CK-19

CK-19（共6篇）

CK-19 篇1

本文通过免疫组化方法检测p63与CK5及CK19、CEA和SmA在正常涎腺与肿瘤组织的表达,探讨涎腺上皮干细胞可能存在的部位,涎腺上皮与涎腺良恶性肿瘤细胞的表型特点及组织来源。

1 材料与方法

1.1 标本来源及微阵蜡块的制作

从大连市口腔医院病理科收集近10 年保存的石蜡标本69 例,包括基底细胞腺瘤8 例、多形性腺瘤14 例、腺样囊性癌18 例、黏液表皮样癌9 例、低分化腺癌2 例,腺泡细胞癌、乳头状腺癌、恶性多形性腺瘤和肌上皮癌各1 例;另选正常涎腺组织14 例。全部样品均利用自制穿孔针,制成组织芯片。5 μm厚切片裱于载玻璃片备用。

1.2 主要试剂

鼠抗人p63、CK5、CK19、CEA和SmA单克隆抗体;生物素标记的兔抗鼠IgG二抗;DAB显色液。以上试剂均购自上海长岛生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色方法:二步法

试剂使用前需平衡至室温。所有操作在室温中进行。

切片预处理:

石蜡切片:①二甲苯脱蜡,酒精梯度水化;②切片置于10 mmol/L的柠檬酸缓冲液中(pH 6.0)煮10～20 min,然后室温冷却20 min;③切片用3% H2O2 处理5 min。

染色:①用PBS洗3 次,每次2 min; ②加一抗,在4 ℃冰箱过夜; ③用PBS洗3 次,每次2 min; ④加二抗,室温放置30 min; ⑤用PBS洗3次,每次2 min; ⑥DAB显色5～10 min; ⑦苏木精复染,脱水,封片。以PBS代替一抗作为空白对照。

1.4 结果判定

p63染色分为阳性与阴性,以胞核着棕黄色或黄色为阳性,胞核单纯苏木精着色为阴性。CK 5、CK 19、CEA与SmA以细胞质出现棕黄色颗粒或胞膜着棕黄色为阳性,无阳性细胞的瘤组织判为阴性(-),少数浅黄色细胞≤10%为(+),多数细胞着棕黄色>50%为()、介与其间的11%～50%为()。

2 结 果

2.1 p63、CK5、CK19、CEA及SmA在涎腺正常组织的表达

腺泡肌上皮细胞层中大约每10 个腺泡中有1 个细胞呈p63 阳性,导管基底细胞层内约半数细胞p63阳性;腺泡肌上皮细胞层呈CK5阴性或非连续性阳性,CK5阳性细胞数明显多于p63阳性者,导管基底细胞层细胞均呈CK5阳性(图1、2);CK19在导管腔上皮与腺泡腔上皮呈阳性,部分基底细胞也呈阳性;CEA在导管腔上皮呈阳性,腺泡腺上皮有少数阳性;SmA在腺泡、闰管与分泌管外周呈连续性阳性,而在导管腔上皮呈阴性。

2.2 p63、CK5、CK19、CEA、SmA在涎腺上皮性良性肿瘤组织的表达

2.2.1 基底细胞腺瘤

8例有7例 p63阳性(87.50%)。阳性细胞位于瘤细胞群外周部者5 例,中央部2 例(图 3);CK5阳性8 例( 100%),阳性细胞在瘤细胞群外周部者6 例(图 4),散布于整个瘤细胞内2 例;CK19阳性7 例( 87.5%), 6 例阳性细胞位于瘤细胞群中轴部分(图 5),1 例分布于瘤细胞群各部;CEA阳性者1 例( 1.25%),阳性细胞位于瘤细胞群中轴;SmA阳性1 例,阳性率为1.25%,阳性细胞位于瘤细胞群外周部。

2.2.2 多形性腺瘤

在14 例多形性腺瘤中,p63阳性13 例,阳性率92.86%,12 例的阳性细胞位于瘤细胞群外周(图 6),1 例在粘液样区域散在,阴性的1 例,为黏液区组织;CK5阳性13 例(92.86%),10 例见于瘤细胞群中央与外周(包括1 例散在于黏液样区域)(图 7),3 例位于瘤细胞群外周。阴性的1 例主要为黏液区组织;CK19阳性的有12 例(85.71%),阳性细胞为腺管内衬上皮;CEA阳性有7 例(50%),阳性反应见于少数腺管内衬细胞;SmA阳性的有12 例(85.71%),位于腺管外层细胞7 例,在瘤细胞群外周部和中央在分布5 例,2 例SmA阴性。

2.3 p63、CK5、CK19、CEA、SmA在涎腺上皮性恶性肿瘤组织的表达

2.3.1 腺样囊性癌

18 例中p63阳性15 例(83.33%),其中p63阳性细胞在肿瘤细胞巢外周5 例(图 8),在瘤细胞巢中央与外周均有的1 例,部分瘤细胞团索的外周或成簇有2 例,散在分布的7 例;CK5阳性17 例(94.44%),其中10 例在瘤细胞巢各部,2 例在瘤细胞巢外周,3 例在部分瘤细胞巢外周或成簇,还有2 例散在分布(图 9);CK19阳性16 例(88.89%),阳性反应见于瘤细胞巢中央区域者9 例,位于瘤细胞各部者5 例,呈灶状或外周分布1 例,散在分布的1 例;CEA阳性为2 例(11.11%),阳性细胞位于瘤细胞巢各部及散在各1 例;SmA阳性11 例(61.11%),阳性细胞在瘤细胞巢外周3 例,中央部分1 例,各部分均有2例,部分瘤细胞巢外周或成簇3 例,在瘤巢边缘或巢中散在2 例(图 10)。

