续观察更能反映乙型肝炎患者病情的变化，所以准确、方便、快速检测cccDNA的量是目前乙肝治疗的迫切要求。乙型肝炎病毒HBV cccDNA研究以肝组织为多，但肝组织取材困难，临床应用受到了极大的限制。HBV可以感染白细胞，而这种免疫细胞的感染有利于病毒免疫逃逸，不被免疫细胞攻击，从而导致机体清楚HBV能力下降，故外周血PBMC中存在HBV感染和复制，检测外周血PBMC中cccDNA应该亦能反映HCV的复制，但血液中cccDNA的水平远远低于肝组织，检测亦较为困难。

巢式-实时荧光定量PCR技术具有高灵敏性和高特异性，能够检测极其微量的DNA。cccDNA有共价、闭合、超螺旋双链DNA结构，在碱变性后可再复性，而rcDNA是有缺口的双链DNA，碱变性后不可复性 所以本实验方法应用质粒提取试剂盒抽提肝组织和PBMC中的病毒DNA可以祛除rcDNA、单链DNA和RNA，对cccDNA进行纯化，可进一步提高cccDNA检测的灵敏性和特异性[5]。

本研究结果显示，利用巢式-实时荧光定量PCR技术对20例血清HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎患者的肝组织和PBMC中的cccDNA进行检测，发现肝组织和PBMC中cccDNA的阳性率分别为50%和45%，且两者的符合率高达90%，表明利用巢式-实时荧光定量PCR技术检测外周血PBMC中的cccDNA亦能较真实的反映HBV的复制，可以避免由于肝组织取材带来的限制，且准确、方便、快捷，是一种评价抗病毒药物的疗效，观察乙型肝炎患者病情的变化的有效手段，具有很强的实用性。

参考文献

[1]陈延平. 检测HBVcccDNA的巢式-实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用[D].第四军医大学，2007.

[2]陈勇. 实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA体系建立及临床应用初步研究[D].重庆医科大学，2008.

PCR法 篇4

1 资料与方法

1.1 标本来源:回顾性分析建阳区我院检测的1624例HPV感染患者的临床资料, 男5例, 女1619例, 年龄18~56岁, 平均年龄 (36.2±4.23) 岁, 病程为0.5~9个月, 平均病程 (3.1±0.67) 个月, 所有患者均有性生活史, 均有不同程度的瘙痒, 其中男性常见于冠状沟、包皮内板、龟头、系带及肛门周围, 女性常见于大小阴唇、阴道口、阴道内及会阴处。

1 . 2 仪器与试剂: 高速离心机 ( Thermo - 2 ) , 基因扩增仪 (Hema9600) , 恒温杂交仪 (YN-H16) , 各种小型器材, 人乳头瘤病毒基因分型 (23型) 检测试剂盒, 包括高危型和低危型, 购自亚能生物技术有限公司。

1.3 HPV DNA提取与检测

1.3.1 标本采集:本次实验的标本为采集患者泌尿道分泌物, 外阴赘生物、溃疡处分泌物和组织液等。男性患者用咽拭子采集尿道分泌物, 女性患者以专用宫颈脱落细胞采集器 (宫颈刷) 进行采集, 将宫颈刷置于宫颈口, 单方向旋转4~5周以获得足量的上皮细胞样本, 然后将宫颈刷头部放入提取缓冲液管中, 沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断, 旋紧管盖, 并保持提取缓冲液管直立送检。

1.3.2 实验过程:将送检的标本充分洗脱后取1 m L液体转移到离心管中于13000 r/min离心10 min后弃去上清液, 加入裂解液悬浮沉淀, 沸水浴加热再离心, 上清液作提取样本DNA。再进行PCR扩增、杂交、洗膜、显色, 并观察结果。每次实验设置一个阴性质控和一个阳性质控, 作为质量控制[2]。

1.3.3 结果判读:根据膜条上蓝色斑点显现的位置, 读取相应位。仅一个基因型位点出现蓝色班点, 则为相应基因型单一感染;多个基因型位点出现蓝色斑点, 则为相应基因型的混合感染;检测位点无显色信号, 则为阴性或低于检测限[3]。

2 结果

本次检测HPV阳性患者504例 (31.0%) 。各型均有检测出感染, 单型感染患者346例 (68.7%) ;混合型感染158例 (31.3%) ;其中高危型381例, 占75.6%, 高危型感染以16、52、53、58型感染较多;低危型123例, 占24.4%, 低危型感染以42、43、81型感染较多。

病理诊断显示, 12例阴道内损害, 呈乳头状, 5例小阴唇损害, 呈丝状。年龄段情况比较, 感染高峰人群为30~39岁, 其次20~29岁, 达到40岁以后感染率骤然减少, 见表1。

3 讨论

随着社会经济的不断发展, 性传播类的疾病发病率越来越高, 通过生殖道传播、感染的HPV的概率也不断增多, 目前, 流行病学和分子生物学的研究结果说明, 人乳头状瘤病毒和宫颈癌、癌前病变都存有密切的联系[4]。人乳头状瘤病毒也是引发宫颈癌的主要病毒, 虽然感染HPV的患者在临床上没有明显的症状, 或处于一种亚临床感染, 但是会导致严重的后果发生, 病死率较高, 严重影响了患者的生活质量。PCR-反向点杂交法通过PCR体外的扩增及DNA反向点杂交技术相结合, 分子杂交的特异性较高, 属于HPV检测的新方法, 提高了检测的敏感性[5]。

本院采用PCR-反向点杂交法可对患者分泌物进行基因分型, 了解各型感染情况, 总检出率达31.0%。本研究表明HPV感染高峰人群为30~39岁, 这可能与此阶段年龄妇女性生活频繁、忽略性行为卫生及个人卫生习惯、生活工作压力大等原因有关, 而达到40岁以后感染率又骤然减少。在所有检测HPV型别中, 以高危型HPV感染为主。已有研究表明, 高危型HPV感染且年轻化是影响宫颈癌发生的发生的重要因素[6]。

PCR-反向点杂交法检测HPV结合临床表现及病理细胞学检查, 诊断率高, 特异性强, 对HPV感染病变的早期发现, 判断预后及治疗有重要价值, 对降低宫颈癌的发病率有重要的指导意义。

摘要：目的 探讨闽北建阳区PCR-反向点杂交法在检查患者HPV感染病变中的临床意义及分析。方法 回顾性分析我院检测的1624例HPV感染患者的临床资料, 采用PCR-反向点杂交法对病变标本进行HPV分型检测。结果 共进行1624次HPV分型检测, 检出感染患者504例, 检出率为31.0%, 感染较多的是16、52、58、81型, 并以高危型感染为主。单种分型感染共346例, 两种及以上感染158例。结论 PCR-反向点杂交法在HPV感染的诊断率较高, 特异性较强, 对闽北地区HPV感染病变的早期发现, 判断预后及指导治疗有重要价值。

关键词：反向点杂交法,人乳头瘤病毒 (HPV) ,临床价值

参考文献

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[5]章涛, 李彦, 肖瑜.宫颈疾病HPV亚型感染的导流杂交法检测及意义[J].中国妇幼保健, 2009, 24 (8) :1126-1129.

