HPLC-ELSD法

HPLC-ELSD法（共7篇）

HPLC-ELSD法 篇1

摘要：目的:建立HPLC-ELSD法测定胆南星中胆酸含量的方法。方法:色谱柱为Hypersil BDS C18色谱柱 (4.6mm×200mm, 5μm) , 流动相为乙腈-水 (36∶64) , 柱温为25℃, 流速为1.0mL·min-1。检测器为ELSD, 漂移管温度为100℃, 载气流量为3.0L·min-1。结果:胆酸在0.14~1.4μg进样量范围内与其峰面积积分呈良好的线性关系 (r=0.999 4) , 平均加样回收率为97.13%, RSD=1.80%。结论:该方法简便准确, 灵敏度高, 可用于胆南星中胆酸含量的测定和产品质量控制。

关键词：胆南星,HPLC-ELSD,胆酸

胆南星为制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经混合加工而成, 或由天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成。其具有清热化痰、熄风定惊的功效, 临床用于痰热咳嗽、咳痰黄稠、中风痰迷、癫狂惊痫的治疗。天南星经胆汁炮制后性味发生改变, 功效由燥湿化痰变为清热化痰, 由散结消肿变为熄风定惊, 这种变化主要是由胆汁引起的。胆汁酸中主要含有胆酸、去氧胆酸和鹅去氧胆酸等成分。本文采用HPLC-ELSD法对胆南星中胆酸含量进行测定, 目标物与杂质峰分离效果好, 该方法快速准确, 重现性好, 现报道如下。

1 仪器与试药

仪器:Agilent1100高效液相色谱仪, 蒸发光散射检测器;试剂:乙腈为色谱纯, 甲醇为分析纯, 水为娃哈哈纯净水;对照品:胆酸 (批号:078-9312, 中国食品药品检定研究院) ;药材:胆南星 (批号:10032, 四川广汉中药饮片有限责任公司) ;胆南星 (批号:111002, 四川百胜药业有限公司) ;胆南星 (批号:20121102, 四川千方中药饮片有限公司) 。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil BDS C18 (4.6mm×200mm, 5μm) , 流动相:乙腈-0.2%醋酸 (36∶64) , 柱温:25℃, 流速:1.0mL·min-1;检测器为ELSD, 漂移管温度:100℃, 载气流量:3.0L·min-1。在上述色谱条件下, 供试液色谱图中胆酸与其他组分的色谱峰分离度良好, 见图1。

2.2 供试品溶液制备

取胆南星粉末 (过三号筛) 约2g, 精密称定, 置于具塞锥形瓶中, 加甲醇25mL, 超声处理30min, 滤过, 滤液蒸干, 残渣加甲醇溶解, 转移至5mL容量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。

2.3 对照品溶液制备

精密称取胆酸对照品适量, 加甲醇制成每1mL含70μg胆酸的溶液, 作为对照品溶液。

2.4 标准曲线制备

精密吸取胆酸对照品溶液 (70μg/mL) 2、4、8、12、16、20μL分别注入液相色谱仪中, 测定峰面积。以胆酸进样量的对数为横坐标, 以峰面积的对数为纵坐标, 得线性回归方程为:Y=1.468 6X+3.113 1, r=0.999 4, 胆酸在0.14~1.4μg进样量范围内与其峰面积积分呈良好的线性关系。

2.5 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液 (百胜) , 分别放置0、2、4、6、8、12h后进样测定峰面积, 得峰面积积分RSD为1.24%, 表明供试液在12h内化学性质稳定。

2.6 精密度试验

取同一供试品溶液 (百胜) , 连续进样测定6次, 计算得峰面积积分RSD为1.52%, 表明该方法精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一份样品 (百胜) , 平行取样6次, 按“2.2”项下方法制备供试品溶液, 进样测定峰面积, 计算供试液中胆酸含量, RSD为1.60%, 表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验

取已知含量的样品 (百胜) 1g, 精密称定, 平行取样9份, 分别加入胆酸对照品溶液适量, 按“2.2”项下制备供试品溶液, 进样测定峰面积, 计算供试液中胆酸加样回收率, 得平均回收率为97.13%, RSD为1.8%, 结果见表1。

2.9 样品测定

分别精密吸取对照品溶液5、10μL与供试品溶液10μL, 注入液相色谱仪中测定峰面积, 根据标准曲线计算供试液中胆酸含量, 结果见表2。

3 讨论

在炮制过程中, 胆汁不仅是加工胆南星的主要辅料, 其还从根本上改变了主药的理化性质及性味。目前, 2010版中国药典尚未对胆南星质量标准进行规范, 但许多学者在胆南星质量标准方面进行了研究。赫炎等[1]采用HPLC-ELSD法测定胆南星中猪去氧胆酸含量;高向军等[2]以胆酸为指标, 采用薄层扫描法对胆南星及其制剂中的胆酸含量进行了测定;张厚宝等[3]以总胆酸、胆红素含量为检测指标, 对江苏省8个市县的胆南星进行了测定;张绍轩等[4]以鹅去氧胆酸为对照, 建立了胆南星的薄层色谱鉴别方法。

本文采用高效液相色谱法, 选择蒸发光散射检测器, 以胆酸为对照品, 对市售三种胆南星药材中的胆酸含量进行了测定, 可能由于加工过程中胆汁来源及加入量的不同, 导致胆酸含量有所差异。实验过程中考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%醋酸3种色谱系统, 并对流动相比例进行了考察, 最终乙腈-0.2%醋酸 (36∶64) 分离效果最为理想。

采用HPLC-ELSD法测定胆南星中胆酸含量简便准确, 灵敏度高, 稳定性好, 可用于胆南星中胆酸含量测定, 用于其质量控制。

参考文献

[1]赫炎, 张永欣, 赵惠东, 等.HPLC测定胆南星中猪去氧胆酸的含量[J].中国中药杂志, 2007, 32 (16) :1634-1636.

