Bax/Bcl-2（精选4篇）
Bax/Bcl-2 篇1
近年来, 有关舌苔变化机理的研究已从亚细胞水平发展到基因水平, 从细胞凋亡的角度对舌苔的变化机理研究结果表明, 舌苔上皮细胞在增殖、分化的同时, 有一部分细胞发生了凋亡。中医学认为, 舌苔异常 (厚腻苔或花剥苔) 是厌食症患儿食欲低下、不愿进食的病理特征之一。本课题组在阐明了厌食症患儿舌苔变化与外周血微量元素含量关系[1]的基础上, 从细胞凋亡相关基因的角度揭示了厌食症患儿舌苔变化与细胞凋亡的相关性及中药儿宝方的干预作用。现将结果报道如下。
1临床资料
1.1 一般资料
厌食症患儿60例全部为2008-02～2008-10来自深圳市儿童医院门诊, 年龄为1～14岁, 其中厚腻苔组30例, 花剥苔组30例。男31例, 女29例;平均3.96岁, 病程1月～8年。
1.2 中医诊断标准
参照《中药新药临床研究指导原则·第3辑·中药新药治疗小儿厌食症的临床研究指导原则》。
1.3 主要试剂
鼠抗人Bcl-2、Bax单克隆抗体、兔抗人Fas-L多克隆抗体、免疫组化Ultra Sensitive TMS-P超敏试剂盒、DEPC (二乙基焦碳酸酯) 、多聚-L-赖氨酸、多聚甲醛、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司;其余试剂均为国产分析纯。
2方法
2.1 治疗用药
两组患儿均服用运脾中药儿宝方, 方剂组成:苍术10g、陈皮5g、炒山楂10g、鸡内金10g, 水煎服, 日1剂, 两组均以4周为1个疗程。
2.2 舌苔细胞的留取
用一次性硬毛牙刷用力刮取厌食症患儿舌背中部 (花剥苔者取无舌苔覆盖部位表层) 舌苔, 装于有预冷生理盐水 (含0.1%DEPC) 的10ml具塞离心管中, 洗涤、涂片后-70℃密闭保存备用。
2.3 Bax、Bcl-2及Fas蛋白表达的测定
免疫组化SP法。所有标本涂片以冷丙酮固定15分钟, ddH2O充分洗涤;过氧化物酶阻断剂作用10分钟, PBS洗涤3min×3次;非免疫动物血清作用10分钟;涂片分3组, 分别加入3种第一抗体, 孵育60分钟, PBS洗涤3min×3次;生物素标记二抗作用10分钟, PBS洗涤3min×3次;链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液作用10分钟, PBS洗涤3min×3次;新鲜DAB显色;苏木素复染, 水洗返蓝。阳性反应信号为棕黄色, 阴性对照用PBS代替第一抗体, 反应为无色。以上反应均在室温下进行。
2.4 图像半定量分析和统计处理
采用空军总医院生物医学工程研究所研制的CMIAS真彩色病理图像分析系统, 每张涂片在高倍镜 (40×10) 下随机选取10个视野, 免疫组化测定每张涂片的阳性细胞百分数和阳性单位 (PU) ;所有数据以均数±标准差undefined表示, 统计学处理采用SPSS 10.0软件。结果中阳性细胞百分数的比较先经过平方根反正弦变换undefined后进行t检验, PU值直接进行t检验。
3结果
见表1。
与正常组比较△P<0.05, △△P<0.01;与厚腻苔组比较*P<0.05, **P<0.01;与本组疗前比较#P<0.05, ##P<0.01
4讨论
Bcl-2蛋白家族是重要的细胞凋亡调节因子, 其中Bcl-2、Bcl-xL抑制细胞凋亡, Bax则促进细胞凋亡, 这些调节因子表达的改变影响细胞的凋亡。bcl-2基因高表达能阻断多种因素诱导的多种类型细胞发生凋亡[2,3]。Fas为促凋亡基因[4]。bax是一种与bcl-2拮抗的促进细胞凋亡的细胞凋亡调节基因, bcl-2与bax基因相互制约, 正常情况下保持一种平衡。目前国内外大多数学者把Bcl-2/Bax比值作为判定细胞凋亡是否被抑制或加强的主要标志之一[5]。近年有关舌苔的研究发现, 与正常薄苔比较, 剥苔bax基因过度表达伴随舌苔上皮细胞调亡增多, 而厚苔bax基因低表达伴随舌苔上皮细胞凋亡减少, bax基因表达水平变化趋势与舌苔上皮细胞凋亡水平变化趋势一致[6]。还有学者发现, 慢性胃炎患者舌象形成与细胞凋亡密切相关[7]。
本研究结果发现, 厌食症患儿花剥苔组较正常组Bcl-2蛋白表达明显减少, 而厚腻苔组较正常组bcl-2蛋白表达明显增加;厌食症患儿厚腻苔组较正常组bax和Fas蛋白表达明显减少, 而花剥苔组较正常组bax和Fas蛋白表达明显增加。经中药儿宝方治疗后厚腻苔和花剥苔均恢复为正常薄白苔, Bcl-2、Bax及Fas蛋白表达也恢复正常舌苔的表达水平。本研究结果表明, 厌食症患儿花剥苔的产生可能是由于舌苔上皮细胞bax和Fas过度凋亡, 而厚腻苔的产生可能是由于舌苔上皮细胞bcl-2凋亡不足。由此可见, 厌食症的发生可能与舌苔上皮细胞相关基因的异常凋亡呈相关性, 而中药儿宝方运脾治疗可以调节厌食症患儿舌苔细胞的凋亡平衡。
参考文献
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Bax/Bcl-2 篇2
关键词：β-细辛醚,海马,B细胞淋巴瘤/白血病-2,Bax