2.3.2 黏液表皮样癌

粘液表皮样癌共9例,均呈p63阳性(100%),其中有8 例分布在腺管外周、索条边缘及表皮样区,1 例全部都是阳性;CK5有8 例阳性(88.89%),其中4 例在癌巢与腺管外周,3 例癌巢全部都阳性,1 例散在小簇分布;CK19阳性8 例(88.89%),阳性细胞分布在整个腺管;CEA 5 例阳性(55.56%),其中阳性细胞有4 例分布在黏液腺中央部位,1 例在癌巢周边部;SmA 9例均阴性。

2.3.3 低分化腺癌

共2 例,腺泡细胞癌1 例,乳头状腺癌1 例,p63、CK5及SmA均呈阴性;CK19 均呈强阳性,CEA除1 例低分化腺癌外均阳性,腺泡细胞癌SmA阳性,存在于全部腺管。

2.3.4 恶性多形性腺瘤

恶性多形性腺瘤1 例,5 个指标均呈阳性。

2.3.5 肌上皮癌

肌上皮癌1例,p63、CK5及SmA分别在整个瘤细胞团片呈强阳性,CK19与CEA呈阴性。

3 讨 论

p63基因在鳞状上皮的基底层和旁基底层、泌尿道及前列腺与乳腺等的基底细胞表达。p63的重要功能之一是保持干细胞群体的生存[1]。 目前 认为上述组织的干/祖细胞存在于p63阳性细胞群中。CK5在人类皮肤、汗腺、乳腺及前列腺等组织的基底细胞表达, 是这些上皮干/祖细胞的一种标记。 CK19是选择性标记腺管分泌上皮细胞的胞质或胞膜。CEA,即癌胚抗原,用于标记腺管分泌上皮。SmA是平滑肌肌动蛋白,涎腺的肌上皮可表达。

本实验观察到,p63在基底细胞和肌上皮细胞层细胞核中表达;CK5在基底细胞、肌上皮细胞层的胞质和胞膜表达; CK19在腺管腔上皮和部分基底细胞胞质、胞膜表达;CEA只在导管腺上皮胞质中表达;SmA在腺泡、闰管和分泌管外周上皮胞质中表达。已有研究认为,在乳腺、前列腺p63阳性,CK5阳性细胞中间存在有干/祖细胞[2],推测涎腺的这类细胞群中似应存在干/祖细胞。p63阳性的细胞在涎腺导管远多于腺泡。导管的基底细胞层的CK5阳性细胞显著多于p63阳性细胞,提示涎腺干/祖细胞可能主要存在于CK5与 p63阳性的导管基底细胞中。

在正常涎腺组织中观察到:导管基底层有些呈CK5阳性细胞也呈CK19阳性。推测这种兼具基底细胞与腺管腔上皮标记的细胞可能是一种中间型细胞。

多形性腺瘤14 例中的12 例及基底细胞腺瘤8 例中的5 例, p63与CK5阳性细胞多数在瘤细胞巢边缘,类似正常涎腺基底细胞的位置。但p63与CK5阳性细胞也可分布在细胞条索的中间或散在或全部瘤细胞。Bilal等[3]报道,在15 例多形性腺瘤中,有13 例p63核免疫反应呈弥散性着色,有2 例灶性阳性;Weber等[4]报道:在所有梭形或实性团片肌上皮细胞呈p63强着色,管腔上皮细胞偶尔呈p63阳性,在黏液性软骨样区没见到特殊免疫反应; Bilal等[3]观察,4 例基底细胞腺瘤中,p63反应主要在上皮巢边缘栅栏状排列的暗细胞。

在多形性腺瘤和基底细胞腺瘤中,多形性腺瘤14 例中的12 例、基底细胞腺瘤8 例中的6 例,CK19阳性细胞主要位于细胞巢中央或腺管的内衬细胞; 也有一些CK19阳性细胞分布在2 类肿瘤瘤细胞团索的周边,少数病例的瘤细胞组织呈CK19阴性。在多形性腺瘤黏液区呈p63、CK5和CK19,CEA阴性,说明这些区域已倾向间叶组织的分化特征。这也是多形性腺瘤与基底细胞腺瘤不同的一点。

我们观察到, SmA表达在基底细胞腺瘤有7 例阴性,在多形性腺瘤也有2 例不表达,故这2 种瘤是否由于组织芯片取材小而影响观察结果,还有待探讨。

腺样囊性癌共18 例,p63阳性细胞在癌巢中散在分布的7 例,位于腺巢、索或管壁外周的5 例,瘤组织各部均有者1 例,分布在部分巢索或管壁外周或成簇的2 例,Bilal等[3]观察,11 例腺样囊性癌中,肌上皮分化的腔周细胞有弥散的p63强阳性反应; Edwards[5]观察到,15 例中87%着色主要环绕腺腔细胞的非腔但类似腔上皮的细胞,8 例有5 例实性亚型显示强阳性。本文CK5阳性细胞主要分布在巢、索、管壁的各部10 例,也有分布在巢、索或管壁的外周或成簇。CK19阳性细胞主要分布在巢、索或管壁中央有9 例,其次在巢、索、管壁的各部,也有少数外周散在分布的,CEA表达阴性的16 例,仅2 例阳性,阳性细胞位于瘤组织各部或散在。SmA阳性有11 例,在巢、索和管壁的各部、中央及外周散在各种形式均存在,7例阴性。以上结果提示腺样囊性癌分化的多向性,与正常涎腺腺体、多形性腺瘤和基底细胞腺瘤的上皮性细胞区瘤细胞表型有一定相似性,有向基底或腺上皮、肌上皮或中间型细胞分化等不同倾向。

