P450酶

P450酶（通用4篇）

P450酶 篇1

子宫肌瘤是女性生殖器官最常见的良性肿瘤,其发病机制仍不清楚,普遍的研究结果认为子宫肌瘤是雌激素依赖性疾病,雌激素是其生长的主要促进因子。绝经后的患者体内雌激素水平下降,大部分患者肌瘤停止生长甚至萎缩,但临床上却能见到部分患者绝经后肌瘤不但不萎缩反而增大甚至引起临床症状,从而推测其发病机制可能与局部雌激素形成有关。细胞色素芳香化酶P450(aromatase cytochrome P450,P450arom)是雌激素合成中最重要的限速酶,能将雄激素转化为雌激素。研究发现P450arom在乳腺癌、子宫内膜癌、子宫内膜异位症等雌激素依赖性疾病的病灶中表达增强,导致组织局部雌激素浓度升高,促进肿瘤或异位内膜生长[1,2]。因而介导雌激素合成的P450arom也可能是子宫肌瘤的重要研究靶点。本研究旨在探讨P450arom在绝经后非萎缩性子宫肌瘤中的表达及其与绝经前增生期、分泌期肌瘤的表达是否存在差异,为绝经后子宫肌瘤的病因学研究和内分泌治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 组织来源

选取100例子宫肌瘤患者,患者均行子宫切除术并经病理检查确诊,其中绝经后非萎缩性子宫肌瘤标本40例(绝经后非萎缩性组),患者年龄58.28±5.21岁,绝经7.19±3.24年,绝经后萎缩性肌瘤标本20例(绝经后萎缩性组),患者年龄61.05±4.98岁,绝经9.33±3.78年;绝经前患者40例,其中增生期20例为绝经前子宫肌瘤增生期组(绝经前增生期组),患者年龄44.15±4.15岁,分泌期20例为绝经前子宫肌瘤分泌期组(绝经前分泌期组),患者年龄42.05±4.83岁。同时提取每位患者本身的正常子宫肌层组织。所有患者于手术前日早晨空腹抽取静脉血3 ml,血清学标本不加抗凝剂,2000 r/min离心分离血清,于-70℃冰箱贮存待测。所有患者在术前3个月均未用任何激素类药物;所有绝经后患者均已绝经1年以上,绝经前有子宫肌瘤病史,内膜组织学符合萎缩性宫内膜改变。

绝经后非萎缩性子宫肌瘤指绝经后经妇科检查及B超检查证实肌瘤不萎缩或继续增大,本研究结节直径为4～9 cm;绝经后萎缩性子宫肌瘤选取绝经后经妇科检查及B超检查证实肌瘤至少缩小2 cm,并因子宫脱垂、单纯性卵巢囊肿、宫颈CINⅠ～Ⅲ及盆腔脓肿而行手术的肌瘤,本研究结节直径为1～3 cm。

1.2 雌激素的测定

患者血清中E2含量测定采用化学发光法,试剂盒由Bayer公司提供,所有标本为同批检测,操作严格按试剂盒说明书进行。

1.3 免疫组织化学法测定P450arom表达

1.3.1采用免疫组化SP(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结)法。

其中浓缩型兔抗人多克隆P450arom抗体购自武汉博士德生物有限公司,二抗、三抗均采用北京中山生物技术公司产品,以PBS(磷酸盐缓冲液)代替一抗做阴性对照。按试剂盒说明书方法操作。

1.3.2免疫组化结果判定细胞浆里出现棕黄色的颗粒为P450arom阳性染色。

应用免疫反应评分(immuno reactive score,IRS),综合阳性细胞面积和染色强度进行定性半定量测定。染色强度按下列标准评定:无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。染色的阳性细胞面积评定标准为:无着色,着色面积小于25%为0分,25%～50%为1分,50%～75%为2分,>75%为3分。两项评分相加,将结果分为4个等级:0分为(-),1～2分为(+),3～4分为(++),5～6分为(+++)。(-)和(+)为阴性,(++)和(+++)为阳性。

1.4 统计学方法

各组测定结果均数比较采用t检验,率比较采用χ2检验,等级资料比较采用Wilcoxon秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绝经后非萎缩性组与绝经后萎缩性组一般情况比较

两组的年龄、绝经年数、体重指数(BMI)相比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2 4组患者血清E2水平比较

绝经后非萎缩性组血清E2浓度与绝经后萎缩性组比较,差异无统计学意义(t=0.764,P>0.05),绝经后非萎缩性组血清E2浓度与绝经前增生期组、分泌期组比较,差异有高度统计学意义(P均<0.01),见表2。

2.3 P450arom表达的定位

P450arom表达于子宫肌瘤平滑肌细胞和小动脉内膜平滑肌细胞胞浆,呈棕黄色或棕褐色,在其他成分如侵入肌瘤组织的血细胞中不表达,见图1、图2、图3、图4(见插页12-1),而肌层组织只有少量阳性孤立细胞。

