PC12

PC12（共5篇）

PC12 篇1

细胞缺糖缺氧 (Oxygen-Glucosedeprivation, OGD) 损伤多见于脑缺血、心肌缺血等缺血性损伤疾病。ODG是血管性痴呆 (Vascular dementia, VD) 的典型症状, 其发生发展与神经细胞所处的OGD环境有密切关系。坏死和凋亡是缺血性神经细胞损伤的两种主要形式。当归作为中医圣药, 含有阿魏酸、藁本内酯、当归多糖等多种成分, 对免疫系统、循环系统、呼吸系统、血液系统等均有一定的药理作用[1,2]。笔者选择当归多糖进行研究, 尝试从酶学角度揭开当归治疗VD的机制。

1 材料与仪器

PC-12细胞 (上海中科院生物研究所) ;LDH、T-SOD、MDA试剂盒 (南京建成生物工程研究所, 批号:20110928) ;新生小牛血清 (Gibco公司) ;DMEM培养基 (Sigma公司, 批号:20120430) ;低亚硫酸钠 (天津精细化工有限公司, 批号:20120405) ;Benchmark plus连续波长酶标仪 (上海新振仪器设备有限公司) ;倒置显微镜 (日本奥林巴斯光学株式会社, 型号:IX71) ;COULTER EPICS XL流式细胞仪 (美国beckman公司) ;CFX-96实时反应系统 (美国博乐公司) 。

2 方法

2.1 VD细胞模型制备和分组

参考石瑞丽等[3,4]方法稍加改进建立OGD模型, 在CO2培养箱 (37℃, 5%CO2) 中, 采用含15%新生小牛血清的DMEM培养液培养PC12细胞, 2~3天传代1次, 取对数生长期细胞进行实验。将正常DMEM培养液 (含15%的新生小牛血清) 培养的PC12细胞作为正常对照组;在5%CO2、37℃培养箱中, 将各组缺糖缺氧1、4、12h的PC12细胞模型组分别用含20mmol·L-1与40mmol·L-1低亚硫酸钠的无糖PBS液培养相应时间后作为模型组, 测定相关指标。

2.2 四氮唑蓝比色法 (MTT法) 检测细胞活力

采用MTT法检测造模后PC12细胞的活力变化, 待PC12细胞生长至对数生长期时, 采用DMEM培养基将细胞浓度调至3×105个·mL-1。将上述各组细胞悬液分别以100μL/孔的计量滴入96孔培养板, 设置正常细胞对照孔和调零孔, 向调零孔中加入100μL DMEM完全培养基, 向对照组孔中加入100μL细胞悬液。实验处理后各组每孔加入MTT 10μL, 37℃孵育4h后移弃培养液, 每孔加入150μL DMSO, 振荡10min, 使结晶物充分溶解。在570nm波长下, 采用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值 (OD值) , 记录结果。

2.3 生化法检测细胞培养上清液LDH、MDA和SOD含量

经损伤处理后, 收集细胞上清液, 参照试剂盒说明书, 采用比色法于紫外可见分光光度计上检测上清液中LDH、MDA和SOD活性。

2.4 流式细胞术检测凋亡情况

采用Annexin V-FITC和PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况, 调整细胞计数为1×106个·mL-1, 接种于T-50培养瓶中, 参照试剂盒说明书进行检测, 记录激发光波长为475nm处的荧光强度。

2.5 统计学方法

采用SPSS11.5软件对所得数据进行处理, 实验结果均以均数加减标准差 (±s) 表示, 多组间比较单因素方差检验, 两组间检验比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞活力检测

采用MTT法检测细胞活力发现, 与空白对照组比较, 40mmol·L-1低亚硫酸钠1h模型组细胞存活率显著降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05) , 但随着时间的延长, 细胞存活率又有所回升, 可能与造模剂的逐渐消耗有关;与模型组比较, 各给药组细胞存活率均显著升高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

(±s, n=6)

注:与对照组比较, *P<0.05;与模型组比较, #P<0.05。

3.2 酶学指标检测

与模型组比较, 各组细胞溶液MDA含量均显著降低, T-SOD酶、LDH酶活性显著增强, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。与空白对照组比较, 40mmol·L-1低亚硫酸钠模型组细胞MDA含量显著升高, T-SOD酶、LDH酶活性显著下降, 组间比较差异具有统计学意义 (P<0.05) 。不同浓度的当归多糖作用于PC12细胞后, 与模型组比较, 200μg·L-1当归多糖组细胞MDA含量显著降低, T-SOD酶、LDH酶活性显著增强, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

3.3 细胞凋亡率检测

各剂量当归多糖组细胞存活率均高于损伤组, 且200μg·L-1浓度当归多糖组细胞存活率最高, 差异均具有统计学意义 (P<0.05) 。见图1。

(±s, n=6)

