RT-LAMP

RT-LAMP（共3篇）

RT-LAMP 篇1

猪瘟 (CSF) 是由猪瘟病毒 (CSFV) 引起的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病。2011年12月, 思南县某养猪场存栏生猪56头, 其中有24头发病, 行动缓慢, 表情呆滞, 站立一旁, 弓背怕冷, 低头垂尾, 停食, 体温升高 (41～42 ℃) 。村防疫员用安乃近、磺胺类等药物治疗无明显效果。12月18日前来求诊, 截止笔者就诊时已死亡猪12头, 经实验室诊断为猪瘟, 现将诊断方法介绍如下。

1 诊断材料

1.1 病料采集

按照病料采集的严格要求, 采集发病死亡猪的脾脏、淋巴结、肾脏, 用无菌生理盐水处理后存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 主要试剂

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer3.0试剂盒 (上海生工生物工程有限公司) , Betaine (美国SIGMA公司) , BstDNA聚合酶、反转录酶、ThermoPol buffer、硫酸镁 (北京纽英伦NEB生物技术有限公司) , dNTPs (上海生工生物工程有限公司) 。

1.3 主要仪器

电热恒温水浴箱 (上海贺德实验设备有限公司) , 高速冷冻离心机 (德国制造) , -80 ℃冰箱 (Haier公司) , 自动双重纯水蒸馏器 (上海亚荣生化仪器厂) , 无菌操作台 (上海亚荣生化仪器厂) 。

1.4 引物合成

参考GenBank中登录的基因组序列, 根据LAMP引物设计的原则, 应用在线Primer Explorer 3.0软件设计4条引物, 包括2条外引物 (F3和B3) , 前内引物 (FIP) 和后内引物 (BIP) , 均由大连宝生物公司合成。

F3:CGGGATCCCTGATGATGGCGCAAGTG

B3:CCCAAGCTTGGTTTATTCTTGTTGTGGTACAG

FIP:GCTGTCCTTCTCATGCTCTTTTG-AAGCCAGATAGGATCAACAAAG

BIP:AGAACTAAGCCACCTGACGCTA-TCTTTCCTTTAACTTTACCCTTC

2 诊断方法

2.1 总RNA的提取

采用试剂盒按操作说明进行总RNA提取, 提取过程中所涉及到的实验器材全部用DEPC水处理, 且在生物安全柜中进行。

2.2 RT-LAMP反应体系建立

采用25 μL反应体系 (见表1) , 将水浴锅温度调至63 ℃后, 把含RT-LAMP反应液的PCR反应管充分混匀置于水浴锅内恒温扩增1 h, 75 ℃ 灭活10 min, 4 ℃终止。

3 诊断结果

反应结束后, 不加任何试剂, 瞬时离心可见焦磷酸镁白色沉淀沉于管底, 判定为猪瘟阳性。

4 小结

4.1 猪瘟对养猪业造成巨大的经济损失, 目前没有特效药物可以治疗, 只能根据实际情况制定并严格执行完善的防治措施, 如做好消毒、加强免疫监测、完善免疫计划、加强出入境检疫。一旦发生猪瘟疫情, 应按照猪瘟疫情处置措施进行处置。

4.2 RT-LAMP方法是一种新的核酸扩增技术, 具有简单、快速、特异性强的特点, 不需要昂贵的实验仪器设备, 只需恒温水浴锅、高速冷冻离心机等常规设备即可快速检测到各种病原微生物, 而且灵敏度高、特异性强, 检测结果肉眼即可观察, 为各种病原微生物的检测提供了便捷可靠的方法。

RT-LAMP 篇2

目前常用的血清学检测技术, 如猪瘟正向间接血凝试验和ELISA试验不能区分免疫抗体与感染抗体, 病原学检测技术, 如常规PCR技术、实时荧光PCR技术和基因芯片技术目前虽然能够较好检测CSFV, 但均需要昂贵的仪器, 并且操作复杂, 另外, 经典的病毒分离技术耗时更长, 并且需要实验室细胞培养等特殊条件, 这些技术无法满足基层和大部分规模场现场快速检测需求。而反转录环介导等温扩增 (RT-LAMP) 技术具有敏感性高、特异性强、操作简单、耗时短、不需特殊设备、成本低廉等诸多优点, 该技术自2000年由日本的Notomi等发明以来, 被广泛应用于病原微生物的检测。LAMP反应结果非常易于观察, 反应过程中产生的大量焦磷酸盐使反应液呈浑浊, 肉眼即能观察到, 另外, 利用浊度仪能更精确地观察浑浊程度;也可在反应液中加入荧光染料, 在紫外灯下阳性样品会发出明显的绿色荧光;还可应用电泳观察LAMP特征性条带或用酶切进行鉴定[3]。为此, 本试验建立了快速、灵敏、特异且无需特殊仪器的猪瘟通用型RT-LAMP检测方法, 以方便基层现场检测需要。