黏液表皮样癌9 例。p63阳性细胞存在于表皮样区域,其形式类似于鳞状上皮,也存在于腺样组织区,位于基底层。CK5阳性细胞,在癌巢周边部较多有4例,位置相当于基底细胞,另外有3 例分布在瘤组织各部,1 例在瘤细胞团片、条索及管壁外周或成簇。CK19阳性细胞多分布于腺样形态的区域。CEA分布较近中央区4例,表明黏液表皮样癌既向表皮,又向腺上皮及二者中间型细胞的双向分化。

我们观察到基底细胞腺瘤、多形性腺瘤和腺样囊性癌可同时表达p63、CK5、CK19、CEA和SmA。虽然p63、CK5主要分布在瘤细胞团、索及管壁外周,CK19、CEA分布在瘤细胞团、索的中央部,但是都可以分布在其它部位。说明这几个肿瘤具有分化表型的多向性,这种多向性是来自于发生这些肿瘤的干/祖细胞分化能力的多潜能性。黏液表皮样癌干/祖细胞具有表达向鳞状上皮与腺上皮分化的双潜能性。腺泡细胞癌、乳头状腺癌,低分化腺癌表现了腺癌干细胞单潜能性。而肌上皮癌表现了癌的肌上皮单向分化。传统认为多形性腺瘤的黏液样与软骨样间叶性物质系由肌上皮产生。但Aigner等利用组化,免疫组化,原位杂交及双标技术检测多形性腺瘤基质的CK、Vim、 胶原与S-100等成分,发现肿瘤许多区域存在具腺上皮与间叶2 种特点的过度性表型,因而认为多形性腺瘤的间叶成分可能是腺上皮产物[6]。在多形性腺瘤,我们还观察到它的黏液区p63、CK5、CK19、CEA和SmA均呈阴性,提示该区肿瘤细胞已经丧失上皮表型而具有间叶性质。

参考文献

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CK-19 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年4月至2011年2月大连医科大学附属第一医院收治的相关患者。恶性肿瘤组55例:男31例, 女24例, 年龄30~77岁;其中腺癌40例, 鳞癌14例, 大细胞癌1例。所有病例均经病理检查证实。患者采血前均未行化疗或放疗。对照组包括肺部良性病变组30例:男18例, 女12例, 年龄23~74岁;其中肺炎19例, 肺结核球4例, 炎性假瘤7例。正常健康对照组30例:男15例, 女15例, 年龄21~69岁, 均无心、肝、肺等器质性疾病史。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

在Gene Bank查找Survivin m RNA、CK19m RNA和β-actin m RN (内参) 基因序列, 经Primer5.软件辅助设计引物。引物由大连宝生物公司合成。

1.2.2 标本采集及Total RNA的提取

用枸橼酸钠抗凝经去酶处理的采血管, 取患者晨空腹肘静脉血2.0 ml。

淋巴细胞分层液分离核细胞, RNAiso Plus细胞裂解液裂解, 氯仿、异丙醇进一步抽提总RNA。总RNA用紫外分光光度计定量, 并行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 加入适量RNase-free灭菌水分装-80℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR

逆转录反应条件42℃30 min、95℃5 min、5℃5 min。在PCR反应仪中进行。反应产物-20℃保存备用。PCR扩增反应条件94℃5 min, 变性94℃30 s, 72℃延伸1 min, 共进行30个循环, 最后72℃延伸5 min, Survivin m RNA复性62℃30 s, CK19 m RNA63℃30 s, β-actin m RNA56℃30 s。

1.2.4 RT-PC产物结果鉴定

取PCR产物5μL及5μl DNA Marker, 1%琼脂糖凝胶电泳, EB染色, 经紫外凝胶荧光成像系统分析, CK19 m RNA表达阳性者在460bp处出现条带, Survivin m RNA表达阳性者在439 bp处出现条带, β-actin产物在260 bp出现条带。

1.3 统计学方法

应用SPSS V17.0统计软件包处理, 用χ2检验分析计数资料之间的比较, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总RNA鉴定

实验中所抽提取的总RNA, 其检测的OD260/OD280值为1.8~2.2之间。用1.0%琼脂糖凝胶电泳及EB染色分析可见28 s、18 s、5 s三条带, 表明完整性良好。

2.2 RT-PCR扩增图

用大连宝生物公司的DNA Marker D (100 bp-2 000 bp) 作为相对分子量的质量标准, 电泳结果可显示5条带 (100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp) 。指标Survivin m RNA的扩增产物为439bp;CK19 m RNA大小为460bp;以β-actin m RNA268bp作为内参照, 其在本实验所有标本中均稳定表达。阳性表达电泳图表现为439bp或460bp处出现亮带。

2.3 3组外周血Survivin m RNA的表达情况比较

在55例非小细胞肺癌组中有34例可见Survivin m RNA表达, 表达率为61.82%;肺良性病变组仅2例Survivin m RNA表达, 表达率6.7% (2/30) ;健康对照组无阳性表达 (0/30) 差异有统计学意义 (P=0.00) 。Survivin m RNA在TNM分期差异具有统计学意义 (P=0.004) 。不同病理类型中, Survivin m RNA的阳性率差异无统计学意义 (P=0.446) 。不同年龄组, Survivin m RNA阳性率差异无统计学意义 (P=0.701) 。不同性别组的非小细胞肺癌患者, Survivin m RNA阳性率差异无统计学意义 (P=0.193) 。详见表1。

