MMP-1

MMP-1（共4篇）

MMP-1 篇1

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,具有侵袭性生长的特点,与正常脑组织界限不清楚,给手术切除带来一定困难,预后差。胶质瘤的侵袭生长是一个多因素参与的复杂过程,目前认为在脑胶质瘤侵袭性生长过程中起关键作用的是一类基质金属蛋白酶(matrix-metallo-proteinase, MMPs)。MMPs是一组由结缔组织细胞分泌的,依赖Zn2+的蛋白酶家族,几乎能降解细胞外基质和基底膜(ECM),从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。本文旨在探讨MMP-1、MMP-2、MMP-9在不同级别的脑胶质瘤中的表达,进一步阐明胶质瘤侵袭性生长的机制,从分子生物学水平,为临床诊断和治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集包头医学院第一、三附属医院、包头市二医院病理科存档的2002-2010年间经病理学证实为胶质瘤的石蜡组织标本78例。所有病例临床资料齐全,其中男48例,女30例,年龄7~78岁,平均42.4岁。按照2000年WH0神经系统肿瘤分类标准,将胶质瘤按生物学行为分为4级:Ⅰ级21例,Ⅱ级22例,Ⅲ级20例,Ⅳ级15例。将Ⅰ、Ⅱ级归为低级别组,Ⅲ、Ⅳ级归为高级别组;对照组12例取自非肿瘤患者。

1.2 试剂与方法

采用免疫组化SP法。鼠抗人MMP-1、MMP-2、MMP-9和DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。肿瘤标本经常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后将标本置于pH 6.0枸橼酸缓冲液中进行抗原修复,PBS缓冲液冲洗3次,每次5 min;加过氧化酶阻断剂,室温孵育20 min,PBS缓冲液冲洗3次,每次5 min;加血清室温孵育20 min,甩干血清,滴加一抗,4 ℃冰箱孵育过夜,PBS缓冲液冲洗3次,每次5 min;滴加生物素标记二抗,孵育10 min,PBS缓冲液冲洗3次,每次5 min;最后滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液,室温孵育10 min,PBS缓冲液冲洗3次,每次5 min,DAB反应显色后自来水充分冲洗、苏木素复染。常规脱水、透明、干燥封片后镜下观察。

1.3 结果判定标准

所有结果均经过病理科两位病理诊断医师采用盲法进行确认。根据染色程度进行评分:基本不着色0分,淡黄色1分,棕黄色2分,深棕色3分。每张切片随机选取5个高倍视野(×400),计算出每个视野阳性染色肿瘤细胞的百分数,并取其平均值进行评分:阳性染色肿瘤细胞的百分数<10 %记为0分,10 %~24 %记为1分,25 %~49 %记为2分,50 %~74 %记为3分,75 %~100 %记为4分。阳性率评分与强度评分之积为该组织的免疫组化最终评分:0分为(-),1~4分为(+),5~8分为(++),9~12分为(+++)。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件分析数据。组间比较采用χ2检验,相关性检验采用Spearman相关分析,以P<0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

MMP-1、MMP-2、MMP-9主要定位于细胞浆,核偶有着色,在正常的脑组织中几乎不表达,在胶质瘤中的表达阳性率分别为66 %、64 %、75 %,随着肿瘤的恶性程度升高,其表达水平和强度增加,见表1;按照临床分级,把胶质瘤标本分为低级别组和高级别组,分别对这3个蛋白的表达进行χ2检验,差异均具有统计学意义,见表2。

3 讨论

胶质瘤侵袭性生长涉及多个过程,其中细胞外基质的降解是肿瘤细胞侵袭的前提。MMPs与细胞外基质降解密切相关,其属于一大家族酶类系统,分为间质胶原酶、胶原酶、基质溶解素和膜型金属蛋白酶4类。MMP-1又称间质胶原酶,可降解Ⅰ型胶原和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型纤维胶原,国内外报道MMP-1在胶质瘤和其它肿瘤的侵袭和转移中起了一定作用[1,2]。我们的研究发现MMP-1在胶质瘤中高表达,且其表达强度随着肿瘤级别升高而增强,也证明了MMP-1在胶质瘤的侵袭过程中扮演一定的角色。MMP-2又称明胶酶A,以ECM中的Ⅳ、Ⅴ型胶原及纤维粘连蛋白为主要底物。MMP-9又称明胶酶B,可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原明胶和弹性蛋白等。国内外关于MMP-2和MMP-9与胶质瘤的关系的研究较多,研究表明MMP-2和MMP-9在胶质瘤的生长、侵袭中起重要作用[3,4,5,6]。我们的研究也证实了这一点:MMP-2和MMP-9在正常对照组中不表达,在胶质瘤中的表达明显增强,且在高级别和低级别组中的表达差异具有统计学意义;尤其是MMP-9表现得更为显著,提示其在胶质瘤的侵袭性生长过程中起更重要的作用。采用Spearman进行相关性分析,发现MMP-1、MMP-2和MMP-9与胶质瘤的恶性程度呈明显的正相关。

