U251

U251（精选4篇）

U251 篇1

脑肿瘤干细胞是脑肿瘤中一类特殊亚群的细胞,是肿瘤的“种子细胞”,它们在增殖、分化、致瘤性、信号通路等方面与肿瘤其他亚群细胞存在明显的差异性,它们是肿瘤发生、浸润和复发的关键细胞[1,2,3,4,5]。基于肿瘤干细胞在增殖、分化和致瘤性上的独特性,有学者提出了肿瘤耐药性源于肿瘤干细胞的观点[6]。CD133是神经干细胞和脑肿瘤干细胞的标记物,CD133+细胞不仅具有干细胞特征,而且是脑肿瘤的起源细胞[7]。本文以U251细胞系作为研究对象对脑肿瘤干细胞的耐药特性进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

U251细胞系由中南大学细胞中心实验室提供。

1.1.2 试剂

PRMI1640的完全培养基(美国GIB-CO公司),DMEM/F12(1∶1)培养基(美国Gibco公司),B27添加剂(美国Gibco公司),人表皮生长因子(EGF,英国PeproTech公司),人碱性成纤维生长因子(bFGF,英国PeproTech),左旋谷胺酰氨(美国Sigma公司),特级胎牛血清(美国,Hyclone公司),胰岛素、青霉素和链霉素(华北制药)、左旋多聚赖氨酸(美国Sigma公司),小鼠抗人CD133单克隆抗体(英国R&D System公司),免疫磁珠细胞分选试剂盒(德国Miltenyi公司),总RNA提取试剂盒(美国MRC公司),逆转录试剂盒(北京鼎国),dNTPs(10mmol/L)(北京鼎国)等。

1.1.3 抗肿瘤药物

卡莫司汀(Carmustine,BCNU天津金耀氨基酸有限公司),顺铂(Diamminedichloroplatin,DDP齐鲁制药有限公司),替尼泊苷(Teniposide,VM-26百时美施贵宝公司)。按Limburg推荐的公式计算药物血浆峰浓度(peak plasma concerntration,PPC)(μg/m L)=50×D×2×103/500,其中D为临床化疗剂量[mg/(kg·d)],分别选用0.1、1.0和10.0PPC为实验用药浓度。VM-26、BCNU和DDP的PPC分别为5.0、2.0和3.0μg/m L。

1.2 实验方法

1.2.1 U251细胞系的培养

U251细胞系的培养液为含PRMI1640完全培养基,于5%二氧化碳、37℃饱和温度的培养箱中培养,每2、3 d换液、传代。

1.2.2 免疫磁珠技术分选U251中CD133+与CD133-细胞

按1∶11的稀释比例加入PE标记的小鼠抗人CD133抗体,4℃避光孵育15 min后,用10~20倍体积缓冲液洗涤细胞两次以去除多余的抗体。缓冲液重悬细胞,按1∶5的稀释比例加入抗PE磁珠,混合均匀后4℃避光孵育15 min,加入缓冲液洗涤,1 000 r/min离心10 min,弃上清,重新用缓冲液重悬细胞。500 L1缓冲液洗柱后,将细胞悬液过柱。3×500 L1缓冲液洗柱以去除非标记阴性细胞。移柱出磁场。1 m L缓冲液洗柱,用泵加压,收集洗液即为阳性部分细胞。取分选后的细胞用流式细胞仪检测CD133的表达率及细胞周期。

1.2.3 化疗药物敏感性实验(MTT比色试验法)将

分选出的CD133+与CD133-细胞调整细胞密度至1×105个/m L,接种于96孔板中,每孔接种细胞数103个细胞,再加入无血清培养基至180μL。置5%二氧化碳、37℃饱和温度的培养箱中培养24 h,加入不同浓度的化疗药物20μL,每个药物设3个浓度梯度(0.1、1.0和10.0PPC),每个药物设6个复孔,同时设空白对照和对照组(含细胞用培养液代替化疗药),培养48 h。然后每孔加入10μL MTT,继续培养4 h,吸出每孔培养液,用DMSO200μL溶解,振荡10 min,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内药物蓄积实验

将分选的CD133+与CD133-细胞调整密度至1×105个/m L,将培养瓶置于5%二氧化碳、37℃饱和温度的培养箱中培养24 h,然后加入VM-26,并使培养瓶中的VM-26工作浓度为1.0 PPC。培养48 h后收集细胞,将待测细胞用200 g离心5 min,弃上清,用4℃预冷乙醇固定,4℃保存,固定18 h,离心,PBS洗3次,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。同时设置对照组(不加VM-26)。

将分选的CD133+与CD133-细胞调整密度至1×105个/m L,将培养瓶置于5%二氧化碳、37℃饱和温度的培养箱中培养24 h,然后加入VM-26,并使培养瓶中的VM-26工作浓度为1.0 PPC。继续培养2 h和24 h后换新鲜培养基再培养1 h,收集细胞,将待测细胞用800 r/min离心5 min;弃上清,用75%4℃预冷乙醇固定,4℃保存,固定18 h;800r/min离心,PBS洗涤3次。送北京鼎国生物公司用流式细胞仪在488 nm的激发光、675 nm的发射光下,测定两组细胞在加药后2 h和24内存留的VM-26所释放的荧光强度。

1.2.5 TR-PCR实验检测CD133+/CD133-细胞基因表达谱的差异

引物序列参照文献或用软件Premier5.0设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成[8,9,10],见附表。按Trizol一步法RNA提取试剂盒说明进行总RNA的提取,按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成c DNA,PCR扩增,电泳,得到凝胶在紫外灯下观察测定OD值。

附表引物序列、长度及用途

1.3 统计学处理

数据以均值±标准差表示,组间均数差异性检验采用t检验和方差分析(ANOVA),所有统计学分析均用SSPS13.0完成,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

A:分选前B:分选后

2.1 分选阳性率

利用免疫磁珠分选技术纯化U251细胞中的CD133+细胞。分选前,流式细胞仪测试CD133+细胞的百分比为5.4%,分选后,流式细胞仪测试CD133+细胞的百分比为92.4%,见图1。

