iNOS

iNOS（共7篇）

iNOS 篇1

研究表明肿瘤组织中iNOS (诱导型一氧化氮合酶) 的表达上调, 其催化产生的内源性NO在肿瘤的生物学中起重要作用, 本文主要从iNOS与肿瘤的产生、生长和转移的关系加以综述。

1 iNOS对肿瘤基因的影响

研究表明在多种肿瘤组织已检测到表达上调的iNOS。如NO与其代谢产物活性氧类可氧化DNA, 造成链断裂、交叉联结等多种DNA损伤;或通过氧化应激形成过氧化亚硝酸盐造成DNA损伤, 从而引起基因突变[1,2]。此外, 由iNOS催化合成的NO对原癌基因、抑癌基因具有调节作用。p53基因为公认抑癌基因;bcl2是公认的原癌基因。DasT等[3]在研究中发现, 葡萄球菌A蛋白在抗肿瘤过程中可诱导宿主细胞释放NO, 引起p53表达增加, bcl2表达下降。NO可通过抑制双微体而抑制p53从胞核导出发生突变, 从而提高p53的核保有量, 稳定激活p53基因[4]。

2 iNOS与肿瘤生长、转移的关系

2.1 肿瘤血管形成是肿瘤生长和转移的基础, 肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞产生的内源性NO, 在促进肿瘤血管形成和保证肿瘤最大血供方面起重要作用

在许多实体瘤组织中, 如头颈部鳞癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、妇科肿瘤等, 均发现有NOS的表达和活性的增加;而且NOS的活性与肿瘤的恶性程度呈正相关。Gallo等[5]对头颈部肿瘤的研究发现: (1) 肿瘤总的NOS活性和cGMP水平显著高于正常黏膜; (2) 伴有颈部淋巴结转移的肿瘤组织比无淋巴结转移的肿瘤组织有更多的新生血管形成; (3) 将具有高活性NOS的肿瘤组织植入兔角膜可诱导新的血管形成, 这种作用可被NOS抑制剂所抑制; (4) 肿瘤边缘血管形成是肿瘤转移的独立预告因素。Tschugguel等[6]在人乳腺癌NOS活性和NO的合成较良性肿瘤和正常组织高, 而且在浸润性导管癌中, Ⅲ级分化的肿瘤NO合成明显高于Ⅱ级分化的肿瘤。Teruo等[7]对裸鼠人乳腺癌骨转移的研究发现, 腹腔注射NOS抑制剂L-NAME时, 可明显抑制肿瘤的骨转移。这些结果均提示NOS的表达与肿瘤血管形成及肿瘤的进展密切相关。

2.2 亦有相关研究提示NO具有抗肿瘤的作用

(1) NO介导巨噬细胞的抗肿瘤作用:Jiang等[8]研究表明NO是活化巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的主要效应分子, NO介导活化巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的机理可能是T淋巴细胞识别肿瘤抗原, 分泌细胞因子, 刺激巨噬细胞产生NO, NO杀伤肿瘤细胞; (2) NO干扰肿瘤细胞代谢;Yasushi等[9]研究证实, NO能与肿瘤细胞代谢关键酶的活性部分铁硫基团结合, 形成铁-亚硝酰基复合物, 引起酶中铁的丢失, 使含铁酶活性丧失, 从而抑制肿瘤细胞的生长或引起肿瘤细胞死亡; (3) NO形成高毒性的羟自由基:NO可与肿瘤细胞产生的超氧阴离子 (O2-) 结合, 形成羟自由基 (OH·) , OH·具有很高的活性, 可诱导肿瘤细胞多方面的损害, 发挥其细胞毒性作用[10]。

2.3 NO具有扩张血管、抑制血小板黏附和聚集等作用, 从而抑制肿瘤的转移

Yamamoto等[11]研究NO可通过NO/cGMP途径, 抑制血小板的聚集、黏附。然而血小板在肿瘤转移过程中, 可以和进入血循环的肿瘤细胞形成聚集体, 黏附于血管内皮细胞, 而且肿瘤细胞移出血管浸润周围组织仍需血小板的参与。所以认为, 血小板有促进肿瘤转移的作用, 而NO通过抑制血小板的聚集和黏附来抗肿瘤转移。

2.4 NO对肿瘤的双重作用有浓度依赖性

持续低浓度的N0通过参与血管形成等效应促进肿瘤的生长和转移;高浓度的NO则通过产生细胞毒性和诱导细胞凋亡等途径产生抗瘤效应。Jenkins等[12]发现人结肠癌中iNOS起到促瘤作用的酶活力是约20pmol/ (min·mg) , 此时iNOS的表达活性比引起细胞毒性和凋亡等抗瘤作用时的活性至少低1～2个数量级。NO双重作用的浓度依赖性的机制一般认为持续低浓度的NO可以通过促进肿瘤细胞的生长、参与肿瘤血管形成或者抑制瘤细胞凋亡等效应起到促瘤作用。高浓度No抗瘤的可能机制是干扰瘤细胞的能量代谢;生成氧自由基产生细胞毒性;介导巨噬细胞活化而抗肿瘤。

在啮齿动物的研究中, 提示了iNOS活动在肿瘤的形成、生长、转移以及抗肿瘤的作用。然而, 鉴于实验性模型病程短以及实验动物种属相对低等, 其调节也不像人类那样复杂严密, 为此, 在人类肿瘤和iNOS表达的关系上, NO对肿瘤发生发展的意义尚须进一步深入研究。

摘要：肿瘤组织中iNOS催化产生的内源性NO在肿瘤的生物学中起重要作用, 本文主要从iNOS与肿瘤的产生、生长和转移的关系加以综述。

关键词：iNOS,肿瘤,综述

参考文献

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[3]Das T, Sa G, Chattopadhyay S, et al.Protein A2induced apoptosisof cancer cells is effected by soluble immune mediators[J].CancerImmunol Immunother, 2002, 51 (7) :376～380.

[4]Wang X, Zalcenstein A, Oren M.Nitric oxide promotes p53 nuclearretention and sensitizes neuroblastoma cells to apoptosis by ion-izing radiation[J].Cell Death Differ, 2003, 10 (4) :468～476.

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[8]Jiang H, Stewart CA, Leu RW.Tumor-derived factor synergizeswith IFN-gamma and L PS, IL-2 or TNF-alpha to promote mac-rophage synthesis of TNF-alpha and TNF receptors for autocrineinduction of nitric oxide synthase and enhanced nitric oxide-me-diated tumor cytotoxicity[J].Immunobiology, 1995, 192 (5) :321.

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[11]Yamamoto T, Terada N, Seiyama A, et al.Increase in experi-mental pulmonary metastasis in mice by L2arginine under inhibi-tion of nitric oxide production by NG2nitro2L2arginine methylester[J].Int J Cancer, 1998, 75 (1) :140.

