Smad

Smad（共7篇）

Smad 篇1

骨缝牵张成骨 ( suture distraction osteogenesis, SDO) 是通过扩张装置对骨缝施加张应力, 使骨缝逐渐增宽并改变骨缝的生长趋势, 达到矫治颅面畸形的目的。动物实验证实, 对颅面骨缝施加牵张力能加速骨缝边缘新骨再生与沉积［1 －2］, 可见机械应力刺激是诱导颅颌面骨缝生长改建的一个重要因素, 但骨缝内的组织细胞是如何将力学信号转化成生物化学信号的分子生物学机制仍不清楚。Smad分子是TGF-β 超家族信号分子在细胞内信号转导的始动因子, Smad蛋白在骨骼的发育和再生中发挥着重要的作用, 但Smad是否在SDO过程中起到调节作用还不清楚。本实验建立大鼠颅骨矢状缝体外培养模型, 观察Smad信号通路分子在受力颅骨缝内的时空表达情况, 初步探讨该通路在SDO中的作用。

1 材料和方法

1. 1 矢状缝牵张模型的建立

根据Ikegame［3］的设计原理, 使用0. 28 mm正畸用圆不锈钢丝 (Rocky Mountain, Denver, CO, USA) , 加工成臂长5 cm、缠绕6 圈的螺旋弹簧。调整弹簧力臂端间距, 当两尖端间距压缩至10 mm时产生的张力约为0. 2 g。

取出生7 d SD大鼠72 只, 无菌条件下解剖出颅骨矢状缝 (范围5 mm × 10 mm, 包括两侧顶骨及完整硬脑膜) , PBS冲洗后放入盛有不含血清BGjb培养基 (medium Gibco, USA) 的24 孔板中, 先在孵箱 (37 ℃, 5% CO2, 95%湿度) 中培养, 1 h后取出组织块, 在骨缝中央部位, 用圆规标出距骨缝边缘两侧各5 mm处的颅骨上, 用7 号针头穿刺形成2 个小孔, 将加工弹簧的2 个长臂尖端分别插入骨缝两侧的骨孔中, 由于弹簧向两侧的扩张作用而使骨缝扩宽。加力弹簧放妥后盖上培养皿进行固定培养 (图1A ~ B) 。将16 块颅骨设为空白对照 (不加力) , 剩余颅骨均用加力弹簧固定于骨缝两侧进行加力, 再放入孵箱内进行器官培养［3］。

1. 2 Smad2、Smad3 的RT-PCR检测

取8 只未加力大鼠颅骨矢状缝为对照组, 于加力开始的0、10、20、40、80 min后分别取8 只大鼠颅骨矢状缝作为实验组。在体视显微镜下剪出骨缝组织, 磨碎后加入1 ml Trizol。4 ℃、12 000 r/min离心20min, 弃上清液, RNA沉淀于管底。提取细胞总RNA, 并用RevertAidTM试剂盒 (Femerltas, Lihuania) 逆转录成cDNA。取逆转录产物进行实时荧光定量RT-PCR (ABI Prism 7700, USA) 。PCR反应条件为:94 ℃ 2min, 53 ℃ 20 s, 60 ℃ 40 s, 共43 个循环。

所用引物如下:Smad2 上游引物:5'-AGCATGTC-CTAAAGTCCGTCAGCA-3'; 下游引物: 5'-TTTGAC-TAGCACAGTCCACGGGAT-3'; Smad3 上游引物5'-ACCTAGCACAGGCTCTTTGGATGT-3'; 下游引物: 5'-TTTCATTTGCCCATGTCAGCCTGG-3'; GAPDH上游引物:5'-ACAAGATGGTGAAGGTCGGTGTGA-3'; 下游引物:5'-AGCTTCCCATTCTCAGCCTTGACT-3'。

1. 3 组织学与免疫组织化学染色

取8 只未加力大鼠矢状缝, 以及加力培养结束后的20 min分别取8 只大鼠颅骨矢状缝作为检测标本。将骨缝组织块在4% 多聚甲醛中4 ℃ 固定1 h, 10%EDTA脱钙, 逐级脱水、透明, 石蜡包埋, 7 μm切片抗体 (Cell Signaling Technology, USA) 和SABC二抗试剂盒抗原孵育 (博士德, 武汉) 。常规组织学切片用H&E染色。免疫组织化学染色根据说明书, 使用抗大鼠单克隆Smad2, Smad3 DAB显色。将切片置于光镜下观察, 以棕色颗粒为阳性染色。随机选择高倍视野 (400倍) , 计算视野内阳性与阴性染色细胞的百分比, 每张切片随机选5 个视野, 求其均值。同时根据细胞阳性染色强度以+ ~++++ 进行半定量评价。

1. 4 统计学处理

用SPSS 11. 0 软件对每一时间点的加力组和未加力组样本检测数据进行组间方差分析, P <0. 05 表示差异具有显著性。

2 结果

2. 1 大体标本与组织学观察

正常对照动物 (未加力) 的颅骨矢状缝与加力组骨缝的体视显微镜 (图1C ~ D) 及组织学影像显示:通过用螺旋弹簧给大鼠矢状缝施加张应力后, 其颅骨缝宽度扩张明显 (约为原来的3 倍宽) , 光镜下发现增宽的骨缝内有成骨征象, 可见较多的成骨细胞聚集在骨缝边缘 (图2) 。

2. 2 RT-PCR检测结果

大鼠颅骨矢状缝受牵张力作用后, Smad2 和Smad3 在各时间点均有表达, 但其mRNA增高的水平略有差异 (图3) 。2 种信号分子基因在施加张应力后20 min达到最高的转录水平, 并显著高于未加力组 ( P< 0. 05) 。随着时间延长, 2 个因子的mRNA水平下降, 至加力牵张后80 min, Smad2 表达恢复到对照组水平 (P >0. 05) , 而Smad3 的mRNA表达仍高于对照组 (P <0. 05) 。

A:加力弹簧;B:培养皿;C:未加力骨缝;D:加力骨缝A:The helical spring;B:The culture plates;C:Non-stretched suture;D:Expanded suture

A: 未加力骨缝; B: 加力骨缝A:Non-stretched suture;B:Stretched suture

2. 3 免疫组织化学检测

未受力骨缝组织中有大量圆形和梭形的成骨与成纤维样细胞排列, 镜下可见少量Smad2 与Smad3 阳性染色细胞, 其阳性率分别为 (21. 6 ±8. 8) % 与 (28. 5 ±9. 6) % 。而在受力20 min后, 骨缝中Smad2 与Smad3阳性细胞数量增加至 (51. 3 ± 11. 2) % 与 (59. 6 ±12. 6) % ( P < 0. 05) , 这些阳性细胞集中于骨缝边缘区域, Smad2 与Smad3 主要在这些区域的成骨样细胞中表达。其表达强度加力后显著增加, 特别是Smad3 的表达呈强阳性 (图4, 表1) 。

3 讨论

颅骨缝是哺乳动物颅骨的主要生长区域, 骨缝间隙的维持对早期颅骨的发育有着重要的作用, 异常的骨缝发育和融合可以导致发育畸形, 如由于颅缝早闭引起的各种颅面综合征。近年来的研究证实作用于颅骨缝的张应力能促进细胞增殖分化与蛋白合成, 加速新骨再生, 从而达到改变骨缝生长趋势以矫治颅面畸形的目的［1，4］。然而, 骨缝组织受到张应力刺激后如何将力学信号转化成生物化学信号, 从而引起成骨效应的分子生物学机制目前还不十分清楚。

过去的研究已经证实转化生长因子-β (TGF-β) 在颅骨缝的闭合和开放中起着关键的调控作用, 作为TGF-β 在细胞内主要的传导分子, Smad在机体发育和骨骼形成的过程中起着重要的作用［5 －6］。Smad分子又是TGF-β 超家族信号分子在细胞内信号转导的始动因子, 在以TGF-β、BMP为代表的TGF-β 超家族成员对细胞增殖分化与成骨的调节机制中, 探明Smad蛋白质群的作用具有十分重要的意义。

本研究通过建立大鼠颅骨矢状缝体外培养模型, 观察Smad2 和Smad3 信号通路分子在受力颅骨缝内的表达情况及变化趋势, 结果显示, Smad2 和Smad3的mRNA与蛋白在正常骨缝均有表达, 但加力后其表达水平显著增高, 免疫组化染色显示这些阳性表达主要集中于骨缝边缘区域的成骨细胞。表明Smad信号通路可能参与了骨缝细胞力学信号向生物化学信号的转化。