注:与对照组比较, *P<0.05;与模型组比较, #P<0.05。

3.4 RT-PCR检测Bax和Bcl-2的表达情况

随着剂量的增加, 当归多糖给药组细胞Bax表达量逐渐降低, Bcl-2表达量逐渐升高, 与空白组比较差异均具有统计学意义 (P<0.05) 。见表3。

注:与空白组比较, △P<0.05。

4 讨论

脑缺血导致的神经元死亡类型包括坏死、凋亡和自噬三种[5], 由于凋亡和自噬延迟发生, 使其成为药物治疗的靶点, 但自噬在其中的作用还存在争议[6]。缪春明等[7]通过对PC12细胞OGD损伤过程的研究发现, 自噬和凋亡在细胞OGD损伤过程的早期和晚期分别占有主导地位。凋亡蛋白表达引起细胞死亡, 凋亡造成的神经细胞大量丢失可能是VD发生的原因[8]。Bcl-2家族基因的表达和调控对细胞的凋亡有着至关重要的作用, 其可通过多种通路参与细胞凋亡信号转导。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中最有代表性的促进凋亡和抑制凋亡的基因, 其中Bax作为Bcl-2活性的主要调控因子, 参与细胞凋亡进程[9]。

采用一定浓度的连二亚硫酸钠与培养液中的低浓度O2反应模拟缺氧环境, 通过无糖PBS缓冲液模拟缺糖环境, 可有效避免频繁开合培养箱导致的造模环境不稳的弊端, 更方便有效地模拟ODG模型[3,4]。

最新研究表明, 当归提取物以及当归组成的复方补阳还五汤对血管性痴呆患者的行为学和海马神经元形态学等有较好的改善作用。大量文献提示当归相关制剂对心血管疾病患者血管内皮细胞、神经细胞等组织的Bax和Bcl-2表达有明显调节作用, 提示当归有效成分对血管性痴呆具有潜在的治疗作用[10,11,12,13]。本研究结果表明当归多糖能显著提高体外培养PC12的T-SOD、LDH的生物活性, 降低MDA含量, 降低细胞凋亡率, 这也表明当归多糖能有效提高PC12的抗凋亡能力, 可能与其调节Bcl-2/Bax的表达有关。

PC12 篇2

关键词：盐酸川芎嗪,谷氨酸,PC12细胞

谷氨酸的兴奋性神经毒性是缺血性脑血管疾病研究的一个重要方面, 并被认为是缺血性脑损害的中心环节[1]。近年来的大量实验研究表明, 盐酸川芎嗪有明显的活血化淤作用, 延缓并减轻微循环内红细胞和血小板聚集, 使已聚集的血小板解聚, 并能降低血小板表面活性, 降低血粘度与血脂, 降低纤维蛋白原, 抗血栓形成及溶解血栓的作用[2,3]。本实验以大鼠嗜铬细胞瘤细胞株为对象, 用25mmol/L谷氨酸造成细胞损伤模型, 观察不同浓度盐酸川芎嗪对谷氨酸损伤PC12细胞的保护作用。

1实验材料

1.1药品与试剂

PC12细胞:购自中国生命科学院上海细胞所;盐酸川芎嗪:扬州中宝制药有限公司, 批号060208;DMEM培养基:美国Gibco公司产品;胰蛋白酶 (Trypsin) :美国Gibco公司产品;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司产品;MTT:美国Amersco公司产品;尼膜同 (尼膜地平注射液) , BXBUH01.11, 德国拜尔医药保健股份有限公司;谷氨酸:美国Sigma公司产品;乳酸脱氢酶 (LDH) 测试盒:南京建成生物工程研究所。

1.2仪器

CO2培养箱 (MCO-175) :SANYO公司生产;倒置相差显微镜 (CKx41) :OLYMPUS公司生产;净化工作台 (SW-CJ-1F) :苏净集团安泰公司制造;全自动酶标仪 (ELX800UV) :io-TEK公司生产;蒸汽消毒锅 (ES-215) :TOMY KOGYO Co.LTD.;烘箱 (PH070A) :海一恒科技有限公司;恒温振荡器 (KQ-250DB) :常州国华电器有限公司;水平离心机 (LD4-8型) :北京医用离心机厂。

2实验方法

2.1实验分组

取同一代对数生长期的PC12细胞, 以1.0×105cell/孔种植于96孔培养板上, 放置于细胞培养箱内, 37℃, 5%CO2饱和湿度条件下, 24 h后更换培养液。随即分为正常对照组 (不加谷氨酸的正常细胞组) 、模型对照组 (谷氨酸损伤的细胞组) 、盐酸川芎嗪组 (在培养体系中浓度分别为19.5、39.0、78.0μg/mL) 、尼膜同对照组 (在培养体系中加入尼膜地平4.0μg/mL) , 同一水平8孔排列。