PCR自我鉴定 篇5

1. PCR mix的制备

Taq buffer(10×) 20 μL

(转 载于:wWw.cnboThwiN.cOM 博 威范文 网:pcr室自我鉴定)

dNTP(2.5 mmol/L)5 μL

Primer Forward(50 mmol/L) 10 μL

Primer Reverse(50 mmol/L) 10 μL

ddH2O 147 μL

Taq(2U/μL) 8 μL

total 200 μL

将上述溶液混匀，10 μL每管分装于200 μL PCR管中。

2. 常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝;然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下(管子做好记号，将平板上点的克隆标号与管子上的对应起来，以便筛选到克隆后进行扩繁培养)，盖紧管子。

3. 将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。PCR反应程序根据具体的引物设置，参考下列程序：

95℃，3 min

95℃，30 s 56℃，30 s 72℃，50 s 30个循环

72℃，10 min。

4. 电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。(取5 μL PCR反应液与1 μL上样缓冲液混合，进行1% 琼脂糖电泳，5V/cm，选择适当大小的DNA分子量标准，检查扩增产物。紫外观察PCR产物是否与插入片段大小一致?)

5. 将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增;次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，尽可能安排在早上做PCR，下午就可以提质粒，得到重组载体。

(七)菌液PCR鉴定转化子

1. 取培养过夜的转化菌液20 μL，沸水浴3～5 min。

2. 室温12 000r/min 离心2min。取上清液作为PCR的摸板，按下列反应体系配制

ddH2O 13.5 μL

10×PCR Buffer(25mM Mg离子) 2 μL

dNTP(10mM each) 0.5 μL

Primer l(20μM) 0.5 μL

Primer 2(20μM) 0.5 μL

模板DNA2 μL

TaqDNA聚合酶(2.5U)1 μL

总体积20 μL

3. 加一滴液体石蜡，混匀，短暂离心。

4. 在PCR仪上进行PCR反应。参考下列程序：

95℃，3 min

95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，50 s，30个循环

72℃，10 min。

5. 电泳检测是否得到目的片断。

1 最简单的：用枪尖或者牙签从平板或液体中沾少量菌(多了就会影响反应了，沾上点就够了)，直接加入到PCR体系中反应就行了，依靠变性温度来破裂细菌释放DNA，我一直这样做大量筛选。

2 旁边实验室的方法：用枪尖或者牙签沾少量菌，加入到没有加酶的PCR反应体系中，沸水浴5min，冷却后加入酶，开始反应，有些不容易加热破裂的菌预先煮沸一下，可以释放更多的DNA，有利于PCR反应。

3 用Chelex，旁边的旁边的实验室做菌种鉴定的时候习惯用的方法：可以去除一部分杂质，降低PCR反应所受的干扰。

1) 5%-10%chelex 50μl(配法：5-10g chelex 加入100ml TE)+菌苔，在管壁适当研磨，震荡混匀，短暂离心

2) 煮沸：细菌5min，放线菌10-15min

3) 冷却至室温，10000-1rpm离心5-8min，取上清扩增

注：chelex方法适于细菌、放线菌，chelex提前在65摄氏度水浴中预热，溶液有细小颗粒，吸取时枪尖最好先剪掉，否则不好吸。

这3个方法由简到繁，效果当然是依次提高了。我理解，这样的直接以细菌为模板进行PCR反应，特别是前两种，适用于大量的筛选和验证，由于加入了细菌本身的其他物质以及难免引入的培养基成分，可能会对PCR反应造成干扰，假阳性假阴性都是可能出现的，所以之后最好还要进一步验证。chelex方法可以去除一定的杂质，干扰较小，但是毕竟也不如直接以DNA为模板效果好。楼主需要根据自己的实际需要来选择合适的方法。

把PCR MIX加好，最好把细菌用TIP沾点就可以了。变性温度也不变，时间可长点儿，容易。

我也这样做过，96度变性时延长为10min左右，几乎都能扩增出来。

PCR法 篇6

据联合国粮食和农业组织FAO (1995) 报告报道, 含谷蛋白的谷物、树坚果、鱼、大豆、甲壳类、鸡蛋、花生和牛奶会经常引起过敏反应, 占所有食物过敏原的90%以上[2]。含谷蛋白的谷物具体是指小麦、大麦、黑麦和燕麦。经研究证实, 小麦醇溶谷蛋白、黑麦碱、大麦醇溶谷蛋白和燕麦蛋白是致敏蛋白[3]。敏感个体会对这些蛋白产生不适当免疫反应而患乳糜泻, 一种小肠慢性炎症性疾病。目前, 乳糜泻没有有效的治疗方法, 患者只能通过终身无谷蛋白食疗[4], 若持续摄入含谷蛋白的食物, 则可能导致严重并发症如男女不孕, 肝功能异常和恶性肿瘤等[5]。总之, 乳麋泻是一种具有高患病率和死亡率且易被误诊和漏诊的疾病。

为了尽量避免因消费者误食而导致的过敏事件的发生, 急需建立可靠和灵敏的致敏原检测方法, 为食品标签标注的准确性提供坚实后盾。

目前已有的谷物致敏原测定方法是ELISA, 但此法有不如人意之处。ELISA的检测对象是蛋白质, 蛋白质的三维结构在热加工过程中会发生巨大变化, 这就可能改变醇溶谷蛋白的抗原决定簇, 使其再也无法识别抗体的活性结合位点, 继而降低特异性和产生不确定性。另一个原因是抗体对不同品种谷物 (小麦、大麦、黑麦和燕麦) 的醇溶谷蛋白的亲和力会有较大差异, 因此就可能因标准品的不同, 而出现不同厂家的ELISA试剂盒的测定结果有所不同的情况[6]。因此仍需建立一种快速和灵敏的方法来检测市场上的各种产品。

鉴于上述原因, 可采用PCR来检测食品中的谷物致敏原。PCR的试验对象DNA比蛋白质稳定, 热变性条件下仍可被有效提取, 而且受地理条件和季节变化的影响较小。因此可作为对已建立的酶联免疫吸附法的一种补充。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

材料:大麦、黑麦、小麦、燕麦、荞麦、薏仁米、小黄米、大米、玉米、黄豆、红豆和高粱米, 均购自当地超市。

仪器:SW22振荡水浴槽, 北京优莱博技术有限公司;Centrifuge 5415R离心机、AG22331 Hamburg核酸蛋白分析仪, 德国Eppendorf公司;Eastwin Vortex-2Genie震荡混匀器, 美国Scientific Industries公司;580 BR PCR扩增仪, 美国ABI公司;Power Pac Basic电泳仪、Universal HoodⅡ凝胶电泳成像仪:美国BIO-RAD公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取