器官培养模型已广泛用于研究机械力作用下骨缝的生物学反应。其中大部分实验是将产生特定大小扩张力的弹簧, 固定在骨缝两侧, 这样不仅便于控制力的大小和方向, 还有利于观察组织内不同类型细胞对应力刺激的反应［7 －8］。通过宏观与微观分析, 本实验建立的大鼠颅骨矢状缝体外培养模型实用、稳定, 适合用于SDO的组织细胞与分子生物学基础研究。

目前认为骨细胞是骨组织中基本的力学感受细胞, 同时应力也可以直接激活骨髓间充质干细胞与成骨样细胞的增殖分化。我们曾对大鼠颅骨缝与间充质干细胞进行加力试验后发现, 转录因子Est1 和Cbfa1基因在张应力的作用下表达升高［9 －10］。Ikegame［3］在器官培养实验中发现牵张力引起骨缝边缘细胞碱性磷酸酶 (ALP) 的阳性表达和成骨向分化, 随着时间的延长, 成骨向分化过程逐渐向骨缝中央扩散, 增殖活跃的细胞主要集中在骨缝边缘。这些部位正是Smad2、Smad3 强阳性表达的区域, 说明感受力学刺激并通过这些通路分子将力学刺激转换成生化信号的细胞, 可能主要集中于骨缝边缘。

Smad家族蛋白在将TGF-β、BMP信号从细胞表面膜受体传导至细胞核的过程中起到关键作用, 而且不同的Smad介导不同的TGF-β 家族成员的信号转导。Smad家族含9 种Smad蛋白, 根据功能, Smad蛋白分为受体活化型 (R-Smad) , 共同通路型 (Co-Smad) 和抑制型 (I-Smad) 3 个亚家族。R-Smad又分为2 类:由TGF-β 激活的Smad2、Smad3; 由BMP激活的Smad1、Smad5、Smad8［11］。由于过去的研究证实TGF-β 在颅骨缝的闭合和开放中起着关键的调控作用［5］, 为此本实验选择与TGF-β 关系最为密切的2 个分子即Smad2 与Smad3 的表达规律与趋势进行检测, 结果证实Smad信号通路可能参与了骨缝的牵张成骨过程。说明骨缝细胞受机械力刺激诱导了TGF-β/Smad2、Smad3 基因与蛋白的表达, 而这些信号分子水平的提高又会调控间充质干细胞与成骨样细胞的增殖并向成骨细胞分化, 并向骨缝边缘聚集, 这为在此区域最终形成新骨与改建储备细胞基础。Smad蛋白家族不仅参与TGF-β 超家族信号通路的传导, 同时还与Wnt与BMP等信号通路存在交叉［12］。因此将来有必要探讨这些通路在骨缝牵张与细胞力学信号传导中的相互关系与调控作用, 从而进一步揭示其分子生物学机制。

摘要：目的:观察Smad2和Smad3在大鼠颅骨矢状缝牵张成骨过程中的时空表达。方法:建立大鼠颅骨矢状缝扩张培养模型, 运用RT-PCR及免疫组织化学SABC技术, 观察Smad2和Smad3 mRNA与蛋白在受力骨缝中的表达情况。结果:在牵张力的作用下, Smad2与Smad3的基因表达在20 min左右达到高水平, 随后下降。骨缝受力后Smad2与Smad3蛋白表达显著增强, 其阳性细胞主要集中在骨缝边缘区域。结论:Smad信号通路可能参与了骨缝细胞力学信号向生物化学信号的转化。

关键词：骨缝牵张,Smad2,Smad3,信号通路

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Smad 篇2

1 材料与方法

1.1 对象

随机选择203例2型糖尿病患者,均为本院2008年11月～2009年9月间门诊及住院患者;诊断均符合1999年W H O糖尿病标准,男性103例,女性100例,平均年龄(50.5±10.0)岁。所有患者均排除心脏、肝脏、其它肾脏疾病以及各种感染性疾病,肾功能正常,近期未发生糖尿病酮症酸中毒及高渗性昏迷,无高血压病,未使用A CEI或A R B类药物。根据尿蛋白排泄率(U A ER)(尿微量白蛋白与尿肌酐比值,A CR)分成3组:正常尿蛋白组78例(D 1),A CR<22 m g/g;微量蛋白尿组:69例(D 2),男性的A CR在22～220 m g/g;女性的A CR在31～220 m g/g;临床蛋白尿组56例(D 3),A CR>220m g/g。正常对照组(C)41例(男性23例,女性18例),均为我院健康体检者,平均年龄(47.1±9.8)岁。

1.2 方法

所有入选者测量血压、身高、体质量并计算体质量指数(BM I)。生化指标测定,清晨取空腹静脉血测定空腹血糖(FBG)(葡萄糖氧化酶法)、空腹胰岛素(FIN S)和糖化血红蛋白(H bA 1c)。采用酶联免疫分析(ELISE)法检测血清Sm ad2和Sm ad7。尿白蛋白测定采用免疫比浊法。尿肌酐测定采用肌氨酸氧化酶法-PA T法。

1.3 统计学处理

实验数据用表示,统计分析用SPSS 13.0统计软件处理。进行单因素方差分析比较各组间指标是否存在差异并进行显著性检验。用偏相关分析探讨Sm ad2、Sm ad7与FPG、FIN S、H bA 1c及A CR的相关性,P<0.05为有显著统计学意义。

2 结果

2.1 各组间临床资料和生化指标的比较

各组间的年龄、性别无显著差异(P>0.05)。各组2型糖尿病患者BM I、FPG显著高于正常对照组(P<0.05)。见附表。

2.2 各组间血清S m ad2和S m ad7水平的比较

附表2型糖尿病各组与对照组一般情况及炎症因子水平比较

注:1)与C组比较,P<0.05或P<0.01;2)与D 1组比较,P<0.01;3)与D 2组比较,P<0.01

D 1、D 2和D 3组患者血清Sm ad2和Sm ad7的水平均明显高于正常对照组,差异有显著性(P<0.01);D 3组患者的血清Sm ad2和Sm ad7水平明显高于D 1和D 2组(P<0.01)。D 2组患者血清中Sm ad2和Sm ad7水平明显高于D 1组(P<0.01)(附表)。

2.3 血清S m ad2、S m ad7与其他因素的偏相关分析

控制了其他因素的影响后,发现Sm ad2与A CR(r=0.559,P<0.05)、H bA 1c(r=0.226,P<0.05)呈显著正相关;Sm ad7与A CR(r=0.530,P<0.05)、H bA 1c(r=0.210,P<0.05)呈显著正相关;与FPG、FIN S无明显相关性。

3 讨论

D K D最重要的病理变化是肾小球系膜区细胞外基质(ECM)的大量积聚导致肾小球硬化,是引起糖尿病患者出现肾功能衰竭的重要的病理基础。大量研究证实,TG F-β不仅可促进细胞外基质的合成和沉积,还可激活金属蛋白酶组织抑制因子,抑制金属蛋白酶的降解,进而加速肾小球硬化过程。TG F-β引起肾脏纤维化的具体机制十分复杂,尚未研究清楚。最近关于TG F-β/Sm ad通路的研究为TG F-β引起肾脏纤维化的机制提供了新的见解。Sm ad表达失衡是肾纤维化发生的分子基础。Sm ad的活性增高是包括D K D在内的多种慢性进展性肾病中TG F-β高表达导致肾脏纤维化形成的重要细胞内分子机制。近年来,经实验研究证实,TG F-β是在与其受体(Tβ-R)结合后,经磷酸化激活丝/苏氨酸激酶受体信号转导分子Sm ad,如Sm ad2、Sm ad3,后两者与胞质内同家族分子Sm ad4形成异聚体转移至核内,并在核内相关因子的辅助作用下,影响一系列调节ECM代谢的相关基因,从而发挥其促进器官硬化/纤维化进程的作用,而对于Sm ad家族中的Sm ad7则认为是Sm ad2、Sm ad3和Sm ad4三聚体的抑制因子,其可多环节阻断TG F-β信号通路,具有抗纤维化的功能[1]。