2.4 3组外周血CK19 m RNA的表达情况比较

非小细胞肺癌组CK19 m RNA的表达阳性率为49.09%, 良性病变组CK19 m RNA的表达率为16.67%, 健康对照组均未见CK19m RNA的表达, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。CK19 m RNA的表达与TNM分期有关 (P=0.009) 。组织不同病理类型中, CK19 m RNA的阳性率差异无统计学意义 (P=0.214) 不同年龄组CK19 m RNA阳性率差异无统计学意义 (P=0.891) 。不同性别组, CK19 m RNA阳性率差异无统计学意义 (P=0.333) 。见表1。

2.5 Survivin m RNA联合CK19 m RNA检测的灵敏性、特异性和准确性

单一Survivin m RNA、CK19 m RNA灵敏性分别为61.82%和49.09%, 两者联合检测的灵敏性为80%, 准确性85.22%, 高于任一单一指标的检测。各组之间灵敏性、准确性的差异有统计学意义 (P<0.05) , 特异性无统计学意义 (P>0.05) 。有一定的临床意义。见表2。

3 讨论

肿瘤早期发现和早期诊断是肿瘤防治的关键, 肿瘤标志的研究与应用对肿瘤诊断及指导临床治疗有重要价值。检测外周血中肿瘤分子标志物, 有可能提高肿瘤的早期诊断率。有研究证实, 非小细胞肺癌患者血循环中微转移阳性的, 生存期明显缩短, 预后差[2]。因此在外周血中能找到有助于非小细胞肺癌早发现、早诊断的肿瘤标志物具有重要的临床意义。

Survivin是一种凋亡抑制蛋白, 是目前发现的最具特异性的凋亡抑制因子之一[3]。其特异性高表达于肿瘤组织, 正常分化的组织则不表达[4]。该特性决定了其可能为理想的肿瘤标记物, 并成为肿瘤鉴别诊断以及判断预后等研究的新热点。Yie等[5]研究发现, Survivin表达阳性者具有较高的复发率, 生存期较短;通过多因素分析, Survivin是癌症复发的独立预测因子。CKl9是上皮及上皮性细胞肿瘤的较为敏感、特异性的标记物[6]。90年代开始, CK19 m RNA被广泛用来检测源于上皮组织的肿瘤患者微转移的研究, 特别是非小细胞肺癌患者[7,8]。本研究发现Survivin、CKl9 m RNA的阳性率在NSCLC组、肺良性病变组, 健康对照组中均存在显著性差异, 二者显示了其在肿瘤早期诊断中的潜在价值。Survivin m RNA灵敏性明显高于CKl9 m RNA。随着TNM分期的增高, Survivin或CKl9 m RNA阳性表达率也显著增加, 提示其与患者的预后息息相关。但单一肿瘤标记物的检测存在一定的局限性, 通过同时检测多种特异性标志物, 可能避免出现假阴性和假阳性。本实验联合检测Survivin m RNA和CK19 m RNA在外周血中表达情况, 分析它们与临床病理因素之间的关系。联合检测的灵敏性达78.19%, 准确性达85.22%。故选择适宜的联合检测, 可提高NSCLC早期检出率, 及早发现微转移。

摘要：目的 通过对非小细胞肺癌 (Non-small cell lung cancer, NSCLC) 患者外周血生存素 (Survivin) mRNA及细胞角蛋白19 (CK19) mRNA的检测;探讨其对NSCLC诊断的临床价值和意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应法 (RT-PCR) 检测55例非小细胞肺癌患者、60例对照组的外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA的表达情况。结果 Survivin mRNA和CK19 mRNA在NSCLC组的阳性率显著高于对照组 (P<0.01) 。阳性表达率与临床TNM分期有关 (P<0.01) , 与性别、年龄、病理组织类型无关 (P>0.05) 。Survivin mRNA和CK19 mRNA联合检测, 高于任一单一指标的检测 (P<0.05) 。结论 外周血Survivin、CK19 mRNA可作为早期辅助诊断NSCLC及微转移的一个有价值的肿瘤标志物。联合检测有较高的检出率。

关键词：Survivin mRNA,CK19 mRNA,非小细胞肺癌

参考文献

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CK-19 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

选取佛山市顺德区中医院145例2007年6月~2012年6月的外科手术标本,其中甲状腺乳头状癌85例,男性24,女性61例,年龄21~76岁;结节性甲状腺肿30例,男性8例,女性22例,年龄21~54岁;甲状腺腺瘤30例,男性6例,女性24例,年龄25~56岁。试剂鼠抗人CK19单克隆抗体、鼠抗人Galectin-3单克隆抗体、SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2 方法

将手术切除的145例甲状腺手术标本标本经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,切片厚度4µm。免疫组化染色步骤按试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作为阴性对照,采用已知的阳性切片作阳性对照。

1.3 判断标准

CK19和Galectin-3阳性信号均为胞质内出现棕黄色颗粒,部分Galectin-3在胞核中有表达。在镜下观察,根据棕色反应的阳性强度及细胞数量判断结果。取表达最强的部分,按着色程度分为:基本未着色为0分;着色浅为1分;中度着色为2分;强染着深棕色者为3分。阳性细胞数<10%为0分,10%~50%为1分,51%~75%为2分,>75%为3分。两项相加后0~1为(-),2分为(+),3~4分为(++),5~6分为(+++),2分以上为阳性。

1.4 统计学处理

采用SPSS11.0软件包处理,以(+)以上为免疫组化阳性组,多组数据阳性率的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 甲状腺良恶性病变中CK19和Galectin-3的表达结果

CK19和Galectin-3在甲状腺乳头状癌的阳性表达分别为97.6%和98.8%,且大部分为弥漫强阳性,在结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤的表达分别为13.3%和16.7%、23.3%和20%,且均为弱阳性,详见表1。CK19和Galectin-3在甲状腺良性病变与恶性病变间比较,差异均有显著性(P<0.001)。