(1)与绝经后萎缩性组比较,P>0.05;(2)与绝经前增生期组、绝经前分泌期组比较,P<0.01

2.4 P450arom在4组肌瘤与肌层的表达强度

P450arom在绝经前增生期组、绝经前分泌期组及绝经后非萎缩性组肌瘤中的阳性表达率分别为80.0%、90.0%、72.5%,3组比较差异无统计学意义(P>0.05),而绝经后萎缩性组肌瘤中阳性表达率(25.0%)与其余3组比较,差异有高度统计学意义(P均<0.01),P450arom在绝经后非萎缩性组、绝经前增生期组、绝经前分泌期组肌瘤中的表达强度均高于其相应肌层组织,肌瘤与肌层组织间比较,差异有高度统计学意义(P<0.01);而绝经后萎缩性肌瘤与其相应肌层组织间比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

(1)与其他3组肌瘤阳性率比较,P<0.01;(2)与相应肌层阳性率比较,P<0.01

3 讨论

3.1 E2与子宫肌瘤发生的关系

大量实验研究表明,子宫肌瘤为激素依赖性肿瘤,与正常子宫肌层相比,子宫肌瘤对雌激素具有高应答性。激素和其受体结合后,能促进肌瘤细胞的有丝分裂。Barbarisi等[3]报道,雌激素促肌瘤细胞有丝分裂作用是通过触发细胞分裂素活化蛋白激酶短暂而快速地活化,以及早期下游信号转导通路的快速酪氨酸磷酸化来实现的。绝经后患者体内雌激素水平下降,大部分患者的肌瘤停止生长甚至萎缩,但临床上却能见到部分患者绝经后肌瘤不但不萎缩,反而增大甚至引起临床症状,其发病机制不清。本研究结果显示,绝经后非萎缩性子宫肌瘤患者与萎缩性子宫肌瘤患者血清E2水平均较绝经前子宫肌瘤患者明显降低,但绝经后非萎缩性与萎缩性子宫肌瘤患者血清E2两者相比无统计学意义(P>0.05),这一结果提示子宫肌瘤可能并非由于外周血高水平雌激素的作用,而可能是由于局部组织中高雌激素水平刺激的结果。

3.2 P450arom在子宫肌瘤发病中的作用

P450arom是细胞色素P450的一种,它是CYP19基因编码的产物,参与雌激素的合成,能催化雄烯二酮和睾酮转化为雌酮和E2,是雌激素合成的最后一步限速酶。研究发现P450arom位于细胞内质网内,在人体的许多组织细胞中表达,如卵巢颗粒细胞、胚胎合体滋养层细胞、子宫动脉及腺外器官如皮肤、脂肪组织、脑组织及骨组织;而正常子宫肌层不表达P450arom[4,5,6]。

不少学者发现子宫肌瘤组织及子宫肌瘤临近的肌层组织内皆有P450arom的表达,而无子宫肌瘤患者的子宫肌层未发现P450arom的表达,且子宫肌瘤组织内P450arom表达比同一子宫临近肌层组织高数倍[7,8,9]。本研究结果显示,绝经前增生期和分泌期组子宫肌瘤中P450arom的表达比同一子宫正常肌层明显增高,与上述报道相符。提示P450arom在肌瘤细胞中的强表达使子宫肌瘤组织中的雄激素向雌激素转化,致使组织局部雌激素浓度升高,这种高雌激素再通过自分泌或旁分泌机制来促进子宫肌瘤的发生、发展[9]。

绝经后非萎缩性组肌瘤中P450arom的表达水平与绝经前增生期、分泌期组相当,且显著高于相应肌层组织及绝经后萎缩性组,而绝经后萎缩性组肌瘤与相应肌层之间差异无统计学意义(P>0.05),提示绝经后患者雌激素水平下降,肌瘤仍可生长,可能与P450arom持续高表达、雌激素原位合成增加有关。而绝经后萎缩性组中P450arom的表达水平显著降低,与周围正常肌层的表达相当,提示绝经后肌瘤萎缩可能与P450arom表达下降、局部雌激素合成减少有关。

本研究发现P450arom在绝经前增生期组和分泌期组及绝经后非萎缩组肌瘤中的表达差异无统计学意义(P>0.05),而绝经后萎缩性组显著低于绝经前增生期、分泌期组及绝经后非萎缩组,提示P450arom的表达可能不受外周血性激素影响。Kurose等[10]用不同浓度E2处理肌瘤培养细胞,发现E2不影响肌瘤细胞中P450arom的活性及表达,认为P450arom的表达调节无雌激素依赖性,支持本研究结果。但P450arom与雌、孕激素的确切关系有待进一步研究。

Hiroshi等[8]用不同刺激物处理子宫肌瘤来源的原代细胞,发现芳香化的雄烯二酮和睾酮与E2一样促进肌瘤细胞生长,而周围肌层的细胞对雄激素处理无反应性生长,提示肌瘤细胞能用循环中的雄烯二酮合成足够雌激素促进自身细胞生长,并对原位合成的雌激素反应性增生[9]。并认为肌瘤细胞原位合成的雌激素,尽管量少不能对远处细胞发挥内分泌效应,但足够以自分泌、旁分泌方式有效地刺激自身细胞或邻近细胞的生长。