[12]Jenkins DC, Charles IG, Thomsen LL, et al.Roles of nitric oxidein tumor growth[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92 (10) :4392.

iNOS 篇2

答:INOS系统是一个在常态运行中补充DCS控制不足的新型环保、节能、实用型必备工作软件。系统以先进的测控产品为支撑, 运行控制为目的, 煤-风-温度合理匹配为基础, 在安全可靠下优化燃烧, 进行了控制策略的研究和数据挖掘, 合理调配设备冗余、设备与人的运行操作冗余;合理回收热、充分利用热资源、提高热效率、挖掘该企业的节能空间并与DCS和其他节能系统进行结合, 以能效评估与决策为管理方法, 构成一个包括监测、控制、优化、评估、管理等为一体的智能应用体系。

记者:通过和您交流发现INOS系统在节能方面效果十分显著, 那在环保方面是否也有作用呢?

答:节能和环保不分家。我们的INOS系统其中有一个板块就是环保板块, 从NOX生成源头出发, 通过动态烟气监测装置控制炉内燃烧温度, 进而减少NOX排放。

记者:INOS系统既节能又环保, 那么它可以应用到哪些锅炉中呢?

答:目前我们的主要客户是燃煤锅炉 (大型锅炉400~3000/t蒸发量锅炉及辅机系统和35~350/吨蒸发量锅炉及辅机系统) , 后期我们也会将技术和产品逐步应用于燃油和燃汽炉。

记者:看得出您对INOS系统充满了信心, 通过INOS系统进行节能和环保项目的改造, 它的投资回收情况怎样?就天津而言它的市场空间有多大?

答:INOS系统由硬件、软件、技术调整三部分组成。硬件只占20%, 其安装无需停炉, 极大的减少了停机成本。而项目投资额约占采购能源费用的0.75%~1%;投资回收期为0.5~2年;效益持续期为投运开始, 持续产生效益。经调研, 天津10t-35t锅炉有790余台;35t以上的锅炉约420余台, 大型火电燃煤机组30余台 (200MW以上) , 若能实施性能优化, 预计年节约标煤64.05万吨, 降低碳排放167.811万吨, 市值不低于4亿元, 若项目能得到政府奖励资金的支持, 其市场份额将不低于6亿元, 市场前景可观。

记者:看得出您对INOS系统在建设美丽天津所做的贡献显得很有信心?

iNOS 篇3

1 材料与方法

1.1 试验动物:

昆明小鼠48只 (由辽宁医学院实验动物中心提供)

1.2 方法

(1) 原位杂交:

每组小鼠脊椎离断后, 取肾脏, 及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛。逐级脱水, 石蜡包埋后切片。切片厚度5um, 粘附于涂有多聚赖氨酸 (1mg/mL) 的载玻片上, 而后行原位杂交。并采用DAB染色液显色。iNOS原位杂交检测试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品。实验中设置省去探针组作为阴性对照。用CIAS-1000细胞图像分析系统对各组小鼠肾原位杂交结果进行图象分析, 测其阳性部位灰度并转换为光密度, 即表示iNOSmRNA的相对含量。

(2) 蛋白免疫印迹分析:

石蜡标本取材的同时, 每组小鼠取肾脏, -70℃冰箱保存。裂解, 粉碎, 离心, 考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。每个样品取25ug湿转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭, 一抗—iNOS小鼠抗小鼠单克隆抗体 (稀释度为1∶400) , 二抗—碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体 (稀释度为1:200) (一抗和二抗均为北京中杉公司产品) 杂交, NBT/BCIP显色;扫描电泳条带, 用Gene Tools软件分析电泳条带吸光度。

(3) 统计学分析:

采用SPSS11.0软件, 采用单因素方差分析和重复测量设计的方差分析进行统计学分析。以P<0.05为差异有显著意义。

2 结果

2.1 iNOSmRNA在肾组织中的分布

iNOSmRNA产生于胚胎14d, 主要分布在输尿管芽;胚胎16d至成年iNOSmRNA主要分布在近曲小管, 而远曲小管表达较少。此外在各发育阶段iNOSmRNA在小动脉、中动脉也有表达 (图2, 3) 。

2.2 iNOSmRNA在发育阶段近曲小管和远曲小管表达光密度的变化

肾脏发生发育中iNOSmRNA表达持续稳定在一定水平, 各组之间差异无显著性 (P>0.05) 。

2.3 免疫印迹结果

应用Gene Tools软件对iNOS蛋白表达电泳分析显示, 随着天数的增加蛋白含量逐渐递减 (图1) 。

3 讨论

本实验的原位杂交结果显示iNOSmRNA在胚胎到成年各期的近曲小管有阳性表达。已有研究提出在正常生理状态下iNOS可能通过产生NO调节近曲小管中Na+和HCO3-的转运。又有研究证实在培养的肾脏近曲小管内iNOS来源的NO可能对于维持细胞内K+通道基础活性至关重要。Nicolas J.Guzman提出在近曲小管由免疫兴奋剂诱导的iNOS的内源性NO和供体产生的外源性NO都可能对近曲小管Na+/K+-ATP酶产生抑制。可见iNOS可能对近曲小管正常生理功能的维持起着重要的作用。本实验原位杂交还显示, 在肾脏发生发育中的绝大部分中动脉及小动脉iNOSmRNA呈阳性表达。Mohaupt MG等应用定量PCR及显微解剖技术发现在正常肾脏中存在两种基本的异源表达的iNOS, 其中一种为血管平滑肌类型NOS, 主要存在袢弓及小叶间动脉[1]。又有研究认为:大鼠肾内一些血管平滑肌细胞等细胞中的iNOS可以结构酶形式存在, 调整基础状态下细胞功能。本实验支持以两个上论断。

Morrissey等认为iNOS的存在量与其部位需要的NO量有关。从Western-blot结果提示:iNOS在胚胎及新生时期的总蛋白含量明显高于生后时期。这提示胚胎及新生时期肾脏产生更大量的NO, 肾脏需要的NO量也更多。Ballèvre L[2]等人实验发现:在胚胎和新生的兔和猪的肾脏, NO的产生血管舒张的作用比成年动物作用更大。还有学者认为在新生期之后的发育, 肾脏功能上对NO的依赖是逐步递减的[3,4]。Solhaug认为:在新生阶段, 血管活性作用的系统高度活跃, NO的作用似乎比成年更为重要;NO抑制剂在发育中的肾所产生的效应也比成年更大。这可能与对应激性的血管收缩的反应有关, 比如在这一阶段经常遭遇的生前低氧;增强的NO活性可能正是作为一种高活性肾血管收缩因子如血管紧张素Ⅱ的对抗机制。

参考文献

[1]雷定和, 尹友生.一氧化氮及其合成酶与肾脏的关系[J].实用临床医学, 2004, 5 (1) :123～125.

[2]Ballèvre L, Thonney M, Guignard JP.Nitric oxide modu-lates glomerular filtration and renal blood flow of thenewborn rabbit[J].Biol Neonate, 1996, 69:389～3985.