2.2 CK19和Galectin-3标记共同表达与甲状腺良恶性病变的关系

见表2。在乳头状癌中几乎所有病例均有CK19、Galectin-3两种标记表达,并且绝大多数呈中强阳性表达;而在结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤中约70%病例CK19、Galectin-3两种标记均不表达,更是极少出现2种标记同时表达,差异均有显著性(P<0.001)。

3 讨论

近年来,许多学者对CK19在甲状腺良恶性病变中的表达做了大量的研究工作。Theresa等[1]研究认为CK19在甲状腺乳头状癌的阳性表达率为96%,且均为敏感的和特异的。国内学者何蕊娉[2]也认为在甲状腺良性病变中CK19多为阴性,仅少数阳性表达,即使结节性甲状腺肿和甲亢的乳头状增生结节大多亦为阴性,而乳头状癌不论经典型还是滤泡型基本都是中、强阳性表达。但也有学者有不同的意见。Peyrottes等[3]研究显示,CK19在甲状腺乳头状癌中几乎100%表达,但在良性病变中也有很高的表达,认为CK19不能单独应用于甲状腺乳头状癌的诊断。我们的研究结果CK19在甲状腺乳头状癌的阳性表达率为97.6%,且大部分为为弥漫强阳性,在结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤中的表达分别为13.3%及16.7%,且均为弱阳性。本研究提示CK19在甲状腺乳头状癌的诊断及鉴别诊断中起重要作用,尤其当出现中至强阳性表达时非常有帮助。

Galectin-3是一种分子量为26000的β-半乳糖苷结合蛋白,属于植物血凝素家族[4~7]。近年来的大多数学者的研究结果表明,Galectin-3在甲状腺乳头状癌中具有很高的表达水平[8,9,10]。我们的研究结果Galectin-3在甲状腺乳头状癌的阳性表达率为98.8%,且大部分为弥漫强阳性表达;在结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤中的表达分别为23.3%及20%,且均为弱阳性。此结果显示Galectin-3在甲状腺良恶性病变中的表达有明显差异性。

另外,我们还发现CK19、Galectin-3联合检测在甲状腺良恶性病变的的诊断及鉴别诊断上的作用更加明显,2种标记均阳性表达在乳头状癌中达98.8%,且绝大多数呈中、强阳性表达,在结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤中仅为6.8%和10%,而2种标记无一表达的在甲状腺良性病变中高达70%,在甲状腺乳头状癌中无一例病例。

综上研究证实,CK19和Galectin-3均为有效的标记物,联合使用对于甲状腺乳头状癌的诊断具有较高的实用价值,值得在临床实践中推广应用。

参考文献

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CK-19 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2007年9月-2011年9月在本科行结直肠根治性切除40岁以下结直肠癌患者30例行根治术,排除合并其它脏器肿瘤或术前行辅助化疗的病例。其中男17例,女13例;所有病例临床病理特征根据1997年UICC淋巴结分类,Ⅰ期5例,Ⅱ期13例,Ⅲ期7例,Ⅳ期5例。共采集肿瘤标本的30例,淋巴结108个。另取同期因良性结直肠疾病(结直肠息肉、憩室等)手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组。每个新鲜淋巴结标本平均分为两块(每次切开淋巴结之前,用生理盐水冲洗刀片,以免造成污染),一块用福尔马林固定,石蜡包埋后切片行常规病理检查(HE染色);另一块经液氮速冻后-80 ℃保存用于提取RNA。对于常规病理检查无淋巴结转移患者的淋巴结标本提取RNA。

1.2 引物设计

引物由上海生工公司合成。CK19引物的序列设计为5′-AAGAAAACCCGAAGAGGCC-3′,5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′,引物长度221 bp。

1.3 总RNA抽提及鉴定

30例结直肠癌组织,108枚淋巴结和20例正常组织分别加入提起试剂(Invitrogen)1 ml,电动匀浆1～2 min,匀浆液室温放置5 min后加氯仿200 μl,震荡15 s,12000 r/min,4 ℃离心15 min。上层水相移入另一个Eppendorf管中,加入异丙醇500 μl混匀室温放置10 min。4 ℃ 12000 r/min,离心15 min,弃掉上清,加1 ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀,7500 r/min, 4 ℃离心5 min,弃掉上清。

1.4 RT-PCR 在美国产MJ-Research扩增仪上,将反应体系混匀后进行扩增,逆转录体积为50

μl。扩增步骤如下:(1)42 ℃孵育30 min;(2)95 ℃孵育3 min;(3)95 ℃预变性10 s;(4)55 ℃预变性30 s;(5)72 ℃ 1 min ;(6)重复3～5步骤4次;(7)95 ℃预变性5 s;(8)60 ℃预变性30 s;(9)读取;(10)重复7～9步骤35次;(11);40 ℃预变性1 s。用紫外分光光度仪定量观察并照相记录结果。

1.5 统计学处理

统计学处理应用软件SPSS 13.0完成,计数资料采用χ2分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

患者常规病理组织学方法检查确诊为结直肠癌患者,RT-PCR法同时检测30例结直肠癌患者大体标本均有CK19 mRNA表达;108个淋巴结中有47个存在CK19 mRNA阳性表达,阳性率为43.5%;常规病理检查有25枚有癌转移,阳性率为23.2 %。RT-PCR方法和常规病理(HE染色)方法比较差异有统计学意义(P<0.05);20例良性病变患者30枚淋巴结中CK19 mRNA表达均为阴性。CK19 mRNA在结直肠癌组织及淋巴结中表达见图1。