Kurose等[10]报道,在自然绝经后的6个月,大多数肌瘤结节不萎缩或稍萎缩,而血清雌激素水平快速下降,提示原位合成的雌激素足够防止绝经后妇女肌瘤快速萎缩,而用GnRHa治疗后,患者的肌瘤萎缩程度加快。Makio等[9]发现GnRHa可极度抑制肌瘤组织和周围肌层P450arom的表达,认为使用GnRHa治疗可以清除内分泌和原位雌激素合成,导致肌瘤萎缩比自然绝经快,支持原位雌激素在维持肌瘤生长中的重要性。可见生育期妇女原位雌激素作用可能被卵巢来源的循环高雌激素掩盖,而在卵巢激素耗竭时如绝经后或GnRHa治疗中,原位雌激素可能是肌瘤生长的雌激素主要来源[11]。

综上所述,P450arom在绝经后非萎缩性肌瘤中过度表达,可能导致雌激素原位合成增加,使其不萎缩或继续生长,推测P450arom在子宫肌瘤发病中起重要作用,从而为我们应用芳香化酶抑制剂用于子宫肌瘤的保守性治疗或其辅佐治疗提供了依据。

摘要：目的:探讨芳香化酶P450(P450arom)在绝经后子宫肌瘤中的表达及其在子宫肌瘤发病中的作用。方法:选取100例子宫肌瘤患者,其中绝经后非萎缩性组40例,绝经后萎缩性组20例,绝经前增生期组20例,分泌期组20例。术前测定血清中雌二醇(E2)含量,术中取肌瘤及其相应肌层组织作免疫组织化学染色,检测P450arom的表达。结果:绝经后非萎缩性组与萎缩性组两组血清E2含量相比,差异无统计学意义(P>0.05)。P450arom在绝经后非萎缩性组、增生期及分泌期组肌瘤中的表达水平相比,差异无统计学意义(P>0.05),但均显著高于其相应肌层组织及绝经后萎缩性组(P<0.01);而P450arom在绝经后萎缩性组中的肌瘤表达水平与相应肌层组织相当,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:P450arom在绝经后非萎缩性肌瘤中过度表达,可能导致雌激素原位合成增加,使其不萎缩或继续生长。

关键词：芳香化酶P450,子宫肌瘤,绝经后

参考文献

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P450酶 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

大鼠80只, 皆为雄性;重量 (247.3±8.7) g;将其随机分为4组, 20只/组。空白对照组每天灌胃, 给予生理盐水;受试药物组每天灌胃, 给予六味地黄丸0.5mg/kg;酶抑制剂组每天灌胃, 给予西咪替丁45mg/kg;酶诱导剂组每天灌胃, 给予苯巴比妥钠2.5mg/kg, 均每天用药两次, 持续用药7天。在第7天晚禁食, 探针药物非那西丁于第8天早晨采用腹腔注射, 药物剂量控制在40mg/kg。

1.2 血清样品的采集与处理

在给药后0、2、5、10、20、40、80、160、320min进行采血, 采血方法为心脏采血, 采血量为0.25mL, 静置5min, 在10 000r/min条件下离心5min得到血清。吸取0.1mL血清待试, 加入含内标苄氟噻嗪 (18.8mg/L) 的乙腈溶液0.2mL中, 经过40s振荡, 在10 000r/min下离心5min;取上层溶液于另一离心管中加适量氯化钠盐析, 经40s旋涡振荡, 在10 000r/min下离心5min, 取上层有机相经0.45μm滤膜滤过后, 取20μL进样分析[3]。

1.3 色谱条件

色谱柱VP-ODSC18柱 (4.6mm×250mm, 5μm, 日本岛津公司) ;流动相:体积比为45∶55的甲醇-水溶液;流速:1.0mL/min;检测波长:247nm;柱温:35℃;内标:苄氟噻嗪。

1.4 标准曲线的制备

用含内标的乙腈精确配置200mg/L的非那西丁溶液, 于冰箱中低温储藏待用。将其进一步稀释后得到标准系列溶液, 浓度分别为50.0、25.0、12.5、5.0、0.5、0.1mg/L。加样血清由各浓度标准系列溶液0.2mL与0.1mL空白大鼠血清分别配置而成。后续处理与样品制备方法相同, 在同样色谱条件下进样分析。

1.5 统计学方法

使用SPSS14.0处理, 检测数据以 (珚x±s) 表示, 并采用t检验进行统计分析, P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

药时曲线使用DAS 1.0软件处理, 药动学参数使用SPSS14.0处理数据, 详见表1。比较不同组别灌胃大鼠的血浆中探针药物t1/2。空白对照组、酶抑制剂组与受试药物组比较, 组间差异显著 (t值分别为9.8741、35.1634, 均P<0.01) ;酶诱导剂组与受试药物组比较, 组间差异不显著 (t=8.255 34, P>0.05) 。

3 讨论

实验采用空白对照组、酶诱导剂组和酶抑制剂组与受试药物组进行比较的评价方式, 充分确保了实验方法的科学、有效性。由各组探针药物的t1/2分别为 (92.2±10.4) 、 (85.4±9.0) 、 (160.5±10.5) 、 (65.8±5.9) min, 可以得出实验方法具有可靠性。空白对照组、酶抑制剂组与受试药物组比较, 组间差异显著 (P<0.01) ;酶诱导剂组与受试药物组比较, 组间差异不显著 (P>0.05) 。因此, 可以推断大鼠肝微粒体代谢酶P450活性在六味地黄丸作用下会得到一定增强。

