HO-1（精选4篇）
HO-1 篇1
摘要：目的:研究七氟烷诱导神经元血红素氧合酶-1(HO-1)基因表达的信号转导通路,探讨七氟烷脑保护机制。方法:40只Wist-ar大鼠[年龄(3～4)个月,体重120g～220g]随机分为对照组(C组)、脑缺血-再灌注组(D组)、0.3MAC七氟烷+脑缺血-再灌注组(S1组)、0.6MAC七氟烷+脑缺血-再灌注组(S2组)和0.6MAC七氟烷+U-0126+脑缺血-再灌注组(U组)。测定大鼠海马组织中HO-1-mRNA和ERK1/2、Nrf2、AP-1、HO-1蛋白的表达水平,电镜下观察海马线粒体的变化。结果:D组大鼠海马组织中HO-1基因表达增加,ERK1/2、Nrf2和AP-1蛋白表达增加(P均<0.05),海马神经细胞线粒体变性率升高(P <0.01)。S1组和S2组HO-1基因表达增加,ERK1/2和Nrf2蛋白表达增加,线粒体变性率降低(P<0.01),AP-1蛋白表达变化不明显(P>0.05)。 U组HO-1基因表达降低,ERK1/2和Nrf2蛋白表达降低,线粒体变性率升高(P<0.01),AP-1蛋白表达表达变化不明显(P>0.05)。结论:七氟烷通过ERK1/2/Nrf2信号通路诱导大鼠海马神经细胞HO-1基因表达,保护了海马神经细胞。
关键词：缺血/再灌注损伤,海马,细胞保护,七氟烷,ERK1/2,Nrf2,AP-1,细胞信号转导
研究证明吸入麻醉药具有脑保护作用。七氟烷(Sevoflurane)是近年开始进入临床应用的吸入麻醉药,从药代学和药效学等方面说,七氟烷是目前比较理想的吸入麻醉药之一。阐明七氟烷及其它吸入麻醉药脑保护机制是药理学及麻醉工作者关注的课题。血红素氧合酶(hemeoxygenase,HO)亚型HO-1是脑细胞对抗应激反应和抗氧化损伤的重要组成部分,但目前对诱导和调节神经元HO-1基因表达的信号转导通路仍不完全清楚。细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)家族的功能与调节细胞的增殖、分化和凋亡有关[1]。研究证明MAPK家族信号转导通路能够诱导细胞HO-1基因的表达[2]。我们前期的研究[3,4]发现七氟烷能够诱导神经元HO-1的表达,但七氟烷是否通过MAPK家族信号转导通路诱导神经元HO-1的表达而发挥其对器官缺血性损伤的保护作用尚不清楚。本研究建立大鼠全脑缺血-再灌注模型,探讨七氟烷对脑的保护作用及机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
40只Wistar大鼠[年龄(3～4)个月,体重120g～220g],由昆明医学院实验动物中心提供。
1.1.2 主要仪器及试剂
Ohmeda Excel 210型麻醉机(美国),PCR扩增仪(Biometra,德国),RT-PCR试剂盒(TaKaRa,日本),Western blot检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司,中国),ERK1/2、HO-1、AP-1和Nrf2抗体(Calbiochem,英国),U-0126(Biomol,美国),七氟烷(批号:5422,丸石制药株式会社,日本)。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制备
按照Pulsinelli等[5]报道的四动脉阻断法建立大鼠全脑缺血-再灌注模型:腹腔注射40mg/kg的3%戊巴比妥钠麻醉大鼠,暴露第一颈椎,找到翼状孔,热凝双侧翼状孔处的椎动脉后缝合皮肤。分离暴露两侧颈总动脉,分别将2个无损伤动脉夹包绕在两颈总动脉上,夹放松不影响颈动脉血流。操作动脉夹的一端固定于颈部皮肤上,然后缝合切口。麻醉苏醒后日常喂养。24 h后同时夹闭两侧颈总动脉,20min后松开动脉夹恢复血流,建立全脑缺血-再灌注模型,将阻断双侧颈总动脉后60s内意识尚未丧失的大鼠剔除本实验。
1.2.2 动物选择及分组
Wistar雄性大鼠40只,体重180g～220g,由中国医科大学实验动物中心提供。随机分为5组(n=8):对照组(C组)、脑缺血-再灌注组(D组)、0.3MAC七氟烷+脑缺血-再灌注组(S1组)、0.6MAC七氟烷+脑缺血-再灌注组(S2组)和0.6MAC七氟烷+U-0126+脑缺血-再灌注组(U组)。C组手术方法同上,但不热凝椎动脉和夹闭颈总动脉。夹闭两侧颈总动脉前将大鼠放入5cm×4 cm×3 cm小盒内,盒的两侧各有一小孔,一端接麻醉机输入氧气和麻醉气体,另一端为出气端接Datex麻醉气体监测仪,测定麻醉气体的浓度代表盒内的麻醉药浓度。S1组和S2组大鼠分别吸入0.3MAC或0.6 MAC的异氟烷60 min,U组大鼠腹腔注射U-0126 50μmol/kg后吸入0.6MAC的七氟烷60 min,对照组和脑缺血-再灌注组大鼠吸入氧气。停止吸入后收紧动脉夹夹闭两侧颈总动脉,20 min后松开动脉夹,恢复血流后24 h脱颈处死大鼠取海马。