总之,本研究结果表明:MMPs与胶质瘤的侵袭性生长密切相关,其表达水平能反映出胶质瘤的侵袭能力,它们的联合检测可以判断肿瘤的恶性程度和侵袭能力。

摘要：目的:探讨MMP-1、MMP-2、MMP-9在胶质瘤中的表达及其意义。方法:采用免疫组织化学法对78例石蜡包埋的胶质瘤组织和12例正常脑组织进行标记和分析。结果:MMP-1、MMP-2、MMP-9在正常脑组织中几乎不表达;而在胶质瘤中的阳性率分别为66%、64%、75%,联合检测率为62%,采用Spearm an进行相关性分析,它们与胶质瘤的恶性程度均呈正相关(rs=0.2671～0.5631,P<0.05)。结论:联合检测这3个指标对判断胶质瘤的恶性程度和侵袭能力具有重要的意义。

关键词：MMP-1,MMP-2,MMP-9,胶质瘤

参考文献

[1]Gupta GP,Nguyen DX,Chiang AC,et al.Mediators of vascu-lar remodelling co-opted for sequential steps in lung metas-tasis[J].Nature,2007,446(7137):765-770.

[2]李树合,周定标,余新光,等.胶质母细胞瘤中MMPs和TIMPs的表达及其与瘤周水肿的相关性分析[J].军医进修学院学报,2006,27(3):214-215.

[3]Sternlicht MD,Werb Z.How matrix metalloproteinases regu-late cell behavior[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2001,17(2):463-516.

[4]Rao JS.Molecular mechanisms of gliomas invasivess:therole of Proteases[J].Nat Rev Cancer,2003,3(2):489-501.

[5]Reimers N,Zafrakas K,Assmaann V,et al.Expression of ex-tracellular matrix metalloproteases Inducer on micrometastat-ic and primary mammary carcinoma cells[J].Clin CancerRes,2004,10(10):3422-3428.

[6]Hasebe T,Kajita M,Fujimoto K,et al.Expression profiles ofthe duplicated matrix metalloproteinase-9 genes suggesttheir different roles in apoptosis of larval intestinal epithelialcells during Xenopus laevis metamorphosis[J].Dev Dyn,2007,236(8):2338-2345.

MMP-1 篇2

1 材料与方法

1.1 软骨细胞培养及实验分组

武汉大学动物中心提供SD乳鼠20只,体重40~70g雌雄不限。SD乳鼠处死后,取其膝关节软骨行原代培养将软骨片切成1mm3大小的碎粒并加入新鲜的0.25%的胰蛋白酶,37℃培养箱中消30~45min,以除去可能附着的成纤维细胞。加入0.2%的II型胶原酶,37℃培养箱中消化。离心弃上清液,PBS重悬3次,相同条件再离心,弃上清液去除胶原酶,收集细胞,台盼兰鉴定细胞活力,将消化的细胞接种于含20%胎牛血清和100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的DMEM/F12的6孔板中,密度为106 cells/ml。待细胞80%融合后,培养基中加入不同处理因素进行干预,实验分为4组:A组(对照组)不加任何处理因素;B组:10ng/ml VEGF;C组:10ng/ml IL-1β;D组:10ng/ml VEGF+10ng/ml IL-1β,每组设6个复孔,连续培养48h进行检测。

1.2 定量PCR研究

1.2.1 引物设计及合成(上海生工生物工程公司提供)

β-actin:上游引物5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3

下游引物5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'扩增长度:110bp。

mmp1:上游引物5'-CTTGCTCATGCTTTTCAGCC-3'