P450酶 篇3

关键词：二甲亚砜,细胞色素P450酶3A4,细胞色素P450酶2C9,药物代谢,相互作用

在药物肝脏代谢中, 细胞色素P450酶 (CYP450) 是与相关底物结合后活化或消除的重要药物代谢酶。 其中CYP3A4含量最高, 约占30%;CYP2C9约占12.8%, 是主要的药物代谢酶[1]。150多种药物可以通过CYP3A4或CYP2C9介导代谢 , 包括激素、 免疫抑制剂、钙离子通道阻滞剂、非甾体抗炎药、抗菌药物等。因此, 研究药物对CYP3A4、CYP2C9表达的影响非常重要。现在许多研究常选用肝脏细胞研 究药物对CYP450酶的影响。在体外实验中, 二甲亚砜 (DMSO) 是一种常用的药物溶剂。因其具有一个亲水的亚硫酰基和两个疏水的甲基, 所以DMSO既可溶解极性化合物也可溶解非极性化合物, 可提高许多药物的溶解度而在实验中被广泛使用。通常认为低浓度DMSO对细胞无毒性, 不影响实验结果。然而, 近年来的实验研究发现1%浓度的DMSO会影响干细胞的分化[2];0.5%的DMSO影响耳蜗器官培养[3];0.01%的DMSO抑制肝微粒体中P450 1A2的体外检测[4]。此外, DMSO对CYP450酶也有影响:瑞士学者发现DMSO可上调Hepa RG细胞中CYP1A2、2B6、2C9和3A4的表达[5]。但日本学者曾报道DMSO可抑制CYP2C9、CYP2C18基因的表达[6]。因此, 本研究将考察不同浓度DMSO对肝细胞中CYP3A4和2C9表达的影响, 以助于选择合理的DMSO浓度用于体外细胞实验, 降低DMSO作为溶剂对体外细胞实验结果的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料

Chang Liver细胞 ( 中国科学 院细胞库 ) , RPMI1640培养基 (GIBCO公司) , 胎牛血清 (天杭生物科技有限公司) , 胰蛋白酶 (GIBCO公司) , 青-链霉素 (Millpore公司) , 睾酮 (Sigma公司) , 利福平 (Sigma公司) , RIPA裂解液 (碧云天生物技术有限公司) , 苯甲基磺酰氟 (PMSF, 碧云天生物技术有限公司 ) , 蛋白定量试剂盒 (碧云天生物技术有限公司) , CYP3A4抗体 (Chemicon公司) , CYP2C9抗体 (Abcam公司) , 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体Ig G (鼎国生物技术有限公司) , 辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠抗体Ig G (威奥生物技术有限公司) , 甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体 (GAPDH, Bioworld公司) , 预染蛋白Marker (Thermo公司) , DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 (Milipore公司) , Trizol (Invitrogen公司) , RNA逆转录试剂盒 (Ta Ka Ra公司) , SYBR-标记定量PCR试剂盒 (Ta Ka Ra公司) , 100 bp DNAladder (鼎国昌盛生物有限公司) 。

恒温CO2培养箱 (美国Thermol公司) , 超微量分光光度仪 (美国NanoDrop公司) , 酶标仪 (美国Bio-RAD公司 ) , Veriti誖PCR热循环仪 (美国Life Tech-nologies公司) , 7500实时荧光定量PCR系统 (美国LifeTechnologies公司 ) , 凝胶图像分析系 统 ( 法国Vilber公司) , 蛋白电泳转印仪 (美国Bio-RAD公司) , 低温高速离心机 (美国Beckman Coulter公司) 。

1.2 细胞培养

Chang Liver细胞在含有10% 胎牛血清 (FBS) 、1% 青 -链霉素的RPMI 1640培养液内 , 37°C, 5%CO2饱和湿度培养箱内培养。细胞单层贴壁生长至70%~80%融合时, 以0.25%胰蛋白酶消化 、传代 , 取对数期生长细胞用于各项实验。

1.3 药物处理及分组

选择睾酮作为CYP3A4诱导剂, 选择利福平作为CYP2C9诱导剂, 设定以下分组:空白对照组:细胞仅给予RPMI 1640培养液;DMSO处理组 (分别采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO处理 ) ; 睾酮处理组 ( 分别采用1、10、100μmol/L睾酮处理 ) , 利福平处理组 (分别采用1、10、100μmol/L利福平处理) 。 (0.01%、0.05%、0.1%) DMSO+10μmol/L睾酮组, (0.01%、0.05%、0.1%) DMSO+10μmol/L利福平组。每组各3个样品。

1.4 定量 PCR 法检测 CYP3A4、CYP2C9 mRNA 表达

Chang Liver细胞接种于细胞培养皿中, 接种密度1×106/m L, 在37℃, 5%CO2培养箱中培养。待细胞单层贴壁生长至70%~80%时, 加入上述不同药物处理细胞, 培养24 h。培养结束后, 弃去培养液, 用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤2次后, 加入Trizol试剂提取细胞总RNA, 超微量分光光度计测定RNA浓度及A260/A280值, 当A260/A280>1.8时, 证明纯度较高。根据Ta Ka Ra逆转录试剂盒说明书, 将RNA反转录为c DNA。以c DNA作为RT-PCR的反应模板 , 根据Ta Ka Ra定量PCR试剂盒说明书, 配制反应液进行实时定量PCR反应, 反应条件如下:95℃预变性30 s, PCR反应95℃5 s, 60℃34 s, 循环数为40次 , 测定融解曲线 , 通过Ct值计算相对表达量[7]。以GAPDH为内参 , 引物由上 海生工生物工程有限公司合成, 引物序列见表1。本实验以GAPDH作为内参照 , 所有基因表达 都以GAPDH作均一化处理。