采用改良CTAB裂解液 (Tris-HCl p H值8.0, 100mmol;EDTA p H值8.0, 20mmol;Na Cl 1.4mol;2%CTAB (w/v) ;5%PVP40 (w/v) ) 提取大麦、黑麦、小麦、燕麦、荞麦、薏仁米、小黄米、大米、玉米、黄豆、红豆、高粱米以及桂格燕麦粥、西麦麦片 (含30%燕麦) 、燕麦年轮蛋糕、谷粒酸奶 (含大麦、燕麦仁) 、混合谷物薄饼 (含大麦面粉、全燕麦面粉) 5种实样的DNA。

将样品放入灭菌的研钵中适量研磨, 取100mg加入2m L离心管中, 加入500μL改良CTAB裂解液和10μL蛋白酶K (20mg/m L) 于65℃裂解一整夜, 然后加入600μL酚-氯仿-异戊醇 (体积比为25∶24∶1) 混匀, 13 200r/min离心10min, 取上清液加入等体积氯仿-异戊醇 (24∶1) 混匀, 13 200r/min离心10min, 取上清液加入0.8倍体积的异丙醇于-20℃放置1.5h左右沉淀DNA, 13 200r/min离心10min后晾干, 最后用100μL TE缓冲液溶解沉淀[7]。

1.2.2 用植物通用引物t RNALeu验证所提取样品DNA的扩增性

PCR反应体系为20μL, 其中Mg Cl2终浓度2.0mmol;d NTP终浓度各200μmol;引物终浓度0.5μmol;模板1μL。反应条件为94℃预变性4min, 然后94℃、30s, 54℃、30s, 72℃、40s, 35个循环, 最后72℃延伸5min, 4℃保温。扩增产物用1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测 (TBE缓冲液) , 其中含终浓度为0.5μg/m L的溴化乙锭, 取8μL PCR产物加入上样孔, 110V, 电泳45min, 用凝胶成像系统检测。

1.2.3 引物设计

根据Gen Bank中公布的H.vulgare Hor3 gene, 利用引物设计软件Primer 3.0自行设计, 并将设计的引物通过Blast比对, 考查其特异性。引物由上海生物工程合成, 序列见表2。

1.2.4 PCR反应体系及反应条件

反应条件为94℃, 4min;33个循环 (94℃, 30s;57℃, 30s;72℃, 40s) ;72℃, 5min;4℃保温。扩增产物用1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测 (TBE缓冲液) , 其中含终浓度为0.5μg/m L的溴化乙锭, 取8μL PCR产物加入上样孔, 110V, 电泳45min, 用凝胶成像系统检测。

2 结果与分析

2.1 通用引物t RNA验证所提样品DNA的扩增性

L1:Marker (100~600bp) ;L2:小麦;L3:大麦;L4:燕麦;L5:黑麦;L6:荞麦;L7:薏仁米;L8:小黄米;L9:大米;L10:玉米;L11:黄豆;L12:红豆;L13:高粱米;L14:阴性对照

由图1可知:每种样品处均出现了明亮的目标条带, 说明所提取的样品DNA具有很好的扩增性。

2.2 特异性试验

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦;L3:黑麦;L4:小麦;L5:燕麦;L6:荞麦;L7:薏仁米;L8:小黄米;L9:大米;L10:玉米;L11:红豆;L12:高粱米;L13:阴性对照

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦;L3:黑麦;L4:黄瓜;L5:土豆;L6:大蒜;L7:生姜;L8:芝麻;L9:葱;L10:猪;L11:牛;L12:羊;L13:鸭;L14:阴性对照

试验在所确定的PCR条件下进行, 分别选取了燕麦、大麦、小麦、黑麦、荞麦、薏仁米、小黄米、大米、玉米、黄豆、红豆、高粱米、黄瓜、土豆、大蒜、生姜、芝麻、葱、猪、牛、羊和鸭共22种相关的样品对燕麦引物进行了特异性试验, 结果如图2和图3所示。

由图2和图3可知:引物Barley108bp只在大麦和黑麦处出现明亮目标条带, 在其他对照样品处均不出现条带, 说明引物具有很好特异性。虽在样品鸭处出现一条600bp左右的条带, 但大小与目标条带相差很多, 故并不干扰检测结果的判定。

2.3 检出限

2.3.1 理论检出限

按照试验方法中确立的参数, 我们通过使用不同浓度的大麦DNA模板和黑麦DNA模板对PCR体系的理论检出限进行了研究, 结果如图4和图5所示。

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦100ng/μL;L3:大麦10ng/μL;L4:大麦1.0ng/μL;L5:大麦0.1ng/μL;L6:阴性对照

L1:Marker (100~600bp) ;L2:黑麦100ng/μL;L3:黑麦10ng/μL;L4:黑麦1.0ng/μL;L5:黑麦0.1 ng/μL;L6:阴性对照

由图4和图5可知:引物BR108bp对大麦和黑麦的理论检出限均为1.0ng/μL。

2.3.2 实际检出限

按照试验方法中确立的参数, 我们通过使用将米粉与大麦、米粉与黑麦按照一定的比例进行混合制备成的谷物含量梯度分别为100%、10%、1.0%、0.1%和0.01% (w/w) 的样品DNA模板对PCR体系的实际检出限进行了研究[9], 结果如图6所示。

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦100%;L3:大麦10%;L4:大麦1.0%;L5:大麦0.1%;L6:大麦0.01%;L7:黑麦100%;L8:黑麦10%;L9:黑麦1.0%;L10:黑麦0.1%;L11:黑麦0.01%;L12:阴性对照

由图6可知:引物BR108bp对大麦和黑麦的实际检出限均为1.0%。

2.4 实样检测

为了验证本PCR检测方法的实用性, 试验选取了7种市售样品进行了检测, 其结果如图7所示。

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦早餐营养麦片;L3:大麦面包;L4:谷粒酸奶 (含大麦、燕麦仁) ;L5:混合谷物薄饼 (含大麦面粉、全燕麦面粉) ;L6:黑麦片;L7:黑麦面包;L8:黑麦薄脆饼干;L9:阴性对照

由图7可知:各样品均在108bp处出现了目标条带, 检测结果与产品的标注相符。谷粒酸奶处的条带相对较暗, 可能是因为大麦含量相对较低。

2.5 PCR产物测序

尽管研究结果显示, 在试验条件下各引物均在相应的位置出现了目标条带, 但为了保证试验结果的准确性, 还需对PCR产物进行测序, 并利用DNASTAR的Meg Align将测序结果和目标序列进行比对[10]。通过这样的方式来验证PCR的扩增结果。

经测序和比对, 发现以大麦和黑麦为模板的BR108bp扩增产物与模板序列的匹配度分别达到了100%和97.1% (单向测序) 。

测序结果中引物序列包括紧跟在引物后面的一部分序列是测不到的, 为了获得整个序列, 故采取双向测序, 采用DNAMAN软件进行拼接。先将下游引物测得的序列转化为反向逆转序列, 再与上游引物测得的序列进行拼接。将拼接得到的序列与目标序列进行比对, 考查匹配度。