下游引物5'-AGAAAGGCCAAGGGAATGG-3'扩增长度:114bp。

mmp3:上游引物5'-GTACCCAGTCTACAAGTCCTCCAC-3',

下游引物5'-GTACCCAGTCTACAAGTCCTCCAC-3'扩增长度:162bp。

1.2.2 Real Time PCR反应用Trizol试剂提取软骨细胞总RNA测定RNA的浓度、纯度。

纯度为260/280的比值,比值范围在1.8~2.1之间。再将RNA逆转录成c DNA,c DNA在-20℃保存或立即进行PCR扩增。在无菌的0.2ml PCR管中分别加入8μl dd H2O、12.5μl SYBR Green mix、2.0μl d NTP、2.5μl c DNA、2.0μl上下游引物,总反应体系27μl。循环参数:95℃预先变性1min,再95℃15s,退火温度58℃15s,72℃延伸45s,荧光检测后,72℃延伸5min,再行荧光检测,共循环40次。计算机分析:用5倍稀释的c DNA做模板建立稳定的可信的标准曲线,β-actin作为内参来估计初始拷贝数,绘制熔解曲线重复3次并分析Ct值,且相对表达量由2-△△Ct法计算。

1.3 统计学分析

数据以(+s)表示,用SPSS13.0软件进行统计学分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA),检验水准α=0.05以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组软骨细胞中mm P-1的m RNA表达水平:A组为(1.00±0.13),B组为(1.56±0.38),C组为(1.80±0.14),D组为(4.35±0.41)。A组mm P-1的m RNA表达水平明显低于B、C、D组,B、C组明显低于D组(B组与D组比较P<0.001,C组与D组比较P<0.001),B组与C组比较(P>0.05)无统计学差异。mm P-1及β-actin的Real-Time PCR熔解曲线见图1。

各组软骨细胞中mm P-3的m RNA表达水平:与A组(1.00±0.12)比较,B(2.86±0.26)、C(8.33±0.31)、D(10.79±0.35)组mm P-3的m RNA表达水平显著增高,B、C组明显低于D组(B组与D组比较P<0.001,C组与D组比较P<0.001),B组与C组比较其表达水平明显降低(P<0.001)。mm P-3及β-actin的Real-Time PCR熔解曲线见图2。

3 讨论

mm Ps参与细胞外基质的降解,在OA关节软骨基质及软骨细胞破坏的病理过程中起重要作用。正常关节mm Ps与TIMPs保持一定的平衡。在OA中软骨的TIMPs与mm Ps之间的不平衡与TIMP的不足有关[3]。这种mm Ps与TIMPs的失衡造成了关节软骨细胞外基质过度降解,从而导致软骨退行性病变。IL-1β诱导的软骨细胞是研究OA的理想体外模型。我们用IL-1β诱导鼠骨关节软骨细胞以模拟OA软骨细胞病理学改变,结果显示IL-1β能够明显mm P-1、-3的表达。

关节软骨细胞外基质中最重要的两种成份是蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。其中以Ⅱ型胶原为主,可达软骨胶原总量的90%[4]。mm P-1属于间质胶原酶,可使Ⅱ型胶原变性裂解,mm P-3则属于基质溶解素,对软骨的Ⅱ型胶原N、C末端肽和蛋白聚糖分别有胶原肽酶、裂解作用。mm P-1和mm P-3在OA软骨中表达明显增加,而TIMP增加甚少呈现mm Ps/TIMPs失平衡,从而导致软骨降解增加,最终导致关节软骨进行性破坏,提示mm P-1及mm P-3在OA软骨退变及进行性破坏的过程中起重要作用。