1.2.3 标本制作
在冰面上迅速分离大鼠海马,其中1/2海马组织用2.5%戊二醛固定后制作超薄切片作电镜观察,1/2液氮冷冻后-70℃冰箱保存备用。
1.2.4 RT-PCR检测HO-1-mRNA的表达
用Trizol抽提待测培养海马神经元总RNA。HO-1-mRNA表达水平以β-actin为内对照,逆转录参照TaKaRa公司试剂盒说明书进行,cDNA的PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。HO-1引物大小为441bp,上游引物:5'-ACA GAA GAG GCT AAG ACC G-3';下游引物:5'-CAG GCA TCT CCT TCC ATT-3'。β-actin引物大小690bp,上游引物:5'-CAC CCT GTG CTG CTC ACC GAG GCC-3';下游引物:5'-CCA CAC AGA TGA CTT GCG CTC AGG-3'。阴性对照不加引物和摸板。扩增产物经琼脂凝胶电泳,紫外灯下照像,在图像分析系统上进行密度扫描,用HO-1基因扩增产物的密度与β-actin基因扩增产物的密度比值表示HO-1的基因表达水平。
1.2.5 HO-1、AP-1、Nrf2和ERK1/2蛋白表达的检测
用Western blot法,内参照为GAPDH。抽提各组培养海马神经元的蛋白并测定其浓度,取100μg蛋白样品进行电泳,聚丙烯酰氨(SDS-PAGE)的浓度12.5%,4℃过夜,将蛋白转移到NC膜上,用封闭液(5%脱脂奶粉、2%BSA、0.2%Tween20溶于PBS液)室温封闭2h,将膜与溶于封闭液中的一抗(兔抗大鼠HO-1、AP-1、Nrf2或ERK1/2单克隆抗体,分别按1:2 000、1:200、1:500或1:250稀释)室温孵育2h,PBS洗5min×3次,TBS洗5min×3次,将膜与二抗稀释液(5%脱脂奶粉、2%BSA、0.02%Tween20、150mmmolNaCl、150mmmolTrisHCl,pH7.5)中的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1:3000)室温封闭1h,TBS洗5min×3次,化学发光法显色。Metamorph/BX41图像分析系统测各条带平均吸光度(A)值和条带的面积,每一条带的蛋白含量用此条带的吸光度值乘以条带的面积与同一样本的GAPDH条带的吸光度值乘以条带的面积的比值表示。
1.2.6 标本制备及电镜观察
用2.5%戊二醛固定1 mm×1 mm×1 mm大小的海马组织块,1周后再用1%锇酸固定(4℃,2 h)、乙醇梯度脱水、环氧树脂618包埋、超薄切片、醋酸铀-柠檬酸铅双重染色,透射电子显微镜下观察海马神经细胞超微结构的改变。每例标本随机挑选10个神经细胞,计数每个神经细胞内线粒体总数和变性线粒体数目,以变性线粒体数目除以线粒体总数即为线粒体变性率,计算10个神经细胞线粒体变性率的平均值代表该标本线粒体变性率。具备以下任一现象即认为线粒体发生变性:线粒体肿胀、线粒体膜破坏、线粒体嵴减少或断裂、线粒体基质出现空泡。
1.2.7 统计学处理
SPSS11.0统计软件,数据用均数±标准差表示,采用单因素方差分析,组间比较用q检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠海马组织中HO-1-mRNA和HO-1蛋白的变化
与C组比较,D组表达增加(P<0.05);与D组比较,S1组表达增加(P<0.01);与S1组比较,S2组表达增加(P<0.05);与S2组比较,U组表达降低(P<0.01)(见图1,3,4)。
2.2 大鼠海马组织中ERK1/2、Nrf2和AP-1蛋白的变化
与C组比较,D组表达增加(P<0.05);与D组比较,S1组ERK1/2和Nrf2蛋白表达增加(P<0.01),AP-1蛋白表达变化不明显(P>0.05);与S1组比较,S2组ERK1/2和Nrf2蛋白表达增加(P<0.05),AP-1蛋白表达表达变化不明显(P>0.05);与S2组比较,U组ERK1/2和Nrf2蛋白表达降低(P<0.01),AP-1蛋白表达表达变化不明显(P>0.05)(见图2,4)。
1:Marker;2:C组;3:D组;4:S1组;5:S2组;6:U组;7:阴性对照。
2.3 大鼠海马神经细胞线粒体变性率的变化
与C组比较,D组升高(P<0.01)。与D组比较,S1组降低(P<0.01)。与S1组比较,S2组降低(P<0.05)。与S2组比较,U组升高(P<0.01)(见图5)。
与C组比较,*P<0.01;与D组比较,△P<0.05;与S1组比较,▲P<0.05;与S2组比较,#P<0.01
3 讨论