[2]高向军, 刘涵芳, 张伯崇.胆南星及其复方制剂中胆酸的检查[J].中药通报, 1987, 12 (6) :31-32.

[3]张厚宝, 康纯.胆南星中胆汁成分的检测[J].中药材, 1991, 14 (3) :37-38.

[4]张绍轩, 黄青, 王学农, 等.胆南星的薄层色谱鉴别[J].长春中医药大学学报, 2008, 24 (2) :147-148.

HPLC-ELSD法 篇2

1 仪器与试药

Agilent1200 高效液相色谱仪;Alltech 2000ES蒸发光散射检测器;TU-1901 双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);D-无水葡萄糖(中国药品生物制品检定研究院,批号:110833-200904);XP205 电子天平(瑞士梅特勒公司);优普医疗纯水制造系统;GZX-9140MBE数显鼓风干燥器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);HHW-4 数显恒温水浴锅(金坛市双捷实验仪器厂);高纯氮(安徽金鼎锅炉股份有限公司,纯度≥99.999%);乙腈(HPLC/Spectro,美国TEDIA公司);硫酸、正丁醇、无水乙醇、甲醇、乙醚均为分析纯。

2 UV-分光光度计法测定总糖含量

2.1对照品溶液的制备

取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品适量, 精密称定,加水制成每毫升含40 μg的溶液,即得[5,6,7,8,9,10,11,12]。

2.2 5%苯酚溶液的制备

取苯酚100 g,加铝粉0.1 g,碳酸氢钠0.05 g,蒸馏收集182℃馏分,称取此馏分5 g,置100 m L棕色量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,备用。

2.3 最大吸收波长的测定

精密量取葡萄糖对照品溶液2 m L,精密加入5%苯酚水溶液1 m L、浓硫酸7 m L,混匀,于水浴中20 min,取出,于冰浴中5 min。 另以未加葡萄糖的溶液参比,分别于200~800 nm范围内扫描, 最大吸收波长为490 nm。 见图1。

2.4 供试品溶液的制备

取样品(批号140301)约0.4 g,精密称定,加入50 m L无水乙醇加热回流2 h, 滤过, 残渣挥至无醇味,将残渣和滤纸置烧瓶中,加入50 m L水回流提取2 次,每次2 h,趁热过滤,残渣及烧瓶用热水洗涤,洗液与滤液合并,浓缩转移至100 m L量瓶中,蒸馏水稀释至刻度,摇匀,精密量取1 m L至25 m L量瓶中,蒸馏水稀释至刻度,摇匀,即得。

2.5 标准曲线的配制

分别精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 m L,置于10 m L的量瓶中,加水定容至刻度,摇匀,配成系列标准品溶液。 精密量取2 m L,精密加入5%苯酚水溶液1 m L、浓硫酸7 m L,混匀,水浴加热20 min,取出,冰浴5 min。以蒸馏水为空白,在490 nm波长处测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标作图,得标准曲线方程A=0.0136X-0.0069(r2= 0.9995)。

2.6 精密度试验

取样品(批号140301)约0.4 g,精密称定,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按照“2.5”项下自“精密量取2 m L”起依法操作,测定吸光度,连续测定6 次,计算吸光度RSD为0.78%。 表明精密度良好。

2.7 稳定性试验

取样品(批号140301)约0.4 g,精密称定,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按照“2.5”项下自“精密量取2 m L”起依法操作,测定吸光度,分别于0、1、2、4、6、8、10、24 h测定, 计算吸光度RSD为1.27% , 说明在样品显色之后24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取样品(批号140301)约0.4 g,6 份,精密称定,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按照“2.5”项下自“精密量取2 m L”起依法操作,测定吸光度,计算其平均含量为22.3%,RSD为1.16%。 表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品(批号140301)约0.2 g,6 份,精密称定,加入50 m L无水乙醇加热回流2 h,滤过,残渣挥至无醇味,将残渣和滤纸置烧瓶中,精密加入葡萄糖对照品适量, 加50 m L水回流提取2 次,按“2.4”项下方法制备供试品,按照“2.5”项下自“精密量取2 m L”起依法操作,测定吸光度,结果表明加样回收率符合要求。 见表1。

2.10 样品含量测定

取3 批样品各约0.4 g,精密称定,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按照“2.5”项下自“精密量2 m L”起依法操作,测定吸光度,结果见表2。

3 HPLC-ELSD法测定总糖含量

3.1色谱条件

色谱柱:Xbridge Amide column(4.6 mm×150 mm,3.5 μm); 流动相: 乙腈∶0.1%三乙胺=75∶25; 柱温:30℃;流速:1.0 m L/min;蒸发光散射检测器,漂移管温度:95℃;气体流速:3.0 L/min;理论塔板数按D-葡萄糖峰计算应不低于3000[13,14,15,16,17,18]。

3.2 对照品溶液的制备

精密称取D-无水葡萄糖2份,分别加水制成每毫升含0.30 mg和0.80 mg的溶液,即得。

3.3供试品溶液的制备

取样品约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加水饱和正丁醇25 m L,超声处理30 min,放冷,4000 r/min离心10 min,倾出上清液,沉淀加入配制好的1.5 mol/L硫酸溶液25 m L,沸水浴3 h,取出,冷却至室温,滴加30%KOH溶液中和至p H值6~7, 加入无水乙醇使含醇量达到70%,静置片刻,4000 r/min离心10 min,取上清液, 减压回收乙醇至适量, 转移至100 m L量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,即得。 分别精密吸取对照品液与供试品液各10 μL, 注入液相色谱仪,测定,即得。 HPLC-ELSD色谱图见图2~3。