[3]Sener A, Smith FG.Renal hemodynamic effects of L-NAMEduring postnatal maturation in conscious lambs[J].PediatrNephrol, 2001, 16:868～873.

iNOS 篇4

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

8~12周健康雄性SD大鼠32只, 体质量200~250 g (湖南斯莱克景达实验动物有限公司) , 异氟醚 (Minrad Inc, 美国) , 诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS) 试剂盒、考马斯亮兰试剂盒 (南京建成生物医学工程研究所) , 麻醉机及异氟醚挥发罐 (Dr覿ger Fabius, 德国) , 分光光度计 (上海光学仪器厂) , 呼末气体监测仪 (Datex-ohmeda, 芬兰) , 血气分析仪 (GEM Premier 3000, 美国)

1.2 模型制备

参照文献报道的方法制备大鼠肾缺血再灌注损伤的模型[7]。实验动物麻醉深度达到手术要求后, 将实验动物固定于手术台暖光灯下, 常规备皮、消毒铺单, 术中测肛温, 保持体温维持在36~37℃左右。上述操作成功后, 用盐水纱布覆盖切口, 腹部正中切口进入腹腔, 小心分离出双侧肾蒂, 切除右侧肾, 用无损伤微动脉夹夹闭左侧肾蒂45 min后恢复灌注, 并观察肾脏颜色变化, 确定血流5 min之内恢复, 再灌注3 h后关闭腹腔, 操作过程中注意保护左侧输尿管。逐层缝合腹壁, 待其自然苏醒后置于相对清洁、恒温环境中, 标准饲料喂养, 自由饮水。24 h后处死大鼠, 心脏取血, 3 500 r/min离心后取上清液于-20℃冰箱中保存待测, 打开腹腔留取肾组织标本, 将肾脏标本沿正中线分割成左右两部分, 一部分标本取材后放入10%福尔马林溶液中浸泡送检, 另一部分用滤纸吸干表面血渍后于-70℃冰箱中保存待测。所有标本的取材均取自不同大鼠的相同部位以便结果更具有可比性。

1.3 动物选择及分组

8~12周健康雄性SD大鼠32只, 随机分为4组, 每组8只。A组 (假手术组) :戊巴比妥那麻醉后开腹, 只切除右肾, 左肾不处理, 45 min后关腹, 放置3 h, 饲养24 h后取标本。B组 (异氟醚组) :在1.0MAC (浓度为1.2%) 的异氟醚麻醉下开腹, 只切除右肾, 左肾不处理, 45 min后关腹, 术后持续吸入相同浓度的异氟醚3 h, 饲养24 h后取标本。C组 (缺血再灌注组) :戊巴比妥那麻醉后开腹, 接受右肾切除术, 阻断左肾动脉45 min, 开放肾动脉后关腹, 再灌注3 h, 饲养24 h后取标本。D组 (异氟醚缺血再灌注组) :在1.0MAC的异氟醚麻醉下开腹, 接受右肾切除术, 阻断左肾动脉45 min, 开放肾动脉后关腹, 缺血和再灌注期间继续吸入相同浓度的异氟醚3 h, 饲养24 h后取标本。

1.4 检测指标及实验标本的采集

1.4.1 血气分析检测

所有实验动物均于缺血前和再灌注开始后抽取股动脉血做血气分析, 观察动脉血二氧化碳分压 (Pa CO2) 的变化, 作为呼吸功能的参考依据。

1.4.2 血浆肌酐 (Cr) 和尿素氮 (BUN) 含量检测

试验结束并继续存活24 h后, 所有大鼠均心脏抽取静脉血5 m L, 3 000 r/min离心10 min后取上清液于-20℃保存。全自动生化分析仪测定血浆肌酐 (Cr) 和尿素氮 (BUN) 含量。

1.4.3 肾组织中i NOS活性检测

取左肾下极组织0.2 g, 做肾组织匀浆, 按试剂盒说明操作并测定。计算方法如下:

(U/mgprot) ;U/mgprot为酶活力单位每毫克蛋白肾组织蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。计算方法如下:

1.4.4 肾组织的病理学检查

将实验动物处死以后, 取出的肾脏标本沿正中线分割成左右两部分, 其中一部分标本取材后放入10%的福尔马林溶液中固定, 送病理科做病理组织切片, 观察光镜下的肾组织病理变化。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 多组均数比较用单因素方差分析, 组间比较采用t检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血气分析结果

术中分别在缺血前和再灌注开始后两个时间点抽取股动脉血做血气分析测量动脉血Pa CO2值, B、C、D组与A组比较差异无统计学意义, P>0.05, 见表1。

注:覮B、C和D组与A组比较差异无统计学意义, P>0.05

2.2 血浆肌酐 (Cr) 、尿素氮 (BUN) 含量变化

2.2.1 血浆肌酐结果

C、D组分别与A组比较, 血浆肌酐含量升高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;D组与C组比较, D组血浆肌酐值较C组值降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

2.2.2 血浆尿素氮结果

C、D组分别与A组比较, 血浆肌酐含量升高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;D组与C组比较, D组血浆尿素氮值较C组值降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

2.3 肾组织i NOS活性

肾组织i NOS活性结果:C、D组分别与A组比较, 肾组织i NOS活性升高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;D组与C组比较, D组i NOS活性较C组降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

注:1) 与A组比较, P<0.05;2) D组与C组相比, P<0.05

2.5 肾组织形态学改变

肾组织形态学改变 (HE染色) :A、B两组肾小管排列整齐, 肾间质无充血、水肿及炎性细胞浸润, 肾组织未见明显的病理学改变;C组肾小管上皮细胞呈空泡变形和坏死, 大量肾小管上皮细胞肿胀, 肾小管内可见蛋白管型及脱落坏死的细胞, 肾间质充血、水肿, 局灶炎性细胞浸润;D组肾小管细胞水肿, 仅少部分肾小管上皮细胞坏死脱落, 病理改变明显轻于C组。见附图。

A:假手术组;B:异氟醚组;C:缺血再灌注组;D:异氟醚醚缺血再灌注组

3 讨论

在实验过程中术中分别在缺血前和再灌注开始后两个时间点抽取股动脉血做血气分析测量动脉血Pa CO2值, 结果发现四组都在正常值之内且无明显差异, 表明实验中所有的大鼠都没有发生二氧化碳蓄积, 说明术中实验动物的呼吸也未受到麻醉药的明显影响, 且国外有研究发现异氟醚在动物缺血再灌注损伤模型中对动物的呼吸也不会造成明显的影响[8]。本实验结果显示缺血再灌注组 (C组) 大鼠的血浆肌酐 (Cr) 和尿素氮 (BUN) 含量较假手术组 (A组) 明显升高, 且肾组病理切片显示缺血再灌注组 (C组) 的肾组织损伤明显, 提示模型制备成功。异氟醚缺血再灌注组 (D组) 大鼠血浆 (Cr) 和尿素氮 (BUN) 含量较缺血再灌注组 (C组) 明显降低, 病理结果显示肾脏组织的损伤D组轻于C组, 提示异氟醚对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