采用DNAMAN软件将上游引物测得的序列与下游引物测得的序列进行拼接后发现大麦和黑麦的测序结果一致, 与目标序列只相差一个碱基 (用方框标记的碱基) , 归纳见表4。可见以大麦DNA为模板和以黑麦DNA为模板获得的扩增产物是一致的, 而且都是目标产物。

3 结论

用改良CTAB裂解液提取样品DNA, 使用PCR方法检测市售产品是否污染了致敏原大麦和黑麦。针对大麦和黑麦的理论检出限均为1.0ng/μL, 实际检出限均为1.0%。满足检测产品中是否含大麦和黑麦致敏原的要求。所建立的PCR方法价格低廉, 操作简单, 结果准确可靠, 可作为产品是否含大麦和黑麦致敏原的鉴定方法。

摘要：乳糜泻是患者对小麦、大麦、黑麦和燕麦中的谷蛋白产生的一种不适当免疫反应。患者只能通过终身无谷蛋白食疗来避免严重并发症。本文建立了一种常规PCR方法来同时检测食品中大麦和黑麦致敏原。引物BR108bp是针对大麦醇溶谷蛋白3编码序列设计的, 在GenBank上经Blast, 发现理论上特异性很好。然而通过试验发现, 该引物除了在大麦处出现相应扩增外在黑麦处也扩增出大小约为108bp的条带。经测序和比对, 发现以大麦和黑麦为模板的扩增产物测序结果一致, 并且只与模板序列相差一个碱基, 这说明黑麦也含有这段序列, 只是在核酸数据库中没公布, 因此可以说是发现了黑麦的部分基因序列。通过多次试验, 结果表明:该引物只在大麦和黑麦处出现相应扩增, 具有良好特异性, 针对大麦和黑麦的理论检出限均为1.0ng/μL, 实际检出限均为1.0%。而且能检测热加工食品中的大麦和黑麦DNA, 故可用于日常检测。

关键词：大麦,黑麦,谷蛋白,PCR,检测

参考文献

[1]The Food Allergy&Anaphylaxis Network[EB/OL].http://www.foodallergy.org (2013-05-03) .

[2]Hendra T..Passing the food allergen test[J].Gereal Foods world, 2003, 48 (1) :20-23.

[3]Martin Sandberg, Lisa Lundberg, Monica Ferm, et al.Real time PCR for the detection and discrimination of cereal contamination in gluten free foods[J].Eur Food Res Tech nol, 2003, 217 (4) :344-349.

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[8]SN/T 1202-2003食品中转基因植物成分定性PCR检测方法[S].

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PCR法 篇7

目前,针对动物源性成分的检测技术[3],主要有基于蛋白、DNA的检测。基于蛋白检测,由于蛋白易变性,以及检测对仪器、试剂、样品处理有较高要求,使它的应用受到限制。DNA检测成为检测饲料中动物源性成分的主流,应用较多的有普通PCR[4,5]、PCR - RFLP[6,7]、实时荧光PCR[8,9]。相对于实时荧光PCR,普通PCR、PCR - RFLP灵敏度较低,往往不能达到检测饲料牛羊源性成分的目的。实时荧光PCR方法主要包括基于染料SYBR和基于Taq Man探针,这两种方法各有优缺点。基于染料SYBR实时荧光PCR,染料能够非特异性地与双链DNA结合,如PCR产物、引物二聚体等,特异性受到一定影响; 但是操作简单,不需要设计探针,成本较低。基于TaqMan探针实时荧光PCR,灵敏度高、特异性好,但成本较高,且难以应用于多重PCR检测方法中。

由于多重PCR检测技术具有节约成本、节约时间等优点,成为目前分子生物学研究的重点及热点。SYBR的多重实时荧光PCR应用于微生物、动植物等方面的检测已经有许多报道[10,11,12],但在牛羊源物种识别方面鲜有报道,可能是牛羊同源性较高的原因。从实际样品检测角度出发,结合灵敏度、成本、高通量的要求,研究建立了基于染料SYBR双重实时荧光PCR方法,可快速同时检测饲料中的反刍动物( 牛羊) 源性成分。

1 材料

1. 1 仪器、试剂

小型紫外可见分光光度计( 型号为ND - 1000) 、荧光定量PCR仪( 型号为BIO - RAD IQ5) 、培养箱/干燥箱( 型号为上海一恒PH - 010) 、纯水机( 型号为Millipore Direct - Q) 、离心机( 型号为Sigma1 - 14 ) 、凝胶成像仪( 型号为BIO - RAD) 、电泳仪( 型号为PAC - Universal) 、植物饲料DNA提取试剂盒,由天根生化科技( 北京) 有限公司生产。

1. 2 样品的准备

牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉各3 份,购自北京物美连锁超市; 阴性饲料对照( 饲料中不含牛羊源性成分) ,由中国动物疫病预防控制中心提供; 阳性饲料对照( 饲料中含0. 1% 牛源性成分、0. 1% 羊源性成分、0. 1% 牛羊源性成分) ,购自北京美瑞迪科技有限公司。

2 方法

2. 1 基因组的提取及浓度的测量

先将牛、羊、猪、鸡等肉样分别放在锡箔纸上,置于干燥箱中烘干,温度设置为110 ℃,时间为1 h。然后分别将不同的肉、饲料放在研钵中研成粉末,利用动物源性成分DNA提取试剂盒提取肉组织的DNA,根据说明书进行操作,每种样品至少做3 次平行试验,利用小型紫外可见分光光度计( 型号为ND -1000) 测量核酸的浓度。

2. 2 引物的设计

从Gen Bank中分别找出牛、羊线粒体中线粒体环氧酶2 ( Cox2) 和细胞色素b ( Cytb) 基因,利用BLAST比较2 组基因序列的区别,通过Primer Premier 5. 0 软件分别设计牛羊的特异性引物序列,并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物,引物信息见表1。

2. 3 PCR扩增

2.3.1反应体系

单重荧光PCR: 10 μmol / L上、下游引物各1 μL,2 × Ultra SYBR Mixture 25 μL,模板2 μL,剩余体积用超纯水补齐至50 μL。双重荧光PCR: 牛10 μmol / L上、下游引物各0. 5 μL,羊10 μmol / L上、下游引物各2 μL,2 × Ultra SYBR Mixture 25 μL,牛羊混合模板5 μL,剩余体积用超纯水补齐至50 μL。

2.3.2反应程序

95 ℃ 预变性5 min; 95 ℃ 变性30 s,56 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸1 min,共35 个循环;75 ℃ 检测荧光10 s。 熔解曲线分析,起始温度为72 ℃ ,每间隔10 s升高0. 5 ℃ ,直到升温至85 ℃ 。