3.4 线性试验

取D-无水葡萄糖适量, 精密称定25.35 mg,置25 m L量瓶中,加水溶解稀释至刻度,摇匀,即得。 从上述对照品溶液中分别精密移取适量, 配成0.0507、0.1014、0.2028、0.4055、0.6083、0.8110 mg/m L的系列浓度对照品溶液,摇匀,进样量为10 μL。 以峰面积的对数值为横坐标(X),进样浓度的对数值为纵坐标(Y),绘制标准曲线。 得到回归方程为Y=0.5252X-3.9398(r2= 0.9998), 结果表明D- 无水葡萄糖在0.0507 ~0.8110 mg/m L范围内呈现良好的线性关系。

3.5精密度试验

取D-无水葡萄糖对照品(0.4055 mg/m L)溶液,精密吸取10 μL,重复进样6 次,测得峰面积积分值,计算RSD为0.65%。 结果表明仪器的精密度良好。

3.6 稳定性试验

取样品约0.3 g,精密称定,按“3.3”项下方法制备供试品溶液,精密吸取10 μL,分别在第0、2、4、6、8、10 小时进样一次,共进样6 次,测得峰面积积分值,计算RSD为1.33%,说明该方法稳定性良好。

3.7 重复性试验

取样品约0.3 g,精密称定,按“3.3”项下方法制备供试品溶液,6 份,测定,结果D-无水葡萄糖的平均含量为15.2%。 表明该方法重复性良好。

3.8 加样回收试验

取样品约0.15 g,精密称定,分别精密加入D-无水葡萄糖对照品适量,按“3.3”项下方法制备供试品溶液,测定,结果表明加样回收率试验结果符合要求。见表3。

3.9 样品含量测定

取3 批样品各约0.3 g,精密称定,按“3.3”项下方法进行制备,进样,测定,结果见表4。

4 讨论

苯酚-硫酸法测定原理是根据多糖在硫酸的作用下先分解成单糖分子, 并迅速脱水生成糠醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物测定[19,20,21],此方法专属性较差,但稳定性较好,弥补了HPLC-ELSD法测定中由于对照品单一而使结果偏小的缺点;HPLCELSD法是通过将多糖完全水解, 通过测定葡萄糖来反映多糖的含量,克服了多糖含量测定中专属性不强的缺点,在以后的研究过程中,可以选用不同的单糖对照品来进行测定,使实验结果更加真实、可信,能更好地反映多糖的含量及各个单糖的比例。

在色谱条件的选择上,考察了样品在乙腈和水、乙腈和0.1%三乙胺、乙腈和0.2%三乙胺系统中的分离情况。 结果乙腈和水比例在(81∶19)、(85∶15)、(89∶11)3 个系统中,对照品葡萄糖均为两个峰,而在乙腈和0.1%三乙胺系统中,对照品葡萄糖为单峰,说明三乙胺能加速葡萄糖两个构型之间的转化。 乙腈和0.2%三乙胺系统与乙腈和0.1%三乙胺系统没有明显差异,故选择乙腈和0.1%三乙胺系统。

在前处理的过程中,考察了甲醇、无水乙醇、正丁醇、水饱和正丁醇、乙醚处理后样品中葡萄糖的含量,结果乙醚前处理后得到的葡萄糖含量最高,但考虑到样品中含有苷类成分,乙醚前处理不能有效地将其去除;甲醇、无水乙醇能有效地去除大量的苷类成分,但小分子的葡萄糖也有可能被除去。 综合考虑之下,又对正丁醇和水饱和正丁醇去除苷类能力进行了进一步的考察,结果水饱和正丁醇处理后样品中芍药苷的含量为0.05%(原2.8%),故选择水饱和正丁醇作为前处理的试剂。

在样品的处理过程中, 对水解时间进行了考察,选择了1、2、3、4 h作为考察对象,结果在3 h时水解比较完全,所以选择水解时间为3 h;对醇沉浓度进行了考察, 选择了50%、60%、70%、80%作为考察对象,结果4 个不同的醇沉浓度对结果影响不大,考虑到醇沉效果及尽量避免葡萄糖的损失,确定最终的醇沉浓度为70%。

摘要：目的 建立健脾止泻胶囊多糖的含量测定方法 。方法 以无水葡萄糖为对照品,采用苯酚-硫酸法测定总糖含量;采用1.5 mol/L硫酸溶液水解多糖,通过碱中和、乙醇沉淀的方法得到单糖,用HPLC-ELSD方法测定其含量;色谱条件:色谱柱为Xbridge Amide column(4.6 mm×150 mm,3.5μm);流动相为乙腈∶0.1%三乙胺(75∶25);柱温:30℃;流速为1.0 m L/min;ELSD漂移管温度为95℃;气体流速为3.0 L/min。结果 苯酚-硫酸法中,葡萄糖在6.8~68.0μg/m L范围内与吸光度呈良好的线性关系(r2=0.9995),平均回收率为96.1%。HPLC-ELSD法中,无水葡萄糖在0.0507~0.8110 mg/m L范围内呈现良好的线性关系(r2=0.9998),平均回收率为97.1%,RSD为1.4%。两种测定方法测定多糖的平均含量分别为22.3%、15.2%。结论 该方法稳定可行,重复性好,可以作为健脾止泻胶囊多糖的含量测定方法。