本实验研究中发现,D K D血清中Sm ad2、Sm ad7的水平均明显升高,且Sm ad2、Sm ad7的出现早于尿微量白蛋白,并随着尿蛋白排泄率的增加逐渐升高,而且Sm ad2、Sm ad7均与A CR成显著正相关,提示Sm ad2、Sm ad7在D K D的发生发展过程中起重要作用。由于Sm ad7具有抗纤维化功能[1],故Sm ad7的升高可能是机体的一种对抗性的结果。在人类D K D中,肾间质纤维化与肾小球系膜的扩张、肾小球滤过率下降及蛋白尿的增加有很强的相关性,肾间质纤维化的程度与肾功能异常有相关性。肾小管上皮细胞(TEC)是原纤维变性细胞,具有转化成为肌成纤维细胞的能力,即上皮细胞-间充质转化(EM T),在小管间质纤维化进展中具有活性作用。体外培养的TEC外源性加入TG F-β1,活化的Sm ad2与之呈现时间、剂量的依赖关系,且与体外α平滑肌肌动蛋白(α-SM A,肌成纤维细胞的标志)及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原m R N A和蛋白的重新合成有关。磷酸化的Sm ad2易位至细胞核内后可能作用于靶基因,在转录水平上调控TEC,使之成为具有生成胶原功能的肌成纤维细胞[2],后者产生过多的细胞外基质成分,同时使组织收缩导致肾间质纤维化。最近的研究发现Sm ad7的过度表达可以抑制Sm ad2/3磷酸化[2,3,4],从而抑制TG F-β诱导形成EM T,阻止ECM的产生。而用腺病毒载体电打孔的方法转染Sm ad7基因,也可以明显抑制肾间质纤维化的进程[5]。N G等人[6]在单侧输尿管梗阻和糖尿病肾病小鼠模型研究中发现增加TG F-β的表达能够抑制肾脏的炎症反应,他们还发现其中关键的机制是由于上调Sm ad7的表达所致,表明Sm ad7不仅具有抗纤维化作用,还能够通过阻断Sm ad2/3及核因子kappaB(N F.kB)的激活而负性调节肾脏的炎症反应[7,8,9,10]。

本实验中,所选病例均处肾功能正常阶段,尽管我们发现Sm ad7随着蛋白尿的增加而逐渐升高,但其浓度可能仍不足以抵抗Sm ad2/3信号通路的活化及其它炎症因子等危险因素对肾脏的作用。随着D K D的进一步恶化,至肾功能不全阶段,Sm ad7的表达情况是否会进一步升高还是反而下降,尚不清楚(由于本实验当初未设定D K D肾功能不全期),我们将会做进一步研究。

本研究还发现,在2型糖尿病患者中血清Sm ad2、Sm ad7的水平均与H bA 1c成显著正相关,提示高血糖是刺激Sm ad通路激活的重要条件。自发性2型糖尿病(O LETF)大鼠D K D模型(30周龄)与LETO正常大鼠比较,大鼠肾脏Sm ad3的含量及Sm ad2、3的表达均显著增加,并且与TG F-β和纤维连接蛋白(FN)表达量的增加相平行。而在O LETF大鼠尚未发生D M的12周时,两组大鼠的上述指标比较无显著差异,说明Sm ad 2蛋白表达及TG F-β信号转导在D K D发病中具有重要作用[11]。进一步研究发现,体外培养肾及血管细胞,外源性加入高糖刺激24 h后,Sm ad2和Sm ad3的磷酸化和核内转位作用显著加强[12],说明高血糖可能是引起TG F-β/Sm ads信号通路激活的重要原因之一。但本研究并未直接得出Sm ad2、Sm ad7与FBG呈正相关,可能是由于样本量有限,也可能是因为H bA 1c反映的是平均血糖水平,其与Sm ad2和Sm ad7的关系更为密切。

综上所述,在D K D的发生发展中,TG F-β/Sm ad通路起到了重要作用。由于TG F-β具有的广泛的生理作用,干扰其信号转导通路,可能造成潜在的危险,而深入了解TG F-β信号通路的细节、Sm ad蛋白的功能以及与其它细胞因子间的相互作用,使选择性的阻断TG F-β的病理效应成为可能。应用Sm ad2/3阻断剂,上调Sm ad7的表达,可阻断EM T和减轻肾脏纤维化,对临床上D K D的治疗具有重大的指导意义。

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Smad4在肿瘤中的研究进展 篇3

人类第18号染色体长臂区域上的等位基因杂合性缺失是多种肿瘤的频发事件, 迄今在这一区域已经发现和鉴定了多个肿瘤抑制基因, 如DCC、MADR2/JV18-1、DPC4 (Smad4) 等。其中Smad4蛋白是TGF-β信号传递途径的必需物质, 处于中枢地位。1995年, 有学者在研究黑腹果蝇Dpp体内信号的转导时, 发现Dpp I型受体细胞内信号的下游分子, 并克隆其基因, 这个基因被命名为Mad, 随后有学者克隆出Mad相关基因sma2、sma3、sma4, 并认为其为mad同源物, 在体内可以形成复合物并协同发挥作用。后来人们将各种mad相关蛋白统一命名为Smad, 因此这类蛋白统称为Smads蛋白。当前包括Smad1-9, 它们都存在于细胞质中, 作用是将TGF-β/Smads信号转导入核内并参与TGF-β靶基因的调节。

Smad4作为Smads蛋白家族的重要成员, 其基因定位于染色体18q21.1, 含有11个外显子, 10个内含子, 其核苷酸序列保存在Gen Bank的U44378中, 基因的转录子长2680bp, 是编码552个氨基酸残基组成的蛋白质。Smad4蛋白是通过研究多重终止密码子和启动子拼接位点而确定的。Smad4的一级结构分为3个区:N端区、C端区和中间连接区。N端区和C端区与其他动物的MAD蛋白高度同源, 因此也称MH1和MH2, 中间连接区富含脯氨酸。Smad4与其它的Smad不同, 其MH2没有磷酸化结构SSXS, 单独存在不足以行使信号传导功能, 必须有部分中间连接区才能传递信号, 这部分称为Smad4的活性区。Smad4被认为是通用调节分子, 因为它几乎能与所有活化的受体调节型Smads蛋白结合, 并形成低聚体复合物, 参与信号转导。

2 Sm ad4蛋白的功能及作用机理

Sm a d 4蛋白与TGF-β密切相关, 是TGF-β受体信号传导途径的重要成员。TGF-β是一种多功能多肽, 在组织的发育、再生及修复中起重要作用;TGF-β还是一种具有多功能活性的细胞因子, 其可以调节细胞增殖、分化和凋亡, 对多种细胞因子有重要影响。TGF-β有两型受体, 每一型均含有细胞内有丝氨酸/苏氨酸激酶区。TGF-β细胞因子信号传导通过TGF-βI型、II型受体完成, 这两种受体都有一跨膜片断, 外端暴露于细胞外, 内端插在胞浆中。它们也是丝氨酸/苏氨酸激酶, 通过活化受体的磷酸化, 从而使受体调节型Smad也活化。活化的受体调节型Smad协同Smad将受体信号传到核内。许多Smad基因都介导了TGF-β超家族的功能, 包括骨形成蛋白、活化素和TGF-β。Sm a d 4在肿瘤中发病中, 常常突变, 突变类型以点突变为主, 还可以有错义突变、无义突变、移码突变等, 突变后的Sm ad 4蛋白构象发生改变, 不能与磷酸化的Sma d2和Sma d3结合, 从而不能发挥调控转录的作用。Smad4的MH1域突变并不影响其本身的活性, 但突变型的Smad4比野生型的更容易被激活泛素连接酶降解。磷酸化的TGF-β被激活后, 可活化Smads蛋白, 主要是Smad4, 进而调节靶基因的转录, 控制肿瘤细胞生长、分化及凋亡。此通路受细胞因子调节, 其任何一个元件失调, 均可引起细胞增生, 而在肿瘤细胞形成过程中可引起分化异常, 进而引起异常肿瘤性增生。体内细胞分泌的TGF-β主要通过调控核内CKI (细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子) 的表达, 阻止细胞周期运行, 抑制细胞向恶性转化。在信号传导过程中, 活化的TGF-β1与其膜返体结合后形成两种异二聚体复合物, 继而磷酸化下游的Smad2, Smad3蛋白, 磷酸化后的Smad2和Smad3可与Smad4形成异源复合物, 由胞浆移位至胞核, 调节靶基因的转录。有观点认为Smads家族的基它成员也参与到此通路中, 并形成正反馈与负反馈的平衡, 共同调节肿瘤的进展。但是有观点认为TGF-β在肿瘤的发生、发展中是一把“双刃剑”, 即在癌变期之初作为抑癌因子出现, 而在癌症晚期则通过自分泌 (作用于癌细胞本身) 和旁分泌 (作用于癌细胞周围的微环境) 方式刺激肿瘤浸润、转移, 因此, Smads与TGF-β的通路作用可能更为复杂。