2. 4 熔解曲线的分析

用IQ - 5 做出熔解曲线,根据牛羊扩增片段熔解曲线最大吸收峰所对应的熔解温度( Tm值) 的不同,定性识别饲料中是否含有牛羊源性成分。

3 结果与分析

3. 1 特异性测试

用牛、羊引物分别对牛、羊、猪、鸡DNA模板进行单重荧光PCR扩增,并对熔解曲线进行分析,结果见图1、图2。

由图1 可知,牛扩增产物熔解曲线最大吸收峰所对应的熔解温度为76 ℃,羊扩增产物熔解曲线最大吸收峰所对应的熔解温度为81 ℃。引物与模板交叉匹配,经熔解曲线分析,没有出现其他最大吸收峰,证明没有非特异性扩增。

熔解温度为76℃;1.50 bp DNA Ladder;2~5.反应体系中分别添加牛、羊、猪、鸡模板。

熔解温度为81.5℃;1.100 bp DNA Ladder;2~5.反应体系中分别添加羊、牛、猪、鸡模板。

3. 2 方法的可行性验证

用牛羊混合引物对牛羊模板进行双重荧光PCR扩增,并对熔解曲线进行分析,结果见图3。熔解曲线出现2 个吸收峰,牛羊扩增产物吸收峰的位置与单重荧光PCR结果一致,并且没有杂峰出现,试验证明方法具有可行性。

3. 3 灵敏度的测试

提取牛羊肉骨粉的DNA,分别取3 次提取的平均值作为含牛羊成分100% 模板。将含100% 的牛羊模板DNA等体积混合,然后对模板进行梯度稀释,共稀释3 次,制得1% 、0. 1% 、0. 01% 的DNA模板。以此为模板,进行双重荧光PCR试验,结果见图4。

由图4 可知,当牛羊的模板浓度为总DNA的1% 、0. 1% 时,牛羊的熔解峰较为明显,能够很好地代表反应体系检出牛的扩增片段和羊的扩增片段。当牛羊的模板浓度为总DNA的0. 01% 时,牛的熔解峰较大,羊的熔解峰较小,近乎没有峰值。牛的检出灵敏度为0. 01% ,羊的检出灵敏度为0. 1% 。

图3牛羊扩增产物的熔解曲线

3. 4 实际样品的检测

选取已准备好的10 个贴有标签的饲料,阴性饲料3 个,阳性饲料7 个,其中牛阳性饲料成分3 个,羊阳性饲料成分2 个,牛羊源阳性饲料成分2 个。检出结果与贴有的标签标识吻合,准确度为100% ,见图5。

4 讨论

牛羊线粒体基因同源性很高,利用一个编码基因分别设计牛羊的特异性引物时,在双重体系中容易引起非特异性扩增。试验选择线粒体的2 个编码基因,利用Cytb基因设计羊特异性引物,利用Cox2 基因设计牛特异性引物。

牛羊扩增效率不同,牛的扩增效率要明显高于羊的扩增效率。在双重荧光PCR体系中,牛羊DNA片段的扩增存在竞争关系。试验的成败关键是优化引物的相对含量,试验过程中发现,当牛羊引物含量比值为1∶1 时体系只能扩增牛的DNA片段,当牛羊引物浓度为1∶2 时可以同时扩增牛羊DNA片段,但是饲料中羊成分检测灵敏度仅为1% ,不能达到检测要求; 最终试验将引物含量比例定为1∶4,不仅能够同时检测饲料中的牛羊源成分,而且检测牛羊成分的检测灵敏度≤0. 1% ,符合检测要求。

根据参考文献[13 - 14],熔解曲线出峰位置与扩增片段的大小及G + C含量有关。试验设计的扩增片段G + C百分含量相近( 45% 左右) ,但扩增片段的长度差别较大,牛扩增片段的长度为716 bp,羊扩增片段的长度为120 bp。

5 结论

试验对饲料中是否含有牛羊源性成分做出初步筛选与鉴定,试验能够定性不定量地同时检测出饲料中的牛羊源成分。检出限低确保了饲喂反刍动物饲料的安全,试验同时还具有成本低、高通量检测等优点,适用于实际饲料样品的检测。

摘要：为了快速、灵敏检测反刍动物饲料中的牛羊源成分,试验采用双重荧光PCR方法,根据线粒体环氧酶2(Cox2)和细胞色素b(Cytb)基因,分别设计牛羊特异性引物序列,基于SYBR荧光PCR技术,分析熔解曲线,根据吸收峰的位置不同,定性识别牛羊源成分。结果表明:试验测得单重牛PCR产物熔解曲线吸收峰对应的熔解温度为(76.0±0.5)℃,羊PCR产物熔解曲线吸收峰对应的熔解温度为(81.5±0.5)℃,且双重体系吸收峰与单重对应的熔解温度吻合,说明试验可行。试验检测牛成分的灵敏度为0.01%,检测羊成分的灵敏度为0.1%。该方法可以同时定性检测饲料中牛羊源性成分,成本较低,节省时间,可以应用于高通量的实际检测样品,灵敏度较高。

PCR法 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

2008年3月至2010年5月选择在我院因咳嗽、咳痰、胸痛、发热、胸片或CT异常住院接受检查的患者102例, 其中男67例, 女35例。最小年龄27岁, 最大年龄76岁, 平均年龄 (45.6±8.5) 岁, 全部病例无严重的细菌或真菌感染。所有患者均自愿参加临床研究, 且签署知情同意书。

1.2 诊断方法

(1) 标本处理: (1) 取痰液2m L加液化剂 (1X液化剂Liguidyzing Peagent) 使之充分液化至清亮。 (2) 取1m L液化痰, 1400γ/min离心5min, 小心倾去上清部分。 (3) 向沉渣中加入无菌双蒸水, 振荡混匀, 并颠倒管数次, 1200γ/min离心3min, 倾去上清液。 (4) 重复步骤 (3) 离心后尽量倾去全部上清液。 (5) 向沉渣中加入40μL裂解液, 充分振荡混匀, 100℃加热15min, 1400γ/min离心5min, 取2μL上清液做PCR反应模板。 (2) 结核分枝杆菌核酸扩增 (PCR) 荧光定量检测:取单管单人份PCR反应管, 直接加入处理后样品或各梯度标准品5m L, 6000r/min离心数秒。上机扩增, 扩增参数:93℃120s 1个循环, 93℃45s~55℃60s, 10个循环, 93℃30s~55℃60s 30个循环。反应结束后该电脑根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。根据阳性定量模板和体测样品的扩增情况, 算出反应体系中体测样品中DNA的拷贝数。 (3) 抗酸染色:各标本涂片进行抗酸染色, 在油镜下观察300个视野, 3个菌以上为阳性。