2.2 分选细胞对药物敏感性

MTT法检测CD133+/CD133-细胞对BCNU、DDP和VM-26的耐药性。根据YAMAUE[11]的药物试验评价标准,以50.0%的抑制率作为敏感与耐药的界线。0.1PPC浓度水平的抗肿瘤药物对CD133-细胞具有抑制和杀灭作用,然而CD133+细胞对1.0PPC抗肿瘤药物仍表现出明显的抗药性,说明1.0PPC的抗肿瘤药物尚不能对CD133+细胞产生明显的生长抑制作用;只有在10.0 PPC浓度水平上,CD133+细胞才出现生长抑制。从各个浓度水平上比较,CD133+细胞的耐药性明显高于CD133-细胞。在3种抗肿瘤药物中,VM-26相比其他两个表现出更显著的抑制细胞生长的作用,尤其对CD133-细胞表现更为明显。见图2。

覮表示CD133+组与CD133组相比存在明显差异,P<0.05

2.3 流式细胞仪检测分选细胞的凋亡率和细胞内药物蓄积

流式细胞仪分析1PPC的VM-26处理不同时间(0、24和48 h)CD133+/CD133-细胞的凋亡率显示,与CD133-细胞相比,CD133+细胞表现更为显著的抗凋亡能力。随着药物作用时间延长,CD133-组的凋亡率明显增高,DNA含量少于2n的细胞开始增多,即“亚G1峰”开始出现并逐渐累积,提示细胞凋亡或者坏死增加;而CD133+组并未出现“亚G1峰”,而且2n的细胞并未明显减少,说明细胞生长并未受到明显的抑制和杀灭,见图3。

用1.0 PPC浓度的VM-26作用于两组细胞,流式细胞仪检测不同时间点(2 h和24 h)的CD133+/CD133-细胞内VM-26的荧光强度,通过荧光强度反应VM-26在细胞内的药物蓄积水平。结果如图4,CD133+细胞在加入VM-26后,荧光峰值左移,VM-26平均荧光强度分别为4.56和2.35,说明CD133+细胞内的VM-26蓄积降低;CD133-细胞在加入VM-26后,荧光峰值右移,VM-26平均荧光强度分别为9.34和15.27,说明CD133-细胞内的VM-26蓄积明显增加。

2.4 分选细胞基因谱系的差异

为了探讨CD133+细胞耐化疗药物的机制,本文运用RT-PCR检测两个亚群细胞的CD133、多药耐药基因、DNA修复基因(MGMT)和抗凋亡基因(Bcl-2)表达的差别。ABC药物转运体包括MDR1,MRP与BCRP,尤其BCRP被认为在正常干细胞与肿瘤干细胞的耐药中起着极其重要的作用;MGMT被认为是修复甲基化和氯乙醇化合物细胞毒性的关键基因;抗凋亡基因是细胞逃避肿瘤药物的重要机制。CD133+/CD133-细胞各个基因的表达差异,图5~6。

+代表CD133+细胞组;-代表CD133-细胞组

覮实验组与对照组相比存在明显差异,P<0.05;+代表CD133+细胞组;-代表CD133-细胞组

3 讨论

目前,肿瘤干细胞的耐药性研究在白血病中取得了初步的进展,在对白血病的研究中发现,伊马替尼对慢性粒细胞性白血病干细胞分化出的成熟子代细胞具有明显的生长抑制作用,但是慢粒的白血病干细胞对伊马替尼则表现明显的耐药[12]。而对脑肿瘤干细胞的耐药性研究,尚未有相应的研究报道。本文就是针对脑肿瘤干细胞的耐药特性进行的初步性研究。

CD133可作为干细胞标记物来分离脑肿瘤中的脑肿瘤干细胞[1,3,4,5],本组首先运用免疫磁珠细胞分选技术将U251细胞中分选出脑肿瘤干细胞(Brain Tumor Stem Cells,BTSC,CD133+)和非脑肿瘤干细胞(Non-BTSC,CD133-),通过MTT比色实验和流式细胞技术比较BTSC和Non-BTSC对化疗药物的耐药性。

流式细胞仪的定量分析表明,U251细胞中只有5.4%的阳性细胞率。这说明了,BTSC只是U251细胞系中含量极少的细胞亚群。免疫磁珠分选技术(Magnetic Cell Sorting,MACS)是一种高效的细胞分选技术,分选后的细胞适合继续培养和干预[13]。本实验就是通过MACS技术来分选U251细胞系中的BTSC和Non-BTSC,以获取高纯度细胞,再培养扩增,用于后期的研究。本文运用MACS分选,获取的CD133+细胞纯度可达92.4%。

有学者提出,肿瘤干细胞的存在是肿瘤化疗耐药的根本原因[6]。本实验MTT试验结果发现抗肿瘤药物对CD133-组具有明显的杀灭作用而CD133+组却表现出明显的抗药性。流式细胞仪检测CD133+和CD133-细胞在中等浓度VM-26作用下的凋亡情况。随着药物作用时间延长,CD133-组的凋亡率明显增高,DNA含量少于2n的细胞开始增多,“亚G1峰”开始出现并逐渐累计,提示细胞凋亡或者坏死增加;而CD133+组并为出现“亚G1峰”,而且2n的细胞并未明显减少,表明细胞生长并未受到明显的抑制和杀灭。上述试验结果表明,CD133+细胞是U251细胞系中的耐药亚群。在白血病方面的研究亦得到相似的结论。RAAIJMAKERS[14]等发现在AML中的CD34+CD38-干细胞亚群对米托恩的耐药性明显强于CD34-CD38+细胞亚群。宋永平[12]等对CML的研究发现,伊马替尼对慢性粒细胞性白血病干细胞分化出的成熟子代细胞具有明显的生长抑制作用,而慢粒白血病干细胞对伊马替尼则表现出明显的耐药。LIU[15]报道了在胶质母细胞瘤中,CD133+细胞对替莫唑胺、卡铂、紫杉醇和依托泊苷的耐药性明显强于CD133-细胞。