VEGF由血小板、软骨细胞等通过自分泌或旁分泌产生[5]。研究发现VEGF与OA软骨退变密切相关,膝OA患者关节软骨的表面覆盖一层富含血管的肉芽组织,其关节软骨表达VEGF的细胞数量明显多于健康对照组[6],这些发现显示,VEGF参与了OA的病理改变过程。在OA动物模型中发现VEGF在成熟和肥大的软骨细胞层表达增加,并且与OA严重程度成正比[7]。Mapp等[8]用mm Ps的抑制剂治疗大鼠膝关节OA模型,发现大鼠膝关节骨软骨内血管生成减少、关节疼痛缓解,这些皆表明mm Ps在OA软骨血管生成中发挥重要作用,而骨软骨内血管生成可能是导致引起OA疼痛的重要原因。最近有人提出:抑制异常血管生成将为治疗OA提供有效的治疗策略[9]。最近有研究认为,在OA中血管内皮生长因子可能再刺激软骨细胞增加基质金属蛋白酶及其他蛋白水解酶,破坏关节软骨[10]。在骨性关节炎中血管内皮生长因子可能参与形成骨赘和诱导基质降解代谢因素[11]。关节过度负荷也可导致软骨VEGF表达上调及mm Ps增多和TIMP降低[12],而Ebrahem等[13]对体内缺乏TIMP-3的小鼠研究发现新生的血管明显增加。且在对RA和OA患者病例研究中发现与其相关的总mm Ps升高并且相对应的升高VEGF的水平[14]。以上皆提示在OA中升高的VEGF以及造成mm Ps和TIMP之间的失衡是导致OA的发生发展的重要因素。我们的研究结果显示VEGF可显著增加软骨细胞mm P-1、mm P-3的表达,从而导致mm Ps/TIMPs的失衡,引起关节软骨细胞外基质过度降解,导致关节软骨进行性破坏,这些提示VEGF在OA软骨退变中起着重要作用。

MMP-1 篇3

1 资料与方法

1.1 临床资料

随机选取2010年9月至2012年6月期间我院心血管内科住院的CHD患者117例,均经冠状动脉造影检查确诊,进一步将冠心病组分为ACS组72例,男50例,女22例,年龄(59.2±10.6)岁,其中包括UAP患者48例,AMI患者24例;SAP组45例,男26例,女19例,年龄(60.3±9.7)岁。对照组53例,其中男31例,女22例,年龄(58.6±10.2)岁,为冠状动脉造影正常者。全部研究对象均为无血缘关系的河南汉族人群。排除肿瘤、感染性疾病、近期有脑血管疾病、近期有重大外伤、手术及严重肝肾功能不全者。

1.2 方法

(1)冠状动脉造影:采用Judkins法经桡动脉或股动脉行冠状动脉造影,经两名以上有经验的医师判定及审核造影结果,左前降支(LAD)、回旋支(LCX)、右冠状动脉(RCA)中至少一支狭窄≥50%判定为阳性。(2)标本收集:AMI组于发病24h内抽取静脉血,对照组和心绞痛组于人院次日清晨抽取静脉血4m L,乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)抗凝,摇匀,3000r/min离心10min,分离血清,放入-80℃冰箱内待用。标本收集齐全后统一测定。(3)血清MMP-1水平测定:采用酶联免疫吸附法(EL1SA)检测血浆MMP-1水平,试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。(4)血清LP(a)水平测定:采用免疫透射比浊法测定血浆LP(a)水平,LP(a)试剂盒由上海博尚生物技术有限公司提供,采用免疫透射比浊法在美国雅培AEROSET全自动生化分析仪上测定。

1.3 统计学方法

应用SPSS11.0统计软件,计量资料用表示,多组均数比较运用单因素方差分析,组间均数比较运用独立样本t检验,相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1

ACS组MMP-1血浆水平明显高于SAP组及对照组(P<0.05),后两者之间MMP-1血浆水平差异无统计学意义(P>0.05);ACS组LP(a)血浆水平明显高于SAP组及对照组(P<0.05),后两者之间LP(a)血浆水平也有明显差异(P<0.05);MMP-1、LP(a)血浆水平在AMI组与UAP组之间差异均无统计学意义(P>0.05)(表1、表2)。

注:与SAP组及对照组比较,aP<0.0 5;与对照组比较,bP<0.05。

注:与UAP组比较,t=1.051,aP>0.05

2.2 MMP-1与LP

(a)在各组中的相关性分析:MMP-1与LP(a)血浆水平在ACS组具有明显相关性(r=0.412,P<0.01);而在SAP组和对照组无明显相关性(P>0.05)。见表3。