四动脉阻断法是建立全脑缺血-再灌注损伤模型的经典方法,模型建立成功的关键是永久性阻断双侧椎动脉且阻断双侧颈总动脉后(30～60)s内大鼠意识丧失[5]。海马是最易受损脑区,其神经元对缺血缺氧非常敏感,因此本实验选择海马来研究脑缺血再灌注损伤。预实验证实大鼠吸入0.3MAC和0.6MAC麻醉药时意识不丧失且自主呼吸不受抑制,血液动力学维持稳定。本研究中D组大鼠海马组织线粒体变性率升高,表明脑缺血-再灌注损伤大鼠模型建立成功。
脑缺血性疾病是威胁人类健康的主要疾病,开发特效药物来治疗缺血引起的脑损伤是科研工作者和临床医师面临的难题。近年血红素氧合酶-1 (heme oxygenase-1,HO-1)被预言或许是21世纪治疗缺血性脑损伤的重大突破口之一[6]。HO-1是脑细胞对抗氧化应激反应的重要组成部分[7]。但是,有关HO-1基因表达调节信号通路的研究才刚刚开始,还需进行大量的研究来证实。
细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)家族为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其功能与调节细胞的增殖、分化和凋亡有关。在中枢神经系统MAPK家族成员细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号转导通路与神经细胞的生长、发育和存活有关[1]。脑脑缺血-再灌注后大量的活性氧等通过细胞表面受体、G蛋白、蛋白酶等途径,直接或间接激活ERK1/2,活化的ERK1/2从胞浆进入胞核激活胞核内的细胞信号转导通路。研究证实在胞核的信号分子中,转录因子活化蛋白-1 (activator protein-1,AP-1)和核因子-E2-相关因子-2(nuclear factor-E2-related factor-2,Nrf2)是非常重要蛋白合成的信号因子[8,9,10]。上游的信号被激活,使Nrf2和AP-1磷酸化(激活),活化的Nrf2和AP-1移动到胞核,诱导多种基因,如HO-1基因的表达。有研究[1]发现MAPK家族参与了不同细胞HO-1基因表达的调节。Zhang等[11]研究发现细胞抗氧化损伤时HO-1的激活依赖ERK1/2信号通路。
我们前期的研究发现Sevoflurane能够诱导神经元HO-1基因的表达。但是,七氟烷是否通过ERK1/2信号转导通路诱导神经元HO-1基因表达目前尚不清楚;七氟烷诱导神经元HO-1基因表达的信号通路最终是否由Nrf2或AP-1完成也尚不清楚。实验中我们发现Sevoflurane预处理后大鼠海马组织中ERK1/2和Nrf2蛋白表达增加,同时HO-1蛋白和HO-1-mRNA表达增加,海马神经细胞线粒体变性率降低;应用特异性ERK1/2抑制剂U-0126后,ERK1/2蛋白表达减少,Nrf2蛋白表达也减少,同时HO-1蛋白和HO-1-mRNA表达减少,海马神经细胞线粒体变性率升高。而AP-1蛋白在上述过程中没有明显的变化。实验结果表明表明ERK1/2、Nrf2和HO-1三者间存在序贯的激活关系Jevoflurane激活了ERK1/2,ERK1/2激活Nrf2,激活的Nrf2诱导大鼠海马神经细胞HO-1基因表达,保护了神经元。实验的结果提示Sevoflurane通过ERK1/2/Nrf2信号通路而非ERK1/2/AP-1信号通路诱导大鼠海马神经细胞HO-1基因表达。
综上所述,Sevoflurane通过ERK1/2/Nrf2信号通路诱导大鼠海马神经细胞HO-1表达,保护了神经细胞。Sevoflurane是否还通过其它的信号转导通路诱导神经细胞HO-1基因表达还需更多的研究来证实。
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HO-1 篇2
1 材料与方法
1.1 实验动物及药品试剂
健康清洁级雄性SD大鼠28只(由安徽医科大学实验动物中心提供),体重180~200 g。乙醇(分析醇,纯度>99.7%);白糖;谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH-Px)和超氧化歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;白介素(IL-10)和肿瘤坏死因子(TNF-α)试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司;Taq酶购自PROGMA公司。
1.2 造模及分组
28只大鼠随机分为正常组8只、对照组10只和酒精组10只。其实验方法参照文献[1]。
1.3 方法
1.3.1 标本处理
各组大鼠实验结束前,禁食不禁水24 h并称重。以10%麻醉剂3 m L/kg进行腹腔注射麻醉,所取血液离心待用;取出肝脏,称重后,迅速切下3部分,其中一部分肝组织以4%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋切片;另一部分肝组织则用于制成10%的肝匀浆;最后一部分肝组织置于液氮中,用于抽提RNA。