2.2盐酸川芎嗪对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的保护作用

按照2.1项下进行分组, 参照上述方法复制谷氨酸诱导的PC12细胞损伤模型, 在造模前先给予药物处理, 盐酸川芎嗪组分别给予终浓度为19.5、39.0、78.0μg/mL的药液尼膜同, 对照组给予终浓度为4.0μg/mL的尼膜同, 其余给予等体积的完全培养液, 培养1h, 除正常组外给予终浓度为25mmol/L谷氨酸造模, 再培养24h。用于细胞活力检测和培养上清液中乳酸脱氢酶活性测定。

2.2.1 MTT法检测细胞活力

培养结束后, 弃去培养液, 每孔加入5mg/mL MTT 15μL, 继续培养4h, 弃去上清液, 每孔加入200μL的DMSO 溶液, 反复震荡10min, 直至MTT 反应的蓝色结晶产物完全溶解, 用酶标仪检测490nm 波长处各孔样品的吸光度A值, 以吸光度反映细胞活力。

2.2.2 培养上清液中乳酸脱氢酶的活性测定

培养结束后, 吸取培养上清液, 按照乳酸脱氢酶测试盒说明, 在440nm处测定各组细胞LDH活性。

2.3统计学处理

各组实验结果均以undefined表示, 组间比较采用t检验。

3结果

3.1盐酸川芎嗪对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的细胞活力影响

25mol/L谷氨酸和PC12细胞共同培养24h后, 和未加入谷氨酸的正常PC12细胞相比, 细胞的活力明显下降, 加入盐酸川芎嗪 (19.5、39.0、78.0μg/mL) 能明显改善细胞活力, 其中浓度为39.0、78.0μg/mL的盐酸川芎嗪作用尤为明显。结果见表1。

注:和正常对照组比较:##P<0.01;和模型对照组比较:*P<0.05;**P<0.01:19.5、39.0、78.0μg/mL。

注:和正常对照组比较:##P<0.01;和模型对照组比较:*P<0.05;**P<0.01。

3.2盐酸川芎嗪对谷氨酸诱导的PC12细胞培养上清液中乳酸脱氢酶 (LDH) 的影响

谷氨酸损伤后PC12细胞培养上清液中的LDH活性明显高于正常组 (P<0.01) , 加入盐酸川芎嗪后, 与模型组相比, 培养上清液中LDH活性明显降低 (P<0.01) 。见表2。

4讨论

本实验采用的神经细胞为肾上腺嗜铬细胞瘤分化的细胞株, 与原代培养的神经细胞相比, 具有细胞单一, 生长繁殖快, 培养周期短, 作用方便, 更易控制等优点, 是在体外条件下研究神经元损伤和药物作用的较为理想的细胞。本实验利用谷氨酸诱导PC12细胞损伤模型, 在体外模拟急性缺血性脑血管疾病的基本病理过程。谷氨酸是脑组织内主要的兴奋性氨基酸, 正常情况下, 谷氨酸等兴奋性氨基酸主要存在于神经末梢的囊泡内, 细胞间隙的谷氨酸浓度受神经细胞和神经胶质细胞高摄取系统控制, 不会积累到神经元损伤的浓度。但在脑缺血时, 由于ATP耗竭, 钙离子大量内流, 导致以谷氨酸为代表的兴奋性氨基酸的再摄取减少、释放增多, 引发神经细胞毒性损伤。在此模型建立的基础上, 通过MTT法检测细胞活力和培养上清液中LDH的活性, 观察盐酸川芎嗪在对神经细胞的保护作用。实验结果显示盐酸川芎嗪可使损伤神经细胞活力显著增强, LDH活性明显下降, 表明盐酸川芎嗪可减轻兴奋性氨基酸所致的神经元损伤, 对神经元具有保护作用。

参考文献

[1]姜寿峰, 边连防, 陈晓红, 等.胰岛素对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的保护[J].中国老年学杂志, 2005, 25 (1) :62.

[2]陈泽涛.川芎嗪在脑血管病治疗中的应用[J].中国中西医杂志, 2003, 23 (5) :378.

PC12 篇3

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)Makino)又名天堂草、福音草,是葫芦科绞股蓝属多年生草本攀岩植物,中医认为绞股蓝性凉、味苦,入药具有消炎解毒、止咳祛痰的功效。现代药理学研究发现,绞股蓝皂苷为绞股蓝的主要活性成分,具有降血脂、抗肿瘤、保护肝脏等多种药理作用[5]。近年来某些学者发现绞股蓝皂苷对中枢神经系统也具有一定的保护作用,可明显改善D-半乳糖、SAMP8、β淀粉样蛋白(Aβ1~40)以及脑血管损伤等痴呆动物模型的学习记忆能力,保护并修复已受损的中枢神经系统,这种保护作用可能与绞股蓝皂苷的抗氧化及抗炎机制有关[6,7]。

本研究从体外实验的角度将研究对象由动物模型转变成常见的PC12神经细胞株,采用低糖低血清、谷氨酸及β淀粉样蛋白(Aβ25~35)3种物质诱导该细胞,模拟不同发病机制的老年痴呆症模型,通过研究绞股蓝皂苷对PC12细胞的保护作用,为老年痴呆症的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