NO作为一种信号分子, 具有广泛生物活性, 参与肾脏血流动力学调节, 与肾脏缺血再灌注损伤关系密切。NO在一氧化氮合酶 (NOS) 的作用下, 以左旋精氨酸、分子氧为底物合成, 来源于不同NOS的NO会起到不同的生理和病理作用[9]。NOS分为原生型 (c NOS) 和诱生型 (i NOS) , c NOS根据存在的部位分为神经型 (n NOS) 和内皮型 (e NOS) , 其中n NOS主要分布在神经系统, 在肾脏中分布较少, 肾脏内以e NOS为主, 主要分布在肾小管上皮细胞以及血管内皮, 参与调节肾血流及肾小管功能等, i NOS主要来源于组织的巨噬细胞, 参与介导巨噬细胞的细胞毒作用, 在肾脏中与肾血管内皮损伤、肾小管功能障碍有密切关系, 肾脏缺血再灌注损伤后, i NOS表达增强, i NOS来源的NO增多, 毒性作用显现, NO可与活性氧自由基反应生成具有细胞毒性的过氧亚硝酸离子 (ONOO-) , 过氧亚硝酸离子可引起细胞膜过氧化, 抑制蛋白质功能, 破坏核酸及染色体, 对组织细胞造成伤害[10], 且有研究发现, 在肾脏缺血再灌注损伤实验中, 当抑制i NOS活性时, 可以减轻肾脏的缺血再灌注损伤[2,3,11,12]。

异氟醚是一种常用的吸入麻醉药, 其缺血再灌注损伤的保护作用在心[13,14,15,16]、脑[17,18,19]、肝[20]、肠[21,22]等器官实验中均有证实, 有研究发现异氟醚与i NOS活性有密切的关系, 当用巨噬细胞或肺组织试验时, 异氟醚可以抑制巨噬细胞表达i NOS, 减少NO的产生, 提高组织的生存能力[23,24,25], 本研究同样发现, 即当肾脏发生缺血再灌注损伤时, 肾脏组织的i NOS活性会升高, 而经异氟醚处理后, 肾脏组织的i NOS活性降低, 血肌酐和尿素氮含量、肾组织病理切片都证实肾脏损伤的会减轻, 说明异氟醚可以通过抑制i NOS活性来减轻肾脏的缺血再灌注损伤。

iNOS 篇5

1 材料与方法

1.1 试剂

米诺环素,购于Sigma公司;链脲佐菌素(STZ),购于Sigma公司;一抗i NOS、SABC-POD二抗试剂盒、DAB显色剂均购于武汉博士德公司;葡萄糖测定试剂盒购于上海荣盛生物技术有限公司。

1.2 动物模型

健康雄性SD大鼠28只,体重190~250 g,购于南华大学动物部。适应性饲养1周,随机抽取20只造2型糖尿病模型,先给与高糖高脂饮食1个月,然后禁食12 h,最后按30 mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ用0.1M柠檬酸柠檬酸钠缓冲液p H=4.4配制,现用现配,浓度为1%),72 h后尾静脉血测随机血糖,血糖值≥16.7 mmol/L为造模成功。其余8只大鼠给于正常饮食,所有大鼠均给与充足的饮水,保温,清洁。

1.3 分组和给药

剔除造模不成功的大鼠,将造模成功的大鼠随机分成糖尿病模型组(D组)8只和米诺环素组(M组)8只,正常组(N组)8只。造模成功1周后,米诺环素组每天腹腔注射米诺环素45 mg/kg,连续给药2周,糖尿病模型组和正常组腹腔注射等量的生理盐水。

1.4 取材

给药2周后,用10%的水合氯醛按3.5 m L/kg腹腔注射麻醉各组大鼠,打开颅骨暴露脑组织,分离海马。将海马固定于4%的多聚甲醛中。各组大鼠于处死前尾静脉取血测血糖值。

1.5 免疫组化测i NOS(S ABC法)

石蜡包埋固定后的海马组织,切片,片厚5μm,烤片、脱蜡后,3%的H2O2灭酶后,进行微波热抗原修复,5%BSA封闭,然后滴加一抗i NOS(1︰100)4℃过夜,第二天37℃复温后滴加生物素化二抗和三抗工作液,37℃30 min,最后DAB显色,流水充分冲洗后脱水、透明、封片、镜检。阴性对照用0.01mol/L PBS代替一抗进行同步免疫组织化学染色。

1.6 计算机图像分析

利用LOGENE PAS 900病理图像分析系统计算大鼠海马C3区i NOS免疫阳性神经元的平均光密度值(MOD值)。

1.7 统计学方法

应用SPSS13.0统计分析软件,分别计算血糖值及海马C3区神经元内i NOS平均光密度值(MOD),所得数据以均数±标准差表示,组间比较用两样本t检验,P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠体重和随机血糖比较

建模前各组大鼠体重差异无显著性。实验结束时,与N组比较,D组体重明显减轻(P<0.01);M组体重也明显减轻(P<0.01)。D组和M比较体重差异无显著性,见表1。

造模前各组大鼠随机血糖值差异无显著性。造模后,D组和M组与N组比较血糖明显增高(P<0.01)。给药后,D组和M组血糖差异无显著性,见表2。

2.2 各组大鼠海马C3区i NOS的表达

免疫组化结果显示在大鼠海马C3区可见i NOS免疫阳性产物为棕黄色点状颗粒,主要分布在锥体细胞胞质中。N组阳性反应物少,着色浅,MOD值低;D组阳性反应物明显增多,神经纤维也可见棕黄色颗粒,着色明显加深,MOD值增高,与N组比较差异有显著性(P<0.01);M组阳性反应物减少,着色变浅,MOD值降低,与D组比较差异有显著性(P<0.01),见表3。

注:1)与N组比较,P<0.01;2)与D组比较,P<0.01

3 讨论

NO是一种自由基气体,在中枢神经系统它不仅与血管的舒张密切相关,而且参与神经发育、信息传递、神经再生和突触可塑性等重要生理活动,但是NO产生和释放过多会产生神经毒性。体内NO是L-精氨酸经NOS催化生成,NO的含量和生物学作用完全依赖于NOS的活性。NOS有3种亚型,分别是内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)、神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,n NOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)。e NOS和n NOS是钙依赖性酶,催化生成的NO作用时间较短。i NOS是非钙依赖性酶,它与钙调蛋白结合后不受Ca2+水平变化的影响,它催化生成的NO作用时间较长。i NOS可表达于巨噬细胞、平滑肌细胞、单核细胞、内皮细胞和小胶质细胞,正常情况下体内i N-OS表达很少或不表达,但可被一些免疫细胞因子如TNF-α、IL-1β、INF-γ,氧化应激、AGEs、细菌脂多糖(LPS)等诱导产生。本实验发现i NOS在正常对照组大鼠海马锥体细胞中有微弱的表达,在糖尿病组表达明显增加,不仅表达于锥体细胞的胞质中,还表达于神经纤维,两组差异有统计学意义(P<0.01),说明糖尿病可诱导大鼠海马内i NOS的表达。

糖尿病诱导大鼠海马内i NOS表达增多的机制可能为:(1)糖尿病是一种慢性炎症性疾病,高血糖可诱导炎症因子TNF-α、INF-γ和NF-k B等表达增多,INF-γ是促进i NOS转录的主要因子,在TNF-α协同下共同激活NF-k B转录因子使i NOS表达增多[2]。(2)氧化应激是糖尿病多器官损伤的一个重要原因,氧化应激时促氧化剂过氧化亚硝酸盐生成增多,激活了对氧化剂敏感的NF-k B转录因子,使i NOS表达增多[3]。(3)糖尿病存在糖代谢异常,可导致蛋白质发生非酶糖基化,形成晚期糖基化终末产物(AGEs),AGEs通过MAPKs和PKC途径使i NOS表达增多,活性增强[4]。(4)缺血缺氧是糖尿病血管病变的结果,长期的缺血缺氧可上调i NOS基因的表达,使i NOS表达增多[5]。