HPLC-ELSD法 篇3

1 仪器与试药

WATERS2695-2420型高效液相色谱仪(美国);Empower色谱工作站。

贞芪扶正片(自制);黄芪甲苷对照品(批号:110781-200512,中国药品生物制品检定所,供含量测定用)。甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱:Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相甲醇-水(80 ∶ 20);流速:1.0 ml/min;进样量20 μl。检测器漂移管温度为80℃,载气压力为50psi,柱温为30℃。在该色谱条件下,黄芪甲苷理论塔板数n=4500,分离度 R =4.1,可达基线分离,其他成分对测定无干扰。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1 ml含0.507 5 mg的溶液,摇匀,即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品去糖衣,研细,取1 g粉末,精密称定,置索氏提取器中,加甲醇40 ml,冷浸过夜,再加甲醇适量,加热回流提取4 h,提取液回收甲醇并浓缩至干,残渣加水10 ml,微热使溶解,放冷。用水饱和的正丁醇提取4次,每次40 ml,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次40 ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水5 ml使溶解,放冷,通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm,长12 cm),以水50 ml洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30 ml洗脱,弃去洗脱液。继用70%乙醇80 ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣用甲醇定容至5 ml,即得。

2.4 阴性对照供试液的制备

取处方比例药材(除黄芪外),按贞芪扶正片制备工艺制得黄芪空白片,再按“2.3”项下制备方法制得阴性对照供试溶液。

2.5 干扰试验

照上述色谱条件,取上述3种溶液,分别注入液相色谱仪,结果表明供试品色谱在与对照品色谱相应位置上,有一相同的色谱峰,而阴性对照供试液在此保留时间内无干扰,可达基线分离。在上述色谱条件下,黄芪甲苷理论板数n=6500,分离度 R =9.1。见图1。

2.6 线性关系考察

精密吸取上述对照品溶液3、5、7、10、15、30 μl,注入液相色谱仪。按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积对数lgA为纵坐标,进样量对数值为横坐标进行线性回归,得回归方程为lgA=9.301+1.454 lgM,r=0.999 4。结果表明黄芪甲苷在1.522 5-15.22 5 μg范围内与峰面积分别取自然对数后呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取同一批供试品(批号070405)6份,按含量测定方法测定。结果黄芪甲苷峰面积RSD=2.1%。

2.8 稳定性试验

取上述供试品溶液20 μl,分别在0、2、4、8、16、24 h进样测定,峰面积的RSD=1.08%(n=6), 表明供试品溶液在24 h内测定基本稳定。

2.9 重复性试验

取供试品(批号:070411)6份,每份约1 g,精密称定。按“2.3”项下方法制备并测定,测出黄芪甲苷平均含量分别为0.902 mg/g,RSD=1.4%。

2.10 加样回收试验

精密称取已知含量的样品(批号070413,黄芪甲苷含量0.906 mg/g)6份,每份取样量为供试品取样量(1 g)的50%,按供试品溶液制备项下操作,以当前取样含量的1 ∶ 1,分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液(0.182 mg/ml)2.5 ml,制备加样回收供试品溶液,按含量测定条件测定,计算回收率。见表1。

2.11 样品测定

取10批样品,按上述方法操作制备供试品溶液,按上述色谱条件测定。结果见表2。

注:经过10批样品测定,贞芪扶正片黄芪甲苷平均含量是0.908 mg/g

3 讨论

3.1 根据文献报道,选择超声提取、索氏提取、回流提取,经预试验比较,索氏提取4 h后样品中黄芪甲苷含量提取比较完全。

3.2 黄芪甲苷仅在紫外 200 nm 波长处有弱的末端吸收,响应值很小,采用紫外检测器检测,操作条件须十分严格,而且噪音对检测结果影响也较大。而采用蒸发光散射检测器检测,响应值很好,因此采用 HPLC-ELSD 法检测黄芪甲苷的含量。

3.3 贞芪扶正片所含成分复杂,干扰成分多,因而样品溶液的前处理为本方法的技术关键。本实验参考药典和有关文献资料,从提取纯化方法、溶剂等方面进行试验,确定以正丁醇提取, 氨试液洗涤正丁醇提取液以除去黄芪等药中所含色素、氨基酸等成分,减少干扰,得到色谱峰对称、分离度高。

摘要：目的建立测定贞芪扶正片中黄芪甲苷含量的高效液相色谱-蒸发光散射检测器法(HPLC-ELSD)。方法采用Kromasil C18(250mm×4·6mm,5μm)的色谱柱;以甲醇-水(80∶20)为流动相;流速:1ml/min;ELSD检测条件:检测器漂移管温度为80℃,氮气压力为50psi,柱温为30℃。结果黄芪甲苷在1·522515·225μg范围内与峰面积分别取自然对数后呈良好的线性关系(r=0·9994,n=6),平均回收率是99·98%(RSD=0·3%)。结论HPLC-ELSD法测定贞芪扶正片中黄芪甲苷含量简便、准确、可靠。

关键词：高效液相色谱-蒸发光散射检测器法,贞芪扶正片,黄芪甲苷

参考文献

[1]刘晔,吴乐.RP-HPLC法测定黄芪中黄芪甲苷的含量.中草药,1998,29(增刊):83.

[2]国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部.化学工业出版社,2005:212.