PC12细胞由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供。

1.2 药品与试剂

绞股蓝皂苷(安康正大制药有限公司,国药准字Z10900013);DMEM高糖培养基(含10% 小牛血清,10%马血清,100U·mL-1青霉素,100μg·mL-1链霉素)、DMEM无糖培养基(含1%小牛血清,1%马血清,100U·mL-1青霉素,100μg·mL-1链霉素)(美国Gibco公司);甲基噻唑蓝四氮唑盐、谷氨酸、β淀粉样蛋白(Aβ25~35)(美国Sigma公司);二甲基亚砜、胰蛋白酶(美国Biotium公司);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)

1.3 仪器

HERAcell 150i型CO2 培养箱(美国Thermo公司);Olympus IX51型倒置显微镜(日本Olympus公司);Allegra 25R型高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特有限公司);酶标仪(美国Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养与分组

将PC12 细胞接种到含有10% 小牛血清的DEME高糖培养基中,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,取对数生长期的细胞进行实验。实验随机分为5 组:空白对照组、模型组、绞股蓝低剂量(50μg·mL-1)组、绞股蓝中剂量(200μg·mL-1)组和绞股蓝高剂量(500μg·mL-1)组。

1.4.2 绞股蓝皂苷对PC12细胞增殖的影响

将对数生长期的PC12细胞用0.25%的胰蛋白酶进行消化,吹打成单细胞悬液,按1×108个/L的密度接种到96孔培养板中,每孔100μL,置于CO2培养箱中培养24h后,吸去DEME高糖培养液,加入新鲜配制的浓度为50、200、500μg·mL-1的绞股蓝皂苷培养液,对照组加入等量的高糖DEME培养液,实验中每组设6个平行,继续培养24h后采用MTT法检测细胞存活率。

1.4.3 绞股蓝皂苷对低糖低血清损伤PC12细胞的影响

将单细胞悬液按每毫升1×108个的密度接种到培养板中培养24h后,分别加入低、中、高剂量组的绞股蓝皂苷培养液,对照组加入等量的空白DEME高糖培养液,待细胞适应1h后,再向模型组和绞股蓝低、中、高剂量组加入DMEM无糖培养液,对照组仍用等量的DEME高糖培养液进行补充,实验中每组设6个平行,待细胞培养到24h后采用MTT法检测细胞存活率。

1.4.4 绞股蓝皂苷对谷氨酸损伤PC12细胞的影响

方法同1.4.3,将模型组和给药组中的低糖低血清换成等量的20mmol·L-1的谷氨酸,MTT法测定细胞存活率。

1.4.5 绞股蓝皂苷对Aβ25~35损伤PC12细胞的影响

方法同1.4.3,将低糖低血清换成等量的10μmol·L-1的Aβ25~35,MTT法测定细胞存活率。

1.4.6 细胞存活率和及乳酸脱氢酶(LDH)活力的测定

细胞培养前4h,向培养板中加入5mg·mL-1的MTT 20μL,于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养,待培养液中有蓝紫色的结晶出现后,吸去培养液,加入150μL的DMSO,震荡15 min,待紫色结晶完全溶解,用酶标仪测定570nm处的光密度值,并计算细胞存活率,具体公式如下:

收集培养板中的培养液,取50μL参照乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒说明书测定LDH活力。

1.4.7 统计学处理

采用SPSS统计学软件对实验数据进行统计分析,计量资料用(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,p<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝皂苷对PC12细胞增殖的影响

由图1可以看出,采用不同剂量的绞股蓝皂苷处理PC12细胞24h后,细胞存活率均显著高于对照组(p<0.01);随着绞股蓝皂苷剂量的不断增加,细胞存活率也逐渐升高,这可能是由于绞股蓝皂苷具有抗氧化作用的特性,减少自由基对PC12细胞的损害,促进细胞继续增殖。

注:与对照组比较##p﹤0.01Note:compared with normal group##p﹤0.01

2.2 绞股蓝皂苷对低糖低血清损伤PC12细胞的影响

正常P12细胞经低糖低血清处理后,其细胞存活率明显下降(p<0.01),这说明低糖低血清能引起PC12细胞出现损伤,当加入不同剂量的绞股蓝皂苷后,细胞存活率显著提高,在中、高剂量组中细胞存活率甚至超过了对照组,可见绞股蓝皂苷不仅能缓解低糖低血清造成的细胞损伤,而且还能进一步促进细胞的增殖。具体结果如图2所示。

注:与对照组比较##p﹤0.01;与模型组比较**p﹤0.01Note:compared with control group##p﹤0.01;compared with modle group**p﹤0.01

2.3 绞股蓝皂苷对谷氨酸损伤PC12细胞的影响

由图3可见,采用谷氨酸对PC12细胞进行处理后,谷氨酸模型组与正常对照组相比,细胞存活率显著下降(p<0.01),添加不同剂量的绞股蓝皂苷对PC12细胞进行预处理后,细胞存活率相比模型组明显上升(p<0.01,p<0.05),这说明绞股蓝皂苷可对抗谷氨酸,保护PC12细胞免受损伤。