1.3.2 肝组织病理形态学检查
从4%甲醛溶液取出肝组织块,石蜡包埋。切成5μm厚的切片,常规HE染色,光镜下观察。
1.3.3 肝指数的测定
处死动物后,立即取出肝脏,滤纸吸干表面水分后称其湿重,计算肝系数:肝脏湿重/大鼠体重。
1.3.4 血液中相关生化指标的测定
采用分光光度法测定血清中与肝细胞损伤相关的酶(AST、ALT);血清中IL-10和TNF-α含量采用ELISA法测定,其方法严格按照试剂盒说明书操作。
1.3.5 肝匀浆中相关指标的测定
采用分光光度法测定10%的肝匀浆中的GSH、MDA和SOD,其方法严格按照试剂盒说明书操作。
1.3.6 采用R T-PCR检测IL-10和HO-1 mR-NA表达水平
取50~100 mg大鼠肝脏组织,采用Trizol法抽提总RNA,然后逆转录合成c DNA,进行PCR扩增,扩增产物在2%凝胶上做电泳,摄像,存入计算机,以IL-10和HO-1与内参照β-actin的IOD比值评定IL-10和HO-1 m RNA表达水平。HO-1上游引物序列:5'-GACAGAAGAGGCTAAGA CCGC-3';下游引物序列5'-GACGCCGACTACCAAG GG-3'。模板变性温度:94℃,4 min,扩增循环32周,变性:94℃,40 s,退火55℃,50 s,延伸72℃,80 s,最后孵育10 min,预期产物为578 bp。IL-10上游引物序列:5'-AGTGGAGCAGGTGAAGAATG-3';下游引物序列:5'-CCAGCCTTAGGATCGAAGTT-3'。模板变性温度:94℃,4 min,扩增循环30周,变性:94℃,30s,退火60℃,40 s,延伸72℃,1 min,最后孵育10min,预期产物为479 bp。用β-actin作为对照,β-actin上游引物序列:5'-ACCACAGCTGAGAGGG AAATCG-3';下游引物序列:5'-AGAGGTCTTTACG-GATGTCAACG-3'。扩增循环28周,变性:94℃,30 s,退火54℃,40 s,延伸72℃,1 min,最后孵育10 min,预期产物为277 bp。
1.4 数据分析与统计学分析
所有数据以均数±标准差来描述,SAS9.0软件包进行分析,采用t检验,组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肝组织病理形态学的改变
通过HE染色观察比较各组大鼠肝脏的病理切片:酒精组肝小叶内出现大量脂肪变性和细胞水肿,汇管区域伴有部分炎症细胞浸润和点状坏死,同时局部有少量肝纤维化(图1)。对照组肝小叶内出现少量脂肪变性以及细胞水肿,汇管区域伴有极少量炎症细胞浸润和部分点状坏死(图2)。正常组肝脏则出现无脂肪变性、炎症和坏死(图3)。
2.2 肝系数比较
由表1可见,酒精组的肝指数高于对照组和正常组,其差异有统计学意义(P<0.01),而正常组与对照组之间差异无统计学意义,说明乙醇对酒精组大鼠肝脏造成一定程度的损伤。
2.3 血液中相关生化指标的变化
由表2可知,酒精组血清中TNF-α和肝匀浆MDA水平高于对照组和正常组,差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05);而3组中IL-10含量、GSH-Px以及SOD活性呈逐渐降低的趋势,且低于对照组和正常组,差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05),提示随着肝损伤程度的加重,大鼠肝组织中脂质过氧化损伤程度也逐渐增强,而IL-10含量的降低在一定程度上可能与TNF-α的分泌平衡失调有关。
注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与对照组比较,P<0.01
2.4 IL-10和HO-1 mRNA表达水平的变化
RT-PCR显示,与正常组和对照组相比较,酒精组大鼠肝脏中IL-10 mRNA表达强度明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。同样,HO-1 mRNA的表达水平也随着肝损伤程度的加重而降低,其中酒精组与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.01),与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。
注:1)与正常组比较,P<0.05,2)与正常组比较,P<0.01
3 讨论