3 讨论

MMPs在体内主要降解细胞外基质(ECM),参与结缔组织的降解和重建、炎症反应和缺血、缺氧损伤,目前医学上已发现的MMPs有20多种。MMP-1是MMPs家族中重要的一种间质胶原酶,能够降解ECM中的胶原蛋白,使斑块纤维帽变薄易于破裂,导致急性血栓事件的发生。Ryuichi k等[1]研究发现,冠心病组和对照组之间血浆MMP-1水平无明显差别,但复合冠脉病变组血浆MMP-1水平明显高于非复合冠脉病变组,提示血浆MMP-1水平升高与斑块的不稳定性有关。Tanindi A等通过检测冠心病患者外周血中的MMP-1水平发现,CAD患者外周血MMP-1水平较对照组升高,差异具有统计学意义,ACS组MMP-1水平升高更为明显,提示MMP-1与冠状动脉粥样硬化及斑块不稳定性有关[2]。

另有多项研究结果表明,LP(a)与CHD有关。Framingham心脏研究发现,Lp(a)升高是冠心病、心肌梗死和脑卒中的独立危险因素[3]。Dangas G等通过对冠心病患者粥样硬化斑块标本进行研究发现,LP(a)与粥样硬化斑块内巨噬细胞的共染率可达到90%以上,UAP组LP(a)的染色面积大于SAP组,差异具有统计学意义,LP(a)与巨噬细胞二者的染色区域具有显著相关性(r=0.88,P<0.001),提示Lp(a)与斑块不稳定性相关[4]。孙凯等发现LP(a)可促进巨噬细胞表达多种MMPs,包括MMP-1、2、9等,同时抑制TIMPs的表达[5]。Ashfaq F等通过对印度北部的人群进行研究发现Lp(a)血浆水平和冠心病患者冠脉病变积分呈正相关,高水平的Lp(a)是CAD的一个独立危险因素,降低Lp(a)血浆水平可以延缓CAD的发展。另有研究发现Lp(a)存在于不稳定斑块的巨噬细胞中,并且Lp(a)沉积部位的MMPs的活性明显增强,提示Lp(a)可能调节MMPs的表达和(或)活性[7]。

本研究结果发现,血浆MMP-l及脂蛋白(a)水平在ACS组高于SAP组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),MMP-1血浆水平与LP(a)血浆浓度在ACS组呈显著正相关,(r=0.412,P<0.01),表明MMP-1及LP(a)水平升高与动脉粥样硬化及斑块不稳定性相关,与既往大多数研究结果相一致,LP(a)可能通过调节MMP-1的表达和活性参与ACS的发生,二者可作为冠状动脉斑块不稳定性的独立预测因素,在临床上具有良好的应用前景。

参考文献

[1]Kato R,Momiyama Y,Ohmori R,et al.Levels of Matrix metalloproteinase-1in Patients With and Without Coronary Artery Disease and Relation to Complex and Noncomplex Coronary Plaques[J].Am J Cardiol,2005,95(1):90-92.

[2]Tanindi A,Sahinarslan A,Elbeg S,et a1.Relationship Between MM P-1,MM P-9,TIM P-1,I L-6 and Risk Factors,Clinical Presentation,Extent and Severity of Atherosclerotic Coronary Artery Disease[J].Open Cardiovasc Med J,2011,5(1):110-116.

[3]Bostom AG,Gag non DR,Cupples LA,et al.A prospective investigation of elevated Lipoprotein(a)detected by electrophoresis and cardiovascular disease in women:the Framingham Heart Study[J].Circulation,1994,90(4):1688-1695.

[4]Dangas G,Meh ran R,Har pel PC,et a1.Lipoprotein(a)and inflammation in human coronary atheroma:association with the severity of clinical presentation[J].J Am Coll Cardiol,1998,32(7):2035-2042.

[5]孙凯,周宪梁,李昭晖,等.Lp(a)对THP-1源性巨噬细胞基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂表达和活性的影响[J].中国比较医学杂志,2006,16(12):710-715.

[6]Ashfaq F,Goel PK,Moorthy N,et a1.Lipoprotein(a) and SYNTAX Score Association with Severity of Coronary Artery Atherosclerosis in North India[J].Sultan Qaboos Univ Med J,2012,12(4):465-472.