3 Smad4在肿瘤中的作用

Smad4研究最多是在胰腺组织中, Smad4在胰腺癌组织中的表达明显低于正常组织, 同时相关研究表明胰腺癌中Smad4/TGF-β通路与PTEN和NF-kappa B调节有关。还有观点认为胰腺癌中SCF (beta-Tr CP1) 对Smad4蛋白有重要的调节作用。范振斌等通过对30例移行细胞癌新鲜癌组织进行分析和精细遗传作图, 并用DPC4/Smad4抗体对相应的病理组织切进行免疫组织化学分析, 结果显示DPC4/Smad4三个紧密联锁的微卫星位点D18S46、D18S363、D18S474有高频率的杂合性缺失, 18个微卫星位点中有5个点在所分析人群中多态性甚低, 与西方人数据差别明显;且免疫组化显示DPC4/Smad4在80%的肿瘤中表达下降或不表达, 与微卫星杂合性缺失对应良好, 并认为抑癌基因DPC4/Smad4的失活在中国人膀胱移行细胞癌的发生发展中具有一定作用, 其等位基因的杂合性缺失是该基因失活的重要机制。有观点认为当R-Smad被I型受体磷酸化, 从而导致与CO-Smad Smad4结合, 复合体进入核内启动转录, 一旦进入细胞核, Smad复合体与其他转录共刺激信号组成共抑制分子, 共同控制靶基因的表达, 因此伴随着Wnt信号系统异常调节, 或者由于Wnt基因的异常表达, 破坏了正常的Wnt/B-catenin、Notch、BMP的信号系统, 导致肿瘤细胞可自分泌大量的TGF-β1, 磷酸化R-Smad, 从而导致与CO-Smad Smad4结合, Smad4的减少, 使细胞对TGF-β1的生长抑制产生耐受, 促进肿瘤的发展。伴随着Notch信号途径的异常表达, 引起下游级联信号系统TGF-β超家族在内的细胞信号传导的异常, Smad4作为TGF-β1信号传导系统的关键组成元件, 对其信号转导具有着关键作用。其缺失或突变可使细胞对TGF-β1的生长抑制产生耐受, 促进肿瘤的发展。体外细胞培养的实验也证实了此观点。有研究结果显示Smad4与Cyclin D1在膀胱癌中具有正相关性, 且随着肿瘤恶性程度的增高, 二者的表达率均下降, 认为Smad4与Cyclin D1的表达与自然病程密切相关, 其表达变化是肿瘤进展的表现。张磊等通过应用免疫组织化学技术检测多Smad4、Cyclin D1、Survivin和Cox-2在44例大肠癌组织中的表达, 认为其联合检测对了解大肠癌的发生、发展、指导治疗和判断预后有重要意义, Smad4可作为一个独立预测指标判断大肠癌的预后。SELIL与Smad4蛋白在食管癌中具有协同作用, SELIL在食管癌中的作用可能通过TGF-β信号途径影响基因的表达而调控细胞的生长。吴鹏等通过应用RNA干扰技术下调Smad4基因表达, 观察其对宫颈癌细胞增殖的影响, 认为其能筛选出特异而高效阻断Smad4基因表达功能的sh RNA, Smad4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。Blackford等认为Smad4基因突变与胰腺癌的预后密切相关。Kloth等通过免疫组织化学技术对117例原发性宫颈癌患者的Smad4进行检测, 显示肿瘤中Smad4低表达, 并认为细胞浆中Smad4的弱表达和细胞核中表达的缺失与宫颈癌的不良预后密切相关。因此, Smad4在不同肿瘤中的表达均有变化, 提示Smad4参与了肿瘤的发生发展。

4 Smad4在肺癌中的作用

有学者在1998年对肺癌组织及体外培养的细胞株中相关的Smad4/TGF-β基因进行分析, 认为Smad4/TGF-β参与了肿瘤的发生。Gemma等通过Northern blot、RT-PCR等技术对肺癌细胞系TGF-β的表达进行分析, 认为TGF-β可以调节M M P-2、P AI-1、I L-1及C E A等多种细胞因子, 在肺癌的发生中具有至关重要的作用。Ke等认为Smad4通过不同的机制影响肿瘤的血管生成, 并通过应用免疫组织化学技术检测肺癌中DPC4/Sm a d4与血管生成的关系, 结果显示DPC4/Sm ad 4能降低肿瘤组织中VEGF蛋白和m RNA的表达, 增加TSP1蛋白和m RNA的表达, 确认DPC 4/Sm a d 4是一个重要的生物学指标, 并在肿瘤转移及血管生成中发挥重要作用。Filyak等认为Smad2、Smad3、Smad4蛋白下调, 而Smad7上调对人肺癌A5 49细胞系的发生发展有重要作用。Finger等认为TGF-βRIII作为一个新的肿瘤抑制基因在肺癌细胞系中普遍丢失, 其表达可能与肿瘤的浸润等生物学行为有关。因此, 关于Smad4/TGF-β在肺癌及肺组织中表达, 主要研究在体外培养的细胞系中, 而对肺癌组织中蛋白的表达及m RNA的表达关注较少。

5 临床意义和展望

目前关于Smad4在肿瘤中的研究是人们关注的热点, 其可以作为预测肿瘤预后的重要指标, 因此, 临床可以借助相关的辅助方法来判断患者预后。但是由于TGF-β超家族成员庞大, 受体配体间组合作用多样化, 个体成员在不同肿瘤中发挥作用也不尽相同, 因此对于其真正的作用机制及干扰因素, 临床及基础研究中并不十分清楚, 对其机理及影响因素的研究将是当前研究的重要方向。同时构建合格的人类肿瘤动物模型, 进行阻断Smad4/TGF-β通路的研究, 有望成为肿瘤研究及治疗的靶点, 可以为肿瘤的治疗提供新的思路。由于Smad4/TGF-β为肿瘤研究的新领域, 与其它研究一样, 还有哪些基因可以诱导其强表达或弱表达?动物实验中对Smad4/TGF-β的干扰能否直接用于临床?Smads家族的其它成员, 如Smad1、Smad2、Smad3、Smad7与Smad4/TGF-β是否具有相互作用?等等。相信随着这些问题广泛而深入的研究, 对于抗肿瘤通路的研究及治疗将开辟新的途径。

摘要：肿瘤的侵袭和转移是重要的生物学行为, 其发生发展机制一直是人们研究的热点。当前, 人们对TGF-β/Smads信号途径在细胞及生物体中的作用研究较多, 同时对TGF-β/Smads在肿瘤中的作用也日益受到关注。有观点认为TGF-β/Smads信号转导途径中任一元件的异常表达均可引起其传导紊乱, 引起疾病的发生或肿瘤的形成。Smad4作为Smads是的重要一员, 在机体中有重要作用。本文对TGF-β/Smad4的作用及其在肿瘤中的作用进行综述, 以期为探讨肿瘤的发生发展提供理论支持。

关键词：Smad4,肿瘤,研究进展

参考文献

[1]黄娟, 朗楠, 刘明, 等.Rac1小干扰RNA对胃肠道肿瘤细胞恶性生物学行为的影响[J].四川大学学报 (医学版) , 2009, 40 (4) :588～592.

Smad 篇4

1 对象与方法

1.1 对象

2006年7月—2009年7月, 我院住院诊断为胶质瘤的患者45例 (男32例, 女13例) , 年龄18～83岁, 平均年龄 (47±3) 岁。病理诊断确诊为低级别胶质瘤 (L组) (Ⅰ～Ⅱ) 20例, 高级别胶质瘤 (H组) (Ⅲ～Ⅳ级) 25例。对照组10例 (N组) (男7例, 女3例) , 年龄16～78岁, 平均年龄 (44±2) 岁;病理诊断排除胶质瘤可能。

1.2 标本采集

采集标本后冻存于-70℃, 统一提取RNA和蛋白做荧光定量-PCR (RT-PCR) 和Westernblot检测。

1.3 逆转录聚合酶链反应

标本按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA。RT-PCR步骤按照美国Promega公司试剂盒及其说明书进行。BMP4的上游引物为5'-AGCATGTCAGGATT-AGCCGA-3', 下游引物为5'-TGGAGATGGCACTCAGTTCA-3';SMAD 4的上游引物是:5'-TTATGGGTTCTGGGTGGGTTT-3', 下游引物是:5'-TGAGGTCTTACGGTGGGTGT-3';β-actin的上游引物为5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'下游引物为5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。