HPLC-ELSD法 篇4

1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪,Waters 2424型ELSD检测器,1/100000电子天平。黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号110781-201314,含量95.8%)；康复春口服液(批号20140721、20140810、20140920,湖南回春堂药业有限公司生产)。乙腈为色谱纯,水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5μm)；流动相为乙腈-水(30∶70)[1]；流速：0.9 ml/min；柱温：30℃；ELSD参数：漂移管温度70℃,载气压力:25 kPa,增益值：3。

2.2 对照品溶液的制备

称取黄芪甲苷对照品10.95 mg,置

10 ml量瓶中,加甲醇溶解后稀释至刻度。

2.3 供试品溶液的制备[2]

精密吸取本品10 ml,用三氯甲烷振摇提取2次,30 ml/次,分取上层溶液,用水饱和的正丁醇萃取5次,30 ml/次,合并正丁醇液,加入氨试液2次,80ml/次,合并正丁醇液层,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中,加甲醇至刻度,即得供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液的制备

根据处方组成(原药材由湖南回春堂药业有限公司提供)按比例不加黄芪按康复春口服液的制备工艺制备阴性样品,再按2.3项下的方法制成阴性对照溶液。按上述色谱条件测定,黄芪甲苷峰与前后峰分离好,且阴性样品溶液在与黄芪甲苷对照品相同保留时间处未显色谱峰,故认为无干扰。见图1。

2.5 标准曲线绘制

分别精密吸取对照品溶液1,2,6,1015,20μl,注入液相色谱仪,按上述色谱条件进行测定,以进样量X(μg)的自然对数为横坐标,峰面积Y自然对数为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程：ln Y=1.562ln X+13.506r=0.999 1(n=6)。结果显示,黄芪甲苷在1.05～20.92μg呈良好线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取黄芪甲苷对照品溶液5μl,注入液相色谱仪,连续进样5次,测定黄芪甲苷的吸收峰面积,RSD=1.85%(n=5)。

2.7 稳定性试验

精密吸取供试品溶液20μl,在0、2、8、16、24、36、48 h分别进样,黄芪甲苷峰面积RSD=1.12%(n=7),表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.8 重现性试验

取同一样品(批号20140721)6份,10 ml/份,按2.3项方法制备溶液,照含量方法测定,结果平均含量为0.084 mg/ml,RSD=1.19%。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品(批号20140721,0.084 mg/ml),精密量取6份,5 ml/份,分别精密加入浓度为1.049 mg/ml的黄芪甲苷对照品0.4 ml,按2.3项的方法制备溶液,按照上述方法测定黄芪甲苷的含量,计算回收率,结果平均回收率为93.98%,RSD=1.87%(n=6)。见表1。

2.1 0 样品测定

取3批康复春口服液,照2.3项下制备供试品溶液,每批样品制备平行样2份,进样20.00μl。含量分别为(批号20140721、20140810、20140920)0.084、0.088、0.089 mg/ml。另采用原标准中的方法测定,含量分别为(批号20140721、20140810、20140920)0.0459、0.0509、0.0371 mg/ml。

3 小结

3.1 黄芪甲苷无特征紫外吸收,仅在200 nm处有弱的末端吸收,需采用紫外末端波长检测[3],对溶剂要求较高,试验成本昂贵；且如有其他皂苷类成分的存在时,干扰严重,分离度下降,重现性差,很难利用HPLC-UV联用测定黄芪甲苷含量。

3.2 原标准采用薄层扫描法对黄芪甲苷进行测定,但此法受硅胶颗粒细度及薄层板的厚度、活化程度、点样、展开、显色剂量的多少及均匀程度、加热时间等诸多因素影响,往往需要反复试验,其准确性、稳定性、精密度很难保证。

3.3 原质量标准中,供试品溶液的处理还要过D101型大孔吸附树脂柱及用水、40%、70%乙醇洗涤,本法省去上述步骤,实验表明黄芪甲苷分离效果也很理想,且加样回收率也比较好。

摘要：目的 建立康复春口服液中黄芪甲苷的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法,色谱柱:Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm,5μm),流动相:乙腈-水(30∶70),流速:0.9 ml/min;柱温:30℃;ELSD参数:漂移管温度70℃,载气压力:25 kP a,增益值:3。结果 黄芪甲苷在1.0520.92μg之间呈良好线性关系,回归方程为:ln Y=1.562ln X+13.506,r=0.999 1(n=6);回收率为93.98%,RSD=1.87%(n=6)。结论 本方法简便、准确和重现性好,可作为康复春口服液的含量测定方法。

关键词：康复春口服液,高效液相色谱-蒸发光散射检测法,黄芪甲苷,含量测定

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部.北京:中国医药科技出版社,2010:284.

[2]朱克旭,李永宏,刘冰冰.HPLC-ELSD法测定芪心合剂中黄芪甲苷的含量.安徽医药,2011,15(11):1364-1365.

HPLC-ELSD法 篇5

1 仪器与试药

岛津LC20A高效液相色谱仪,蒸发光散射检测器(SEDEX-75);色谱柱为Hypersil BDS-C18柱;LCsolution操作系统。

黄芪甲苷对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号110781-200613),乙腈为色谱纯;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Hypersil BDS C18色谱柱(5μm,200mm×5.0mm);流动相是乙腈-水(32∶68);流速1.0mL/min;载气为3.5mL/min;蒸发光散射检测器漂移温度40℃;理论板数以黄芪甲苷峰计应不低于3000。

2.2 对照品溶液制备

将黄芪甲苷对照品干燥至恒重,精密称取适量,用甲醇溶解稀释成浓度为0.1mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备[1]