酒精性肝病的发病机制比较复杂,目前还没有完全清楚,一般认为与酒精及其代谢产物对肝脏的毒性作用、氧化应激、免疫介导、细胞因子、细胞凋亡、内毒素以及病毒的叠加、遗传等多种因素有关。目前广为接受的理论是DAY和JAMES等提出的“二次打击”学说[2]。该学说认为,酒精及其代谢产物对肝细胞的直接影响可作为“初次打击”,它导致肝细胞功能异常,使肝细胞对各种损伤的易感性增高,并产生诱发“再次打击”的物质;而氧化应激相关的脂质过氧化、炎症细胞因子的释放、线粒体功能的异常等形成“再次打击”,诱导肝脏的炎症反应,导致肝细胞发生变性坏死、肝纤维化及肝硬化。
大量研究表明,炎症介质在酒精性肝病的发病过程中起着重要的作用。L-10是一种分子量约35~40 kD的单肽链糖蛋白,主要有Th2细胞产生的免疫调节性细胞因子。它主要是通过与其受体而发挥功能:既可通过抑制单核-巨噬细胞激活和增殖来下调炎症反应,又能广谱抑制单核-巨噬细胞炎症介质IL-1、IL-6、IL-8与TNF的合成和表达;但是,IL-10生产不足也可能导致酒精性肝硬化患者体内过量的TNF-α的生产,从而引起其与促炎因子的平衡失调而诱发肝损害。同时,研究发现IL-10基因敲除小鼠对内毒素及酒精性肝损伤更加敏感[3],揭示了IL-10的相对不足在酒精性肝损害产生机制中起重要作用。本研究结果表明,相对于正常组和对照组,血浆IL-10水平及其m RNA的表达在模型组呈现逐渐降低,而TNF-α的含量则逐渐升高,说明随着肝损伤程度的发展,细胞免疫将大量消耗抗炎因子,致使IL-10水平及其m RNA的表达下降。
血红素氧化酶(heme oxygenase,HO)是血红素降解过程中的一种限速酶[4],有3种亚型:HO-1、HO-2和HO-3。其中HO-1是一种可诱导的亚型,是血红素降解的限速酶,可将血红素降解为一氧化氮、胆红素和Fe2+。近年来越来越多的研究证实HO-1保护功能是通过降解血红素而具有抗氧化应激、抗炎症、抗凋亡以及抗增殖产物而发挥出来的。HO-1可以在细胞因子和CD95所介导的肝损伤模型中抑制肝细胞凋亡的损伤[5],而进一步研究发现,HO-1不仅可以抑制肝损伤程度,而且还可以延长动物的存活时间以及减少细胞因子(TNF-α、IFN-r[6]等)的表达,从而揭示了诱导HO-1对治疗炎症性肝病有着潜在的作用。另有研究也表明特异性诱导HO-1在培养的肝细胞和内皮细胞中表达,可以对抗TNF-α介导的细胞毒性以保护其对抗氧化应激等反应,提示HO-1表达上调具有重要的抗氧化应激的功能。然而,本实验显示,随着肝损伤的发展,大鼠肝组织中GSH和SOD水平降低而MDA的含量增加,说明肝组织内有大量的ROS产生。其中更重要的是,通过RT-PCR法检测发现HO-1 m RNA的表达水平与肝损伤程度成反比,表现为逐渐降低的趋势,其原因可能是长期的慢性酒精性肝损伤抑制了HO-1表达及活性,而过量ROS的产生会加剧肝脏损伤的程度或者大量ROS的产生导致HO-1的清除能力减弱,从而使得HO-1的表达及对乙醇所致肝脏损伤的保护能力随着肝损伤程度的加重而降低,这一点与国内外有关报道相似[7,8,9]。
另外,近来的研究已经证实,IL-10与HO-1在酒精性肝病发展过程中构成一条新的抗炎通路[8]。DRECHSLER等通过向巨噬细胞内注射IL-10后发现,酒精对巨噬细胞的急性毒性作用明显减轻,而进一步研究证实这种作用与HO-1的作用机制有着一定的关系[9];同时,MANDAL等也发现被激活的IL-10/HO-1通路能够抑制被LPS所刺激的枯否细胞而产生的TNF-α的表达量,也有研究证实IL-10主要是通过IL-10的诱导基因(包括HO-1和BCL3)发挥其抗炎症功能[10]。本实验显示,在酒精性肝病发展过程中,IL-10和HO-1蛋白及m RNA的表达水平逐渐降低,提示了诱导IL-10与HO-1的表达将可能有助于抑制酒精性肝病的发生发展。而IL-10/HO-1通路在酒精性肝病发生发展过程中的相关机制尚不清楚,有待于进一步的研究。
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HO-1 篇3
1 对象与方法
1.1 对象
筛选职业性慢性锰中毒患者200例,均为汉族,男性179例,女性21例;年龄为(41.67±6.94)岁,工龄为(22.83±8.03)a。病例来源于山东济南、泰安、淄博、青岛、烟台等地,经职业病专家组复检,符合职业性慢性锰中毒诊断标准(GBZ 3-2006)。按1 ∶2的比例为每例病例匹配2例对照,对照组匹配条件为与病例组同一单位、同工种、同期作业、锰作业工龄相近(工龄相差≤3 a)而未发生锰中毒的工人;民族、性别、出生地相同,年龄相近(年龄相差≤5岁)。对照组男性358例,女性42例;年龄为(45.30±5.20)岁,工龄为(23.70±5.81)a。对照组和病例组在性别构成、年龄和工龄差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 标本收集与保存
所有研究对象均填写《职业性慢性锰中毒患者调查表》,并签署知情同意书。对受试者取静脉血5 ml(无须空腹),分装到5%EDTA抗凝管中,24 h内送往实验室于-80 ℃冰箱中保存。采用美国QIAGEN 公司抗凝外周血液基因组提取试剂盒提取DNA,操作按照说明书进行,将DNA置-80 ℃冰箱中保存备用。