1.4 蛋白印记技术

在蛋白酶存在下裂解缓冲液[50mmg/L tris-HCL (pH 7.4) , 0.5mmol/L EDTA, 0.5%NP 40和150mmol/Lnacl]裂解组织, 裂解物12 000r/min离心10min弃沉淀, 取蛋白80μg以10%SDS-PAGE电泳分离, PVDF转膜。以相应蛋白的抗体鉴定BMP4、SMAD 4蛋白, ECL增强试剂盒显色, β-action做对照。

1.5 统计学方法

实验结果采用SPSS 13.0统计软件分析, RT-PCR和Westernblot结果经bandscan分析后进行t检验, 以P<0.05为有统计学差异。

2 结果

RT-PCR结果显示在与正常脑组织相比、低级别胶质瘤、高级别胶质瘤中BMP4表达分别降低了 (23.5±0.23) %、 (46.6±0.34) % (P<0.05) ;SMAD 4表达分别降低了 (30.6±0.41) %、 (95.3±1.02) % (P<0.05) , 差异均有统计学意义。Westernblot结果显示与正常组织相比, 低级别胶质瘤、高级别胶质瘤BMP4表达分别降低了 (28.4±0.25) %、 (80.4±1.05) % (P<0.05) ;SMAD 4表达降低了 (76.8±1.15) %、 (96.2±2.01) % (P<0.05) , 差异均有统计学意义。

3 讨论

目前临床上胶质瘤的诊断主要依赖于影像学和病理学结果, 但往往不能有效地推测患者的预后情况。因此, 了解胶质瘤的发病机制, 从分子水平上进行诊断和治疗能够更好地了解肿瘤的发展阶段与趋势。TGF-β是一个庞大的家族, 由大量结构相关的多肽生长因子组成, 包括原形的TGF-β、激活素 (activin) 和BMP等3大类40多个成员。TGF-β超家族在调节细胞的增殖、分化、基质形成、凋亡和肿瘤发生等过程中起重要作用。BMP4是的一个TGF-β的一个蛋白, 已有多篇报道, BMP4与肿瘤细胞的发生发展有关[9,10,11], 在此实验里, RT-PCR和Westernblot结果都显示BMP4在胶质瘤中低表达, 且随着等级的升高而减少, 差异具有统计学意义。已经有报道[11]BMP4的高表达可以抑制胶质瘤细胞的生长, 但是BMP4是否与肿瘤的发生发展有关并不清楚, 在此实验里, 我们发现了在胶质瘤细胞中, BMP4的表达明显低于正常脑组织中的表达, 且胶质瘤等级越高, BMP4的表达越低, 那么我们可以大胆推测, BMP4可能与胶质瘤的发生发展及恶性程度有关。那么, 在胶质瘤的诊断和治疗中, 我们就可以以BMP4作为靶点, 来检测肿瘤的发生发展、恶性程度及预后, 进而提高胶质瘤的诊断和检测水平。

SMAD 4, 又称DPC 4 (Deletedinpancreaticcancer 4) , 位于染色体18q21.1, 最初作为肿瘤抑癌基因而被发现。据报道, 有50%的胰腺癌SMAD 4突变或者缺失[12]。卵巢癌、乳腺癌及头颈部肿瘤中, SMAD 4基因也存在着表达缺失或突变[13]。但是, 胶质瘤细胞中SMAD 4的表达变化却鲜有报道。本实验里, RT-PCR结果显示, 与正常脑组织相比, 胶质瘤中SMAD 4表达明显降低, 在高级别胶质瘤中SMAD 4几乎没有表达, 说明在胶质瘤中, 也存在着SMAD 4基因的突变和缺失。与胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌及头颈部肿瘤SMAD 4基因的表达的趋势相同。SMAD 4是抑癌基因, 本实验里SMAD 4的低表达, 说明胶质瘤的发生发展可能与抑癌基因SMAD 4的突变和缺失有关, 检测SMAD 4的表达, 对于检测胶质瘤的发生发展有重要意义。

本实验证明了BMP4、SMAD 4与胶质瘤中低表达, 且胶质瘤等级越高, 表达越低。BMP4、SMAD 4可能与胶质瘤的发生发展及恶性程度有关, 检查患者肿瘤BMP4的表达, 可以作为观察患者肿瘤恶性程度及预后情况的一个指标。对于患者的诊断有重要意义。

摘要：目的 探讨骨形成发生蛋白4 (BMP4) 和SMAD4表达变化在胶质瘤诊断中的意义。方法 随机选取胶质瘤标本45例, 正常脑组织10例, 应用RT-PCR和Western blot检测胶质瘤标本和正常脑组织中BMP4和SMAD4表达。结果 RT-PCR结果 显示, 与正常脑组织相比, 低级别胶质瘤、高级别胶质瘤中BMP4表达分别降低 (23.5±0.23) %、 (46.6±0.34) %, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。SMAD4表达分别降低 (30.6±0.41) %、 (95.3±1.02) % (P<0.05) 。Western blot结果 显示与正常脑组织相比, 低级别胶质瘤、高级别胶质瘤BMP4表达分别降低 (28.4±0.25) %、 (80.4±1.05) % (P<0.05) 。SMAD4表达降低 (76.8±1.15) %、 (96.2±2.01) % (P<0.05) , 差异有统计学意义。结论 BMP4、SMAD4可能与胶质瘤的发生发展及恶性程度相关, BMP4、SMAD4可能成为胶质瘤诊断和分级的一个重要指标。

Smad 篇5

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

采用Spragoe-Dawleg(SD)系雄性大鼠,SPF级,购买于广东省医学实验动物中心。动物实验在广州医科大学实验动物中心进行,注册编号为SYXK(粤)2010-0104。盐酸阿霉素(adriamycin,ADR),为深圳万乐药业有限公司产品,批号H44024359。重组腺病毒(Ad-Smad7、Ad-GFP)购买于汉恒生物科技有限公司。大鼠手术器械一套、10%水合氯醛、40 单位胰岛素针(美国BD公司)等。

1.2 模型的建立及分组

随机取40 只大鼠,体重150~180 g。ADR肾病模型一次性尾静脉注射ADR 6.5 mg/kg,注射后1、4及10 周末检测24 h尿蛋白,模型组尿蛋白与正常对照组之间差异有统计学意义,出现病理学改变证明模型构建成功。实验分正常对照组(Con组)、ADR肾病组(ADR组)、ADR肾病+Ad-Smad7 组(肾病Ad-Smad7 组)、肾病+Ad-GFP组(肾病Ad-GFP组) 和ADR肾病+ 假手术组(肾病sham组),每组8 只。ADR注射1 周末,肾病Ad-Smad7组通过夹闭腹主动脉近心端、远心端,由腹主动脉向单侧肾动脉灌注Ad-Smad7; 同法建立肾病Ad-GFP组;肾病sham组开腹后相同时间内单纯夹闭腹主动脉;Con组尾静脉注射等容积的生理盐水。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1肾病模型的尿生化检测

ADR注射后1、4及10周末用代谢笼分别收集24 h尿液,记录24 h尿量,3 000 r/min离心5 min后暂存于4℃冰箱,用邻苯三酚红比色法检测24 h尿蛋白。

1.3.2构建肾病Ad-Smad7组、肾病Ad-GFP组及肾病sham组

在ADR注射1周末,每组随机选取8只模型鼠,术前1天禁食不禁饮。按4 ml/kg水合氯醛麻醉,作倒T字开口,逐层开腹,找左肾部位,分离左肾静脉,显露术野后,找到下腔静脉与腹主动脉,分别游离出下腔静脉和腹主动脉。细丝线分别游离腹主动脉近心、远心端。备好重组腺病毒,胰岛素针。分别用动脉夹夹闭游离好的腹主动脉近心端及远心端,将5×109pfu/ml重组腺病毒(Ad-Smad7/Ad-GFP)均速地从腹主动脉灌注入左肾动脉,灌注完立即退针,按压约5 min。按压同时稍提起左肾静脉丝线,短暂阻断左肾血流,延长腺病毒与该肾的接触时间。阻断血流注射病毒总时间控制在10 min以内。确认清理干净后关腹,肌肉层连续缝合,皮肤间断缝合。连续肌注10万u青霉素3 d,放回笼里保暖。

1.3.3肾脏标本采集

Con组和ADR组分别于ADR注射后4周末及10周末取肾,肾病Ad-Smad7组、肾病Ad-GFP组、肾病sham组于4周末取肾。切取肾脏后剥离肾包膜,部分肾组织置于4%多聚甲醛做冷冻切片荧光检测,部分肾皮质置于10%甲醛做病理检查,HE染色;其余肾组织置于液氮保存。