干细胞与肿瘤细胞在某些特性上的相似点,比如DNA修复,表达ATP药物转运体和抗凋亡特性是学者提出肿瘤干细胞耐药性的理论基础[6]。

MGMT对抗烷化剂药物杀伤肿瘤细胞的作用,是造成肿瘤细胞耐药的重要原因之一。有学者认为,MGMT是胶质瘤耐药的重要因素[16]。本研究的结果表明,相比CD133-细胞,CD133+细胞对BCNU表现出显著的耐药性,这与CD133+高表达MGMT的结果是一致的。这个结果提示了,在U251细胞系中,MGMT的表达主要来源于CD133+细胞,CD133+细胞的DNA修复能力可能是其在BCNU化疗后仍能存活的重要原因。在LIU[15]的报道中,三个不同胶质瘤母细胞瘤细胞系中的CD133+细胞的MGMT表达是CD133-细胞的32~56倍。

ABCB1(MDR1)、ABCG2(BCRP)与ABCC2(MRP1)代表着肿瘤主要的耐药蛋白[17,18]。本研究的结果表明,CD133+细胞同样具有通过表达ABC转运体外排药物的避免药物杀伤的功能。实验通过RT-PCR技术检测了CD133+细胞和CD133-细胞亚群的ABC转运体ABCB1、ABCG2和ABCC2的表达水平,并通过流式细胞仪检测了两个亚群细胞的抗肿瘤药物VM-26的蓄积情况。结果发现,高表达ABCB1、ABCG2和ABCC2的CD133+细胞的VM-26的蓄积远远低于CD133-细胞亚群,并且随药物的作用时间CD133+细胞外排VM-26的表现明显,相反,VM-26在CD133-细胞呈现了蓄积增加。这提示了CD133+细胞中ABC转运体泵的作用;同时也提示了ABC转运体是CD133+细胞一个重要的耐药机制。刘继东[19]等在最近的研究中,也报道了ABCG在CD133+细胞中的正相关性。

抗凋亡是肿瘤逃避化疗药物杀灭的重要机制之一[20,21]。流式细胞仪检测发现CD133+细胞的凋亡率明显低于CD133-细胞,这与RT-PCR检测CD133+细胞的Bcl-2在m RNA水平上表达要明显高于CD133-细胞的表达水平一致。抗凋亡家族尚包括多个成员如FLIP、Bcl-XL、XIAP、SURVIVIN等,LIU[16]的研究发现,这些基因在CD133+细胞的表达明显高于CD133-细胞的表达,而促凋亡基因BAX的表达则低于CD133-细胞。在急性粒细胞性白血病的研究中发现,CD34+细胞(白血病干细胞)的抗凋亡基因Bcl-2的表达亦明显高于CD34-细胞[22]。

因此,MGMT、ABC药物转运体及抗凋亡基因的高表达可能是脑肿瘤干细胞对化疗耐药的重要原因。脑肿瘤干细胞仍可能存在着其他的耐药机制,例如细胞在体内处于相对的静止状态,长期处于G0期,也是其免于细胞毒性的一个机制。房佰俊等将慢性粒细胞性白血病(CML)中的白血病干细胞分离后,用流式细胞仪将其分成G0、G1和S/G2+M期3个细胞亚群,在药物敏感性试验比较中发现G0期细胞对化疗药物的抗性最强[23]。脑肿瘤干细胞耐药机制的多样性,以及其对不同药物耐药机制的差异性,是今后脑肿瘤干细胞耐药机制研究的一个重要方向。

摘要：目的 探讨脑肿瘤干细胞对抗肿瘤药物的耐药性及其机制。方法 通过磁珠分选(MACS)将U251细胞中的CD133+与CD133-细胞进行分选,用MTT法和流式细胞技术比较CD133+与CD133-细胞对抗肿瘤药物替尼泊苷(Vm-26)、卡莫司汀(BCNU)和顺铂(DDP)的敏感性、细胞凋亡率及细胞内药物蓄积的差异性,通过RT-PCR检测CD133+与CD133-细胞耐药基因谱的差异。结果 U251细胞系中,CD133+细胞约占5.4%,分选后的CD133+细胞的阳性率可达92.4%,CD133-细胞对抗肿瘤药物替尼泊苷、卡莫司汀和顺铂的敏感性明显高于CD133+细胞;流式细胞仪试验显示,在中等浓度的替尼泊苷作用下,CD133-细胞的凋亡明显,并出现明显的“亚G1峰”,而CD133+细胞并未受到明显抑制和杀灭;流式细胞仪检测显示CD133+细胞内的药物蓄积明显低于CD133-细胞;RT-PCR实验显示MDR1、BCRP、MRP、MGMT和Bcl-2表达在CD133+明显高于CD133-细胞。结论 CD133+是U251细胞系中的耐药细胞亚群,高表达ABC转运体,DNA修复和抗凋亡基因可能是CD133+细胞耐药的重要机制。

关键词：肿瘤干细胞,磁珠分选,耐药性,U251人胶质母细胞瘤细胞系

U251 篇2

关键词：银杏提取物(GBE),U251胶质瘤细胞,凋亡

在脑肿瘤治疗中,传统的手术、放疗、化疗对人体损伤大且效果不佳。近年来,国内外研究表明,银杏提取物具有显著的抗肿瘤活性[1,2]。2011年11月6日我们观察银杏提取物对人脑胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

U251人脑胶质母细胞瘤,DMEM培养基,丙酮,PBS缓冲液(p H 7.2~7.4),胎牛血清(FSC),MTT,Annexin-V异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙(PI)染色试剂盒。