1.5 Western blot 方法检测蛋白表达

细胞接种于培养皿中, 分别加入不同的药物处理24 h后 , 用PBS清洗细胞3次 , 使用含有PMSF的蛋白裂解液裂解细胞, 操作均在冰上进行, 收集各组细胞裂解产物, 加入1/4体积的上样缓冲液, 涡旋混匀, 在100°C水浴中煮沸10 min使蛋白变性。配制5%浓缩胶、10%分离胶 , 根据蛋白浓 度决定加 样量。浓缩胶用电压100 V电泳, 当样品浓缩为一条直线改用150 V电压 , 约70 min后停止电泳。取下凝胶100 V转膜120 min, TBST室温封闭2 h。加入一抗, CYP3A4 (1∶2000) 、CYP2C9 (1∶2000) , GAPDH (1∶5000) , 4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次, 10 min/次, 加入1∶2000稀释的二抗, 室温孵育1 h, TBST洗膜3次;化学发光试剂显色发光, 以GAPDH蛋白作为内参, 蛋白表达都以GAPDH作均一化处理。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据管理和统计分析。定量PCR中所有数据均以均数±标准差 (±s) 表示, 组间差异比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。分析前均进行方差齐性检验, 以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DMSO 对 CYP3A4、CYP2C9 mRNA 表达的影响

定量PCR获得的样品Ct值, 经倍数转换后, 与空白对照组 (1.00±0.06) 比较, 0.01%、0.05%的DMSO[ (1.00±0.18) 、 (1.24±0.11) ]对Chang肝细胞中CYP3A4m RNA的表达几乎没有 影响 , 而与空白对照组比较 , 0.1%的DMSO (4.03±1.03) 可明显诱导CYP3A4 m RNA的表达 (P < 0.01) 。见图1。

与空白对照组比较, **P<0.01;DMSO:二甲亚砜

以同样的方法测定不同浓度DMSO对CYP2C9m RNA的影响 , 结果发现 :与空白对照组 (1.05±0.39) 比较, 0.01%、0.05%、0.1%的DMSO[ (1.29±0.25) 、 (1.12±0.43) 、 (1.83±1.03) ]对Chang肝细胞中CYP2C9 mRNA的表达几乎没有影响 (P > 0.05) 。见图2。

DMSO:二甲亚砜

2.2 DMSO 对 CYP3A4、CYP2C9 蛋白表达的影响

与空白对 照组比较 , 0.01% 、0.05% 的DMSO对Chang肝细胞中CYP3A4蛋白的表达几乎没有 影响 , 而0.1%的DMSO可明显诱导CYP3A4蛋白的表达。见图3。

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶;DMSO:二甲亚砜

与空白对照组比较, 0.01%、0.05%、0.1%的DMSO对Chang肝细胞中CYP2C9蛋白的表达几乎没有影响。见图4。

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶;DMSO:二甲亚砜

2.3 DMSO 与 药 物 联 合 使 用 对 CYP3A4、CYP2C9mRNA 表达的影响

与空白对照组 (1.03±0.33) 比较, 0.01%、0.05%、0.1%的DMSO+10μmol/L睾酮组[ (1.65±0.32) 、 (0.64±0.24) 、 (1.28±0.27) ]Chang肝细胞CYP3A4 m RNA的表达差异无统计学意义 (P > 0.05) 。与空白对照组比较, 10、100μmol/L的睾酮[ (3.20±0.23) 、 (2.13±0.03) ]能够显著上调CYP3A4 mRNA的表达 (P < 0.01) 。见图5。

与空白对照组比较, **P<0.01;DMSO:二甲亚砜;Test:睾酮

与空白对照组 (1.02±0.29) 比较, 1、10、100μmol/L的利福平[ (0.93±0.11) 、 (1.30±0.76) 、 (1.02±0.15) ], 以及0.01%、0.05%、0.1%DMSO+利福平组[ (0.70±0.17) 、 (2.77±1.63) 、 (0.88±0.53) ]Chang肝细胞CYP2C9 m RNA的表达差异无统计学意义 (P > 0.05) 。与10μmol/L利福平比较 组 , 0.01% 、0.05% 、0.1%DMSO + 利福平组Chang肝细胞CYP2C9 m RNA的差异无统计学 意义 (P > 0.05) 。见图6。

DMSO:二甲亚砜;Rif:利福平

2.4 DMSO 与药 物联合使用对 CYP3A4、CYP2C9 蛋白表达的影响

与空白对照组比较, 单用睾酮可诱导Chang肝细胞CYP3A4蛋白的表达。但当睾酮中分别加入0.01%、0.05%DMSO可使CYP3A4的蛋白表达显著上升。见图7。

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶;DMSO:二甲亚砜;Test:睾酮

与空白对照组相比, 单用利福平对Chang肝细胞CYP2C9蛋白的表达的影响较小 , 但当利福平中分别加入0.01%、0.05%、0.1%DMSO均使CYP2C9的蛋白表达显著上升, 见图8。