1.3.4冷冻切片荧光显微镜检测Ad-Smad7

4%多聚甲醛固定的肾组织过夜,蔗糖溶液脱水,直至肾组织沉降到容器底部。预冷冷冻切片机,温度调至-22℃,切片厚度为45μm。按需要切取适量肾组织,加PBS泡于6孔板中。病理级玻片预先过明胶,以防脱片。每张玻片用抗荧光淬灭封片剂封片,荧光显微镜观察拍照。

1.3.5 HE染色

切片在二甲苯中脱蜡;依次放入100%、95%、85%、70%酒精,各级为2~5 min。最后经蒸馏水转入染液;苏木精染液染色10 min;水洗玻片上多余染液,0.5%~1.0%盐酸酒精(70%酒精配制)分色片刻。镜检控制,直至细胞核及核内染色质清晰为止;流水冲洗,或在碳酸锂饱和液中短时间碱化,蒸馏水短洗;0.1%~0.5%伊红染液染色1~5 min;依次经70%、85%、95%、100%酒精脱水;二甲苯透明(2次),共约10 min;迅速滴加适量中性树胶,加盖玻片封固。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间两两比较采用LSD法检验,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿霉素肾病模型24 h尿蛋白检测

分别取Con组、ADR组1 周末、4 周末、10 周末24 h尿,ADR组1 周末24 h尿蛋白升高,4 周末升至较高水平,与同时间点Con组比较显著升高,模型构建成功;4 周末ADR组与1 周末ADR组比较显著升高。10 周末稍降低,但仍较同时间点Con组高。Con组各时间点尿蛋白差异无统计学意义,见图1。

2.2 正常对照组与模型组病理检测

Con组肾小球内皮、毛细血管清晰,血管球与肾球囊无黏连(见图2A);ADR组肾小球系膜基质增多,毛细血管腔狭窄或破坏,毛细血管丛与囊壁黏连(见图2B)。

2.3 4 周末各组大鼠尿蛋白比较

ADR注射4 周末,与Con组比较,ADR组24 h尿蛋白显著升高。与ADR组比较,Ad-Smad7 转染后大鼠24 h尿蛋白减少,差异有统计学意义;与肾病Ad-GFP组、肾病sham组比较,肾病Ad-Smad7组大鼠24 h尿蛋白也减少,差异有统计学意义。ADR组、肾病Ad-GFP组、肾病sham 3 组尿蛋白比较差异无统计学意义。见图3。

2.4 各组肾组织冷冻切片荧光镜检

肾病Ad-GFP组的荧光镜检可见肾小管上皮细胞有绿色荧光,表明腺病毒已转染至小管上皮细胞。与Con组、ADR组比较,Ad-Smad7 在5×109pfu/ml时转染效果明显,而肾病sham组与ADR组相似,仅有轻微均匀的自发荧光。见图4。

2.5 各组大鼠肾脏病理改变

Con组见肾小球系膜细胞、毛细血管清晰,血管球与肾球囊无黏连;与Con组比较,ADR组肾小球系膜基质增多,毛细血管腔狭窄或破坏,毛细血管丛与囊壁黏连,部分肾小球有新月体形成;肾病Ad-GFP组肾小球球囊变形,毛细血管球萎缩,部分血管腔闭塞,肾小管上皮细胞肿胀,排列紊乱,部分脱失;肾病sham组肾小球毛细血管成分叶状,系膜细胞增殖,与ADR组相似;肾病Ad-Smad7 组血管球和肾球囊结构分明,内皮细胞、系膜细胞均匀分布,较ADR组病理改变减轻。见图5。

1)与1周末ADR组比较,P<0.01;2)与Con组比较,P<0.05

A:Con组;B:ADR组

1:Con组;2:ADR组;3:肾病Ad-GFP组;4:肾病sham组;5:肾病Ad-Smad7;1)与Con组比较,P<0.01;2)与ADR组比较,P<0.05;3)与肾病Ad-GFP组比较,P<0.05;4)与肾病sham组比较,P<0.05

A:Con组;B:ADR组;C:肾病Ad-GFP组;D:肾病sham组;E:肾病Ad-Smad7组;与Con组、ADR组比较,肾病Ad-Smad7和肾病Ad-GFP在5×109pfu/ml时转染效果最明显,肾病sham组与ADR肾病组相似,仅有轻微均匀的自发荧光

A:Con组;B:ADR组;C:肾病Ad-GFP组;D:肾病sham组;E:肾病Ad-Smad7组

3 讨论

肾组织纤维化和炎症是慢性肾脏病病理过程,可发展为肾小球硬化。各种致病因素长期持续刺激肾小球,使内皮细胞受损,血管塌陷,系膜细胞增殖,细胞外基质(ECM)堆积,导致肾小球硬化。多条信号通路参与肾小球硬化过程,包括TGF-β/Smad信号通路,MAPK通路,Wnt通路等。其中Smad2、3、4、7为TGF-β1 的下游效应蛋白,Smad7 为负反馈调节蛋白。有研究显示细胞内Smad7 的水平是决定TGF-β1 反应性的主要因素,它通过干扰TβRⅠ型受体对Smad2、Smad3 蛋白的磷酸化, 或招募E3 泛素连接酶(如Smurf1/2)导致活化的TβRⅠ型受体泛素化标记,对TGF-β1/Smad通路起负反馈调节作用[4,5]。

本研究前期在Ang II刺激肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC) 增殖的研究表明,Smad 7 通过抑制活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,抑制Ang II对NF-κB的激活,增加IκBα 的蛋白表达并使核内表达增多,促进GMC凋亡,缓解其增殖。梗阻性肾病大鼠及细胞实验均发现,过表达Smad 7 后mi R29b重新表达,Smad 7 能抑制糖化终产物和Ang II引起的micro RNAs的表达,阻断肾硬化的发展[6]。Chung等[7]的研究表明,过表达Smad 7 可抑制糖化终产物诱导的Smad 3 磷酸化,提示过表达Smad 7 可作为糖尿病肾病治疗的靶点。本实验通过腺病毒介导Smad 7 基因转染肾病大鼠,观察Smad 7 干预后对模型大鼠蛋白尿及肾病病理的影响。

阿霉素作为一种蒽环类抗肿瘤抗生素,具有强烈的细胞毒作用,直接损伤肾脏细胞。它的醌式结构,在肾内代谢还原成半醌式自由基,后者与氧结合产生ROS,促使肾小管上皮细胞脂质过氧化,滤过膜结构、功能受损,产生蛋白尿。此外阿霉素还有心脏毒性、胃肠道反应等副作用,剂量过大会造成动物死亡,存活率降低[8,9]。因此,经过预实验,本研究采用一次性尾静脉注射6.5 mg/kg ADR的给药方式,减少药物血管外渗的机会,也减轻胃肠道反应。24 h蛋白尿检测结果显示,ADR组大鼠于阿霉素注射1周末即出现蛋白尿。研究显示基因表达在大鼠肾脏可持续约3 周[10],所以本实验从ADR注射1 周末开始转染Smad 7 重组腺病毒,4 周末检测转染效果。

腺病毒介导外源性基因转染至大鼠肾脏定向表达的研究表明,腺病毒的感染效率高,用包装细胞进行扩增,一次包装所得的滴度较高(纯化后为1011pfu/ml),纯化后的腺病毒可直接进行动物活体注射[11],因此,本实验用腺病毒为载体介导Smad 7 基因对阿霉素肾病大鼠进行干预。关于腺病毒活体注射的研究显示,不同的注射方式感染率有明显差异。单纯静脉注射通过血循环可使腺病毒经过肾脏,但病毒会同时感染多个器官,到达肾脏的腺病毒减少。为了使病毒感染大鼠并具有肾脏靶向性,实验人员通过直接将重组腺病毒由腹主动脉向左侧肾动脉灌注,暂时阻断腹主动脉远心端、近心端血流(近心端至右肾动脉下方,远心端至左肾动脉下方),在两者间进针即可使腺病毒灌注至左肾,并适当延长灌注时间[3,12]。

各组大鼠肾脏冰冻切片的荧光显微镜检结果显示,Con组、ADR组仅有轻微均匀的自发荧光,与前两者比较,肾病Ad-Smad7 和肾病Ad-GFP均见阳性表达区,Ad-Smad7 组位于肾小管上皮细胞及小管间质,Ad-GFP主要位于肾小管上皮细胞。实验表明5×109pfu/ml时转染效果最明显,且不引起大鼠过早死亡。肾病sham组与ADR组相似,仅有轻微均一的自发荧光。由此可见介导Smad 7 的腺病毒已成功转染至大鼠靶肾脏。