1.2 方法

1.2.1银杏提取物的制备[3]银杏叶以丙酮提取.再以溶剂萃取为主,除去其脂溶性、水溶性成分.以及蛋白质、多糖、缩合多酚等高分子化合物。

1.2.2倒置显微镜观察Trypan Blue染色后各组U251脑胶质瘤细胞形态,见图1、2、3、4。

1.2.3 U251细胞增殖情况观察采用MTT法。将各组细胞悬液浓度调整为5×103/mL,接种96孔板,1 mL/孔,每组设3个复孔。PBS冲洗后加入MTT,培养24h,用酶联免疫检测仪检测570 nm波长处各组细胞的光密度(OD)值,以此表示细胞增殖情况。数值越小,表示增殖力差,并计算抑制率,见附表。抑制率=(1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100%1.2.4 U251细胞凋亡率测算采用流式细胞仪检测。于培养24 h后,取各组细胞,进行FITC/PI荧光染色,按试剂盒说明操作;然后上机检测,读取各组细胞凋亡率数值。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件。所得数据以表示,组间比较用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察Trypan Blue染色后各组U251脑胶质瘤细胞形态

2.3 各组U251细胞凋亡率比较

培养24 h,A、B、C、D组细胞凋亡率分别为0.3%±0.3%、10.6%±1.7%、21.9%±4.3%、33.5%±2.1%。B、C、D组与A组比较,P均<0.05。

3 讨论

银杏,蕨类植物,银杏提取物成分及其复杂,包括黄酮类化合物、银杏内酯和白果内酯等主要活性成分以及烯醇类、酚类、酸类、甾类、糖类等含量较少的组分。国内外部分学者曾对银杏提取物的银杏黄酮,银杏酚酸的体内外抗肿瘤活性做过研究,并取得一定进展。在对胃癌[4]、肝癌[5]的研究上成果显著,其抑制U251肿瘤细胞可能机制为对抑癌基因的激活调节,对脂肪酶的抑制影响,诱导肿瘤细胞凋亡等,本研究结果表明,银杏提取物对U251细胞的抑制作用效果明显,可诱导肿瘤细胞凋亡,以期用于临床可改善患者生存质量,延长患者生命。

参考文献

[1]Li W,Pretner E,Shen L,etal.Common gene targets of Ginkgo bilobaextract(EGb761)in human tumor cells:relation to cell growth[J].Cell Mol Biol(Noisy-le-grand),2002,48(6):655-662.

[2]高凌,亢寿海,张能芳,等.银杏叶聚戊烯醇对移植性肝癌的治疗作用[J].医药学刊,2004,22(1):73-74.

[3]陆玲.银杏制品开发与质量控制[J].杭州食品科技,1998,(2):1-2,7.

[4]张凤,杨桂文,张金凤,等.银杏叶类黄酮对人胃癌细胞BGC823体外的增殖抑制作用[J].世界华人消化杂志,2005,13(21):2627-2629.

U251 篇3

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,BMSCs)具有很强的分化能力,在合适的条件下可以分化成骨、软骨、脂肪组织等多种组织细胞[2,3,4]。BMSCs的这一特点及其靶向迁徙的能力[5]使它在基因治疗中具有了独特的价值。BMSCs可作为理想的分子载体,通过外源治疗基因TRAIL修饰后的BMSCs可以向受损组织趋化及发挥修复作用。由此可知,BMSCs经过肿瘤杀伤基因修饰后有可能携带治疗性物质靶向杀伤肿瘤细胞。本实验将TRAIL的选择性杀伤细胞作用与BMSCs的肿瘤细胞迁徙性相结合,探究TRAIL转染骨髓干细胞后靶向治疗脑胶质瘤的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞和主要试剂

人骨髓间充质干细胞购于美国Millipore公司,U251胶质瘤细胞株购自南京凯基生物公司,血清和DMEM培养基均购于美国Millipore公司,RT-PCR(Reverse Transcription-Polym erase Chain Reaction,逆转录-聚合酶链反应)试剂盒,美国BIO-RAD公司,Trizol试剂,Invitrogen公司,质粒提取盒,天根生化科技有限公司,转染试剂(Trans IT-2020),Invitrogen公司,流式试剂,美国BD公司,一抗、二抗,英国Abcam公司,质粒由加拿大UBC大学实验室提供。

1.1.2细胞培养与传代

取出BMSC(U251)冷冻保存细胞于37℃水浴锅中迅速复苏,将细胞液移于离心管中离心、收集细胞,再加入含10%胎牛血清(fatal bovine serum,FBS)的完全培养基,充分吹打悬浮细胞,移于培养瓶中,置于37℃、5%二氧化碳孵育箱培养,待细胞长到80%~90%时,用0.25%胰酶消化、收集细胞,进行传代培养。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs向肿瘤细胞迁徙的体外实验

利用8μm孔径的Transwells小室进行BMSCs迁徙实验。将1×105个/ml BMSCs置于上室,U251胶质瘤细胞置于下室,然后置于37℃、5%二氧化碳培养箱中24 h,取下滤膜,用PBS冲洗2遍,并用细胞铲刮除黏附的细胞,甲醛固定30 min,风干后用0.1%结晶紫染色30 min,随机选取5个视野在显微镜下观察、计数。

1.2.2质粒的扩增与提取

质粒属于绿色荧光蛋白的分泌型TRAIL真核表达质粒,内含有目的基因TRAIL以及抗AMP(ampicillin,氨苄青霉素)片段,置于-20℃保存备用。取质粒与感受态细胞(由实验室提供)冰上解冻,将两者混匀后于42℃水浴90 s,加入LB培养基(Luria-Bertani培养基),摇床振荡复苏细胞;在选择性培养板(AMP)上涂板,过夜培养。挑取单菌落加入含AMP的LB培养基中振荡培养,待LB变浑,采用高纯度质粒小提中量试剂盒(tiangen)进行提取,具体参照试剂盒说明书,提取的质粒置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3质粒转染BMSC细胞

待细胞达80%左右时进行转染,转染前细胞用无双抗培养基培养24 h。将含TRAIL的质粒溶于Opti-MEM培养基中混匀,另取转染试剂Trans IT-2020溶于Opti-MEM培养基混匀,将两溶液吹打混匀后立即加入细胞中,并边加边摇,置于37℃、5%二氧化碳孵育箱中培养,6 h后换成完全培养基。培养24~48 h后于显微镜下观察。