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶;DMSO:二甲亚砜;Rif:利福平

3 讨论

DMSO是体外细胞实验中经常使用的药物溶剂, 常用的浓度为0.1%, 普遍认为该浓度下的DMSO对实验结果的影响小。然而本实验研究发现0.1%甚至更低浓度DMSO能够影响Chang肝细胞中CYP3A4和CYP2C9的表达。以往研究也发现2.5%的DMSO可提高人肝脏细胞CYP3A4 m RNA的表达[8]。DMSO可通过以下途径对CYP3A4 m RNA诱导性表达和构成性表达产生影响:DMSO可增强CYP3A4 m RNA启动子———孕烷活化受体 (PXR) 的表达[9], 从而增强其诱导性表达。 增强其构成性表达是通过激活激活蛋白 (activator protein, AP-1) [10], 进一步激活构成性肝增强子模块4 (CLEM4) ;并且促进CCAAT增强子结合蛋白α (C/EBPα) 修复[9], 而增强其调 控。本实 验进一步证实了0.1%DMSO可使肝脏细胞CYP3A4 m RNA和蛋白的表达升高。

但是本实验中发现, DMSO在与睾酮联合使用时, 在基因水平上未见其上调CYP3A4 m RNA作用, 这可能是由于DMSO抑制了6β羟化睾酮的活化, 从而抑制了CYP3A4 m RNA的表达。而在蛋白水平上DMSO与睾酮联合使用后可提高CYP3A4蛋白的表达。其原因可能是DMSO抑制了CYP3A4蛋白的代谢, 也可能是DMSO增加了细胞膜的通透性, 使细胞内睾酮的浓度升高, 从而诱导了CYP3A4的蛋白表达。

本实验还发现, 0.01%、0.05%、0.1%DMSO对CYP2C9m RNA和蛋白的影响相对较小。CYP2C9转录调控受到5' 端启动子区孕烷活化受体 (PXR) [11]、构成性雄烷受体 (CAR) [12]、维生素D受体 (VDR) [13]、糖皮质激素受体 (GR) [14]等的识别, 而核肝因子4 (HNF4) [15]、核肝因子3γ (HNF3γ) [16]参与CYP2C9的转录。只有当药物反应性核受体、核肝因子、共激活因子等共同作用才能最大程度地激活CYP2C9基因[17]。然而DMSO除对PXR的影响可见于文献报道外, 对其他因子的影响均未见报道。因此仅对PXR的作用可能不足以启动CYP2C9的基因转录。从药物合用结果来看, 单用DMSO对肝细胞CYP2C9无显著影 响。然而 当合用利 福平后 , CYP2C9蛋白表达明显升高, 这可能与DMSO增加细胞膜的通透性, 使胞内药物浓度提高有关。相关机制有待进一步研究。

P450酶 篇4

近年来,随着合理用药认识的不断增强,发现许多中草药存在药物相互作用[7]。而这些相互作用大多与肝脏药物代谢酶有关。在肝脏药物代谢酶的研究中,细胞色素P450 酶(cytochromes P450,CYP450)是一类重要的氧化酶系统,与许多内源性和外源性物质的生物转化有关[8]。约有75%的药物通过CYP450酶系中CYP3A4[9]和CYP2C9[10]亚型代谢,是药物代谢的主要途径。在含有隐丹参酮成分的丹参制剂研究中已发现,丹参通过CYP3A4 和CYP2C9 与咪达唑仑[11]、5- 氟尿嘧啶[12]、氯沙坦[13]、环孢素A[14]、华法林等[15]药物间存在相互作用。隐丹参酮在肝微粒体中可竞争性抑制CYP2C9 的活性[16],然而隐丹参酮对肝细胞中CYP3A4、CYP2C9 表达的影响尚未见报道。故本研究将揭示隐丹参酮对CYP3A4 和CYP2C9 蛋白及m RNA的变化,进而阐明隐丹参酮的药物代谢途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Chang肝脏细胞(上海中科院细胞研究所),RPMI 1640 培养基、10%胎牛血清(美国Hyclone公司),0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA、青- 链霉素(美国Gibco公司),隐丹参酮(批号:110852,纯度>98%)(中国食品药品检定所),CCK- 8 试剂盒(日本Dojindo公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解液、SDS- PAGE上样缓冲液(江苏碧云天生物有限公司),CYP3A4 抗体(美国Merk Millipore公司),CYP2C9 抗体(英国Abcam公司),辣根过氧化酶标记的甘油醛- 3- 磷酸脱氢酶(HRP- GAPDH,上海康成生物工程有限公司),化学发光试剂盒(美国Thermo公司),Trizol试剂(美国Invitrogen公司),逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(日本Ta Ka Ra公司)。

1.2 仪器与设备

恒温二氧化碳CO2培养箱(美国Thermal公司),酶标仪、免疫印迹电泳转膜仪(美国Bio- RAD公司),凝胶图像分析系统(法国Vilber公司),PCR热循环仪、7500 实时荧光定量PCR系统(美国Life Technologies公司),ND2000 超微量分光光度计(美国nanodrop公司),低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司)。