大量的i NOS催化生成大量的NO,有研究发现NO是神经元增殖的负调控因子[6],大量的NO可通过抑制细胞分裂减少海马内神经元的增殖。此外,大量的NO与超氧负离子结合形成促氧化剂过氧化亚硝酸盐阴离子(ONOO-),ONOO-具有神经毒性作用(1)ONOO-引起碱基脱位点、DNA单链断裂、双链断裂,从而损伤DNA,最终导致神经元凋亡[7];(2)神经生长因子(NGF)对神经起营养支持作用,糖尿病时胰岛素抗体可以与NGF发生交叉反应,使NGF减少,ONOO-能够破坏残存的NGF,造成神经变性[8]。因此,大量i NOS可影响海马突触可塑性,降低LTP,导致认知功能障碍。

米诺环素(minocycline)又名美满霉素,化学名为二甲胺四环素,为第2代半合成的四环素类药。米诺环素能够抑制白细胞趋化聚集[9],清除体内产生的活性氧和自由基,抑制炎性因子的释放[10,11]。现研究发现,米诺环素不但具有良好的抗菌作用,而且在脑缺血模型中表现出抑制海马齿状回小胶质细胞激活的功能,保护新生的神经元,增强海马神经发生,利于运动协调功能的恢复,改善空间学习记忆的能力[12]。此外,米诺环素还能够减少糖尿病时一些炎症因子的表达[13],米诺环素能使糖尿病大鼠视网膜中TNF-αm RNA表达减少60%,IL-1m RNA表达减少30%[14]。本实验发现米诺环素组大鼠海马i NOS表达较糖尿病组明显减少,两组比较差异有显著性,说明米诺还素可减少糖尿病大鼠海马内i NOS的表达但对血糖值变化没有影响,表明米诺环素减少iNOS表达并非通过降低血糖值实现的,但米诺环素减少i NOS表达的具体机制还需要进一步的研究。

综上所述,糖尿病大鼠海马神经元内i NOS异常增高,可导致海马突触可塑性的改变。米诺环素可通过减少i NOS在2型糖尿病大鼠海马C3区锥体细胞内的表达,减轻糖尿病对海马的影响,可能会减轻糖尿病引起的认知功能障碍,值得进一步的实验与临床研究。

摘要：目的探讨诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)在2型糖尿病大鼠海马中的表达情况以及米诺环素对iNOS表达的影响。方法高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病模型。将SD大鼠随机分为正常对照组(N组)、糖尿病模型组(D组)、米诺环素组(M组)。造模成功1周后,M组每天腹腔注射米诺环素45mg/kg,D组和N组腹腔注射等量的生理盐水,连续给药2周,然后取大鼠海马组织,免疫组化方法测各组大鼠海马中iNOS表达情况。结果N组、D组、M组海马iNOS阳性神经元的平均光密度值(MOD值)分别为(0.101±0.012)、(0.196±0.020)和(0.128±0.010),D组和M组iNOS表达较N组高,差异有显著性(P<0.01),M组iNOS表达较D组低,差异有显著性(P<0.01)。结论iNOS在2型糖尿病大鼠海马神经元中表达异常增高,米诺环素可减少大鼠海马神经元iNOS的表达,这可能是米诺环素保护糖尿病认知功能障碍的机制之一。

iNOS 篇6

关键词：米诺环素,PAI-1,糖尿病,大鼠,海马

糖尿病引起的神经系统损伤复杂多样,糖尿病患者不仅易发生脑出血、脑梗死、周围神经病变,而且会出现轻度的认知功能障碍[1],主要表现在学习和记忆能力下降,重者可发展为痴呆,在中枢神经系统中,海马与学习记忆密切相关,糖尿病引起认知功能障碍的确切机制至今尚未明确。近年来一氧化氮(nitric oxide,NO)在中枢神经系统中的作用日益受到重视,被认为是连接糖尿病神经病变血管学说与代谢学说的桥梁。体内NO是L-精氨酸经一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化生成,i NOS是NOS的一种亚型,正常情况下很少表达,糖尿病可诱导i NOS生成增多,继而导致NO生成增多,过多的NO具有神经毒性作用。因此,研究糖尿病时大鼠海马内i NOS的表达情况对研究糖尿病引起认知功能障碍的发病机制具有重要意义,同时观察米诺环素对i NOS表达的影响以探讨米诺环素对糖尿病引起中枢神经系统病变的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

米诺环素,购于Sigma公司;链脲佐菌素(STZ),购于Sigma公司;一抗i NOS、SABC-POD二抗试剂盒、DAB显色剂均购于武汉博士德公司;葡萄糖测定试剂盒购于上海荣盛生物技术有限公司。

1.2 动物和动物模型

健康雄性SD大鼠28只,体重190～250 g,购于南华大学动物部。适应性饲养1周,随机抽取20只造2型糖尿病模型,先给与高糖高脂饮食1个月,然后禁食12 h,最后按30 mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ用0.1M柠檬酸柠檬酸钠缓冲液pH=4.4配制,现用现配,浓度为1%),72 h后尾静脉血测随机血糖,血糖值≥16.7 mmol/L为造模成功。其余8只大鼠给于正常饮食,所有大鼠均给与充足的饮水、保温、清洁。

1.3 动物分组和给药

剔除造模不成功的大鼠,将造模成功的大鼠随机分成糖尿病模型组(D组)8只和米诺环素组(M组)8只,正常组(N组)8只。造模成功1周后,米诺环素组每天腹腔注射米诺环素45 mg/kg,连续给药2周,糖尿病模型组和正常组腹腔注射等量的生理盐水。

1.4 取材

给药2周后,用10%的水合氯醛按3.5 m L/kg腹腔注射麻醉各组大鼠,打开颅骨暴露脑组织,分离海马。将海马固定于4%的多聚甲醛中。各组大鼠于处死前尾静脉取血测血糖值。

1.5 免疫组化测P AI-1(S ABC法)

石蜡包埋固定后的海马组织,切片,片厚5μm,烤片、脱蜡后,3%的H2O2灭酶后,进行微波热抗原修复,5%BSA封闭,然后滴加一抗i NOS(1∶100)4℃过夜,第2天37℃复温后滴加生物素化二抗和三抗工作液,37℃30 min,最后DAB显色,流水充分冲洗后脱水、透明、封片、镜检。阴性对照用0.01 mol/L PBS代替一抗进行同步免疫组织化学染色。

1.6 计算机图像分析

利用LOGENE PAS 900病理图像分析系统计算大鼠海马C3区i NOS免疫阳性神经元的平均光密度值(MOD值)。

1.7 统计学方法

应用SPSS13.0统计分析软件,分别计算血糖值及海马C3区神经元内i NOS平均光密度值(MOD),所得数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较用两样本t检验,P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重和随机血糖比较

建模前正常对照组(N组)、糖尿病组(D组)、米诺环素组(M组)大鼠体重差异无显著性。实验结束时,与正常对照组比较,糖尿病组体重明显减轻(P<0.01);米诺环素组体重也明显减轻(P<0.01)。糖尿病组和米诺环素组比较体重差异无显著性。