1.2.4质粒转染的BMSCs中目的基因的表达

应用PCR检测TRAIL基因的表达情况,培养24 h后收集各组BMSC细胞,用PBS(phosphate belanced solution,磷酸缓冲液)冲洗3次,加入Trizol裂解细胞,严格按照说明书提取总RNA(ribonucleic acid,核糖核酸)。引物序列通过Olig 6软件设计,由宝生物公司合成。扩增TRAIL基因编码序列的引物:正向5'-TGACTGTGGCTGTGACTTA-3';反向5'-ACTCCCAGGTTTCTATCTT-3'。β-actin的正向5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3';反向5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。PCR扩增条件:共30个循环,每个循环包括94℃30 s,55℃30 s,72℃60 s。同时扩增管家基因β-actin作为对照验证。每孔加5μl样品,并在一侧加入5μl的2 000 Marker,进行琼脂糖凝胶电泳,20 min后获取图片,并对数据进行分析。

应用Western blot法检测相关蛋白的表达水平,β- actin作为内参。培养48 h后收集各组细胞蛋白产物,取50μl样本与5×SDS- PAGE缓冲液混合,电泳后经转膜仪将样本转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,经漂洗、封闭、一抗(抗TRAIL)孵育、二抗孵育,检测结果并通过Image J2X软件扫描图像及定量分析。

1.2.5流式细胞仪检测U251细胞的凋亡率

各实验组细胞处理48 h后,收集培养基到新的离心管中,加PBS冲洗3次,将冲洗液吸取到相应离心管中(避免丢失悬浮的凋亡细胞影响实验结果)。用0.25%胰酶消化、收集细胞到相应的离心管,1 000r/min,离心5 min。用预冷的PBS冲洗3次,然后用1×bind buffer将细胞配成(1-5)×104/ml的细胞悬液,取100μl加入新的EP管中,每管加5μl Annexin V-FITC和5μl PI(propidium iodide),暗环境培养15 min后加入400μl 1×bind buffer,立即用流式细胞仪检测,1 h内完成,并分析实验结果(实验需设置3组质控样本)。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,用配对资料t检验,各组数据均符合正态分布,转染后的BMSCs细胞对U251 细胞的增抑制率及凋亡率比较,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMS Cs向U251 细胞的迁徙能力

应用Transwell法验证BMSCs向肿瘤细胞的迁徙能力,BMSCs与U251 细胞共培养48 h后,随机选取5 个视野在显微镜下观察、计数,可见U251 细胞培养液可刺激更多的BMSCs发生迁徙,与生理盐水及培养基比较,差异有统计学意义(P <0.05)(见图1)。荧光显微镜下发现,BMSCs主要聚集于U251细胞周围,而在无U251 细胞的培养基周围仅散在少量BMSCs(见图2)。由此可证明,BMSCs向肿瘤细胞迁徙的特异性。

2.2 RT- P CR及We s te rn blot检测目的基因表达

通过PR- PCR扩增,将扩增的目的基因分别加样进行琼脂糖电泳,经20 min后观察结果并成像(见图3)。结果显示条带随培养时间的延长依次由淡变亮,表明TRAIL在BMSCs内成功表达。应用Western blot法检测转染组与未转染组目的基因的表达情况,可见转染组的TRAIL表达与PCR结果有相同效果,随着培养时间的延长表达量相继增加,β-actin在不同细胞的表达量无差异。见图4。

2.3 流式细胞仪检测U251 细胞的凋亡率

采用Annexin V/PI双染色法进行检测各组U251 细胞的凋亡情况并记录数据,U251 细胞的凋亡率取右下象限(见图5),即Annexin V- FITC(+)/PI(-),由表1 可见转染组诱导U251 细胞的凋亡率与空白组比较差异有统计学意义(P <0.05),而未转染组与空白组比较差异不明显(P >0.05)。TRAIL对BMSCs的凋亡作用见图6。 由表2 可见转染的TRAIL对BMSCs无明显毒性作用(P >0.05)。

生理盐水及培养基仅诱导少量的BMSCs发生迁徙比较,U251细胞培养液可刺激更多的BMSCs发生迁徙(P<0.05)

质粒属于绿色荧光蛋白的分泌型TRAIL真核表达质粒,转染后的BMSCs置于上室,U251胶质瘤细胞置于下室,共培养48 h后,可见BMSCs透过Transwell小室,且主要聚集于U251细胞周围,而无U251细胞的地方较少

A:β-actin组;B:TRAIL组。TRAIL组又分为24、48和72 h组。可见TRAIL条带的表达量随时间呈递增趋势

取未转染的BMSCs培养48 h后提取TRAIL表达蛋白产物行Western blot检测作为对照组;以转染后的BMSCs表达产物作为实验组,并依次分为24、48和72 h组,证明TRAIL的表达量随时间递增

A:实验以BMSCs TRAIL+U251作为实验组;B:BMSCs+U251作为阴性对照;C:单纯U251细胞作为空白对照组。共同培养48 h后收集细胞于新的离心管,分别加入Annexin V/PI试剂后行流式细胞检测,可见BMSCs TRAIL+U251组U251细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)

A:实验以BMSCsTRAIL作为实验组;B:单纯BMSCs作为对照组。共同培养48 h后行流式细胞检测,可见两组BMSCs的细胞凋亡率比较(P>0.05),证明TRAIL对BMSCs无影响

(%,n=3,±s)

注:1)与BMSCs+U251 组比较,P <0.05;2)与空白对照组比较,P >0.05

(%,n=3,±s)

3 讨论

人脑胶质瘤是神经外科最常见恶性肿瘤,发病迅速,致死率高[6,7],目前针对脑胶质瘤的治疗有放疗、化疗、手术治疗,但治愈率很低,术后极易复发[8],5年生存率也不足20%。因此,对脑胶质瘤是治愈要探索新的治疗手段,众所周知,细胞的分化受到基因的严密调节,能否选择一种方法在肿瘤细胞的生长分化过程中杀伤肿瘤细胞呢?许多专家已经证实肿瘤坏死因子和抑癌基因在调控细胞生长分化中至关重要[9],所以,基因治疗脑胶质瘤可能成为根治胶质瘤的有效方法。