1.3 HO-1基因BccI位点的PCR扩增
引物由上海生工生物工程公司合成,上游引物:5'CGCTTTAAGATGCAGCCTTG3';下游引物:5'GATGGAGTCTCTCTGTCACCAA3'。PCR反应体系:2×Master Mix(天根生化科技有限公司)12.5 μl,上下游引物各1.0 μl,DNA模板3.0 μl,加双蒸水到25 μl。在PCR扩增仪(美国Bio-RAD公司)上进行扩增,反应条件为:94 ℃预变性5 min,于94 ℃ 30 s,60 ℃45 s,72 ℃45 s进行35个循环,72 ℃延伸10 min。取5 μl扩增产物,用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳,目的条带片段长度为288 bp。见图1。
1.4 HO-1基因BccI位点多态性的检测
取10 μl扩增产物加入限制性核酸内切酶BccI(纽英伦生物技术有限公司)5 U,酶切缓冲液2 μl,加双蒸水至总体积20 μl,于37 ℃恒温水浴箱内消化16 h。取酶切产物10 μl用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳分析,野生纯合子RR因不能被酶切只有1条带(288 bp);突变杂合子RS被切成3条带(288、148和140 bp),突变纯合子SS被切成2条带(148和140 bp)。见图2。
1.5 统计学分析
所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行处理,以P<0.05(双侧)为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 HO-1基因BccI位点等位基因及基因型在病例组与对照组中的分布 由表1可见,HO-1基因BccI位点等位基因R与S的频率在对照组和病例组的分布差异无统计学意义(χ2 =1.263,P>0.05);HO-1基因BccI位点基因型在对照组和病例组的分布差异无统计学意义(χ2=1.309,P>0.05)。
2.2 HO-1基因BccI位点等位基因及基因型在男性病例组与对照组中的分布 由表2可见,HO-1基因BccI位点等位基因R与S的频率在男性对照组和病例组中的分布差异无统计学意义(χ2=0.896,P>0.05),HO1基因BccI位点基因型在男性对照组和男性病例组中的分布差异亦无统计学意义(χ2=0.929,P>0.05)。
2.3 HO-1基因BccI位点基因型及等位基因在不同工龄病例组与对照组中的分布 由表3可见,按年龄分层后工龄为20～29 a的研究对象中,HO-1基因BccI位点等位基因R与S的频率在对照组和病例组中的分布差异有统计学意义,且等位基因S携带者发生职业性慢性锰中毒的危险性为R的2.632倍(95%CI=1.210～5.724);基因型在对照组和病例组中的分布差异有统计学意义,具有RS基因型的个体发生职业性慢性锰中毒的危险性与具有RR基因型的个体相比升高了1.788倍(OR=2.788,95%CI=1.251～6.216)。
3 讨 论
过量锰在体内转化产生大量自由基,引起脂质过氧化,神经元变性坏死[2]。锰职业接触人群在同样的作业环境、同样接触水平条件下,仅有部分人发生慢性锰中毒,提示个体对锰易感性存在着差异,表明遗传因素在锰中毒过程中起着重要作用[6]。前期研究发现锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、细胞色素2E1(CYP2E1)基因多态性可能与职业性慢性锰中毒易感性有关[7,8]。
血红素加氧酶(HO)是一种氧化应激诱导蛋白,是体内重要的抗氧化物质,目前已经发现3种HO同工酶(HO-1、HO-2和HO-3)。Chun[9]研究发现,HO-1基因在锰诱导时表达明显,因而HO-1基因被认为是受到锰暴露等氧化损伤时细胞受影响的早期指标之一。HO-1能分解血红素产生胆绿素、游离铁和一氧化碳,这些分解产物具有抗氧化活性,所以HO-1在防御氧化应激介导的细胞损伤方面起重要作用。任何产生氧化应激的因素诸如重金属、内毒素、脂多糖、氧化剂、细胞因子和紫外线照射等能诱导HO-1的表达;HO-1的高表达可防止细胞损伤,抑制细胞凋亡及炎症反应。研究表明,HO-1基因启动子(GT)n基因多态性与阻塞性肺气肿、缺血性脑血管性疾病等疾病的易感性有关[10,11]。
本研究选择HO-1基因BccI位点进行研究,未发现突变纯合基因型,未发现其多态性与职业性慢性锰中毒易感性有关;而按工龄分层后发现,HO-1基因BccI位点基因型在20～29 a工龄的对照组与病例组的分布有显著性差异,具有RS基因型的个体发生职业性慢性锰中毒的危险性与具有RR基因型的个体相比升高了1.788倍。在以后的研究中有必要选取HO-1基因多个位点并扩大样本量进行研究。