注:M为marker; C 为肿瘤组织;L为淋巴组织

3 讨论

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一。在我国近20年来尤其在大城市发病率明显上升,且有年轻化趋势。虽然目前结直肠癌治疗疗效较过去已经明显提高,但复发和转移依旧是治疗失败的主要原因之一,常规病理未发现淋巴结转移,术后复发率高达近一半[2]。微转移是指在非血液系统恶性肿瘤的发展过程中,播散并存活于淋巴系统、骨髓等组织器官中的微小瘤灶,常无临床表现,而这些微小瘤灶正是造成肿瘤转移或复发的重要原因之一,也是目前肿瘤防治中被关注热点之一。目前学术界公认的肿瘤转移概念,分为四种:常规病理HE染色认定的病灶大于2 mm称为转移(metastasis);0.2 mm<病灶<2 mm称为微转移(micrometastasisMM);小于0.2 mm的病灶定义为亚显微转移;在单个淋巴结中只有一个转移癌细胞则称为冬眠癌细胞。目前研究认为,可能是淋巴系统、骨髓、肝等组织器官中的微小瘤灶导致结直肠癌临床无法及时和正确治疗。故淋巴结转移是影响结直肠癌预后的最主要因素之一。传统病理学检查是通过对其具有代表性的一个切面经HE染色作普通光镜检查得知的,阳性率较低,漏诊率较高。文献报道漏诊率高达10%～30% [3]。故寻求高特异性、高敏感性,能准确判断淋巴结有无早期转移具有重要临床意义。随着分子生物技术发展,利用分子生物技术可以发现常规HE染色不能发现的单个癌细胞,正是因为这些微转移可能发展为致命显性,因此微转移的检测目前为人们重视并成为肿瘤研究热点。近年来,随分子生物技术进步,RT-PCR方法因其高度敏感性成为目前监测微转移最令人瞩目的方法。本文试图探讨RT-PCR检测CK19 mRNA在诊断青年(40岁以下)结直肠癌患者区域淋巴结微转移的价值及其应用前景。

RT-PCR技术具有敏感性高、特异性强,简单快速的优点。可在106～107个正常细胞中检测出1个癌细胞[4,5]。其检测结果直观,易于判断,避免常规病理学检测时带有的主观性。又因结直肠癌是常见的来源于上皮组织的恶性肿瘤之一,CK是上皮细胞骨架的组成成分,表达在正常的上皮及上皮源性肿瘤及其转移肿瘤细胞,CK家族由分子量为40×103 U～68×103 U不等的20个成员组成。CK19常见的角蛋白之一,它非常局限在胃肠上皮细胞,几乎所有结直肠癌都明显的表达。CK19是上皮细胞细胞的标志性基因,已有研究表明CK19在结直肠癌细胞株的表达高达100%,且在侵袭、转移、扩散到其它组织器官始终保持稳定性。故可作为结直肠在淋巴结、骨骼和外周血等间叶组织转移的标记物。因其具有较高的敏感性和特异性而被应用于肿瘤微转移的检测。正常淋巴组织中不表达,结直肠癌区域淋巴结阳性表达表示存在转移,通过检测CK19的表达可监测结直肠癌淋巴转移。本研究利用RT-PCR方法检测结直肠癌区域淋CK19的表达,阳性率为43.5%;常规病理检查,阳性率为23.2 %;良性病变患者表达为阴性,表明RT-PCR技术可以很大程度提高检测的敏感性,降低假阴性。本研究显示,CK19 mRNA在癌组织、有转移的淋巴结中有表达,而在非肿瘤的正常淋巴结不表达,说明CK19 mRNA特异性高,因此CK19可作为结直肠癌区域淋巴结微转移特异性指标。

应用RT-PCR检测CK19 mRNA,对30例结直肠癌患者的癌组织标本和108个淋巴结进行检测,检测良性结直肠疾病(结直肠息肉、憩室等)手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组。结果表明30例结直肠癌患者均有CK19 mRNA表达,108个淋巴结中有47个存在CK19 mRNA阳性表达,阳性率为43.5%;常规病理检查有25枚有癌转移,阳性率为23.2 %;20例良性病变患者30枚淋巴结CK19 mRNA表达为阴性。提示RT-PCR方法对检测CK19 mRNA具有很高特异性,目前应尽可能在临床上推广应用这一方法。结直肠癌常规病理淋巴结检测率阳性率只有23.2%,而RT-PCR技术阳性率高达43.5%,表明该技术对结直肠癌淋巴结微转移检测具有高敏感性,因结直肠癌淋巴结转移直接影响结直肠癌预后,提示手术中应规范行淋巴结切除,术后对高危患者要采取即时、适当的综合治疗,如对结直肠癌行新辅助放化疗及辅助化疗,规范化疗、联用靶向治疗药物。许多研究表明,微转移的患者预后明显差于无转移者,无淋巴转移结直肠癌患者,五年生存率高达90%,反之则减半[6]。 本研究通过RT-PCR法扩增检测K19 mRNA来判断结直肠癌淋巴结微转移比常规病理组织学检查敏感且特异性高,可测出低水平表达的CK19 mRNA,及时发现常规病理无法发现的淋巴结隐匿转移即微转移,筛选出高度复发危险的患者,提高了淋巴结转移诊断率,有助于对淋巴结转移灶作出早期诊断,提高肿瘤分期准确性从而更好地制定术后个体性化疗方案。早期结直肠癌患者,只要淋巴结发现有微转移,则预后差,术后需要行化疗等综合治疗,而不存在淋巴结微转移,术后可不化疗,从而可以节省社会医保资源,减轻患者痛苦。