注:与对照组比较##p﹤0.01;与模型组比较*p﹤0.05,**p﹤0.01Note:compared with control group##p﹤0.01;compared with modle group*p﹤0.05,**p﹤0.01

2.4 绞股蓝皂苷对损伤Aβ25~35PC12细胞的影响

由图4 可以看出,添加10μmol· L-1的Aβ25~35后,模型组与对照组相比细胞存活率明显下降(p<0.01),可见Aβ25~35对正常PC12细胞具有明显损伤;添加不同剂量的绞股蓝皂苷对细胞进行预处理后,给药组的细胞存活率明显高于模型组(p<0.01),这说明绞股蓝皂苷对Aβ25~35引起的细胞损伤具有明显的保护作用。

注:与对照组比较##p﹤0.01;与模型组比较**p﹤0.01Note:compared with control group##p﹤0.01;compared with modle group**p﹤0.01

2.5 绞股蓝皂苷对乳酸脱氢酶(LDH)活力的影响

由表1 可以看出,低糖低血清、谷氨酸和Aβ25~35对PC12细胞处理后,LDH含量显著增加(p<0.01)。乳酸脱氢酶(LDH)的水平高低是反映细胞是否受到损害的一个敏感性指标。当细胞出现损伤时,细胞膜通透性将增加,细胞内LDH将逐步释放到培养液中,导致培养液中LDH含量增多,因此测定培养液中LDH水平的高低可以判断细胞损伤的程度[8]。LDH水平越高说明细胞受损程度越严重,因此以上3种物质对PC12细胞的损伤程度依次为谷氨酸>Aβ25~35>低糖低血清;实验中加入不同剂量的绞股蓝皂苷后,与模型组相比,培养液中LDH释放水平显著降低(p<0.05),且降低程度与绞股蓝皂苷呈剂量依耐性,这进一步证实了绞股蓝皂苷可减少LDH的释放,对低糖低血清、谷氨酸和Aβ25~35引起的细胞损伤有明显的保护作用。

注:与对照组比较##p ﹤0.01;与模型组比较*p ﹤0.05,**p ﹤0.01Note:compared with control group##p ﹤0.01;compared with modle group*p ﹤0.05,**p ﹤0.01

3 讨论

阿尔茨海默病(AD)是一种发病机制非常复杂的神经系统退行性疾病,人们根据发病机制的不同,在体外构建了各种神经细胞病理模型,包括淀粉样蛋白损伤模型、过氧化氢损伤模型、谷氨酸损伤模型、缺血缺氧损伤模型等,这些模型构建方法简单,周期较短,重复性好,现已成为AD药物筛选和神经系统病理机制研究中的常见模型[9~12]。PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株,具有神经内分泌细胞的一般特征,培养过程中因其具有可传代的特点而广泛应用于神经生理与神经药理研究中。

神经细胞代谢异常活跃,为维持神经系统正常运行,神经细胞需要不断地从外界摄取能量。研究发现,当神经细胞处于缺血、缺氧的环境中时,其能量代谢将出现障碍,引起神经元变性、凋亡,因此低糖低血清损伤模型常作为体外血管性痴呆模型。

谷氨酸是中枢神经系统中一种十分重要的兴奋性递质,参与各种神经功能活动。近年来研究发现,谷氨酸不仅可作为营养因子促进神经元及轴突的生长发育,同时也是一种神经毒素,它能激活谷氨酸受体,导致神经元代谢紊乱并出现肿胀而死亡,同时还可竞争神经细胞膜上的谷氨酸/胱氨酸逆转因子,破坏细胞对胱氨酸的摄取,导致胞内谷胱甘肽含量下降,活性氧大量积累,最终迫使神经细胞出现死亡[13]。

β淀粉样蛋白(Aβ)是AD老年斑的主要成分,由β-淀粉样蛋白前体(APP)通过蛋白酶水解生成。正常情况下,APP会在α蛋白酶和γ蛋白酶的帮助下进行水解,该过程中不会产生β淀粉样蛋白;但当有β蛋白酶存在时,APP会改变氨基酸水解位点,生成Aβ1~42/43和Aβ1~40,其中Aβ1~40可引起神经元功能丧失进而导致死亡[14]。研究发现,在体外水溶液中,Aβ1~40中25到35位氨基酸残基可形成稳定的聚集,产生神经毒性,因此Aβ25~35常作为体外神经细胞毒性实验的AD模型[15]。