精密量取本品5g,置索氏提取器中,用甲醇50mL冷浸,第2天再加甲醇适量,加热回流,待提取液无色后取出,放冷,滤过,并用少量甲醇分次洗涤容器,合并洗液和滤液,蒸干,加水50mL于残渣,微热使之溶解,然后用水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次40mL,合并正丁醇提取液,再用氨试液充分洗涤,每次40mL,2次,最后分取正丁醇液,蒸干,用甲醇溶解残渣后移至5mL的量瓶,取甲醇加至刻度,摇匀,即得供试品溶液。

2.4 阴性供试品溶液的制备

精密称取缺少黄芪的阴性样品5g,按2.3中相同方法制备阴性供试品溶液。

2.5 系统适应性试验[2]

精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪。结果表明,供试品色谱中黄芪甲苷色谱峰与其他成分峰分离良好,其色谱峰的保留时间与对照品一致,阴性供试品溶液色谱峰未见干扰。理论板数以黄芪甲苷峰计应不低于3000。见图1。

2.6 线性关系的考察

精密量取黄芪甲苷对照品,加甲醇溶解稀释得0.50mg/m L的对照品储备液。分别精密量取该溶液1、2、4、5、6、8、10m L于10m L容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,然后分别精密量取各浓度对照品溶液10μL,进样测定,记录色谱图,以对照品浓度(μg/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,得回归方程:Y=4.0206X-6.4720,r=0.9996。结果表明,黄芪甲苷在进样量0.20～2.00μg范围内浓度与峰面积呈良好线性关系。

2.7 精密度试验

精密量取黄芪甲苷对照品溶液10μL,进样,在上述色谱条件下测定。重复进样6次,测得黄芪甲苷峰面积RSD为0.96%,表明此法的进样精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一供试液,重复进样6次,RSD为1.793%。表明方法重复性好。

2.9 回收率试验

精密量取样品9份,每份分别精密加入一定量对照品溶液(取样量和加入量详见表1),按上述供试品溶液制备方法操作,在“2.1”项色谱条件下进行进样测定,记录色谱图,计算回收率和RSD(%),测得平均回收率为97.32%,RSD为2.31%。

2.1 0 稳定性考察

取同一供试品溶液,分别在0,2,4,6,8h进样测定,结果黄芪甲苷色谱峰面积RSD=2.41%(n=5),说明供试品溶液在8h内稳定。

2.1 1 样品测定

分别精密吸取对照品(0.1mg/mL)和供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,测定即得。分别测定3批样品,每g含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计分别是29.3μg,31.4μg,27.6μg。根据以上样品的测定结果,本品含量限度初步定为每g含黄芪以黄芪甲苷(C15H26O)计,不得少于15.0μg。

3 讨论

3.1 提取方法的选择,试验过程中分别采用索氏提取器提取,80℃温浸提取和超声波提取,后两种方法测得的黄芪甲苷含量略低,故选区索氏提取器提取方法。

3.2 黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分之一,为定量分析健脾益气胶囊中黄芪甲苷的含量,本实验建立了黄芪甲苷的HPLC-ELSD测定法。本方法样品处理简单,在实验色谱条件下色谱分离完全,加样回收率高,精密度试验相对标准偏差小,测试数据可靠,能更有效的控制产品质量。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人国共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2010:212.

HPLC-ELSD法 篇6

资料与方法

仪器:日本岛津LC-10A高效液相色谱仪, N2100液相色谱工作站, Alltech2000ES型蒸发光散射检测器。

药品与试剂:血府逐瘀口服液 (批号:120101~120110十批次) ;苦杏仁苷对照品 (批号:110820~220403) ;甲醇为色谱纯;其他试剂都是分析纯;水是超纯水。

方法: (1) 色谱条件与系统适用性试验:Diamonsil C18色谱柱, 其规格为250mm×4.6mm, 5μ;流动相为甲醇-水 (25:75) , 流速1.0ml/分, 其中检测采用蒸发光散射检测器, 漂移管温度控制在105℃, 空气或氮气作为雾化气体, 其流速控制在3.0L/分。在理论上来说, 应该按照苦杏仁苷峰值来计算板数, 其板数不应该低于3000[2]。 (2) 溶液的制备:对照品溶液的制备:对苦杏仁苷对照品进行精密称取适量, 将对照品放入棕色瓶中, 然后加入甲醇, 制造成对照品溶液, 其中每1ml对照品溶液中, 含0.2mg苦杏仁苷[3]。供试品溶液的制备:取本品0.4g研细, 精密称定, 置索氏提取器中, 加石油醚 (60~90℃) 适量, 加热回流2小时, 弃去乙醚液, 药渣挥去乙醚, 置索氏提取器中, 再加甲醇适量, 加热回流5小时, 提取液浓缩, 转移至25ml量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 得出结果。阴性对照液干扰试验:为进一步考查实验设计过程以及测定样品中苦杏仁苷方法及合理性, 取10μl的不含苦杏仁苷的阴性对照液, 将阴性对照液注入高效液相色谱仪, 进行测定, 得出结果。测定法:精密吸取5μl、15μl的对照品溶液, 10μl的供试品溶液, 然后将其注入高效液相色谱仪, 进行测定, 得出结果, 然后用外标二点法对数方程进行计算[4]。 (3) 线性关系考察:精密吸取对照品溶液各4μl、8μl、12μl、16μl、20μl, 然后将它们注入色谱仪, 按照同样的方法进行测定。采用线性回归进行计算, 其中纵坐标为峰面积的自然对数, 横坐标为苦杏仁苷进样量的自然对数, 回归方程:Y=6.2303+1.2026X。 (4) 精密度试验:精密吸取10μl供试品溶液, 然后注入高效液相色谱仪, 连续注入5次, 对每次的峰面积进行测量, 然后计算RSD值。 (5) 稳定性试验:精密吸取同一批号的供试品溶液, 然后注入高效液相色谱仪, 每隔2小时进样一次, 按上述的含量测定方法进行测定, 对峰面积进行测量, 计算RSD值。 (6) 重现性试验:精密吸取同一批号样品, 注入高效液相色谱仪, 多次进行测定, 计算RSD[5]。 (7) 回收率试验:采用加样回收法, 分别精密取得已知含量的样品和一定量对照品溶液, 一共取得6份, 将样品加入对照品溶液中, 然后进行测定。 (8) 样品含量测定:采用确定的方法对10个批号的样品进行测定, 得出样品含量[6]。