造模前各组大鼠随机血糖值差异无显著性。建模成功后,糖尿病组和米诺环素组与正常组比较血糖明显增高(均P<0.01)。给药后,糖尿病组和米诺环素组血糖差异无显著性。见附表。

2.2 各组大鼠海马C3区i NOS的表达

免疫组化结果显示在大鼠海马C3区可见i NOS免疫阳性产物为棕黄色点状颗粒,主要分布在锥体细胞胞质中。正常组阳性反应物少,着色浅,MOD值低;糖尿病组阳性反应物明显增多,神经纤维也可见棕黄色颗粒,着色明显加深,MOD值增高,与正常组比较差异有显著性(P<0.01);米诺环素组阳性反应物减少,着色变浅,MOD值降低,与糖尿病组比较差异有显著性(P<0.01)。见附表。

注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与糖尿病组比较,P<0.01

A:正常对照组大鼠海马C3区i NOS阳性神经元,糖尿病组大鼠海马C3区i NOS阳性神经元;B:C:米诺环素组大鼠海马C3区i NOS阳性神经元

3 讨论

NO是一种自由基气体,在中枢神经系统它不仅与血管的舒张密切相关,而且参与神经发育、信息传递、神经再生和突触可塑性等重要生理活动,但是NO产生和释放过多会产生神经毒性。体内NO是L-精氨酸经NOS催化生成,NO的含量和生物学作用完全依赖于NOS的活性。NOS有3种亚型,分别是内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)、神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,n NOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase i NOS)。e NOS和nNOS是钙依赖性酶,催化生成的NO作用时间较短。i NOS是非钙依赖性酶,它与钙调蛋白结合后不受Ca2+水平变化的影响,它催化生成的NO作用时间较长。i NOS可表达于巨噬细胞、平滑肌细胞、单核细胞、内皮细胞和小胶质细胞,正常情况下体内i N-OS表达很少或不表达,但可被一些免疫细胞因子如TNF-α、IL-1β和INF-γ,氧化应激、AGEs、细菌脂多糖(LPS)等诱导产生。本实验发现i NOS在正常对照组大鼠海马锥体细胞中有微弱的表达,在糖尿病组表达明显增加,不仅表达于锥体细胞的胞质中,还表达于神经纤维,2组差异有显著性(P<0.01),说明糖尿病可诱导大鼠海马内i NOS的表达。

糖尿病诱导大鼠海马内i NOS表达增多的机制可能为:(1)糖尿病是一种慢性炎症性疾病,高血糖可诱导炎症因子TNF-α、INF-γ和NF-kB等表达增多,INF-γ是促进i NOS转录的主要因子,在TNF-α协同下共同激活NF-kB转录因子使i NOS表达增多[2];(2)氧化应激是糖尿病多器官损伤的一个重要原因,氧化应激时促氧化剂过氧化亚硝酸盐生成增多,激活了对氧化剂敏感的NF-kB转录因子,使i NOS表达增多[3];(3)糖尿病存在糖代谢异常,可导致蛋白质发生非酶糖基化,形成晚期糖基化终末产物(AGEs),AGEs通过MAPKs和PKC途径使i N-OS表达增多,活性增强[4];(4)缺血缺氧是糖尿病血管病变的结果,长期的缺血缺氧可上调i NOS基因的表达,使i NOS表达增多[5]。

大量的i NOS催化生成大量的NO,有研究发现NO是神经元增殖的负调控因子[6],大量的NO可通过抑制细胞分裂减少海马内神经元的增殖。此外,大量的NO与超氧负离子结合形成促氧化剂过氧化亚硝酸盐阴离子(ONOO-),ONOO-具有神经毒性作用:(1)ONOO-引起碱基脱位点、DNA单链断裂、双链断裂,从而损伤DNA,最终导致神经元凋亡[7];(2)神经生长因子(NGF)对神经起营养支持作用,糖尿病时胰岛素抗体可以与NGF发生交叉反应,使NGF减少,ONOO-能够破坏残存的NGF,造成神经变性[8]。因此,大量i NOS可影响海马突触可塑性,降低LTP,导致认知功能障碍。

米诺环素(minocycline)又名美满霉素,化学名为二甲胺四环素,为第二代半合成的四环素类药。米诺环素能够抑制白细胞趋化聚集[9],清除体内产生的活性氧和自由基,抑制炎性因子的释放[10,11]。现研究发现,米诺环素不但具有良好的抗菌作用,而且在脑缺血模型中表现出抑制海马齿状回小胶质细胞激活的功能,保护新生的神经元,增强海马神经发生,利于运动协调功能的恢复,改善空间学习记忆的能力[12]。此外,米诺环素还能够减少糖尿病时一些炎症因子的表达[13],米诺环素能使糖尿病大鼠视网膜中TNF-αm RNA表达减少60%,IL-1mRNA表达减少30%[14]。本实验发现米诺环素组大鼠海马i NOS表达较糖尿病组明显减少,两组比较差异有显著性,说明米诺还素可减少糖尿病大鼠海马内i NOS的表达但对血糖值变化没有影响,表明米诺环素减少i NOS表达并非通过降低血糖值实现的,但米诺环素减少i NOS表达的具体机制还需要进一步的研究。

综上所述,糖尿病大鼠海马神经元内i NOS异常增高,可导致海马突触可塑性的改变。米诺环素可通过减少i NOS在2型糖尿病大鼠海马C3区锥体细胞内的表达,减轻糖尿病对海马的影响,可能会减轻糖尿病引起的认知功能障碍,值得进一步的实验与临床研究。

iNOS 篇7

1 Toll样受体4及Toll样受体4/诱导型一氧化氮合酶信号通路

Toll样受体4(TLR4)是人类发现的第一个横跨膜TLR分子。人类TLR4基因位于9q32-q33染色体上,包含4个外显子和3个内含子,总长度为19KB。脂多糖(LPS)是革兰染色阴性菌胞膜外的主要成分,可被TLR4特异性识别,并触发TLR4的信号转导。在TLR4的信号转导过程中,TLR4的活化需要髓样分化因子2(MD-2)的参与,MD-2通过介导脂质A(LPS的活性成分)与TLR4之间离子的相互作用激活TLR4。LPS与TLR4/MD-2复合体结合之前首先要与LPS结合蛋白(LBP)、CD14结合。CD14通过将LPS转移并结合于TLR4/MD-2复合体表面,完成复合体对LPS的识别作用。当复合体识别LPS后,通过TlR功能区的接头蛋白(TIRAP)和髓样分化主要反应蛋白88(My D88)产生细胞内第一信号。此后TLR4/LPS复合体迅速发生内化作用并通过干扰素(IFN)-β相关衔接分子(TRAM)和TIR接头蛋白分子(TRIF)产生附加信号最终导致促炎性因子的产生[1],构成机体免疫系统抵御HPV入侵的第一道防线。因此,TLR4是宫颈局部免疫系统不可或缺的重要组成部分。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i N-OS)是催化合成一氧化氮的关键酶之一,其基因序列上游受TLR信号的调控。在TLR4途径及与之相交联的信号通路的下游通路中,可分为My D88和TRIF两种途径,之后又依次经过肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、丝裂原蛋白激酶(MAPK)、核因子(NF)-KB等关键基因对i NOS进行调节,构成了TLR4/i NOS信号通路[2~4]。