1材料和方法

1.1病毒株和待检材料

猪瘟兔化弱毒疫苗株 (HCLV) 、猪伪狂犬病病毒、猪蓝耳病疫苗株、猪O型口蹄疫疫苗株、猪细小病毒和猪圆环病毒为本中心保存;待检材料为辽宁省部分地区猪场或门诊送检疑似猪瘟病料。

1.2引物设计与合成

参照NCBI上发表的42株CSFV及20株BVDV全基因组序列, 利用生物学软件DNAStar进行序列比对分析, 最终选取NS5B基因作为靶序列, 利用LAMP在线设计软件Primer Explorer V4, 设计了一套针对CSFV基因组的NS5B基因保守区6个位点的RT-LAMP反应引物, 包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP, 引物序列见表1。

1.3病毒RNA的提取

取200μL脏器研磨液上清 (或血清) , 用Trizol试剂进行病毒RNA的提取, 提取的病毒RNA溶于20μL ddH2O中, 直接进行检测或贮存于-20℃以下备用。

1.4 RT-LAMP方法的优化

1.4.1引物浓度的优化

由于RT-LAMP试验中外引物浓度在正常范围内对试验影响极小, 本试验固定外引物对F3/B3浓度, 对内引物对FIP/BIP设置了五个浓度梯度, 分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5μM, 进行RT-LAMP反应, 产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.4.2 RT-LAMP反应温度的优化

在确定最佳引物反应浓度的情况下, 进行反应温度的优化。反应温度从61℃开始, 以1℃为单位递增, 至65℃, 进行RT-LAMP反应, 产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.4.3 RT-LAMP反应时间的优化

在确定最佳引物反应浓度和反应温度的情况下, 进行反应时间的优化。反应时间分别设置为30、45、60、75和90 min, 进行RT-LAMP反应, 产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.5扩增产物的检测

扩增反应结束后, 经离心肉眼可观察到反应管底有无白色沉淀产生, 也可向每个反应管中加入1μL smart Green I荧光染料, 肉眼观察颜色变化情况, 将反应管置于紫外灯下观察绿色荧光产生情况, 也可取5μL反应产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察有无特异性反应条带。

1.6 RT-LAMP的敏感性试验

将提取的CSFV核酸模板10倍稀释至1.0×10-5, 每个稀释度取2μL, 进行RT-LAMP反应检测, 同时用猪瘟荧光定量RT-PCR检测试剂盒 (中山大学) 进行检测, 对两种方法进行比较。

1.7 RT--LAMP的特异性试验

提取猪瘟病毒阳性病料、猪瘟兔化弱毒疫苗株 (HCLV) 、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病疫苗株、猪O型口蹄疫疫苗株、猪圆环病毒和猪细小病毒核酸, 进行猪瘟RT-LAMP检测, 进行特异性试验。

2结果

2.1 RT--LAMP方法的反应条件

通过优化试验确定CSFV RT-LAMP方法的最佳反应体系为:10μM外引物对F3/B3各0.5μL, 20μM内引物对FIP/BIP各1μL, LAMP-Mix 10μL, AMV 1μL, Bst DNA聚合酶1.5μL, RNA模板2μL, ddH2O2.5μL, 总体积为20μL。最佳反应条件为:63℃, 1 h;80℃, 10 min。

2.2 RT-LAMP扩增产物的检测结果

反应结束后, 反应管经8 000 rpm离心3 min, 肉眼即可观察到猪瘟阳性样品管底有白色沉淀产生, 如在反应管中加入1μL smart Green I荧光染料, 紫外灯下可看到明显绿色荧光 (见图1A) , 经1.2%琼脂糖凝胶电泳可看到特异性条带 (见图1 B) 。

2.3 RT-LAMP方法的敏感性及与荧光RT-PCR方法的比较结果

猪瘟病毒RNA模板从10-1～10-5分别进行RT-LAMP和荧光RT-PCR检测, 结果可见, RT-LAMP检测方法在10-3时仍能检出, 而荧光RT-PCR在10-2时在Ct值为38时荧光曲线才向上 (见图2) , 表明我们所建立的猪瘟病毒RT-LAMP方法的敏感性至少比猪瘟病毒荧光RT-PCR方法高一个数量级, 因而具备高敏感性的优点。