腺病毒介导基因转染至大鼠的研究显示,基因表达在大鼠肾脏内可持续约3 周。灌注重组腺病毒Smad7 后,即实验4 周末,肾病Ad-Smad7 组24 h尿蛋白与ADR组、肾病Ad-GFP组、肾病sham组比较明显减少,提示过表达Smad 7 基因可抑制肾病蛋白尿。Liu等[13]研究表明,小鼠高血压肾病模型通过非侵入的超声微泡技术,强力霉素诱导Smad 7 表达的质粒注入到肾脏后显示,Smad 7 提前干预能防止Ang II引起的进行性肾损伤,抑制蛋白尿和血肌酐的增高。Wang[14]等研究显示通过下调Smad7 蛋白,过表达的mi R21 能促进糖尿病肾病中TGF-β1 诱导的肾硬化。有肾病模型研究发现小管间质损伤和肾小球病变一样决定着慢性肾脏病的进展,但其机制仍未十分清楚, 如肾大部分切除模型、Heymann肾炎,他们实验表明持续的蛋白尿与肾小管损伤密切相关[15]。而本实验中Smad 7 也正是在肾小管上皮细胞表达,可能Smad 7 通过小管上皮细胞抑制TGF-β/Smad通路,从而抑制阿霉素肾病的进展,减轻肾病蛋白尿。

实验检测各组肾病大鼠肾脏病理改变,Con组见肾小球系膜细胞、毛细血管清晰,血管球与肾球囊无黏连;与Con组比较,ADR组肾小球系膜基质增多,毛细血管腔狭窄或破坏,毛细血管丛与囊壁黏连,个别肾小球有新月体形成;肾病Ad-GFP组与ADR组相似,毛细血管球萎缩,肾小管上皮细胞肿胀,排列紊乱,球囊黏连;肾病sham组肾小球毛细血管成分叶状,系膜细胞增殖;肾病Ad-Smad7 组血管球和肾球囊结构较分明,内皮细胞、系膜细胞分布较均匀,与ADR组比较有明显减轻。可见,过表达Smad 7 可缓解阿霉素肾病病理损害。

Smad 篇6

肺纤维化是一种原因不明的慢性间质性肺疾病, 是呼吸系统最严重的疾病之一。目前对该病的病因, 发病机制尚不完全清楚, 也没有有效的治疗手段, 患病率和病死率成逐年上升的趋势, 故也成为国内外学者研究的热点之一。随着对肺纤维化发生机制研究的不断深入, 大量研究结果证实, TGF-β, CTGF, PDGF等细胞因子能促进肺成纤维细胞分裂增殖, 对成纤维细胞具有趋化作用, 调节胶原蛋白的合成和降解, 在肺纤维化发生发展中起关键作用。本文仅对TGF-β及其Smad信号转导通路在肺纤维化中的作用做一介绍。

1 TGF-β/Smads信号转导通路的组成

TGF-β超家族, TGF-β受体和Smads蛋白家族组成该通路。

1.1 TGF-β超家族

其至少包括30种相关的蛋白。如TGF-βs, 骨形态发生蛋白 (BMP) , 活化素 (activin) , 抑制素 (inhibin) , nodal, dpp等, TGF-β是该家族重要成员之一[1], 目前知道的TGF-β有6个亚型, 为TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5, TGF-β6。在哺乳动物中存在最多的是TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3三种形式, 他们分别位于染色体19q13, 1q41和14q24, 且具有高度同源性和结构相似性, 其中TGF-β1所占比例最高, 活性最强, 功能最多, 被广泛应用于临床和实验研究中。TGF-β分泌后发挥其生物学效应必须经过激活这一过程, 即TGF前体分子LTGF必须激活成为成熟的TGF-β形式才能与受体结合, 进而激活该通路。

1.2 TGF-β受体

TGF-β受体 (TGRF) 有8种不同类型的受体, 其中Ⅰ型和Ⅱ型是TGF-β信号转导的主要受体, 属丝/苏氨酸受体家族。在Ⅰ型受体的胞内区外侧一段含丝/苏氨酸残基, 是Ⅱ型受体磷酸化激活的部位, 而Ⅰ型和Ⅱ型受体细胞外区则含半胱氨酸残基。Ⅲ型受体, 是一个锚着蛋白多糖, 无信号转导结构但可以提高TGF-β对Ⅱ型受体的亲和力[2]。TGF-β受体只有通过与其配体的结合及活化, 才能启动Smad信号转导通路。

1.3 Smads蛋白家族

Smads蛋白是最近几年发现参与TGF-β超家族信号在细胞内转导的一族信号蛋白[3]。在哺乳动物中发现了8种Smad蛋白。按照结构和功能分为三类: (1) 受体激活型Smads蛋白 (R-Smads) , 他们被Ⅰ型受体磷酸化进而激活, 例如Smad1, 5和8被BMP型Ⅰ型受体激酶和ALK1磷酸化激活, 而Smad2, 3被活化的activin及Ⅰ型受体 (ALK4和5) 磷酸化激活[4]。 (2) 共同介质型Smads (Co-Smads) , 在脊椎动物中仅有Smad4, 只有与Smad4结合以后所有TGF-β超家族的信号分子才能进入细胞核。 (3) 抑制型Smads (Ⅰ-Smads) , 可以与激活的Ⅰ型受体结合抑制或调节TGF-β家族的信号转导, 包括Smad6, Smad7[5]。

2 TGF-β/Smads信号转导机制

TGF-β本身是以无活性的形式存在于细胞内, 它的表达是需要借助其相对应的信号通路, 其中Smads通路是最重要的信号转导分子。在信号转导过程中, TGF-β先与TβRⅡ形成异源二聚体复合物, 然后与TβRⅠ结合形成四聚体使其活化, 活化的TβRⅠ直接使Smad2/3磷酸化, 进而与Smad4结合形成转录复合物, 移入细胞内, 参与相应靶基因转录, 从而在细胞水平上介导TGF-β发挥其生物学效应。Smad6和Smad7可以抑制TβRⅠ磷酸化Smad2/3这一过程, 从而使得TGF-β的生物学效应得以平衡, 共同完成其生理和病理作用。研究其在生理和病理状态下的信号转导对进一步探讨该通路与肺纤维化的发病机制的关系有十分重要的意义。

3 TGF-β/Smads信号转导通路与肺纤维化

Verrecchia[6]等通过应用包含265个抑制ECM相关基因的c DNA差异杂交表达列阵技术, 发现人类成纤维细胞中许多胶原基因启动子由Smad3介导, 包括ColⅠα1和ColⅡα2, ColⅢα1, ColⅤα2, ColⅥα1和ColⅥα3。Zawel等[7]发现, TGF-β1处理后肺成纤维细胞Smad3和Smad4通路活化, 进而启动了TGF-β1靶基因collal, timp-1的转录, 导致Ⅰ型胶原的表达增多, 部分揭示了TGF-β1促进肺纤维化发展的机制。实验证明, 给与Smad3敲除的大鼠注射活性TGF-β1因子, 由于阻碍了TGF-β1诱导基质基因, 组织蛋白酶抑制剂 (TMP-1) 的表达, 从而阻碍基质聚集, 促进肺纤维化的发生[8]。在博莱霉素诱导肺纤维化的模型中, Smad3敲除的小鼠肺纤维化损伤比野生型的小[9]。在另外一个由吸入表达活化TGF-β的腺病毒载体诱导的肺纤维化模型中, Smad3敲除小鼠无纤维化损伤, 而野生型小鼠则有EMC的沉积[10]。上述实验中, TGF-β的激活均可以被Smads家族中的抑制型Smads所抑制, 其中Smad7能竞争性占据TβRⅠ型受体, 阻断磷酸化Smad2/3这一过程, 从而抑制TGF-β的表达以达到抑制肺纤维化进程的目的。Nakao等[11]在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型气管内注入带有smad7c DNA的腺病毒, 结果表明, Ⅰ型前胶原RNA表达受抑制, 羟脯氨酸的含量降低, 没有形态学上的纤维化改变。Smad6和Smad7不同, 受体蛋白激酶不是他的作用靶位, 而是与Smad4竞争并结合被受体激活的R-Smad, 形成没有活性的R-Smad聚合体, 从而起到干扰信号系统转导的效应[12]。