1.3 统计学处理

使用SPSS 13.0对各项资料进行统计、分析, 采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

肺结核患者按2001年全国肺结核诊断标准确诊 (根据临床表现、胸部X线或CT、痰涂片或/和培养及抗结核治疗有效为标准) , 非肺结核病患者根据临床表现、胸部X线或CT、病理及其他辅助检查以及治疗效果而确诊。经上述诊断方法进行诊断发现:102例受检查的病例中有45例为肺结核患者, 占44.12% (45/102) , 非肺结核病患者组57例, 其中肺癌15例, 肺炎24例, 支气管哮喘5例, 肺脓肿11例, 支气管扩张伴感染2例。102例受检者经过FQ-PCR和抗酸染色检查发现, FQ-PCR检查出42例阳性, 占41.17% (42/102) , 低于2001年全国肺结核诊断标准确诊病例数, 但是差异无统计学意义 (P>0.05) ;抗酸染色共检查出27例阳性, 占26.47% (27/102) , FQ-PCR的阳性检查结果明显优于抗酸染色的检测结果, 且差异具有统计学意义 (P<0.05) , 具体结果可见表1。

3 讨论

随着分子生物学技术的发展, PCR技术曾经广泛用于临床检测, 但不久人们发现传统PCR因在开放状态下分析, 对实验室的污染是不可避免的, 因为污染而导致的假阳性结果, 使PCR无法满足临床应用。而FQ-PCR是在全封闭状态下, 实现PCR扩增和产物分析。改正了传统PCR的缺陷, 并由于其扩增与自动化分析一体化, 使检测更加简便和快速。FQ-PCR技术主要是在PCR反应体系中加入一条荧光标记的基因探针, 只要标本中结核分枝杆菌数达到10~103/m L时, FQ-PCR技术便可给予准确定量。本文的研究结果显示102例受检者经过FQ-PCR和抗酸染色检查发现, FQ-PCR检查出42例阳性, 占41.17% (42/102) , 低于2001年全国肺结核诊断标准确诊病例数, 但是差异无统计学意义 (P>0.05) ;抗酸染色共检查出27例阳性, 占26.47% (27/102) , FQ-PCR的阳性检查结果明显优于抗酸染色的检测结果, 且差异具有统计学意义 (P<0.05) 。这表明FQ-PCR可以有效地检测出肺结核患者体内的结核分枝杆菌且这种检测方法明显优于传统的抗酸染色法。

PCR法 篇9

关键词：建兰花叶病毒,荧光RT-PCR,快速检测,蜘蛛兰

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(OdontogLossum ringspot virus,简称ORSV)是发生最为普遍的兰花病毒,广泛分布于全世界栽培兰花的地区[1,2,3,4,5,6],这2种病毒传染性强,其中CymMV相对ORSV更易传染,在市场上蝴蝶兰、文心兰和卡特兰CymMV的感染率高达66%以上[7],病毒侵染导致植株生长不良甚至死亡,有时病毒感染后还会在植株的营养生长期出现较长时间的隐症现象,但带毒植株开花小而少,花期缩短,发病兰株观赏价值和经济价值大为下降,还会导致种质退化,对兰花产业造成严重危害。

多年来,国内学者不断深入地对CymMV的检测技术开展研究工作:1997年,潘俊松等[8]从石桷兰中分离出CymMV用于制备抗血清;郑平等[9]用组织涂抹酶联免疫吸附技术检测CymMV和ORSV;周国辉等[10]用RT-PCR方法对病毒分子进行鉴定;2007年施农农等[11]对用电镜法对CyMV和ORSV进行超微结构观察;2008年高焕利等[12]用IC-RT-PCR检测CymMV,提出了该方法可检测到CymMV分离物的最低病毒量为2.72×10-7μg/mL(428个拷贝)。2006—2008年期间,笔者在根据文献资料的多种方法对147个样品进行CymMV检测,并相应的隔离栽培,但不时发现有部分初检为阴性的样品,经过一段时间养护后复检为阳性,对苗圃中兰花种苗的检测也经常发现这种情况。这就涉及检出限的问题,说明有部分样品中只含有微量CymMV,用前述的方法不能被检出。

为解决检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题,笔者摸索建立了利用实时荧光PCR仪快速检测微量建兰花叶病毒的方法,使建兰花叶病毒的检测水平从灵敏度、准确性、稳定性上有所提高。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料。

供试材料为蝴蝶兰(PhaLaenopsis sp.)(1#)、卡特兰(CattLeya sp.)(2#)、文心兰(Oncidium sp.)(3#)、蜘蛛兰(Arachnis sp.)(4#)、皇后兰(GrammatophyLLmn sp.)(5#)、蕙兰(C.Faberi)(6#),所有样品之前经ELISA筛检,并由笔者所在实验室分类保存,其中本试验所用的卡特兰、文心兰和蜘蛛兰为加保护液冻存的叶片组织,其他为从植株上采的新鲜叶片。

1.1.2 供试试剂。

供试试剂为:UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒(上海Sangon),MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒(上海Sangon)、One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(大连Takara公司)。

1.1.3 供试仪器。

供试仪器为:Bio-Rad Opticon 2荧光定量PCR仪(美国),Thermo Labsystem MuLtiskan Mk 3酶标仪(上海雷勃),TC-96/H/G基因扩增仪(大和热磁),VARIAN CAR Y50紫外-可见分光光度计(美国)。

1.2 引物设计与合成

查询NCBI基因库(GeneBank),根据CymMV保守序列,设计并合成3对特异性引物(表1)。

1.3 RNA提取

样品用液氮研磨成粉状,称取粉状未解冻试样(约为100 mg),提取步骤参照RNA抽提试剂盒推荐方法稍加调整,因试样较粘稠,每100 mg试样加0.8 mL裂解液提取,洗脱体积为50μL。取20μL RNA提取物用无菌水稀释100倍在分光光度计上以波长260 nm检测总RNA含量,以A260/280比值和200～400 nm扫描图检测RNA纯度,纯化提取物直到A260/280比值>1.9。将提取物10μL/管分装在RNAase free的PCR管中,-80℃保存备用。

1.4 普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测熔解曲线分析

将1.3提取的兰花RNA用MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒,反应条件参照文献[7]。反应结束后,取C1、C4、C7产物分别为4.0、5.0、6.0μL,各加0.5μL上样缓冲液,于1.2%琼脂糖凝胶上(含EB 0.2μL/mL)进行电泳。

1.5 荧光RT-PCR定性检测和熔解曲线分析

将1.3提取的兰花RNA用One Step SYBR PrimeScript TM RT-PCR试剂盒进行荧光PCR定性检测,具体操作步骤:每孔加RT-PCR Buffer(内含dNTP Mixture,Mg2+,SYBR誖Green I)25μL,反转录酶和Taq酶混合物2.0μL;10μmoL/L上游、下游引物(C7)各1.0μL;水20μL;最后加1.0μL标准品或试样,制成总体积为50μL反应液体系,以无菌水代替试样作空白对照,加盖密封,1 000 r/min离心1 min,在荧光PCR仪上逆转录和扩增反应,经优化后的一步法RT-PCR反应条件为:(1)43℃,30 min;(2)94℃,15 s;(3)94℃,5 s;(4)55℃,30 s;(5)72℃,20 s;(6)读板;(7)将(3)～(6)步PCR反应循环30次;(8)72℃,5 min。将扩增产物进一步做熔解曲线分析:55～94℃;每0.5℃读板1次,每点持续5 s。