2 TLR4/i NOS信号通路在肿瘤形成中的作用

如今,众多研究已经发现TLR4/i NOS信号通路在与感染、炎症相关肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用。

2.1 TLR4在肿瘤形成中的作用

与感染、炎症相关肿瘤的特点是在局部组织微环境中炎症细胞及细胞因子的出现促进了肿瘤的生长,血管的形成,增强了肿瘤的侵袭和(或)转移能力。TLR4的活化促进了促炎性细胞因子和趋化因子以及免疫抑制因子的表达。特别是在肿瘤微环境中TLR4促进CD4+、CD25+及Foxp3+调节性T细胞(Tregs)分泌IL-10及TGF-β,这些细胞因子可抑制非调节性T细胞的抗肿瘤效应。Zhou等[5]指出TGF-β1/H2O2/LPS长期持续作用可以增强肿瘤失巢凋亡抵抗能力和侵袭能力。TGF-β1/H2O2/LPS诱导肿瘤产生的转移潜能足以使肿瘤发生转移并形成转移病灶。Pimentel-Nunes等[6]发现人类感染幽门螺杆菌后其正常胃黏膜TLR4高表达,这项研究认为胃黏膜早期暴露于LPS的环境中,可减少Toll相互作用蛋白(TOLLIP)的表达,并促进促炎性因子的产生。TLR4及这些炎性因子的作用导致环氧化酶-2(COX-2)的异常转录。胃黏膜细胞表型改变以及细胞内COX-2的过表达激活肿瘤细胞内途径最终导致肿瘤的发生。

2.2 TLR4相关信号分子参与肿瘤的发生、发展

核因子NF-k B是TLR4途径下游的信号分子,控制多种炎症基因的表达。NF-k B也是一种将炎症与肿瘤联系在一起的关键分子,LPS可增加NF-KB的活性。研究发现TLR/MYD88/NF-k B信号通路在连接炎症与肿瘤发展、侵袭性关系方面起了重要作用。在大多数未受刺激的正常细胞中,NF-k B作为一种由P50、P65、Ik B亚单位组成的不活跃三聚体存在于细胞浆中。当受到刺激,NF-k B抑制蛋白(Ik B)经历磷酸化和蛋白酶体的泛素化降解作用后暴露P50-P65异二聚体上的核定位信号,引起向细胞核迁移,并结合于特殊的一致序列上从而引起基因的转录。在这些转录的基因中,包括了编码生长因子及与侵袭性相关分子的基因。

高迁移率族蛋白(HMGB1)是TLR4的一种外源性配体,它是由受细胞因子刺激的细胞或坏死细胞分泌的一种DNA结合蛋白,具有监视染色体,维持细胞自噬作用,保护细胞免受凋亡的功能。此外,HMGB1作为一种典型的损伤相关分子模式(DAMP),结合其他因子后具有细胞因子、趋化因子、生长因子活性,从而发挥炎症反应和免疫应答作用,甚至参与肿瘤的发生、发展过程[7]。

2.3 i NOS、NO在肿瘤形成中的作用

一氧化氮(nitric oxide,NO)是细胞内的一种信号分子,存在于机体所有细胞当中,作为一种氧化还原的自由基,可修饰许多生物分子从而导致疾病的发生。蛋白质巯基亚硝基化修饰(S-nitrosylation,or S-nitrosation)是由NO及其衍生物与蛋白质半胱氨酸上的巯基共价连接,形成亚硝基化巯基(S-nitrothiols),是一种重要的蛋白质翻译后修饰,也是NO信号分子发挥其生物学效应的重要途径。越来越多的研究表明,若发生异常的蛋白质巯基亚硝基化修饰可导致蛋白质的折叠异常,线粒体裂变。Lee等[8]指出胚胎发育过程中NO含量的增加可能通过对线粒体和内质网蛋白质巯基亚硝基化修饰损害胚胎的发育。此外,S-亚硝基谷胱甘肽及内皮型NO合酶产生的NO可调节不同亚细胞结构区分的Ras蛋白巯基亚硝基化修饰,并刺激细胞增殖。另有一项研究显示,在髓过氧化物酶(MPO)和i NOS共表达的卵巢癌上皮细胞中,细胞凋亡率较正常卵巢上皮细胞低。MPO是一种可以利用i NOS生成的NO的酶,NO作为一种单电子底物,可产生亚硝基化的NO+,从而进行蛋白质巯基亚硝基化修饰半胱天冬酶-3(caspase-3),诱导卵巢癌上皮细胞的凋亡抵抗[9]。还有研究发现,i NOS介导的NO生成在胃组织的癌变、肿瘤的淋巴管形成,以及淋巴转移过程中发挥了重要作用[10]。

3 TLR4/i NOS信号通路与宫颈癌的关系

3.1 宫颈癌局部免疫调节

大量研究证实宫颈癌的发生、发展与宫颈局部免疫微环境中免疫细胞的数量及功能异常有关。宫颈局部免疫效应细胞主要包括T淋巴细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞以及嗜酸性粒细胞等。

3.1.1 T淋巴细胞

机体抗宫颈癌免疫是以细胞免疫为主,T淋巴细胞亚群在宫颈癌免疫监视中起中心调控作用,是机体抗宫颈癌免疫的重要效应细胞。研究表明,在宫颈上皮内瘤变(CIN)及侵袭性宫颈癌中Th1细胞活性降低,Th2活性升高,导致细胞免疫受到抑制,Th1向Th2的漂移进一步导致组织损伤[11]。Ding等[12]发现随着CIN向宫颈癌的进展,Treg/Th17平衡向Treg细胞偏离,这一失衡参与CIN的进展及宫颈癌的免疫逃避。T淋巴细胞及其亚群在数量和功能上的改变,可导致机体免疫在与病毒抗争中失败,并进一步促进HPV持续感染乃至诱导宫颈癌的发生、发展。

3.1.2朗格汉斯细胞

朗格汉斯细胞(LC)是未成熟的树突状细胞(DC),来源于骨髓造血干细胞,是宫颈鳞状上皮内的免疫监视细胞。LC作为TLRs信号的效应细胞摄取抗原并分化成为成熟的树突状细胞,发挥免疫作用。巨噬细胞炎症蛋白(MIP-3α)是CC趋化因子家族成员之一,作为LC最有效的趋化因子,与其唯一受体CCR6结合,可趋化骨髓及外周血的LC前体细胞进入上皮组织内,保持对外界抗原的免疫监视作用。然而,在宫颈癌前病变组织中,LC数目虽稍有增加,但其功能却存在缺陷,这种功能缺陷的未成熟DCs可诱导效应T细胞向调节性T细胞的转换,从而引起免疫耐受。

3.1.3 NK细胞

NK细胞是机体免疫应答中另一类重要的细胞,能够对受刺激的细胞(如病毒感染、肿瘤细胞)迅速作出反应,这一过程不需要主要组织相容性复合体(MHC)的参与。有研究指出,在高级别鳞状上皮损伤(HGSILs)及HPV16感染的宫颈癌细胞中NK-活化受体NKp30及NKp46含量明显降低,影响了NK细胞的溶细胞功能。Jimenez-Perez等[13]发现表达NK细胞表面活化性受体(NKG2D)配体的宫颈癌细胞系能够通过下调NKG2D来抑制NK细胞的细胞毒作用从而达到免疫逃逸的目的。