1.3 试验方法

1.3.1细胞培养

Chang肝脏细胞培养于含有10%FBS、1%青-链霉素的RPMI 1640培养基,37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度培养箱内。当单层贴壁细胞覆盖培养皿70%~80%时,用0.25%胰蛋白酶消化90 s、进行细胞传代。

1.3.2细胞存活率检测

取对数生长期的Chang肝脏细胞,制成单细胞悬液,接种于96孔板,每孔接种密度为1×105个/ml,在37℃、5%二氧化碳CO2的培养箱内培养,至细胞单层铺满孔底,弃去培养基,分别加入含不同浓度的隐丹参酮(10、100、1 000、10 000μmol)的培养基100μl,每个浓度设置5个复孔,同时设置只含细胞培养液的空白组、未经药物处理的细胞对照组。在37℃、5%二氧化碳CO2的培养箱内分别培养24、48 h后,加入10μl CCK-8溶液,继续培养1 h,取上清液50μl,用酶标仪检测每孔在450 nm处的吸光度值。其中细胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。As为实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8和隐丹参酮),Ac为对照孔(含有细胞的培养基和CCK8,不含隐丹参酮),Ab为空白孔(不含细胞和隐丹参酮的培养基、CCK-8)。

1.3.3 Western blot法

细胞接种于培养皿中,隐丹参酮高低剂量组每天分别给予10和100μmol隐丹参酮,CYP3A4和CYP2C9阳性对照组给予100μmol利福平,CYP3A4阴性对照组给予100μmol浓度酮康唑。处理1、3和7 d后,用预冷的PBS清洗细胞3次,加入含有PMSF的蛋白裂解液裂解细胞200μl,收集各组细胞裂解产物,上述操作均在冰上进行。裂解30 min后,4℃,12 000 r/min离心15 min,取上清液,用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。调整蛋白浓度一致后,加入1/4体积的5×上样缓冲液,涡旋混匀,在100℃水浴中煮沸10 min使蛋白变性。配制5%浓缩胶、10%分离胶,根据蛋白浓度决定加样量。浓缩胶用电压100 V电泳,当样品移动到分离胶后改用120 V电压至结束。取下凝胶,在100 V电压下,将凝胶上蛋白转至PVDF膜100 min,5%脱脂牛奶室温封闭2 h。含有目的蛋白的PVDF膜分别加入一抗,CYP3A4(1∶2 000)、CYP2C9(1∶2 000),GAPDH(1∶5 000),4℃摇床孵育过夜。次日,用TBST溶液洗膜3次,后加入1∶2 000稀释的二抗,室温孵育1 h,TBST洗膜3次;化学发光试剂显色发光,通过凝胶图像分析系统成像。

1.3.4定量R T-PCR法

Chang肝脏细胞接种于细胞培养皿中,接种密度1×106个/ml,在37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养。待细胞单层贴壁生长至70%时,每天隐丹参酮高低剂量组分别给予100μmol和10μmol隐丹参酮,CYP3A4和CYP2C9阳性对照组给予100μmol利福平,CYP3A4阴性对照组给予100μmol浓度酮康唑,空白对照组给予仅含有10%FBS、1%青-链霉素的RPMI 1640培养基溶液。处理1、3和7 d。培养结束后,弃去培养液,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后,依次加入Trizol、氯仿、异丙醇、75%酒精等试剂提取细胞总RNA,超微量分光光度计测定RNA浓度。根据Ta Ka Ra逆转录试剂盒说明书,将RNA反转录为c DNA。再根据Ta Ka Ra定量PCR试剂盒说明书,用c DNA作为模板,通过SYBR法进行实时定量PCR反应。反应条件如下:95℃预变性30 s,PCR反应95℃、5 s,60℃、34s,循环数为40次,测定融解曲线,通过Ct值计算相对表达量2-△△Ct[17]。以GAPDH为内参,引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列见表1。

1.4 统计学方法

细胞活力测定和蛋白表达量测定采用Graph Pad Prism 5 统计软件进行数据分析,用SPSS 19.0 统计软件进行定量PCR测定。计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间差异比较用方差分析,两两比较用LSD- t检验,分析前进行方差齐性检验,P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隐丹参酮对Cha ng肝脏细胞存活率的影响

隐丹参酮在10、100 和1 000 和10 000μmol浓度下干预细胞24 h对细胞影响小,细胞生存率分别为(114.36±4.13)%、(76.43±3.32)%、(104.98±7.50)%和(135.97±3.81)%,细胞存活率均高于50%。作用48 h后,细胞存活率略有下降,分别为(82.43±8.01)%、(102.28±6.91)%、(99.49±8.26)%和(105.18±0.67)%,但细胞存活率仍均高于50%。见图1。

2.2隐丹参酮对CYP 3A4、CYP 2C9 蛋白表达的影响

2.2.1隐丹参酮对CYP3A4蛋白表达的影响

10μmol、100μmol隐丹参酮干预Chang肝脏细胞1 d后,CYP3A4蛋白的表达相比于空白对照组略有下降,结果分别为(0.84±0.05)和(0.91±0.03)。随着隐丹参酮干预时间的延长,即3 d后,Chang肝脏细胞CYP3A4蛋白的表达较空白对照组比较有下降,结果分别为(0.68±0.83)和(0.78±0.13)。隐丹参酮干预Chang肝脏细胞7 d后,对CYP3A4蛋白的抑制作用更为明显,结果分别为(0.60±0.13)和(0.70±0.02),与CYP3A4抑制剂酮康唑组对蛋白的抑制作用相近。见图2。