摘要：目的 利用RT-PCR检测CK19 mRNA技术,从分子水平探讨在青年结直肠癌患者区域淋巴结微转移的价值及临床意义。方法 采用RT-PCR扩增,对角蛋白CK19检测。对30例结直肠癌患者的癌组织标本和108个淋巴结进行检测,检测良性结直肠疾病(结直肠息肉、憩室等)手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组,同时行常规病理检查。结果 30例结直肠癌患者均有CK19 mRNA表达,108个淋巴结中有47个存在CK19 mRNA阳性表达,阳性率为43.5%;常规病理检查有25枚有癌转移,阳性率为23.2%;20例良性病变患者30枚淋巴结CK19mRNA表达为阴性。结论 RT-PCR扩增CK19 mRNA检测结直肠癌区域淋巴结微转移,是一种敏感而特异性的检测方法,对青年结直肠癌患者指导治疗,有较大的临床意义。

关键词：青年结直肠癌,微转移,淋巴结,聚合酶链反应

参考文献

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[5] Walker J,Quirke P.Prognosis and response to thempy in colorectal cancer[J].Eur J Cancer, 2002,38(7):880-886.

CK-19 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2007年1月至2012年4月收治的175例甲状腺良恶性肿瘤患者,其中,男性46例,女性129例,年龄23~75岁,平均年龄42.6岁。所有甲状腺肿瘤患者中,118例(67.43%)为甲状腺癌,包括111例乳头状癌和7例滤泡癌,57例(32.57%)甲状腺良性肿瘤,包括30例甲状腺腺瘤,18例结节性甲状腺肿和9例慢性淋巴细胞性甲状腺炎。

1.2 方法

将所有肿瘤组织标本用10%中性福尔马林固定,常规处理后石蜡包埋,制成厚度为3µm的连续切片,给予常规HE染色。采用EnVision对CK19、Galecin-3和TPO进行染色,用DAB显色,苏木素复染。阳性对照选择已知阳性的组织切片,阴性对照用磷酸盐缓冲液取代一抗。

1.3 结果判断

由两名医师独立阅片,分别对免疫组化结果进行记录,细胞质出现棕黄色颗粒未阳性。CK19、Galecin-3的半定量判断方法为,未见阳性细胞为阴性(-);阳性细胞<30%为弱阳性(1+);阳性细胞达30%~60%为中等阳性(2+);阳性细胞>60%为强阳性(3+)。TPO的半定量判断方法为,阳性细胞<30%为阴性(-);阳性细胞达30%~50%为弱阳性(1+);阳性细胞达50%~75%为中等阳性(2+);阳性细胞>75%为强阳性(3+)。

1.4 统计学方法

运用SPSS13.0统计学软件对数据进行处理,计数资料采用卡方检验或确切概率法,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

比较甲状腺良、恶性肿瘤患者肿瘤组织中CK19、Galecin-3和TPO表达情况,甲状腺恶性肿瘤患者肿瘤组织中CK19、Galecin-3表达明显高于甲状腺良性肿瘤患者,而TPO表达明显低于甲状腺良性肿瘤患者,差异均具有统计学意义(P<0.05),分别见表1、2、3。

*与甲状腺良性肿瘤相比,P<0.05差异具有统计学意义

*与甲状腺良性肿瘤相比,P<0.05差异具有统计学意义

*与甲状腺良性肿瘤相比,P<0.05差异具有统计学意义

3 讨论

在甲状腺肿瘤的临床病理诊断过程中,由于HE染色的灵敏度和特异性有限,因此仅依靠HE染色对甲状腺肿瘤的不典型病变进行诊断的结果是不可靠的。近年来,临床研究人员通过对甲状腺良恶性肿瘤组织特异性肿瘤分子表达的差异,分析并总结了一些与甲状腺肿瘤良、恶性相关分子标志物[2,3]。本文研究的CK19、Galecin-3和TPO就是这类肿瘤标志物。

CK19在甲状腺乳头状癌中表达增加,在所有乳头状癌的亚型中均可检测到CK10的表达。而甲状腺滤泡状癌也可以表达CK19,虽然表达强度不如乳头状癌,但显著高于甲状腺良性滤泡性病变。Galecin-3是galecin家族蛋白之一,与细胞的生长、分化、黏附、凋亡等生理功能以及肿瘤的侵袭和转移密切相关。临床研究显示,Galecin-3在淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中具有较高表达。上世纪末,研究学者首次发现Galecin-3在甲状腺恶性肿瘤中具有较高表达。本文研究结果也证实了这一点,甲状腺恶性肿瘤患者的肿瘤组织Galecin-3表达显著增加,与甲状腺良性肿瘤患者相比差异显著。TPO蛋白是自单克隆抗体MoAb47应用以来受到临床研究人员普遍关注的分子标志物。TPO对鉴别甲状腺良恶性肿瘤的敏感性与特异性均较高。

本文通过对我院2007年1月至2012年4月收治的175例甲状腺良恶性肿瘤患者肿瘤组织CK19、Galecin-3和TPO蛋白表达情况的检测,分析其在甲状腺良恶性肿瘤病理诊断中的价值。研究结果显示,甲状腺恶性肿瘤患者肿瘤组织中CK19、Galecin-3表达明显高于甲状腺良性肿瘤患者,而TPO表达明显低于甲状腺良性肿瘤患者,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

由此可见,在甲状腺人性肿瘤中CK19、Galecin-3的表达显著升高,而TPO蛋白表达显著降低,甚至出现缺失现象。将CK19、Galecin-3和TPO三种分子标志物联合检测能较准确地对甲状腺良恶性肿瘤进行诊断,具有较高的临床应用价值。