2.4 RT--LAMP的特异性试验结果

本试验所建立的猪瘟通用型RT-LAMP检测方法能够特异性地检测出猪瘟病毒, 同时对猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪口蹄疫病毒疫苗株、猪细小病毒和猪圆环病毒等病毒核酸无扩增 (见图3) , 表明该方法具有高特异性的特点。

3讨论

RT-LAMP技术是一种基于LAMP方法基础上加入反转录酶而建立的一步法检测RNA病毒的技术。该技术主要原理是设计一组针对靶基因片段的6个特异性位点的4条引物 (2条内引物和2条外引物) , 在一种具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶的作用下, 先利用2条内引物和2条外引物, 通过链置换作用形成茎环状DNA结构, 然后在内引物的作用下通过环介导的自动循环链置换反应大量扩增靶序列[4]。由于该技术不需要PCR仪或荧光PCR仪等特殊仪器, 只需要在恒温水浴锅中进行, 无PCR仪等升降温过程, 因而扩增速度较快, 整个扩增过程只需1 h, 较RT-PCR和荧光RT-PCR方法更省时间;通过与荧光RT-PCR方法的比较显示, RT-LAMP方法的敏感性较荧光RT-PCR方法至少高10倍, 因而在临床样品检测过程中更易降低漏检的机率;RT-LAMP技术设计的4条引物是针对靶基因序列的6个特异性位点, 只有引物与靶基因序列结合区域完全匹配的情况下, 扩增反应才能顺利进行, 因而该技术具备极高的特异性, 从本试验的结果来看也印证了这点。另外, 该方法结果判定简单直观, 所有这些优点使得该技术自2000年发明以来, 就得到广泛关注和深入研究, 并在人的疾病诊断[5,6] (如结核、SARS等) 及畜禽传染病 (口蹄疫、新城疫、传染性法氏囊、禽流感等) 病原学诊断上得到广泛应用[7,8]。

但该方法在应用上必须注意的最重要一点就是避免污染, 否则会造成检测过程中假阳性的出现。Notomi等在2000年设计LAMP方法的初衷就是通过沉淀产生或颜色变化来直接观察检测结果, 因而, 在基层和野外现场检测时, 建议在扩增反应进行前在反应管中加入荧光染料, 反应结束后直接观察颜色变化或在紫外灯下观察荧光即可, 如在实验室进行RT-LAMP反应, 则尽量减少反应管的开盖, 如需开盖, 则应在生物安全柜中进行, 避免造成实验室环境的污染。

参考文献

[1] Zhao JJ, Cheng D, Li N, et al.Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative and differential de tection of wild-type viruses and C-strain vaccine of Classical swine fever virus [J].Vet.Microbiol, 2008, 126 : 1-10.

[2]仇华吉.猪瘟防制中存在的问题及对策[J].中国兽医杂志, 2008, 44 ( 5 ) : 80-81.

[3]唐毕锋.环介导等温扩增技术的应用和发展[J].实用医学杂志, 2008, 24 ( 22 ) : 3972-3974.

[4] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al.Loop-medi ated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Ac ids Res, 2000, 28 ( 12 ) : E63-e63.

[5] Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K.Loop-Mediated Isothermal Amplification for Direct Detection of Mycobac terium Tuberculosis Complex, M.avium, and M.intra cellulare in Sputum Samples[J].J Clin Microbiol, 2003, 41 ( 6 ) : 2616-2622.

[6] Poon L, Leung C, Tashiro M, et al.Rapid Detection of the Severe Acute Respiratory Syndrome ( SARS ) Coro navirus bya Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay[J].Clinical Chemistry, 2004, 50 ( 6 ) : 1050-1052.

[7] Dukes J P, King D P, Alexandersen S.2006.Novel re verse transcription loopmediated isothermal amplifica tion for rapid detection of foot-and-mouth disease vi rus[J].Arch.Virol, 151 : 1093-1106.