PC12 篇4

依托考昔为选择性COX-2抑制剂,是一种非甾体类抗感染药,可以特异性地抑制COX-2的表达,抑制AA代谢转化成PGE2。本研究以PC12细胞低氧缺糖(OGD)模型模拟脑缺血损伤[2],探讨新型COX-2抑制剂依托考昔对脑缺血损伤的影响,以期为依托考昔在临床上治疗脑缺血提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司),MTT(Sigma公司),LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所),COX-2抗体(武汉博士德生物有限公司),羊抗鼠荧光二抗(Abchem公司),依托考昔(默沙东公司),尼莫地平(中国药品生物制品检定所)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

PC12细胞由浙江大学神经药理教研室馈赠。PC12细胞培养于含有10%胎牛血清,青、链霉素各100 U/ml的高糖DMEM培养基中,置于37℃饱和湿度、含5%CO2和95%空气的恒温箱中培养,0.25%胰蛋白酶消化传代。待细胞传至10～20代时进行实验。

1.2.2 PC12细胞OGD模型的建立[3]

PC12细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板内,贴壁24 h后处理。培养板内细胞以无糖Earles平衡盐溶液(无糖OGD液:NaCl 6.8 g/L,KCl 0.4 g/L,CaCl2·2H2O 0.264 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,NaH2PO4·2H2O0.156 g/L,NaHCO32.2 g/L)洗涤2次,换成无糖OGD液,将培养板置于密闭OGD罐内,通以95%N2-5%CO2气体,通气30 min后,置于37℃培养箱内继续培养相应时间。正常对照采用有糖OGD液于培养箱内培养相应时间。

1.2.3 药物处理

PC12细胞接种于96孔板贴壁后,给以不同浓度的依托考昔(Eto)(10、20、40、80、160 mmol/L)预处理30 min,换成OGD液进行OGD处理相应时间,OGD过程中全程给药。采用尼莫地平(Nim)作为阳性对照。

1.2.4 MTT法检测PC12细胞存活率

细胞经OGD处理后,将孔内液体换成有糖OGD液,加入MTT液使终浓度为0.5 mg/ml,继续培养4 h后,弃去孔内液体,加入100 ml二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝紫色复合物,振荡10 min,于酶标仪上490 nm波长处测定吸光度值。

1.2.5 乳酸脱氢酶(LDH)活性检测细胞损伤

细胞经OGD及药物处理后,收集培养上清液,按照LDH试剂盒说明操作并计算LDH释放率,并与对照组比较。

1.3 统计学方法

数据以均数±标准差表示,经SPSS 12.0软件统计,两组间各项检测指标进行One-way ANOVA分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OGD处理诱导PC12细胞损伤

镜下观察,正常的PC12细胞清晰可见,呈梭状;OGD损伤后细胞皱缩、结团,胞体折光性下降。OGD 4 h细胞开始出现损伤,存活率为对照组的87%左右,OGD 6 h后细胞存活率为对照组的68%左右(图1),与对照组比较,差异有高度统计学意义(P<0.01)。

2.2 COX-2抑制剂依托考昔对PC12细胞OGD损伤的保护作用

COX-2选择性抑制剂依托考昔能明显改善OGD诱导的PC12细胞损伤的形态学变化(图2A)。与对照组比较,40～80 mmol/L依托考昔能显著增加OGD 6 h后PC12细胞的存活率(图2B),并降低LDH释放率(图2C)。

3 讨论

缺血性脑损伤在临床上较常见,因其较高的发病率、死亡率、致残率及复发率影响生存质量。缺血性脑损伤时,花生四烯酸通过代谢产生大量TXA2、PGs及白三烯等炎性物质。TXA2和部分前列腺素可诱导血小板聚积、脑血管痉挛与血管通透性增加,促进血-脑屏障开放,加重脑损伤与脑水肿形成[4]。同时,花生四烯酸经COX-2代谢过程中产生大量氧自由基,导致神经细胞损伤[5]。研究发现,脑缺血-再灌注后COX-2在神经元、脑血管内皮细胞中表达增强。此外,在大鼠脑缺血损伤的灶性缺血区,COX-2 mRNA与蛋白水平也有显著增加[6]。同时研究表明,在大鼠脑缺血-再灌注模型中,COX-2选择性抑制剂NS398、塞来昔布等均能通过缩小梗死面积减少PGE2的聚集,减少氧自由基产生,提高SOD活性减轻缺血后损伤,从而产生脑保护作用[7,8]。另一种COX-2抑制剂尼美舒利能降低血-脑屏障通透性及白细胞浸润,从而保护脑损伤[9]。

本研究发现,依托考昔在离体水平上能显著保护OGD诱导的PC12细胞损伤。经依托考昔处理后,PC12细胞存活率与对照组比较,在浓度为40～80 mmol/L时有显著性增加(P<0.05),同时LDH释放率显著降低(P<0.01),显示依托考昔对OGD诱导的PC12细胞损伤具有显著的保护作用。

摘要：目的:探讨环氧化酶-2(COX-2)抑制剂依托考昔对PC12细胞低氧缺糖损伤(OGD)的保护作用。方法:以PC12细胞OGD损伤模拟脑缺血损伤模型,依托考昔的给药浓度分别为10、20、40、80、160mmol/L,采用光镜观察细胞形态学变化,以MTT法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤。结果:依托考昔(40～80mmol/L)能增加OGD损伤后PC12细胞的存活率,并减少LDH释放(P<0.05)。结论:COX-2抑制剂依托考昔对OGD诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。

关键词：依托考昔,环氧化酶,脑缺血

参考文献

[1]Planas AM,Soriano MA,Rodriguez-Farre E,et al.Induction of cyclooxygenase-2mRNA and protein following transient focal ischemia in the rat brain[J].Neurosci Lett,1995,348(3):187-190.