TRAIL是肿瘤坏死因子家族的最新成员,可与肿瘤细胞膜上的DR5 结合,再通过一系列级联反应组成DR5- FADD- Caspase 8(DISC)死亡诱导信号复合体,激活Caspase 8,诱导肿瘤细胞发生凋亡[10],而对正常细胞无影响[11]。另外,也有相关文献证明TRAIL联合放化疗可显著增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性,增加耐药性肿瘤的凋亡,因此,TRAIL日益受到人们的重视,但是TRAIL在肿瘤治疗中的应用较为局限,原因有:1TRAIL在血浆内的半衰期极短,大约小于1 h[12];2具备生物活性的TRAIL必须以三聚体的形式存在,故难以透过血脑屏障发挥作用;3应用腺病毒基因疗法体外能诱导数种人肿瘤细胞凋亡,但体内有引起宿主抗病毒免疫反应的可能。BMSCs的肿瘤迁徙性已在许多文献中被证实,可能是肿瘤细胞分泌相关性因子,从而诱导BMSCs发生迁徙,BMSCs的这一特性为靶向杀伤肿瘤细胞提供了理想的载体。BMSCs可以向肿瘤组织趋化,定位于其间质中增殖、分化[13],所以将目的基因转染入骨髓干细胞,通过骨髓干细胞将治疗基因带入肿瘤组织,由于治疗基因的存在及分泌杀伤物质从而达到肿瘤的抑制作用。本实验主要是探究TRAIL基因作为目的基因转染骨髓干细胞后对U251 胶质瘤细胞的体外靶向抗瘤作用。

实验构建TRAIL的表达载体转染骨髓干细胞,转染成功后,通过PCR及Western blot检测转染后TRAIL的表达,由图3、4 可知转染后的TRAIL基因在BMSCs中表达,且TRAIL的表达量随时间延长而增加。选择第3 天的转染组与U251 胶质瘤细胞共培养,并利用流式细胞仪检测U251 细胞的凋亡率,发现实验组U251 细胞的凋亡率明显增加,BMSCs作为基因载体诱导肿瘤细胞凋亡,自身却不发生凋亡。由此推断,BMSCs作为有效的基因载体,不仅克服TRAIL基因在血浆中半衰期短的难题,而且TRAIL修饰后的BMSCs具备靶向抗瘤的作用,这为恶性胶质瘤的治疗提供了新的途径。

U251 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

DMSA@γ-Fe2O3纳米磁流体由东南大学生物材料与器件实验室 (江苏省重点实验室) 提供, 直径为 (17.8±2.1) nm, 密度为12.93g·L–1, pH 6.5。交变磁场装置由上述实验室提供, 频率为40kHz, 功率为80kW, 磁感应强度为0～100kA·m–1。卡氮芥为天津金耀氨基酸有限公司产品, 四甲基偶氮唑盐 (MTT) 、二甲亚砜 (DMSO) 、胰蛋白酶、低糖型DMEM培养基为美国Gibco公司产品, 胎牛血清 (FCS) 为杭州四季清产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人胶质瘤细胞株U251由江苏省人民医院惠赠, 用含10%胎牛血清 (FCS) 的低糖型DMEM培养液培养, 分别加入最终浓度为100U·ml-1的青霉素和链霉素, 置5%CO2、37℃培养箱内, 2～3d传代1次。待细胞生长至80%融合时, 改用无血清DMEM培养液静置24h, 将细胞同步静止于G0期。随机分为对照组、磁纳米热疗组、化疗组、磁纳米热疗联合化疗组 (简称热化疗组) 4组。对照组更换培养液后继续培养, 磁纳米热疗组加入适当浓度的Fe2O3浸提液置于磁场下43℃热疗2h, 化疗组加入一定浓度的卡氮芥后继续培养24h, 热化疗组加入上述浓度的卡氮芥培养24h后置于磁场下43℃热疗2h。

1.2.2 Fe2O3纳米磁流体的消毒及浸提

将纳米磁流体滤膜过滤消毒后, 加入少量不含胎牛血清的DMEM培养液混匀 (以使纳米材料沉淀) , 离心 (1200r·min-1) 5min, 倒去上清液, 加入适量培养基浸提, 使用前超声震荡30min (使纳米材料充分混匀) , 以DMEM培养基稀释至所需浓度。

1.2.3 Fe2O3纳米磁流体的升温实验

将Fe2O3纳米磁流体分别以0、2、4、6、8、10g·L-1的浓度置于T- 25培养瓶内, 培养瓶内部置一根光纤, 通过测温装置与计算机相连, 再将培养瓶置于37℃水浴箱, 以模拟正常人体内温度, 然后再置于一定强度交变磁场下, 观察各Fe2O3浓度下升温情况, 确定温度上升≥43℃时Fe2O3浓度的范围。

1.2.4 MTT法测定U251细胞的增殖率及抑制率

(1) Fe2O3纳米材料对细胞的毒性实验。细胞接种于96孔板 (每孔体积200μl, 6×104个细胞·孔-1) , 待细胞融合至80%, 无血清培养液静止24h, 将消毒后的纳米材料经超声震荡30min后, 用DMEM培养基稀释后加入, 使其终浓度分别为0、0.01、0.05、0.075、0.1、0.2g·L-1, 阳性对照为 0.7g·L-1的聚丙烯酰胺单体溶液, 每组设5个复孔, 培养48h后, 每孔加入20μl MTT (5g·L-1) , 37℃继续培养4h, 弃去各孔内液体, 每孔加入DMSO 150μl, 置摇床低速混匀10min后, 在酶标仪上测定492nm处的吸光度 (OD) 值。按下列公式计算细胞相对增殖率 (RGR) :RGR=实验组OD值均数/对照组OD值均数×100%, 并按表1规定把RGR值转换成6级反应, 实验结果为0～1级反应认为无毒性作用, 实验结果为2级反应则结合细胞形态综合评价, 实验结果为3～5级反应认为有毒性作用。 (2) 卡氮芥工作浓度的确定。药物设0.0125、0.025、0.05、0.1及0.25g·L-15个浓度组, 每组设5个复孔, 以MTT法测定细胞增殖抑制率, 以IC10～IC25的药物浓度作为热化疗实验的工作浓度。 (3) 各组U251细胞的抑制率。取对数生长期细胞接种于50ml培养瓶中, 每瓶细胞为2×105个·ml-1, 分别进行干预后培养24h, 经洗涤、消化、离心、吹打均匀后, 分别以等密度接种于96孔板 (每孔体积200μl) , 继续培养24h后, MTT法分别测各组抑制率。抑制率= (1-实验组OD值均数/对照组OD值均数) ×100%。