1.6 荧光RT-PCR定量检测

由于普通RT-PCR与荧光PCR定性检测存在差异,对有差异结果通过与一定浓度的重组质粒同时扩增进行定量分析。

1.6.1 标准品的制备。

将得到的经纯化的扩增产物,与质粒(p UCm-T载体)连接并克隆,提取相应的重组质粒,制成100 ng/mL的溶液,以此作为标准品储备液。

1.6.2 一点法粗略定量检测。

将C4重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.8×102质粒/μL标准使用液。4#样品和标准品在相同条件下进行反应:RT-PCR Buffer 12.5μL,反转录酶和Taq酶混合物1.0μL;10μmoL/L上游、下游引物(C4)各0.5μL;水10μmoL;最后加0.5μL标准品或试样,制成总体积为25μL反应液体系,反应条件为:(1)43℃,30 min;(2)94℃,2 min;(3)94℃,30 s;(4)、55℃,30 s;(5)72℃,25 s;(6)读板;(7)将(3)～(6)步PCR反应循环35次;(8)72℃,10 min。

1.6.3 绝对定量法检测。

将C7重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.6×107、2.6×105、2.6×102质粒/μL的标准使用液。将1#、4#和5#样品和标准品在相同条件下进行反应,引物为C1,其他反应试剂同1.62,反应条件参照文献[13]。对线性范围内未知样品用绝对定量法计算其原始拷贝数,对线性范围以下的样品进行半定量分析其浓度范围。

1.7 测序验证

收集1.4和1.6的扩增产物,经纯化、克隆,委托上海Sangon测序。

2 结果与分析

2.1 CymMV的普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测结果

用所设计3对的CymMV PCR引物进行RT-PCR反应,能够成功地在部分兰花病样总RNA抽提物中扩增到与预期大小相符的单一明亮的DNA电泳条带(图1)。由图1可见4#样在电泳图上未检出CymMV,但该植株再经过3个月的隔离栽培后出现症状,并用ELISA和PCR方法均检出CymMV,随后逐渐枯死。

注:图中1为DNA Marker,2～8、9～16、16～22孔依次为1#～6#样品C1、C4、C6和相应的空白对照的产物。

2.2 荧光RT-PC定性检测结果

由图2可知,4#样的总RNA提取物经荧光RT-PC定性检测发现该蜘蛛兰已被CymMV感染,但其含量极低,对产物进一步进行熔解曲线分析,结果4#样与其他样品的产物Tm都是78.0℃,并由图3可知,其熔解曲线均为单一产物形态,表明4#样与其他样品的具有相同的单一产物。

2.3 荧光RT-PCR半定量检测结果

由图4可知,4#样的CymMV C4模板浓度<2.8×102质粒/μL的C4重组质粒模板浓度,因重组质粒中的模板为双链DNA,0.5μL重组质粒模板数为2.8×102×2×0.5=2.8×102拷贝,即4#样的CymMV C4模板<2.8×102拷贝。由图5可知,4#样的CymMV C1模板<2.6×102拷贝,同时可以看出,2.6×102拷贝和2.6×100拷贝扩增曲线并无明显的区别,因此当模板数<2.6×102拷贝,只能进行定性分析。

2.4 测序结果

测序结果表明,所有扩增产物的实际长度与预期完全相符。应用NCBI基因库的BLAST对产物进行同源性分析,C1产物与基因库中CymMV相应序列的同源性≥96%;C4产物同源性89%～99%。C7产物的测序结果同源性比较见图6,由图6可知,1#样蝴蝶兰同源性≥96%;5#样皇后兰同源性≥97%,与AM055640.2所报道的序列完全相同,与1#样有5个碱基的差异(同源性97%);4#样蜘蛛兰与基因库序列的同源性94%～96%;与基因库中EU672821.1序列最接近,存在7个碱基的差异(同源性96%);4#样与1#样有12个碱基的差异(同源性94%),4#样被其他样品污染的可能性极小。因此,认为该植株在引进时已经携带微量的CymMV。

3 结论与讨论

3.1 建立了微量CymMV的快速检测方法

传统的PCR-电泳方法无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析,必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力,而且电泳分辨率限制了该方法的检测灵敏度。

荧光RT-PCR法在检测时可进行实时观察扩增状态,因此在很大程度上加快检测速度;该方法因所有试验在封闭系统内完成,可变因素大大减少,比普通PCR方法灵敏度提高了102倍;因为不需要进行后期处理,可防止强致癌物溴乙锭对操作人员的危害。本研究建立的CymMV实时荧光RT-PCR检测方法具有灵敏度高、操作快速、结果直观准确的特点,可应用于种苗中微量CymMV的早期检测,并对深入开展CymMV生物学特性研究打下基础。

3.2 检测灵敏度可达基因拷贝数仅在个位数

荧光RT-PCR检测方法不但可以定性分析,也可进行定量分析,导入基因拷贝数解析,在本文中主要针对病毒含量在定量限(2.6×102拷贝)以下的样品进行分析,因此只能通过半定量方法推算其基因拷贝数仅在个位数。

3.3 荧光RT-PCR定性和绝对定量检测对引物要求高

荧光PCR法的荧光扩增曲线,不能分辨扩增产物有几个,因此必须是单一产物的扩增。扩增结束时,可用熔解曲线法对扩增的特异性进行验证。因此,要求引物具有高度的特异性和目标基因的保守性。

荧光RT-PCR定量检测方法分为绝对定量和相对定量法,相对定量法检测成本高,本研究主要针对生产应用,因此,采用了绝对定量法,该种方法对于引物的特异性、保守性和产物的稳定性要求较高,所应用的引物应经过反复验证。

PCR法 篇10

1 材料与方法

1.1 菌株来源

84株金葡菌均为我科2008年1月~2009年1月从临床标本中分离的菌株,分别来源于痰液、脓液、血液、分泌物、腹腔引流物、肾囊肿穿刺液、胸腔积液、脓疱液、疱液、导管下段及导管尖端,经美国DADE-BERING公司Walk Away-40全自动微生物分析仪鉴定核实为金葡菌。

1.2 细菌鉴定质控菌株

金葡菌ATCC25923,购于卫生部临床检验中心。

1.3 仪器与试剂

Walk Away-40全自动微生物分析仪(美国DADE-BERING公司产品),PCR仪(美国Eppendorf公司产品),测序仪(美国ABI公司),凝胶成像仪(美国FOTODYNE),电泳仪(瑞典Phermacia公司)。PCR试剂购于上海生工生物工程有限公司。