[2]Zhou T,Xu B,Qu EH,et al.Neurons derived from PC12cells have the potential to develop synapses with primary neurons from rat cortex[J].Acta Neurobiol Exp(Wars),2006,66(2):105-112.

[3]Tauskela JS,Chakravarthy BR,Murray CL,et al.Evidence from cultured rat cortical neurons of differences in the mechanism of ischemic precon-ditioning of brain and heart[J].Brain Res,1999,827(1-2):143-151.

[4]Steiner AA,Ivanov AI,Serrats J,et al.Cellular and molecular bases of the initiation of fever[J].Plos Biol,2006,4(9):e284.

[5]Wang T,Qin L,Liu B,et al.Role of reactive oxygen species in LPS-induced production of prostaglandin E2in microglia[J].J Neurochem,2004,97(4):939-947.

[6]Yokota C,Kaji T,Kuge Y,et al.Process citation[J].Neurosci Lett,2004,357(3):219-222.

[7]Institoris A,Farkas E,Berczi S,et al.Effects of cyclooxygenase(COX)inhibition on memory impairment and hippocampal damage in the early period of cerebral hypoperfusion in rats[J].Eur J Pharmacol,2007,574(1):29-38.

[8]Chu K,Jeong SW,Jung KH,et al.Celecoxib induces functional recovery after intracerebral hemorrhage with reduction of brain edema and perihematomal cell death[J].J Cereb Blood Flow Metab,2004,24(8):926-933.

PC12 篇5

1 材料

1.1 动物及细胞株

SD雄性大鼠,体重(190~210g),购于北京维通利华实验动物技术有限公司。PC12细胞株购于中科院上海细胞库,在DMEM高糖培养液(pH7.0)、37℃、5%CO2的孵育箱中培养。培养液含3.7%的碳酸氢钠、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10%胎牛血清和1%谷氨酰胺。

1.2 药品与试剂

镇肝熄风汤由怀牛膝30g、代赭石30g、龙骨30g、牡蛎30g、龟板30g、玄参15g、天冬15g、白芍30g、茵陈15g、川楝子10g、麦芽30g、甘草6g组成。中药水煎、过滤、浓缩后,令每毫升含生药2g,储存于4℃冰箱中备用。DMEM高糖培养基(Gibco公司);胎牛血清(hyclone公司);MPP+(Sigma公司);蛋白提取试剂盒(碧云天公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司);p-c-jun兔抗鼠多克隆抗体、c-jun抗鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记IgG二抗(Santa公司)。

2 方法

2.1 镇肝熄风汤载药脑脊液(CSF-ZGXF)制备

SD雄性大鼠按含生药28g/kg给予镇肝熄风汤水煎剂,正常对照组给予同体积生理盐水。最后1次给药1.5h后,3%的水合氯醛麻醉SD大鼠,颈后部备皮并用75%酒精消毒。从大鼠枕骨大孔进行无菌穿刺并缓慢抽出脑脊液。脑脊液3000rpm4℃离心10min,收集上清液用0.22μm滤膜过滤,-80℃冻存备用。

2.2 药物处理

实验分空白对照组、MPP+对照组、CSF-ZGXF组,共3组。PC12细胞经0.125%胰蛋白酶消化后以1×105细胞/cm2接种于96孔培养板培养24h。各组细胞加入CSF或培养基,在37℃,5%CO2饱和湿度孵育箱内培养30min后,正常对照组加入培养基,其他2组分别加入含250μmol/L MPP+的DMEM培养基,细胞继续培养72h。

2.3 Western blotting检测PC12细胞p-c-jun蛋白表达

采用细胞蛋白抽提试剂盒提取PC12细胞蛋白质,提取的蛋白质保存于-70℃低温冰箱备用。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测提取样品中蛋白质的浓度后,将蛋白质50μg加入2×SDS凝胶加样缓冲液中经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。胶中蛋白质在70mA恒流状态下4℃过夜电转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜经5%脱脂奶粉在37℃封闭2h。加入一抗c-jun(1∶1500)和p-c-jun(1∶1000),硝酸纤维素膜4℃孵育过夜。与辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(1∶5000)37℃孵育1h。用western blotting印迹荧光发光检测试剂盒曝光、压片。western blotting检测结果采用AlphaImager(tm)图像分析系统扫描,利用AlphaEaseFC软件中SpotDenso功能测定积分光密度值。