结果

阴性对照液干扰试验结果表明, 在苦杏仁苷色谱峰的保留时间处, 阴性对照液的色谱图没有出现干扰峰。测定法结果, 见表1。

根据以上结果, 暂定桃仁药材按干燥品计算, 含苦杏仁苷 (C20H27NO11) 不得<1.8%。

线性关系考察:r=0.9995, 结果表明, 在0.856~4.28μg范围内, 苦杏仁苷进样量的自然对数与峰面积的自然对数之间, 具有较好的线性关系。精密度实验:RSD=0.87% (n=5) , 结果表明测定仪器的精密度良好。稳定性实验:RSD=0.92% (n=5) 。重现性实验:RSD=1.19% (n=5) , 结果表明方法重现性良好。回收率试验结果, 见表2。

样品含量测定结果, 见表3。

讨论

苦杏仁苷的测定方法有3种, 分别为滴定法、色谱法及分光光度法。中药复方制剂的成分非常复杂, 为了对其中成分的含量进行有效测定, 通过使用紫外检测器, 采用高效液相色谱法。苦杏仁苷容易在沸水、乙醇中微溶, 检测波长为210nm, 由于这些理化性质的限制, 导致样品中的苦杏仁苷无法分离出来, 从而造成供试品中阴性液对照液干扰实验为阳性, 得出的结果不准确。而采用蒸发光散射检测器对成分的含量进行检测, 供试品中苦杏仁苷色谱峰完全达到基线分离, 阴性液对照液干扰实验为阴性, 表示无干扰, 且其色谱峰有较高的相应信号[7]。本研究结果表明, 采用本方法测定苦杏仁苷含量, 具有较好重现性、稳定性和精密度, 值得推广, 该方法“一种血府逐瘀口服液的质量控制方法”已经取得授权专利。

根据ELSD的原理, 样品质量与检测器相应之间是一种指数的关系, 而经过对数转换运算, 两者之间呈线性关系, 具有特定的线性方程式, 其截距非零。对含量进行计算是, 采用外标二点法对数方程, 这样可以减少实验误差。在本研究中就采取了同样的方法, 采用线性回归计算, 苦杏仁苷进样量的自然对数与峰面积的自然对数之间, 具有较好的线性关系;为了得到更加准确的结果, 可以在线性范围内, 采用对照品溶液二点法校正和含量计算。

摘要：目的:建立测定血府逐瘀口服液中苦杏仁苷的含量的方法。方法:采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法。色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂, 流动相为甲醇-水 (25:75) , 流速控制在1ml/分, 柱温控制在30℃;蒸发光散射检测器的漂移管温度控制105℃, 空气或氮气作为其中的雾化气体, 其流速控制在3.0L/分。结果:苦杏仁苷的进样量0.8564.28μg, 其峰面积的自然对数与进样量的自然对数具有良好的线性关系 (r=0.9995) , 平均回收率99.06%, RSD=1.39 (n=6) 。结论:该方法灵敏、准确, 可用于血府逐瘀口服液中苦杏仁苷的含量测定。

关键词：血府逐瘀口服液,苦杏仁苷,高效液相色谱法,蒸发光散射检测器,含量测定

参考文献

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HPLC-ELSD法 篇7

1 材料与试剂

1.1 仪器

Shimadzu高效液相色谱仪, 配有SIL-20A自动进样器, SPD-20A二极管阵列检测器, CTO-20A柱温箱, Shimadzu LC Solution色谱工作站, 由日本Shimadzu公司生产;Agi-lent Eclipse XDB-C18色谱柱 (250mm ×4.6mm, 5μm) ;METTLER TOLEDO AB204-N电子分析天平;SEDEX75蒸发光散射检测器;ULTRASONIC CLEANER超声仪。

1.2 试剂

10批巴豆药材分别购自四川、广西、云南3个主产区, 所购药材均经本研究中心赖小平研究员鉴定为大戟科植物巴豆的成熟果实, 见表1。亚油酸 (Linoleic acid) 购自中国食品药品检定研究院, 批号:116222-200301, 纯度>98%, 供含量测定用。异丙醇为色谱纯 (Kermel) 、乙腈为色谱纯 (Merck) , 高纯氮 (广州福北协力气体有限公司) , 其他试剂为分析纯, 水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱 (250mm ×4.6mm, 5μm) ;流动相:乙腈-异丙醇 (53∶47) 等度洗脱;流速:0.8mL·min-1;检测器:蒸发光散射检测器;柱温:25℃;进样量:10μL;记录时间:60min;进样量:10μL。理论塔板数以亚油酸峰计算, 应不低于3 000。

2.2 巴豆油制备

取购于不同产地的10批干燥巴豆种子, 去壳后粉碎种仁, 取约50g, 精密称定, 用滤纸包裹, 置于索氏提取器中, 加适量乙醚, 40℃水浴加热, 提取8h, 蒸干乙醚提取液, 放冷, 得巴豆油 (浅黄色油状, 相对密度为0.90g·mL-1) , 备用。