RT-LAMP 篇3

目前针对IBV的检测方法主要有病原分离、RT-PCR、IBV Real-time PCR检测方法、基因芯片检测方法等, 以上方法虽然也可达到检测结果准备、敏感、特异高的特点, 但是操作过程复杂且需要较为昂贵的仪器, 不适合在基层推广使用。针对上述方法的缺陷, 本试验旨在建立一种快速、简便、经济实用的IBV检测方法。

RT-LAMP检测方法是近年来的一种新的快速检测技术, 该方法操作简单, 无需要昂贵的仪器设备, 本试验初步建立了IBV RT-LAMP检测方法, 为临床快速检测IBV的感染奠定基础。

1 材料和方法

1.1 毒株

传染性支气管炎疫苗毒株 (H120) 、鸡新城疫疫苗 (Lasota系) 、鸡传染性法氏囊疫苗毒株 (B87株) 、禽流感 (H5N1 re-4毒株) 均采购于相关疫苗公司;传染性喉气管炎病毒 (ILTV) 来源于哈尔滨兽医研究所相关实验室。

1.2 试剂

U-LAMP通用型DNA快速扩增试剂盒和Smart Green染料为北京美来博公司产品;TRIzol试剂为Invitrogen公司产品。

1.3 引物的设计

参照Gen Bank中IBV的基因保守序列, 同时参考文献设计LAMP引物, 其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP, 引物由上海生工公司合成, 引物序列, 见表1。

1.4 RT-LAMP反应体系的优化

分别对RT-LAMP反应体系中引物浓度、镁离子浓度、引物比例、酶含以及反应温度和反应时间等进行优化, 多次重复试验以确定最佳反应条件。同时向扩增产物中直接加入Smart Green染料1μL, 混匀后将反应管置于凝胶成像仪中观察荧光结果。

1.5 特异性试验

分别提取传染性支气管炎毒株 (IBV) 、鸡新城疫病毒 (ND) 、鸡传染性法氏囊病毒 (IBDV) 、禽流感病毒 (AIV) 、传染性喉气管炎病毒 (ILTV) 的基因, 以提取的上述RNA或DNA作为模板模板进行RT-LAMP反应。

1.6 敏感性试验

将鸡传染性支气管炎病毒分别稀释10-1~10-8八个梯度, 提取核酸之后, 分别用荧光RT-PCR方法和优化后的RT-LAMP诊断方法进行检测, 并比较两种方法的检测结果。

2 结果与分析

2.1 IBVRT-LAMP反应体系的确立

确定反应体系为:10μL 2×U-LAMP Mix, 2μL 25m M Mg Cl2, 2μL模板RNA, 2μL引物混合物 (1.6μM FIP, 1.6μM BIP, 0.2μM F3, 0.2μM B3) , 1.5μL Bst DNA聚合酶, 1μL AMV酶, 加水补至20μL。将反应体系混匀, 置于63℃水浴锅中作用1h, 80℃10min灭活Bst DNA聚合酶。该体系下的反应产物于2%琼脂糖凝胶上电泳可见LAMP反应的清晰的阶梯状条带, 且加入Smart Green染料后, 反应产物在紫外灯下显现荧光, 而阴性对照无荧光反应。

2.2 特异性试验

以本试验建立的RT-LAMP反应体系扩增IBV、IBDV、AIV、ILTV的基因, 结果均为阴性, 而对IBV的扩增结果表现为阳性 (见图1) 。

注:1~7泳道分别为DNA2000 Marker;IBV;IBDV;ND;ILTV;AIV;阴性对照

2.3 敏感性试验

本试验所建立的RT-LAMP方法对IBV的RNA最小检测限为10-6, 而普通RT-PCR方法对IBV的RNA的最小检测限为10-4 (见图2、3) , 表明RT-LAMP方法的敏感性是普通RT-PCR方法的100倍。

注:1~6泳道分别为DNA2000Marker;10-4;10-5;10-6;10-7;阴性

注:1~8泳道分别为DNA2000 Marker;原倍;10-1;10-2;10-3;10-4;10-5;阴性

2.4 结果可视化效果实验

将反应后的产物加入1μL Smart Green I, 混匀后, 在紫外光下观察结果。加入Smart Green I染料后, 阳性产物在紫外灯下显现绿色的荧光, 而阴性对照则无荧光反应。如图所示: (见图4)

注:1~5管分别为IBV;ND;IBD;AIV;阴性对照

3 讨论

基于LAMP诊断技术建立的诊断方法其反转录和核酸扩增过程均可以在恒温水浴锅中就可以完成, 不需要特殊的仪器设备, 检测结果应用荧光染料实现肉眼可视化, 并且反应具备灵敏特异、简单快速的优势, 因此该技术非常适用于基层兽医实验室的日常监测和突发疫病的快速诊断。