2.4 统计学分析

结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析。各组之间差异的显著性分析采用2组独立样本的t检验。

3 结果

western blotting检测PC12细胞p-c-Jun蛋白表达(图1和表1)结果显示,与正常对照组比较,MPP+组p-c-Jun表达显著上调。与MPP+组,CSF-ZGXF组的p-c-Jun蛋白的表达显著降低。

4 讨论

帕金森病病机复杂,在短期内要获得很好的疗效,则有一定困难。西医目前临床治疗PD,主要是应用L-多巴等DA替代疗法,虽能使PD患者的临床症状在一定时间内获得一定程度的好转,但均不能阻止本病的自然进展,且各种药物都有不同程度的毒副反应,因而限制了其自身在临床上的应用[3]。因此研制安全、有效、可控的药物是当前乃至今后医学科研的重点。挖掘中医学宝库,筛选有效且毒副作用小的方药越来越受到学者的关注。

采用中药及复方直接进行体外实验,难以反映机体真实血药浓度下的药理作用及变化规律,阻碍了中药作用物质基础和作用机制研究的发展。血清药理学在方法学上解决了中药复方提取物直接应用于离体实验的难点,可以研究进入体内的中药有效成分或其代谢产物的药理作用。在体外进行中药对神经保护作用研究时,由于血脑屏障的存在,使脑的内环境、神经元生存的微环境与身体血液系统有着显著的不同,而且药物是否能透过血脑屏障成为研究中药神经保护作用的关键。同时,由于血清中含有多种活性酶及蛋白,对神经细胞均有一定的影响。基于此,梅建勋等用含药脑脊液代替含药血清,建立了中药脑脊液药理学方法。本研究采用脑脊液药理学方法克服了中枢神经系统存在血脑屏障的问题,同时排除了体外实验的各种干扰因素,可直接以观察镇肝熄风汤作用于中枢神经系统的药效学效应。

丝裂原激活的蛋白激酶是信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递。从细胞外刺激作用于细胞,至细胞出现相应的生物学效应,其间通过了MAPK信号转导通路多级蛋白激酶的级联反应。JNK信号通路是MAPK中重要的通路之一。JNK的活化是通过其氨基酸残基磷酸化,一旦被激活,胞浆中的JNK移位到细胞核。活化的JNK可以和c-Jun的氨基末端区域结合,使转录因子的活性区域发生磷酸化。c-Jun属于亮氨酸拉链家族成员,它以同二聚体或异二聚体复合物的形式和许多基因启动子上的AP-1(activator protein-1)和AP-1样位点结合,提高AP-1的转录活性。研究提出将JNK下游底物c-Jun的显性阻滞突变体转染至NGF诱导分化的PC-12细胞中,发现该突变体可以抑制MEKK1及NGF撤除诱发的细胞凋亡。最近一些研究也证实JNK通路的激活与细胞凋亡有密切关系。c-Jun的过度激活与表达能提高转录因子复合物AP-1的DNA结合活性,促进多种凋亡蛋白的表达,从而启动下游级联反应导致细胞凋亡。

本研究发现,与空白对照组比较,CSF-ZGXF组p-c-jun蛋白表达显著升高;与MPP+组比较,CSF-ZGXF组p-c-jun蛋白表达显著降低,表明CSF-ZGXF对MPP+诱导的c-jun磷酸化具有一定抑制作用。因此,我们推测,镇肝熄风汤可能通过抑制c-jun磷酸化,从而起到对PC12细胞的损伤保护作用,进而发挥抗PD作用。

摘要：目的 探讨镇肝熄风汤载药脑脊液对甲基-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导的PC12细胞c-Jun磷酸化的影响。方法 镇肝熄风汤载药脑脊液预处理体外培养的PC12细胞后,加入MPP+诱导PC12细胞损伤模型。用Western blotting检测c-Jun和phospho-c-jun蛋白表达。结果 MPP+处理72h,与空白对照组比较,模型组phospho-c-jun蛋白表达显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,镇肝熄风汤载药脑脊液组phospho-c-jun蛋白表达显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。而各组之间c-jun蛋白表达无显著性差异(P>0.05)。结论 镇肝熄风汤载药脑脊液对MPP+诱导的PC12细胞c-Jun磷酸化具有抑制作用。

关键词：帕金森病,镇肝熄风汤,载药脑脊液,c-Jun,1-甲基-4-苯基吡啶离子

参考文献

[1]Naoi M,Maruyama W.Cell death of dopamine neurons in aging and Parkinson's disease[J].Mech Ageing Dev,1999,111(2～3):175～188.

[2]夏荣蓉,吴颢昕,姜惟.镇肝熄风汤对实验性脑出血大鼠低氧诱导因子-1α的影响[J].中华实用中西医杂志,2005,7(18):958～959.

[3]高敏,郭彩红,林莹莹.帕金森病的中医临床研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(2):11～13.