1.2.5 流式细胞仪检测各组细胞的早期凋亡率

取4组对数生长期的细胞, 每组均为3瓶, 每瓶3ml, 分别进行干预后放回培养箱37℃继续培养, 再培养24h后消化收集细胞。参照试剂盒说明书进行操作, 检测细胞早期凋亡率。

1.3 统计学处理

实验数据以undefined表示, 多组间比较采用单因素方差分析。应用SPSS 11.0统计分析软件进行统计分析。

2 结果

2.1 Fe2O3纳米材料的体外升温实验

在交变磁场下, 随着Fe2O3浓度的增加, 培养液升温的速度增快, 峰值温度提高 (表2) 。当Fe2O3浓度≥8g·L-1时, 细胞培养液温度可达43℃以上。照射前10min升温迅速, 15～30min升温平缓, 40min后不再上升。以培养液浓度为8g·L-1组为例, 升温曲线见图1。

2.2 Fe2O3纳米材料对U251细胞的毒性

纳米材料作用于U251细胞48h后结果显示, 不同浓度的纳米材料浸提液对于胶质瘤细胞U251的增殖无明显影响, U251细胞的RGR及毒性评级见表3。

2.3 不同浓度卡氮芥对人胶质瘤细胞U251的抑制作用

在一定范围内随着卡氮芥浓度的增加, 其对U251细胞增殖的抑制作用逐渐增强, 且呈浓度依赖性 (P<0.05) ;其浓度为0.2g·L-1时抑制率可达83.6%, 其工作浓度为0.02g·L-1 (图2) 。

2.4 不同处理方法对U251细胞的抑制作用

各组细胞分别经过干预后结果显示, 单纯的磁场下热疗 (43℃下2h) 及化疗均对U251细胞均有抑制作用 (P<0.05) , 热化疗组对U251细胞的抑制作用明显强于磁纳米热疗组及化疗组 (均P<0.05, 表4) 。

与对照组相比, △P<0.05;与磁纳米热疗组及化疗组相比, *P<0.05

2.5 流式细胞仪检测U251细胞凋亡情况

经过干预后, 与对照组细胞凋亡率 (2.58%) 相比较, 磁纳米热疗组、化疗组及热化疗组的细胞凋亡率均明显增加, 分别达到13.75%、17.60%及35.27%, 差异均有统计学意义 (P<0.05) ;而且热化疗组细胞凋亡率高于磁纳米热疗及化疗组, 且差异也有统计学意义 (P<0.05) 。见图3。

3 讨论

研究[1]证明, 肿瘤细胞对热高度敏感, 43℃以上的温度可以有效杀伤肿瘤细胞, 使肿瘤细胞凋亡或直接死亡。而纳米颗粒在交变磁场作用下通过磁滞或驰豫等原理, 吸收电磁波能量转换为热能, 可以实现肿瘤细胞水平的热疗, 其应用前景十分诱人。当前, 不少国家都在进行有关磁性纳米材料对脑胶质瘤热疗的相关研究。许多体外实验已证明在一定强度的交变磁场下, 纳米材料温度可平稳升高到43 ℃以上。本实验为完全模拟体内的升温情况, 将装有Fe2O3纳米磁流体的T- 25培养瓶置于37℃水浴箱内, 在频率100kHz、强度15kA·m-1的交变磁场作用下, 培养液温度从37.0℃逐步上升到38.5℃以上, 最高达45.2℃, 显示升温效应良好, 且与Fe2O3浓度呈明显正相关;Fe2O3 浓度达到8g·L–1时温度即可稳定在43.0℃以上。此结果与以前的研究[2,3,4]基本一致。Hilger等[2]认为, 磁流体温度的增加与铁的含量呈正比。颜士岩等[3] 采用化学共沉淀法制备出直径大小为20nm的γ-Fe2O3粒子, 并对其表面用谷氨酸修饰后制成磁流体, 在交变磁场中加热后可升温至39～46℃。贺莲香等[4]发现, 随着磁流体中Fe3O4纳米粒子浓度的增加, 细胞培养液的温度分别上升到38.9～47.2℃。

卡氮芥为亚硝脲类抗癌药, 其脂溶性高, 易通过血脑屏障, 临床疗效显著, 是神经胶质瘤的经典化疗药物。

热本身会对细胞产生直接的细胞毒效应, 而热疗与化疗联合应用往往可以起到协同的作用。结合国内外文献, 认为其机制可能有以下几方面: (1) 加温使细胞膜蛋白变性, 细胞膜稳定性被破坏, 通透性增加, 细胞呼吸受抑制、酸中毒, 药物进入细胞内的量增多, 增加了化疗效果[5]; (2) 加温使肿瘤局部血流量增多, 从而使瘤体内的药物浓度增加; (3) 加温抑制了DNA多聚酶介导的DNA损伤修复作用, 以及使某些蛋白质变性, 故加温可能会逆转肿瘤细胞对某些药物的多药耐药性[6]; (4) 热疗易在肿瘤中心部位达到较高温度, 中心部位在酸性环境下热疗更易诱发肿瘤细胞凋亡[7]; (5) 热化疗能降低肿瘤血管内皮生长因子 (VEGF) 合成与分泌, 破坏与减少肿瘤血管再生[8]。