MMP-1 篇4

1 材料和方法

1.1 材料

12~24 月龄成年雄性杂种犬(第四军医大学动物实验中心); DMEM培养基、 胎牛血清、 Ⅰ型胶原酶、 胰蛋酶、 青霉素-链霉素(Hyclone,USA); Trizol、 RT试剂盒DRR047S(Takara,JP); 兔抗人MMP- 1抗体(Abcame,USA),鼠抗兔荧光抗体(Sigma,USA),Carl Zeiss荧光显微镜(GE)。

1.2 方法

1.2.1 牙根吸收动物模型的制作

按照张子川[8]报道的方法建立牙根吸收动物模型:以上颌一侧的3 个切牙为实验牙,采取同颌对侧同名牙作为对照。实验组牙齿的处理:以种植钉为支抗,通过橡皮圈对牙齿施加持续性压低重力[9],制作牙根吸收动物模型(图 1)。对照组牙齿不做加力处理。

A: 植入种植钉; B: 未加力前牙根尖X线片(箭头所示实验牙齿根尖形态完整、较尖锐); C: 持续性压低重力1 月后; D: 实验牙牙根尖X线片(箭头所示实验牙齿根尖变圆钝,提示出现牙根吸收)

1.2.2 犬牙根吸收牙周组织中IL-

1β表达情况检测 持续加力一月后,实验牙齿明显压低(图 1C),X线片上可观察到实验牙根尖变圆钝的影像(图 1D)。全麻下,拔除上颌3个实验牙及3 个同颌对照牙,刮取根尖1/3牙周膜,提取RNA,采用RT- PCR检验实验组与对照组的牙周组织中IL- 1β的表达。狗的IL- 1β、GAPDH引物由Takara公司合成(表 1)。

1.2.3 IL- 1β对人牙周膜细胞(hPDLCs)MMP-

1、TIMP- 1表达的影响研究 收集因正畸需要而拔除的健康前磨牙,刮取根中1/3牙周膜,酶消化法分离hPDLCs。待细胞传至Ⅳ代,用于实验研究。通过以下3 个步骤逐步研究IL- 1β对人牙周膜细胞MMP- 1、 TIMP- 1表达的影响:

(1)不同浓度梯度IL- 1β对hPDLCs的MMP- 1、TIMP- 1表达影响:分别加入含有IL- 1β浓度为0、 0.01、 0.1、 1、 10 ng/ml 并含有1% FBS的培养基作用24 h后,通过RT- PCR的方法检测hPDLCs的MMP- 1、TIMP- 1的变化。紫外分光光度计测定RNA,A260/A280值均在1.8~2.0之间,A260在0.1~1.0之间。后续反转录及PCR过程均按照试剂盒说明进行(PCR引物序列由上海生工技术有限公司合成,表 2)。PCR产物经1%凝胶电泳之后,拍照观察。采用上海培清凝胶分析系统分析各条带的吸光度值。MMP- 1,TIMP- 1的mRNA相对含量=MMP- 1,TIMP- 1条带吸光度值/对应的GAPDH条带的吸光度值。

(2)不同时间IL- 1β对hPDLCs的MMP- 1、TIMP- 1表达影响:依据上述(1)中结果,选出对hPDLCs的MMP- 1、TIMP- 1表达影响最显著的IL- 1β浓度,分别刺激hPDLCs 6、 12、 24 h,通过RT- PCR方法,分析不同时间hPDLCs中MMP- 1、 TIMP- 1表达的变化。

(3)免疫荧光检测hPDLCs中MMP- 1、TIMP- 1蛋白的表达: 依据上述(1)与(2)中的结果找出对hPDLCs的MMP- 1、TIMP- 1表达影响最显著的IL- 1β作用浓度和时间,进行免疫荧光检测。

2 结 果

2.1 犬牙根周组织中IL- 1β表达

图 2为动物模型根周组织中IL- 1β检测的电泳结果。实验组在250 bp的位置有较清晰条带,对照组中未观察到明显的电泳条带。

2.2 IL- 1β对hPDLCs中MMP- 1、TIMP- 1表达的影响

图 3所示为不同浓度的IL- 1β刺激hPDLCs细胞,其MMP- 1、TIMP- 1 mRNA的表达变化的检测结果。统计学分析显示:与对照组相比,0.01 ng/ml与0.1 ng/ml组对MMP- 1表达的影响无统计学意义(方差分析,P=0.165, P=0.205); 1 ng/ml和10 ng/ml组均促进MMP- 1的表达(P<0.05),但2 组间MMP- 1的表达差异无显著性。0.01、 0.1、 1、 10 ng/ml浓度组与对照组相比,TIMP- 1的表达均有下降(P<0.05),且10 ng/ml浓度组的TIMP- 1的表达下降程度高于其它浓度组(P<0.05)。结果提示,IL- 1β对hPDLCs细胞MMP- 1表达有促进作用,对TIMP- 1的表达则有抑制作用,其中10 ng/ml浓度组对MMP- 1表达的促进和对TIMP- 1表达的抑制作用最强。