Smad 篇7

关键词：灯盏花乙素,肝星状细胞,TGF-β1/Smad信号通路

肝纤维化是指在各种致病因子作用下,肝星形细胞(hepatic Stellate cell,HSC)被活化并增殖,分泌出大量的胶原纤维,过度沉积于肝脏的病理过程,它不是一个独立的疾病,而是许多慢性肝脏疾病的共同阶段。肝纤维化属于可逆的阶段,肝纤维化阶段的治疗非常重要[1]。灯盏花乙素(scutellarin,scu)又名野黄芩苷,是从灯盏花中提取的一种黄酮类成分,具有广泛的生物学活性。近年来发现灯盏花乙素对多种器官纤维化[2,3]有治疗作用,可以减轻CC14和猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型的纤维化程度[4,5],但其抗肝纤维化的作用机制研究较少。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是促进HSC增殖和胶原纤维分泌作用最强的细胞因子之一[6]。本研究拟在人肝星形细胞系LX-2细胞上观察灯盏花乙素对肝星形细胞生物学活性及TGF-β1信号通路的影响,初步探讨灯盏花乙素治疗肝纤维化的作用机制。

1 材料和方法

1.1 药品、试剂和器材

灯盏花乙素,成都贝斯特试剂有限公司,纯度≥98%,批号:150615;LX-2细胞,Scott L.Friedman教授赠送[7];胎牛血清(fetal bovin serum,FBS),GIBCO公司,批号:1616496;DMEM高糖培养基,Hyclone,批号:NAC1363;Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒,日本同仁化学研究所,批号:GX612;Caspase-Glo3/7检测试剂盒,普洛麦格(北京)生物技术有限公司,批号:0000116968;转化生长因子β1,Peprotech Inc,批号:100-21;Procollagen TypeⅠC-peptide(PIP) EIA试剂盒,Takara Bio Inc,批号:AK1801;PathScanPhospho-Smad2(Ser465/467) Sandwich ELISA Kit,Cell Signaling Technology,Inc,批号:0015;PathScanPhosphoSmad3 (Ser423/425) Sandwich ELISA Kit,Cell Signaling Technology,Inc,批号:0028。

十万分之一电子天平,OHAUS,型号:AP2500;酶标仪,美国BIO-RAD公司,型号:MODEL 6800;倒置荧光显微镜,西安测维光电技术有限公司,型号:LWD300-38LT1;Ensipire多功能酶标仪,PerkinElmer,型号:2300;二氧化碳培养箱,赛默飞世尔科技(中国)有限公司,型号:371。

1.2 CCK-8法检测灯盏花乙素对LX-2细胞增殖的影响[8]

分别在正常状态和TGF-β1刺激下观察灯盏花乙素对LX-2细胞增殖的影响。将LX-2细胞消化成单细胞悬液,按1×104个/孔接种于96孔板中,培养24小时后,加入灯盏花乙素,TGF-β1刺激的组别同时加入2 pg/L的TGF-β1,培养24小时,加入CCK-820μL,培养0.5小时,采用酶标仪在450 nm波长处测定其光吸收值。

1.3 化学发光法检测灯盏花乙素对LX-2细胞Caspase3/7活力的影响

将LX-2细胞消化成单细胞悬液,按1×104个/孔接种于96孔板中,接种于96孔板中,培养24小时后,加入灯盏花乙素,再分别培养10小时和22小时,加入检测试剂,每孔100μL,继续培养2小时,用化学发光仪检测其化学发光值。

1.4 ELISA法检测灯盏花乙素对LX-2细胞Ⅰ型前胶原分泌的影响[9]

将LX-2细胞消化成单细胞悬液,按1×104个/孔接种于96孔板中,培养24小时,加入2 pg/L的TGF-β1和灯盏花乙素,再培养48小时,采用ELISA法检测上清中Pro-collagenⅠ的影响。

1.5 ELISA法检测灯盏花乙素对LX-2细胞TGF-β1信号通路Smad2、Smad3磷酸化水平的影响

将1.5×105个LX-2细胞接种于12孔板中,培养24小时后,换为无血清培养基,培养24小时,加入灯盏花乙素培养2小时,加入2 ng/mL TGF-β1,30分钟后,将上清吸出,用PBS冲洗细胞1次,加入细胞裂解液,在冰上孵育5分钟,将细胞刮下来,超声2次,3000 rpm,离心10分钟,将上清取出,每孔加100μL稀释后的细胞裂解液到酶标板中,之后按试剂盒说明书进行操作。

1.6 统计学处理

实验数据采用SPSS 14.0进行数据分析,计量资料以均数±标准差()表示,对各组数据先进行方差齐性检验。如方差齐,用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析,Dunnet-t检验;如果方差不齐,进行对数转化后,再进行方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 灯盏花乙素对LX-2细胞增殖的影响

1、10、100μmol/L 3个浓度的灯盏花乙素作用24小时对正常LX-2细胞活力无明显影响;2 pg/L TGF-β1作用24小时可明显诱导HSC的增殖,10μmol/L和100μmol/L灯盏花乙素对TGF-β1诱导的LX-2细胞增殖有抑制作用,提示灯盏花素有抑制TGF-β1诱导的HSC增殖的作用。见表1。

2.2 灯盏花乙素对LX-2细胞Caspase3/7活力的影响

灯盏花乙素作用12小时和24小时,只有100μmol/L的灯盏乙素能提高LX-2细胞的Caspase3/7活力,表明只有高浓度的灯盏花素可在一定程度上诱导HSC的凋亡,灯盏花乙素对HSC增殖的抑制作用并非全部通过诱导凋亡而实现。见表1。

注:与0μmol/L比较,aP<0.05。

2.3 灯盏花乙素对LX-2细胞Ⅰ型前胶原分泌的影响

灯盏花乙素对正常HSC分泌Ⅰ型前胶原没有影响;TGF-β1刺激LX-2细胞后,细胞分泌Ⅰ型前胶原显著增多,1、10、100μmol/L 3个浓度的灯盏花乙素都抑制了Ⅰ型前胶原的分泌,提示灯盏花乙素具有抑制星形细胞分泌胶原的能力。见表2。

注:与0μmol/L比较,aP<0.05。

2.4 灯盏花乙素对LX-2细胞TGF-β1下游信号通路分子p-Smad2和p-Smad3水平的影响

TGF-β1刺激LX-2细胞后,TGF-β1信号通路Smad2和Smad3磷酸化水平显著提高,灯盏花乙素10和100μmol/L不同程度上抑制了2个分子磷酸化的程度,提示灯盏花乙素可以抑制TGF-β1信号通路相关分子,灯盏花乙素对星形细胞增殖和胶原分泌的抑制作用可能是通过抑制TGF-β1信号通路而实现的。见表3。

注:与Control比较,aP<0.05;与TGF-β1比较,bP<0.05。

3 讨论

灯盏花又名灯盏细辛,为云南地方性中草药,具有散寒解表、活血舒筋、止痛消积等功效,以灯盏花乙素为主要成分的灯盏花注射液在临床治疗脑血管疾病取得了很好的效果[10,11,12]。近年来发现灯盏花乙素在抗器官纤维化方面有一定作用。灯盏花乙素抗心肌间质纤维化的机制之一是能够抑制TGF-β1信号通路[13],笔者推测灯盏花乙素可能也是通过作用于TGF-β1信号通路而发挥抗肝纤维化作用。

肝脏TGF-β1由肝细胞、Kupffer细胞和内皮细胞分泌[14,15],被认为是在肝纤维化过程中发挥关键作用的细胞因子[16,17],它不但能促使肝星形细胞转化为成纤维细胞,而且是促进成纤维细胞分泌胶原纤维作用最强的细胞因子[18,18],能刺激细胞外基质的合成并抑制基质的降解[19]。正常情况下,TGF-β1是失活的状态,一旦激活,TGF-β1就会和细胞膜表面的TGF-β受体结合,形成二聚体,转入膜内,引起Smads家族转导子主要是Smad2和Smad3的磷酸化,之后和Smad4结合,转入细胞核,调节靶基因的表达[20,21]。Smads被认为是TGF-β1介导胶原合成、促进纤维化的关键通路。

笔者检测了灯盏花乙素对肝星形细胞的作用及对TGF-β/Smad信号通路相关因子的影响。实验结果表明灯盏花乙素能抑制肝星状细胞的增殖,降低细胞活力,抑制Smad 2和Smad3的磷酸化,从而抑制TGF-β/Smad信号通路,这可能是灯盏花乙素抗肝纤维化的作用机制之一。