摘要：目的 探讨血红素加氧酶-1(HO-1)基因BccI位点多态性与职业性慢性锰中毒遗传易感性的关系。方法 采用1∶2配对病例-对照研究的方法,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)测定200例职业性慢性锰中毒患者与400例对照组HO-1基因BccI位点基因型,统计分析基因多态性与职业性慢性锰中毒的关系。结果 未发现突变纯合基因型;HO-1基因BccI位点等位基因及基因型在对照组和病例组中分布差异无统计学意义;在男性病例组与对照组中的分布差异亦无统计学意义;但分层分析后发现在工龄20～29 a的对照组和病例组中,等位基因S携带者发生职业性慢性锰中毒的危险性为R的2.632倍(95%CI=1.210～5.724),携带基因型RS的个体患职业性慢性锰中毒的危险性是携带基因型RR个体的2.788倍(95%CI=1.251～6.216)。结论 未发现HO-1基因BccI位点基因多态性与职业性慢性锰中毒的易感性有关,但发现在工龄20～29 a的人群中携带S等位基因或具有RS基因型的个体发生职业性慢性锰中毒的危险性增加。
关键词：职业性慢性锰中毒,基因多态性,病例对照研究,血红素加氧酶-1(HO-1)
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HO-1 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物
36只健康雄性SD大鼠 (山西医科大学实验动物中心提供) , 体重230 g～270 g。
1.2 药品及试剂
重组人促红素注射液 (北京四环生物制药有限公司) , Nrf2、HO-1兔抗鼠多克隆抗体 (北京博奥森生物技术有限公司, 免疫组化用) , PV-6001二步法免疫组化检测试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司) , 辣根过氧化物酶标记的二抗 (北京中杉金桥生物技术有限公司) 。
1.3 分组
随机将36只SD大鼠分为假手术组 (n=12) 、缺血组 (n=12) 和rhEPO治疗组 (n=12) 。每组随机选取6只行免疫组化。
1.4 模型制作与取材
1.4.1 模型制作
采用改良的Zea-Longa法[3]制备pMCAO 模型。大鼠在术前24 h禁食, 术前4 h禁水, 10%的水合氯醛 (0.35 mL/kg) 腹腔注射麻醉后, 仰卧位, 取颈正中切口, 暴露并钝性分离左侧颈总动脉 (CCA) 、颈外动脉 (ECA) 、颈内动脉 (ICA) 。结扎ECA远端、CCA近心端, 用动脉夹夹住ICA, 在CCA近分叉处约5 mm处剪一“V”型小口, 将预先准备好的直径约0.26 mm的蘸有石蜡的尼龙线头轻轻插入CCA, 从CCA分叉处计算, 插入18 mm～20 mm时稍遇阻力即可停止, 并结扎CCA, 逐层缝合筋膜、皮肤, 建立pMCAO模型。假手术组除插入鱼线约10 mm外, 其余操作与缺血组相同。rhEPO治疗组在缺血2 h时腹腔注射rhEPO 5 000 IU/kg, 假手术组与缺血组则给予等量的生理盐水。参考 Zea Longa评分标准, 评分为0分和4分者均剔除。缺血24 h后处死大鼠。
1.4.2 取材
造模完成后, 各组随机取6只在相应时间点心脏灌注去血后, 断头取脑, 经10%中性甲醛固定24 h后, 取视交叉后1 mm～4 mm脑组织, 石蜡包埋, 切片行免疫组化。
1.5 脑梗死体积的测量
大鼠在缺血24 h后以10%水合氯醛麻醉后断头取脑, 以生理盐水冲洗后, 将脑组织迅速置于-20 ℃冰箱冻存20 min后取出, 去除嗅球、小脑和低位脑干, 切除额极和枕极, 以2 mm间距行冠状位切片, 共5片, 然后浸于2%的TTC (2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑) 磷酸盐缓冲液中, 置于37 ℃的水浴箱中染色30 min, 再在4%的多聚甲醛溶液中固定12 h, 取出后用数码相机照相, 最后利用图像分析软件计算出梗死区域的面积, 为了消除脑水肿的影响, 梗死区域体积用占对侧大脑半球体积的百分比来表示。
1.6 免疫组化检测Nrf2及其HO-1的表达
免疫组化方法严格按说明书染色步骤进行, 抗原修复后, 孵育一抗, Nrf2和HO-1兔抗鼠多克隆抗体分别按1∶100和1∶200稀释。每片在高倍镜 (400倍) 下随机选取损伤侧 (左侧) 皮层范围内5个非重叠视野, 利用Image-Pro Plus软件计算平均阳性细胞数。
1.7 统计学处理
采用SPSS11.5统计软件包进行分析, 数据用均数±标准差
2 结 果
2.1 各组大鼠脑梗死体积比较