1.4 引物设计

根据Gen Bank中已发布的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件及参考文献[2]设计mec A基因、TSST-1基因、PVL基因引物,扩增产物预期长度分别为892 bp、578 bp和578 bp,由上海生工生物工程有限公司合成。

mec A:P1 5'-GCC GTA GTT GTC GGG TTT GG-3',P25'-GGC GGA TGT GCG ATT GTA TTG C-3'。

PVL:P1 5'-GTG ATG GCG CTG AGG TAG TC-3',P25',-GCT GGG GGT AAT TCA TTG TCT G-3'。

TSST-1:P1 5'-GCT ATC GTA AGC CCT TTG TTG C-3',P2 5'-GCT GGA TCC GTC ATT CAT TGT T-3'。

1.5 细菌DNA的提取

将冰冻保存的84株实验菌株用胰酶大豆肉汤复苏、转种哥伦比亚羊血琼脂培养基。用接种环挑取24 h培养的单个菌落,置于100μl裂解液(1 mol/L Na OH+20 g/L SDS)中,100℃水浴30 min,冷却后用等量的1 mol/L盐酸中和,离心10 min(13 000 r/min)去沉淀,再用乙醇沉淀DNA(加入400μ无水乙醇),混匀后-20℃冰冻30 min,13 000 r/min离心15 min,弃上清。加入70%乙醇200μl,静置5 min,13 000 r/min离心5 min,吸干上清液,完全晾干沉淀后,用30μl双蒸水溶解DNA,作为PCR扩增模板。

1.6 多重PCR扩增体系及反应条件

把3对引物放入同一反应体系建立多重PCR。PCR体系:采用20μl反应体系,模板1μl,起始引物和终末引物各1μl,d NTP 1.5μl,Taq酶0.2μl,10×Buffer 2μl,Mg2+2μl,双蒸水11.3μl。PCR反应条件:94℃预变性4 min,然后进入循环,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸150 s,共进行35个循环,最后72℃延伸15 min,PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳,然后在溴化乙锭溶液中染色20 min,清水冲洗后用凝胶成像系统观察结果。

1.7 序列测定

将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,结果与Gen Bank中的核苷酸序列进行同源性比较。

2 结果

2.1 多重PCR扩增产物的电泳分析

84株金葡菌中检出mec A基因阳性49株,检出率为58.3%;检出PVL基因20株,占临床分离株的23.8%,其中,MRSA为13株(13/49,26.5%),MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因阳性菌株。部分菌株的PVL基因PCR扩增结果见图1。

(1~6、9~11泳道为PVL基因阴性菌株;7、8泳道为PVL基因阳性菌株;M:PCR marker)

2.2 PVL基因阳性金葡菌的分布特点

PVL基因阳性的分离株中,有7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离自血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液。

2.3 测序结果的分析

将测序结果与Gen Bank中的已有序列进行比较,同源性为100%。

3 讨论

最近,国内学者报道葡萄球菌已是医院感染分离率最高的细菌,其中MRSA占较高的比例[3]。近年来,其临床分离率呈明显上升趋势,因具有多重耐药特征和携带多种毒力因子(如PVL、TSST-1、SEC等)已成为临床治疗的难点。笔者对我院金葡菌感染情况分析发现,我院MRSA感染占58.3%,MSSA占41.7%,明显高于马筱玲等[4]报道的MRSA检出率(42%),说明我院MRSA感染率较高,并且多为院内感染,应引起临床重视。MRSA的甲氧西林耐药决定簇(mec A)位于SCCmec盒上,该结构类似于转座子,可以介导mec A基因游离传播,使敏感的金葡菌获得甲氧西林耐药;同时SCCmec盒还可以整合许多其他耐药基因。因此,MRSA菌株常表现为多重耐药。MRSA的产生还与临床上抗生素的不合理应用有密切关系。

PVL是金葡菌产生的一种外毒素,该毒素特异性地吸附并作用于白细胞,改变白细胞的通透性,造成大量白细胞损伤,丧失吞噬能力。同时,由于白细胞的破坏,处理抗原和呈递抗原信息的能力下降,损害了机体的防御屏障和免疫应答,从而不能建立有效的特异性免疫。近年来由产PVL金葡菌所致感染而导致死亡病例逐渐增多,尤其是携带PVL基因的MRSA[5]。本研究结果显示,84株金葡菌中PVL基因阳性的检出率为23.8%,明显高于闫中强等[6]报道的PVL基因检出率(15.7%)。20株PVL阳性菌株中,7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离直血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液,说明不同临床标本中都可能检出PVL阳性的金葡菌,PVL阳性的金葡菌主要造成化脓性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因阳性菌株在MRSA中的分离率高于MSSA,PVL基因阳性的MRSA具有多重耐药性且携带PVL,其毒性强,有一定的致死性,将会给患者带来严重的后果。

TSST-1是金葡菌产生的一种产热毒素,作为超抗原,TSST-1与MHC-Ⅱ类分子结合,作用于T细胞受体,使其大量增殖,并产生白细胞介素-1、白细胞介素-2及干扰素等多种细胞因子,是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究对84株金葡菌进行检测,未检出TSST-1基因,可能与感染类型不同、其金葡菌携带的毒素基因不同有关。

摘要：目的:了解金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)耐药基因及所携带致病毒素基因PVL与TSST-1的特点。方法:应用多重PCR法检测mecA基因、TSST-1基因及PVL基因。结果:84株金葡球经多重PCR法对其mecA基因进行检测,检出率为58.3%(49/84)。PVL基因阳性菌株的分离率为23.8%(20/84),PVL阳性的MRSA为13株(13/49,26.5%),PVL阳性的MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因。结论:金葡菌的耐药性呈上升趋势,且金葡菌可产生多种毒素,在分离金葡菌的同时,应加强其耐药基因及毒素基因的检测。

关键词：金黄色葡萄球菌,中毒休克综合征毒素-1基因,杀白细胞毒素基因

参考文献

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[2]Yamasaki O,Kaneko J,Morizane S,et al.The association between staphylococcos aureus strains carrying panton-valentine leukocidin genes and the development of deep seated follicular infection[J].Clin In-fect Dis,2005,40(3):381-385.

[3]姚春艳,府伟灵.葡萄球菌医院感染的耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2004,14(1):104-106.

[4]马筱玲,孙光明,戴媛媛,等.金黄色葡萄球菌耐药性监测[J].临床输血与检验杂志,2007,9(1):18-20.

[5]Lopez-Aguilar C,Perez-Roth E,Moreno A,et al.Association between the presence of the panton-valentine leukocidin-encoding gene and a lower rate of survival among hospital pulmonary patients with staphylo-coccal disease[J].J Clin Microbiol,2007,45(1):274-276.

[6]闫中强,沈定霞,罗燕萍,等.多重PCR检测临床分离金黄色葡萄球菌Luks/PV基因和mecA基因[J].中国感染与化疗杂志,2008,8(4):255-259.