2.3 供试品溶液制备

精密称取200mg巴豆油置于10mL容量瓶中, 加流动相乙腈-异丙醇 (53∶47) 溶解, 超声使其溶解完全, 然后加流动相稀释至刻度, 以0.45μm微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得。

2.4 参照物溶液制备

精密称取亚油酸对照品适量, 加乙腈- 异丙醇 (53∶47) 溶解制成0.525g·mL-1的参照物溶液, 以0.45μm微孔滤膜滤过, 即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验取10号供试品1份, 按照“2.2”项下方法制备样品溶液, 按照“2.1”项下色谱条件, 连续进样6次, 记录色谱图, 计算得各共有峰的相对保留时间、相对峰面积积分RSD均小于3%, 表明仪器精密度良好, 符合对指纹图谱的要求。

2.5.2稳定性试验取10号供试品1份, 按照“2.2”项下方法制备样品溶液, 按照“2.1”项下色谱条件, 分别于放置0、2、4、6、8、10、12、24h后进样, 记录色谱图, 计算得各共有峰的相对保留时间、相对峰面积积分RSD均小于3%, 表明供试品溶液在24h内性质稳定, 符合对指纹图谱的要求。

2.5.3重复性试验精密量取10号供试品6份, 每份2mL, 按照“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进样, 记录色谱图, 计算得各共有峰的相对保留时间、相对峰面积积分RSD均小于3%, 表明实验重复性良好, 符合对指纹图谱的要求。

2.6 样品测定

取10批巴豆供试品, 按照“2.2”项下方法制备供试品溶液, 在“2.1”项色谱条件下依次进样检测, 记录色谱图。对照品溶液HPLC-ELSD色谱见图1, 10批巴豆供试品的HPLC-ELSD色谱叠加见图2。

2.7 指纹图谱建立

2.7.1 参照峰选择对亚油酸对照品色谱图与样品色谱图中保留时间相同的色谱峰进行比较, 其紫外吸收光谱完全一致, 故可以确定样品色谱图中S号特征峰为亚油酸。在各批次样品图谱中, 亚油酸色谱峰分离良好、峰面积较大且为所有样品共有, 因此确定亚油酸为参照峰。

2.7.2不同来源药材指纹图谱及相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》 (研究版) 软件, 以批号为BD20100420巴豆油的图谱作为参照谱进行指纹匹配, 确定了14个共有峰, 建立了巴豆油HPLC-ELSD指纹图谱的共有模式, 进行了相似度计算, 以平均数表示10批样品的相似度, 见表2。14个共有峰的峰面积总和占总面积的比例大于90%。以亚油酸为参照物 (S号峰) , 其保留时间和峰面积为l, 计算其他各共有峰的相对保留时间和相对峰面积, 结果见表3和表4。

3 讨论

3.1 色谱条件选择

本实验前期对乙腈-异丙醇 (1∶1) 、乙腈-异丙醇 (51∶49) 、乙腈-异丙醇 (53∶47) 、乙腈-异丙醇4个不同比例的流动相进行了考察, 结果表明乙腈-异丙醇 (53∶47) 等度洗脱时, 各色谱峰的保留时间较为适中, 分离度良好, 对称性较佳, 且基线平稳, 便于指纹图谱的分析, 故选择乙腈-异丙醇 (53∶47) 作为流动相。

3.2 色谱柱选择

实验中考察了不同品牌:Thermo Hypersil Gold C18、Kromasil C18、Agilent Eclipse XDB C18的3根十八烷基键和相硅胶色谱柱的性能, 结果表明, 相比于其他两根色谱柱, 采用Agilent Eclipse XDB C18色谱柱时基线平稳, 色谱峰数目较多, 分离度和峰形极佳。因此, 选择该色谱柱进行指纹图谱研究。

4 结语

巴豆是一种毒性极强的常见中药材, 其脂肪油成分复杂。目前, 国内外对巴豆油中化学成分的研究还不够深入系统, 而巴豆油具有极强的药理活性, 有待进一步研究、开发。2010版《中国药典》中仅对巴豆脂肪油含量进行了粗略限定, 这对于全面反映该药材的质量、临床用药安全性来说远远不够。因此, 建立全面、系统、特征性反映巴豆油化学成分的指纹图谱, 可为巴豆药材的质量评价和控制提供参考依据[7]。

本实验通过建立巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱, 确立了14个共有峰, 并指认了其中1个色谱峰。对10批巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱进行相似度评价, 发现指纹图谱共有峰相对保留时间基本一致, 共有峰相对峰面积差异较大, 提示不同来源的巴豆药材化学成分种类相似, 但含量差异较大。该方法操作性强, 重复性好, 具有较强的特征性和代表性, 可为巴豆油的内在质量控制提供科学依据。

摘要：目的:建立巴豆油的HPLC指纹图谱, 为科学评价与有效控制巴豆油的质量提供新方法和依据。方法:采用HPLC-ELSD法, 测定10批巴豆样品, 色谱条件为:Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱 (250mm×4.6mm, 5μm) , 流动相:乙腈-异丙醇 (53∶47) 等度洗脱;流速:0.8mL·min-1;检测器:蒸发光散射检测器;柱温:25℃;进样量:10μL。结果:在指纹图谱中, 确立了14个共有峰, 建立了巴豆油部分的色谱共有模式;10批样品的指纹图谱相似度在0.7580.998之间。结论:该方法简便、准确、重现性好, 为评价巴豆油的定性鉴别及内在质量控制提供了科学依据。

关键词：巴豆油,亚油酸,HPLC-ELSD,指纹图谱

参考文献

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