TTC染色结果:脑组织梗死灶呈白色, 正常组织呈红色, 部分组织表现为由白色向红色过渡区。缺血组左侧半球梗死灶主要位于额顶叶皮质及纹状体。假手术组无梗死体积。与缺血组相比, rhEPO治疗组脑梗死体积明显减小, 有统计学意义 (P<0.01) 。详见表1。
2.2 免疫组化测定脑组织中Nrf2及HO-1的分布与表达
假手术组可见HO-1在细胞浆中有少量表达;缺血组阳性细胞增多, 阳性细胞主要为缺血区的神经元和星形胶质细胞。与假手术组相比, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;rhEPO治疗组阳性细胞增多更为明显, 与缺血组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。
假手术组中有少量Nrf2浆阳性细胞, 无明显核阳性细胞。缺血组可见明显的Nrf2核阳性细胞, 核阳性细胞主要为缺血区的神经元和星形胶质细胞。与假手术组比较, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;rhEPO治疗组可见大量的核阳性细胞, 与缺血组比较, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。表明rhEPO能增加核内Nrf2的含量。详见表2。
3 讨 论
Nrf2是新近发现的一种对氧化应激非常敏感的基因转录因子, Nrf2的缺失或激活障碍, 会使细胞对氧化应激的敏感性提高[4]。卒中发生前Nrf2的激活能够清除缺血半暗带区的自由基。HO-1是一种重要的抗氧化酶, 又称热休克蛋白32 (HSP32) , 在各种理化因素如发热、氧化应激等状态下, 可在脑中大量被诱导、表达, 从而发挥作用。rhEPO在缺血性脑损伤中具有抗氧化作用, 但其抗氧化作用机制是否与Keap1-Nrf2/ARE抗氧化系统有关, 尚不清楚。
本研究通过观察大鼠局灶性脑缺血模型Nrf2及HO-1的表达, 进一步探讨rhEPO的抗氧化作用机制。免疫组化结果证实, 假手术组有少量的Nrf2和HO-1阳性细胞;缺血组Nrf2核阳性细胞和HO-1阳性细胞增多, 提示急性脑缺血发生后, Nrf2与Keap1分离, 转位进入胞核, 进而与核内的ARE结合, 上调HO-1;rhEPO治疗组与缺血组相比, Nrf2核阳性细胞和HO-1阳性细胞明显增多, 提示rhEPO可能促进了Nrf2的核转位。本研究表明, 脑缺血发生后, 脑中Keap1-Nrf2/ARE抗氧化系统被激活, rhEPO可能通过激活该抗氧化系统来发挥抗氧化作用。
假手术组中有少量的阳性细胞, 表明机体在生理状态下, 有少量的Nrf2和HO-1蛋白的表达, 并处于转录翻译与降解的平衡状态, 这样就维持了生理条件下机体内的氧化/抗氧化系统的平衡。由于本研究只局限在蛋白水平, rhEPO对Nrf2、HO-1核酸水平的影响以及调控机制尚不明确。
有研究表明, PI3K[5]、PKC/络氨酸[6]、MAPK[7]等细胞内信号传导途径在该抗氧化系统的激活机制中起了非常重要的作用。但有关rhEPO对该系统的激活机制的研究甚少, Hwang等[8]研究表明HO-1的上调是通过激活PI3K和ERK激酶而实现的。Gene等[2]的研究认为, rhEPO通过PI3K、MAPK途径, 促进Nrf2的核转位, 从而上调HO-1的表达。对于rhEPO激活该氧化系统的具体机制有待进一步研究。
rhEPO能在急性脑缺血大鼠模型中发挥神经保护作用, 其机制可能与上调缺血半暗带中Nrf2和HO-1的表达, 参与Keap1-Nrf2/ARE抗氧化系统有关。
摘要：目的 研究重组人促红细胞生成素 (rhEPO) 对急性脑缺血大鼠脑组织中核因子E2相关性因子2 (Nrf2) 及血红素加氧酶 (HO-1) 表达的影响, 探讨rhEPO的抗氧化作用机制。方法 随机将36只雄性SD大鼠分为假手术组、缺血组和rhEPO治疗组。采用线栓法制作大鼠永久性局灶性脑缺血 (pMCAO) 模型。rhEPO治疗组在缺血2h后腹腔注射rhEPO 5 000IU/kg, 模型组和假手术组在等时间点给予等量的生理盐水。TTC (2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑) 法测量脑梗死体积, 免疫组化方法测定脑组织中Nrf2及HO-1的表达。结果 rhEPO治疗组与缺血组相比, 脑梗死体积减小, 各组脑组织中Nrf2及HO-1的表达量按假手术组、缺血组、rhEPO治疗组依次增高, 各组间差异均具有统计学意义 (P<0.01) 。结论 急性脑缺血后, 脑组织中Keap1-Nrf2/ARE抗氧化系统被激活, rhEPO可能通过激活该氧化系统而发挥脑保护作用。
关键词：脑缺血,重组人促红细胞生成素,E2相关性因子2,血红素加氧酶,Keap1-Nrf2/ARE抗氧化系统
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