由此, 我们提出假设:即磁场下热疗是否也可以增强化疗药物对脑胶质瘤细胞的抑制作用, 并对此进行研究, 结果显示, 磁纳米热疗组、化疗组及热化疗组的细胞凋亡率均较对照组有明显升高, 其中热化疗组升高最明显 (35.27%) , 而热疗组及化疗组分别为13.75%及17.60%。由此我们可以看出, 43℃磁纳米热疗和单独化疗均对胶质瘤细胞有抑制杀伤作用, 并且二者存在协同效应。

本实验热疗法采用的是磁纳米技术, 随着其临床应用步伐的加快, 纳米材料的体内残留及其生物毒性的问题越来越受到人们的关注。2003年, Hilger等[9] 指出, 未经修饰的8nm的氧化铁颗粒在低浓度下无细胞毒性作用。颜士岩等[10]研究结果显示, γ-Fe2O3粒子的体外细胞毒性很小, 且无致畸、致突变作用, 证实该材料具有良好的生物相容性。然而也有研究[11]显示出纳米材料的一些毒性特征。本研究将Fe2O3纳米材料浸提液作MTT试验, 结果显示不同浓度的浸提液对于胶质瘤细胞的增殖无明显影响, 细胞毒性分级为 0～1级, 说明本实验使用的纳米材料体外试验对U251细胞无毒性作用。

综上所述, 单纯的磁纳米热疗和单纯化疗均有杀伤胶质瘤细胞的作用, 而热疗联合卡氮芥可以显著提高对细胞的抑制作用, 这为胶质瘤热化疗的临床应用提供了一定理论依据。虽然目前我们只能从实验角度肯定这一结果, 然而研究将磁纳米技术与化疗药物联合作用于脑胶质瘤细胞仍是一次有意义的尝试。

摘要：目的研究在一定强度交变磁场下DMSA@γ-Fe2O3纳米磁流体热疗联合化疗药物卡氮芥对人胶质瘤细胞U251的影响。方法对Fe2O3纳米材料进行体外升温实验, 以期找到热疗 (43℃) 所需的最佳浓度。MTT法评价Fe2O3纳米材料对人胶质瘤细胞U251的毒性作用, 并确定卡氮芥对该细胞的工作浓度。将人胶质瘤细胞U251分为对照组、磁纳米热疗组、化疗组、磁纳米热疗联合化疗组 (简称热化疗组) , 对照组更换培养液后继续培养, 磁纳米热疗组加入适当浓度的Fe2O3浸提液置于磁场下43℃热疗2h, 化疗组加入工作浓度的卡氮芥后继续培养24h, 热化疗组加入上述浓度的卡氮芥后置于于磁场下43℃热疗2h, 采用流式细胞仪观察各组细胞的凋亡情况。结果Fe2O3纳米材料升温效应良好, 当Fe2O3浓度≥8g·L-1时, 温度可达43℃以上。Fe2O3纳米材料对U251细胞毒性为0～1级, 均属对细胞无毒性范畴。以24h时IC10～IC25的药物浓度作为实验的工作浓度, 确定卡氮芥的工作浓度为0.02g·L-1;43℃单独热疗和单独化疗均对胶质瘤细胞有抑制和杀伤作用 (P<0.05) , 而在此温度下磁纳米热疗与药物联合抑制作用均明显强于单独热疗和单独化疗 (P<0.05) ;流式细胞仪结果显示, 对照组、磁纳米热疗组、化疗组、热化疗组细胞凋亡率分别为2.58%、13.75%、17.60%和35.27%。结论交变磁场作用下, 磁纳米热疗 (43℃) 可以明显增强化疗药物卡氮芥对人胶质瘤细胞U251的抑制作用。

关键词：磁流体,交变磁场,人胶质瘤细胞,卡氮芥

参考文献

[1]欧陕兴, 肖湘生, 赖晃文, 等.纳米磁诱导人肝癌Hep-6细胞凋亡的探索性实验[J].中国临床康复, 2003, 7 (20) :2812-2813.

[2]Hilger I, Hiergeist R, Hergt R, et al.Thermal ablation of tumors using magnetic nanoparticles:anin vivofeasibility study[J].Invest Radiol, 2002, 37 (10) :580-586.

[3]颜士岩, 张东生, 顾宁, 等.Fe2O3纳米磁流体热疗治疗肝癌[J].中华实验外科杂志, 2004, 21:1443-1446.

[4]贺莲香, 张阳德, 何剪太, 等.铁磁流体联合交变磁场对人肝癌细胞HepG2的影响[J].中国现代医学杂志, 2007, 09:1042-1043.

[5]刘宝瑞, 钱晓萍.肿瘤热化疗的基础与临床研究进展[J].国外医学肿瘤学分册, 2004, 31 (1) :34-37.

[6]Brozovic A, Simaga S, Osmak M.Induction of heat shock pro-tein70in drug-resistant cells by anticancer drugs and hyper-thermia[J].Neoplasms, 2001, 48 (2) :99-103.

[7]Ohtsubo T, Park HJ, Lyons J C, et al.Effect of acidic environ-ment and p53on apoptosis induction by hyperthermia[J].Int J Hyperthermia, 2000, 16 (6) :481-491.

[8]Sawaji Y, Sato T, Takeuchi A, et a1.Anti-angiogenic action of hyperthermia by suppressing gene expression and production of tumor-derived vascular endothelial growth factorin vivoandin vitro[J].Br J Cancer, 2002, 86 (10) :1579-1603.

[9]Hilger I, Frbauf S, Lin B W, et a1.Cytotoxicity of selected mag-netic fluids on human adenocarcinomacels[J].J Mag Mag Ma-ter, 2003, 261:7-12.

[10]颜士岩, 张东生, 顾宁, 等.肿瘤热疗用Fe2O3纳米磁性粒子的生物相容性研究[J].东南大学学报:医学版, 2005, 24:8-12.