2.2.2隐丹参酮对CYP2C9蛋白表达的影响

10μmol隐丹参酮干预Chang肝脏细胞1、3和7 d后,CYP2C9蛋白的表达与空白对照组相比CYP2C9蛋白的表达差异无统计学意义,结果分别为(0.94±0.14)、(0.96±0.20)和(0.83±0.19)。100μmol隐丹参酮干预Chang肝脏细胞1、3和7 d后,与空白对照组比较CYP2C9蛋白的表达差异无统计学意义,结果分别为(1.19±0.24)、(1.05±0.09)和(1.10±0.15),见图3。

2.3 隐丹参酮对CYP 3A4 m RNA、CYP 2C9 m RNA表达的影响

2.3.1隐丹参酮对CYP3A4 m R N A表达的影响

10μmol隐丹参酮干预Chang肝脏细胞1 d后对CYP3A4 m RNA表达无显著影响,结果为(0.86±0.19),而持续给予10μmol隐丹参酮3 d和7 d后CYP3A4 m RNA表达下降,结果分别为(0.31±0.09)和(0.56±0.04)。100μmol隐丹参酮干预Chang肝脏细胞1 d后对CYP3A4 m RNA的表达也无显著影响,结果为(1.11±0.03),而持续给予100μmol隐丹参酮3 d和7 d后,逐步抑制CYP3A4 m RNA的表达,结果分别为(0.80±0.05)和(0.74±0.04),见图4。

2.3.2隐丹参酮对CYP2C9 m R N A表达的影响

10μmol隐丹参酮干预Chang肝脏细胞1、3和7 d后对CYP2C9 m RNA的表达无显著影响,结果分别为(1.14±0.17)、(0.81±0.08)和(0.97±0.07)。100μmol隐丹参酮干预Chang肝脏细胞1、3和7 d后,也对CYP2C9 m RNA的表达无显著影响,结果分别为(1.10±0.16)、(1.05±0.05)和(0.93±0.10)。见图5。

1:Cry 10μmol:隐丹参酮低剂量组;2:Cry 100μmol:隐丹参酮高剂量组;3:Contorl:空白对照组;4:KET 100μmol:阴性对照组;5:RIF100μmol:阳性对照组

1:Cry 10μmol:隐丹参酮低剂量组;2:Cry 100μmol:隐丹参酮高剂量组;3:Contorl:空白对照组;4:RIF 100μmol:阳性对照组

1:CRY 10μmol:隐丹参酮低剂量组;2:CRY 100μmol:隐丹参酮高剂量组;3:Contorl:空白对照组;4:KET 100μmol:阴性对照组;5:RIF 100μmol:阳性对照组;†与Contorl组比较,P<0.05

1:CRY 10μmol:隐丹参酮低剂量组;2:CRY 100μmol:隐丹参酮高剂量组;3:Contorl:空白对照组;4:RIF 100μmol:阳性对照组;†与Contorl组比较,P<0.05

3 讨论

在Chang肝脏细胞的体外研究中,隐丹参酮对细胞毒性的影响较小,在10~10 000μmol浓度下培养48 h内细胞生存率均大于50%。但隐丹参酮是丹参中的脂溶性成分,1 000μmol和10 000μmol的隐丹参酮不能完全溶解于PRMI 1640 培养液中,而在前期研究中笔者发现常用的助溶剂———二甲亚砜会影响P450 酶的表达[18]。此外已有文献报道,1 000μmol、10 000μmol隐丹参酮干预结肠癌细胞以及Hep G2 细胞,细胞生存率低于50%[19,20]。因此,在研究隐丹参酮对CYP450 酶的影响中,选用10μmol和100μmol两个浓度。

研究结果表明10μmol和100μmol隐丹参酮可影响CYP3A4 蛋白和m RNA的表达, 而对CYP2C9 蛋白及m RNA的表达无显著影响。已有学者研究发现,隐丹参酮可以抑制LS174T细胞中PXR的表达[21]。PXR是CYP3A4 基因转录的启动子,隐丹参酮可以通过PXR通路抑制Chang肝脏细胞中CYP3A4 基因的转录,从而减少CYP3A4 m RNA和蛋白的表达。然而,本实验发现隐丹参酮干预1 d没有对CYP3A4 m RNA及蛋白的表达产生显著的影响,但随着干预时间的延长隐丹参酮可抑制CYP3A4 蛋白和m RNA的表达。已有报道其他中草药对P450 酶系也存在相似的情况[22],但机制尚不明确。由此提示在长期使用隐丹参酮时应关注其与经CYP3A4 酶代谢的药物间的相互作用。在慢性疾病或其他需要长期服药的疾病中,许多药物是CYP3A4代谢酶为底物,包括硝苯地平、氨氯地平、阿普唑仑、环孢素、他克莫司、辛伐他汀等。若在临床上需长期联合使用含隐丹参酮制剂与CYP3A4 代谢酶为底物的药物时,应注意可能由于药物代谢减慢而出现的不良反应。