摘要：目的 分析并探讨CK19、Galecin-3和TPO表达在甲状腺良恶性肿瘤病理诊断中的价值。方法 对我院2007年1月至2012年4月收治的175例甲状腺良恶性肿瘤患者进行免疫组化检测CK19、Galecin-3和TPO蛋白的表达情况。结果 甲状腺恶性肿瘤患者肿瘤组织中CK19、Galecin-3表达明显高于甲状腺良性肿瘤患者,而TPO表达明显低于甲状腺良性肿瘤患者,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 在甲状腺恶性肿瘤中CK19、Galecin-3的表达显著升高,而TPO蛋白表达显著降低,甚至出现缺失现象。将CK19、Galecin-3和TPO三种分子标志物联合检测能较准确地对甲状腺良恶性肿瘤进行诊断,具有较高的临床应用价值。

关键词：CK19,Galecin-3,TPO,甲状腺良恶性肿瘤,病理诊断

参考文献

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CK-19 篇6

1资料与方法

1.1一般资料:选取2013年9月至2014年9月我院进行切除甲状腺的的60例甲状腺乳头状癌患者的标本,切除甲状腺的的60例甲状腺滤泡性腺瘤患者的标本,患者年龄25~60岁,平均年龄(45±3.8)岁。由两名资深且经验丰富的病理医师进行检测。

1.2诊断方法:对120份标本进行固定,使用10%的福尔马林,进行常规的组织处理,用石蜡包埋,切片呈4μm,使用HE进行染色。选用德国的自动免疫组化染色仪,使用En Vision二步方法,34βE12、CK19、TPO进行染色处理,使用DBA显色,使用苏木精复染色,已知阳性的切片作为对照,PBS做阴性对照。本研究使用美国Antibody diagnostical公司的的鼠抗人的34βE12单克隆抗体、鼠抗人的CK19多克隆抗体、TPO单克隆抗体。

1.3判断标准:细胞质或者细胞膜上有黄棕色颗粒出现,为阳性细胞。每个切片选取五个×400的视野,计算每个视野中的阳性细胞在总细胞中所占的比例。取每个视野中的阳性细胞在总细胞中所占的比例的平均值。着色的细胞比例占到50%及以上的标本记为+++,着色的细胞比例占到25%~50%的标本记为++,着色的细胞比例占到10%~25%的标本记为+,没有细胞着色或者着色的细胞比例占到10%的标本记为阴性。

1.4统计学处理:所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计分析,计数资料以百分率(%)表示,使用χ2进行检验,P<0.05表示为差异有统计学意义。

2结果

2.1阳性及阴性检查结果,见表1。

2.2阳性检出率的对比:34βE12在甲状腺乳头状癌的患者中的表达率为96.3%,CK19在甲状腺乳头状癌的患者中的表达率为98.1%,TPO在甲状腺乳头状癌的患者中的表达率为94.3%。见表2。

3讨论

甲状腺乳头状癌是常见的恶性肿瘤疾病之一,极大地影响并威胁着人们的健康。对于甲状腺乳头状癌的早期诊断、治疗工作的开展,则成为提高健康水平的重要条件。在我国,甲状腺乳头状癌在恶性肿瘤居于上升趋势。我们对于甲状腺乳头状癌的了解也越来越多,诊断方法也是不断优化。

本研究分析2013年以来在我院诊断的甲状腺乳头状癌患者60例,甲状腺滤泡性腺瘤60例,均进行34βE12、CK19、TPO的抗体检测,对比观察阳性表达率。34βE12在甲状腺乳头状癌的患者中的表达率为90.3%,高于在甲状腺滤泡性腺瘤的患者中的表达率3.3%。CK19在甲状腺乳头状癌的患者中的表达率为90.1%,与在甲状腺滤泡性腺瘤的患者中的表达率80.3%,差别很小。TPO在甲状腺乳头状癌的患者中的表达率为2.3%,在甲状腺滤泡性腺瘤的患者中的表达率为90.11%。形态学检查是常见的常规检查方法,但受到病变部位的影响和分辨的影响,应用起来有一定的局限性。诊断中能否无误的区分出增生明显的腺瘤样的结节和滤泡型的甲状腺乳头状癌,这是个很重要的问题。我们考虑在以后的诊断中,可以将34βE12、TPO联合使用,互相补充,发挥各自方法的优点,从而大大提高诊断的准确率。

综上所述,采用34βE12与TPO在甲状腺乳头状癌的诊断中应用效果较高,检查更加可靠,更加利于病理医师的诊断。具有较高的临床应用价值,值得推广。

注:三种方法的检出率进行比较,相互间的差异有统计学意义,P<0.05

摘要：目的 探讨分析34βE12、CK19、TPO在甲状腺乳头状癌诊断中的应用及效果。方法 分析在我院诊断的甲状腺乳头状癌患者60例,甲状腺滤泡性腺瘤60例,均进行34βE12、CK19、TPO的抗体检测,对比观察阳性表达率。结果 34βE12在甲状腺乳头状癌的患者中的表达率为90.3%,高于在甲状腺滤泡性腺瘤的患者中的表达率3.3%。CK19在甲状腺乳头状癌的患者中的表达率为90.1%,与在甲状腺滤泡性腺瘤的患者中的表达率80.3%,差别很小。TPO在甲状腺乳头状癌的患者中的表达率为2.3%,在甲状腺滤泡性腺瘤的患者中的表达率为90.11%。结论 34βE12与TPO在甲状腺乳头状癌的诊断中应用效果较高,检查更加可靠,具有较高的临床应用价值,值得推广,CK19意义不大。

关键词：34βE12,CK19,TPO,甲状腺乳头状癌,甲状腺滤泡性腺瘤

参考文献

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