3.1.4 巨噬细胞

巨噬细胞在肿瘤免疫中也有重要作用。研究发现,肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAMs)参与促进肿瘤的发生、生长、侵袭和转移过程。巨噬细胞存在2种亚型即M1经典活化型,M2选择活化型。M1型巨噬细胞可以发挥吞噬作用,清除微生物,抑制肿瘤细胞,将抗原提呈给T细胞,激活适应性免疫应答。而M2型巨噬细胞可促进肿瘤的发生。肿瘤组织中浸润的巨噬细胞以M2型为主,其分泌的IL-10可诱导HPV特异性调节性T细胞的扩增,这可能会抑制效应T细胞的抗肿瘤活性。

3.1.5 嗜酸性粒细胞

嗜酸性粒细胞是一种多功能粒细胞,它为人们所孰知的功能是帮助机体抵御寄生虫的感染。然而,越来越多的证据表明,人类恶性肿瘤组织中存在嗜酸性粒细胞的浸润。嗜酸性粒细胞能产生多种调节性或促炎性的细胞因子和趋化因子。Miyagaki等[14]认为在皮肤T细胞淋巴瘤中,eotaxins和CCR3表达增加,导致Th1型和Th2型细胞因子失衡,呈现Th2型偏移,致使细胞免疫功能下降,有利于肿瘤的生长。但是,也有学者发现,肿瘤组织中嗜酸性粒细胞的浸润是预后良好的标志,它可诱导肿瘤细胞凋亡并且可以直接杀死肿瘤细胞[15]。值得注意的是,在宫颈鳞状细胞癌组织中也存在嗜酸性粒细胞的浸润。嗜酸性粒细胞浸润的宫颈癌患者存在Th1向Th2的漂移。然而,目前关于嗜酸性粒细胞在宫颈癌中的作用研究甚少,两者之间的关系有待进一步研究。

3.2 TLR4与宫颈癌的关系

流行病学及分子生物学的研究发现,一些类型的肿瘤与病毒感染关系非常密切。如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)与肝癌的关系密切;HPV与宫颈癌关系密切。已有研究表明,TLR4不仅可以识别细菌成分,而且还能够识别病毒成分。TLR4可以激活固有免疫系统抵抗呼吸道合胞病毒感染[16];TLR4也可以通过My D88非依赖性途径激活针对汉坦病毒的免疫应答[17]。

在TLR4、HPV与宫颈肿瘤的关系方面,学者们也做了许多研究。Cheng等[18]指出TLR4在宫颈癌中高表达,其活性的增高,促进了He La细胞的增殖并增强了抗凋亡能力。此外,TLR4激活下游的NF-k B途径,促进了宫颈癌免疫抑制细胞因子IL-6及TGF-β1的产生。Wang等[19]发现TLR4的表达情况与宫颈组织病变的病理分级一致:侵袭性宫颈癌(ICC)中TLR4的表达较CIN高,正常上皮及恶性宫颈基质中TLR4表达较低。Si Ha(HPV16+)宫颈癌细胞中TLR4的表达较He La(HPV18+)宫颈癌细胞高。当运用TLR4激活剂脂多糖(LPS)后,Si Ha细胞中TLR4的表达增加,出现凋亡抵抗现象,并指出这种凋亡抵抗可能与HPV16的感染有关。此外,Hasimu等[20]对维吾尔族女性宫颈损伤患者的研究发现在CIN及宫颈鳞状细胞癌发生、发展的过程中TLR4发挥了重要作用,而HPV16的感染可以增加TLR4的表达。

然而,Yu等[21]却发现,宫颈癌中TLR4表达下调,这种表达下调似乎与P16INK4 A(HPV病毒整合于宿主细胞后产生的一种重要的标记物)的表达有关。这一研究结果与先前的研究结果正好相反,因此,可以推测TLR4在宫颈癌发生、发展中的作用可能受到其他因素的影响。有的因素可协同TLR4促进宫颈癌的发生、发展,有的因素则可以抑制宫颈癌中TLR4的表达。故哪些因素可与TLR4相互作用促进宫颈癌的发生、发展,哪些因素可抑制宫颈癌细胞中TLR4的表达,以及这些复杂的调控机制在宫颈癌细胞中是如何有规律地发挥作用,值得我们深究。

3.3 i NOS、NO与宫颈癌的关系

以往研究及我们前期的研究都已经证实在多种宫颈癌组织中i NOS高表达。Dong等[22]指出敲除Si Ha和He La细胞的i NOS基因后,两种癌细胞的增殖能力减弱,且血管内皮生长因子(VEGF)水平与NO的含量的密切相关。还有研究发现,宫颈组织中HR-HPV的出现与NO释放增加有关[23]。Wei等[24]认为宫颈部位高浓度的NO可能通过诱导DNA损伤及突变导致肿瘤的发生。他们将含有HR-HPV游离基因的细胞暴露于NO的环境中,发现HPV的早期转录水平增加2~4倍,但病毒DNA的复制量不增加。该过程中还伴有E6、E7mRNA水平的增加,p53及pRb蛋白水平的显著降低,发生凋亡的细胞数量减少,DNA双链断裂的数量增多,突变率增高。由此,他们推测NO可能是HPV相关宫颈癌在癌变过程中的一种辅助分子。

研究发现,雌激素可通过与特异性的雌激素受体(α、β)结合,刺激动态内皮蛋白的亚硝基化修饰。研究者们还观察到在i NOS高表达的结肠癌中存在ER-α、ER-β的表达。ER-α、ER-β拮抗剂可阻止蛋白的亚硝基化修饰,提示雌激素可能促进蛋白的亚硝基化修饰[25,26]。然而,宫颈组织是雌激素敏感器官,上述作用是否也存在于宫颈癌细胞中值得我们深究。

4 结语

由于宫颈组织HPV感染的特殊性,使宫颈局部免疫调节越来越受到人们的重视。目前,这种免疫调节方式在宫颈癌发生机制中的作用是人们研究的热点。然而,宫颈局部免疫调节涉及的方面很多,找到有效的切入点来研究其与宫颈癌发生之间的关系显得至关重要。虽然,目前的研究已经证实在宫颈癌中TLR4、i NOS表达有所变化,但这种变化的意义何在,这种变化与宫颈癌的发病机制之间到底有何关联,以及这能否为今后宫颈癌临床靶向治疗提供一种新的途径?尚需我们进一步探索、研究。

摘要：宫颈癌的主要病因是持续高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染。宫颈局部免疫调节因素在HR-HPV感染转归中具有重要作用。Toll样受体4(TLR4)是模式识别受体Toll样受体(TLRs)家族的成员之一,能特异性识别革兰阴性菌细胞膜表面的脂多糖(LPS)进而引发信号转导。TLR4途径可通过多种关键基因对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)进行调节,构成了TLR4/i NOS信号通路。TLR4/i NOS信号通路改变宫颈局部免疫微环境,最终导致HPV的持续感染状态,以致宫颈癌的发生、发展。