以上面的实验结果作为IL- 1β浓度选择依据, 再

进行IL- 1β作用效应的时间梯度研究:10 ng/ml IL- 1β刺激hPDLCs细胞,检测其MMP- 1与 TIMP- 1表达的变化,采集时间点为6、 12、 24 h,结果如图 4。统计学分析表明:与对照组比较,10 ng/ml IL- 1β刺激后,自12 h开始MMP- 1的表达出现上调情况(P<0.05),且24 h组较12 h组MMP- 1表达上调程度更高(P<0.05)。10 ng/ml IL- 1β刺激6 h后hPDLCs细胞TIMP- 1的表达就开始出现抑制情况(P<0.05),随时间的延长,这种抑制作用逐渐增强,24 h抑制作用最强(P<0.05)。

2.3 IL- 1β对hPDLCs中MMP- 1和TIMP- 1蛋白表达的影响

浓度为10 ng/ml的 IL- 1β作用24 h后,hPDLCs的 MMP- 1蛋白表达量高于对照组(图 5A、B),TIMP- 1蛋白表达量低于对照组(图 5C、D)。说明IL- 1β具有促进hPDLCs MMP- 1表达、抑制TIMP- 1表达的作用,这与2.2中所显示的结果是一致的。

A、 C: 对照组; B、 D: 实验组

3 讨 论

在正畸治疗中一旦发生牙根吸收,往往会严重影响治疗效果,有时甚至会阻碍正畸治疗的进行,因此这是一个被正畸医生广泛重视的问题。到目前为止,其发生的机制尚不十分明确。有研究表明牙根吸收过程中有炎症因子的参与[5,6,7],引起局部的无菌性炎症,导致牙根组织发生吸收。本研究用持续性过大矫治力压低牙齿,制作出动物模型,然后提取根周组织的RNA,进行RT- PCR实验,结果表明牙根吸收根周组织IL- 1β表达浓度高于正常根周组织。结果提示IL- 1β作为炎症因子参与了牙根吸收的发生过程。为了探讨IL- 1β在牙根吸收过程中的作用机制,我们又通过体外细胞学实验,观察了这个炎性因子对人牙周膜细胞MMP- 1、TIMP- 1表达的影响。牙根吸收是一个组织降解、吸收的过程,而基质金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制因子系统在牙周组织细胞外基质(extracellularmatrix, ECM) 的降解与合成中发挥重要的作用[3,4]。MMP- 1属于胶原酶之一,在骨吸收过程中,MMP- 1可去除骨表面未矿化层,将刺激吸收的矿化牙骨质暴露于破骨细胞[10]。Domon等[11]认为牙根吸收过程与这一过程可能类似。TIMPs是一种内源性的MMPs组织特异性抑制剂,两者共同调解组织的改建[12,13,14]。迄今发现的TIMP家族有4 种即TIMP- 1、 TIMP- 2、 TIMP- 3、 TIMP- 4,它们可下凋MMPs的活性,对于维持ECM 的稳态有重要作用[15]。我们运用RT- PCR、免疫荧光技术研究IL- 1β对人牙周膜细胞(hPDLCs)MMP- 1、TIMP- 1表达的影响。首先,我们通过RT- PCR的方法,研究了不同的浓度、时间IL- 1β对hPDLCs细胞MMP- 1、TIMP- 1表达的影响,结果显示IL- 1β对hPDLCs细胞MMP- 1表达的促进作用和对TIMP- 1表达的抑制作用,这种作用随着浓度的增高及作用时间延长有增高的趋势。然后,我们以浓度梯度、时间梯度的研究结果为依据,以适当浓度和时间将IL- 1β作用于hPDLCs细胞,通过免疫荧光方法检测,进一步证实了IL- 1β对hPDLCs细胞MMP- 1、TIMP表达的影响。