抑郁症 (depression) 是临床较为常见的精神疾病性障碍, 病因较为复杂, 病程较长, 发病率呈逐年上升趋势[1,2]。中药石菖蒲具有提神醒脑、开窍益智的作用, 是中医治疗脑病常用药物之一, 现代药理学研究提示, 石菖蒲具有较好的抗抑郁作用[3]。本实验通过研究石菖蒲主要有效成分β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马区的作用, 探讨其对海马神经元凋亡因子Bax (Bcl-2 associated X protein, Bax) 、B细胞淋巴瘤/白血病-2 (B cell lymphoma/leukemis-2, Bcl-2) 表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
2~3个月龄的清洁级雄性SD大鼠, 体重180~200 g, 由大连医科大学实验动物中心提供, 许可证号:SCXK (辽) 2008-0002。
1.1.2 药品
盐酸氟西汀胶囊 (由苏州俞氏药业有限公司提供) , β-细辛醚标准品 (由天津一方科技有限公司提供) 。
1.1.3 其他材料
试剂兔抗鼠Bax抗体 (购于Abcam公司) 、兔抗鼠Bcl-2抗体 (购于Abcam公司) 。免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂、PBS缓冲液 (购于福州迈新生物技术开发有限公司) 。
1.1.4 仪器
光学显微镜CX11R BSF (Olympus) , 图像分析系统DP801 (Alphamiager公司) 。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
大鼠适应性喂养1周, 自由进食水。保持环境干燥, 通风, 温度18~20℃, 无噪声, 无人为光源。进行敞箱实验 (Open-field-test) , 选取得分相近的80只大鼠进行分组, 按随机数字表法分为四组:正常组、β-细辛醚组、氟西汀组、模型组, 每组20只。
1.2.2具体方法
除正常组外每笼单只饲养, 正常组不给予任何刺激。β-细辛醚组、氟西汀组、模型组, 均接受慢性轻度不可预见性应激刺激 (Chronic unpredictable mild stress stimulation, CUMS) :每天进行一种不可预知的刺激, 持续21 d, 每种刺激使用不超过4次, 避免大鼠适应刺激, 刺激方法根据Katz法改进。具体方法:摇晃 (30 min) , 倾斜鼠笼 (45°, 24 h) , 禁食水 (24 h) , 束缚 (24 h) , 热刺激 (45℃, 5 min) , 冰水游泳 (4℃, 5 min) , 夹尾 (3 min) , 潮湿环境 (100 g垫料中加入200 m L水, 24 h) 。造模开始计为第1天。第2天起, β-细辛醚组给予10 g/L的β-细辛醚组混悬液, 按25 mg/ (kg·d) 灌胃给药。氟西汀组给予10 g/L的氟西汀混悬液, 按1.2 mg (/kg·d) 灌胃给药。模型组给予等量生理盐水, 每天灌胃一次。
1.2.3免疫组织化学法检测大鼠海马组织Bax、Bcl-2蛋白表达
石蜡切片脱蜡和水化后进行抗原修复。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶 (SP) 法进行免疫组织化学染色, 并DAB显色, 经过苏木素复染、PBS洗涤、盐酸乙醇分化后返蓝, 常规脱水、透明、中性树胶封片。每一张切片在阳性表达区域挑选10个无重叠视野, 使用Olympus显微镜、DP801形态分析软件进行图像采集处理, 图像分析系统进行分析, 测出Bax、Bcl-2蛋白抗原表达的总面积、阳性细胞数和平均吸光度IA, 计算其积分吸光度。
1.3 统计学处理
运用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理, 计量资料采用 (±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD检验, 以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠海马区Bax蛋白表达
模型组大鼠海马区Bax蛋白表达较正常组显著增强, 两组积分光密度比较差异有统计学意义 (P<0.05) , β-细辛醚组、氟西汀组与模型组比较积分光密度明显降低 (P<0.05) , 见图1、表1。
2.2 各组大鼠海马区Bcl-2蛋白表达
模型组的Bcl-2蛋白表达明显低于正常组, 积分光密度显著降低 (P<0.05) 。β-细辛醚组、氟西汀组积分光密度介于两者之间, 与模型组比较明显升高 (P<0.05) , 见图2、表1。
注:正常组 (图1a) ;模型组 (图1b) ;氟西汀组 (图1c) ;β-细辛醚组 (图1d)
3 讨论
抑郁症的发病率逐年增高, 并且呈现年轻化的趋势。通过孤养大鼠模拟抑郁症情境, 探讨抑郁症的发生与发展机制, 是目前一种可靠的研究手段。前期大量试验证实, CMUS结合孤养模式建立的大鼠抑郁模型, 可以稳定的模拟抑郁症行为学表现[4,5]。并且已经发现抑郁症的发生与大鼠海马神经细胞凋亡密切相关[6]。Bcl-2是凋亡蛋白家族中最重要的一种调控蛋白, 和Bax、Bad、Bak等共同构成了Bcl-2蛋白家族。有研究证实, Bax/Bcl-2的比值变化趋势更能描述细胞凋亡发生[7]。其比值升高, 说明细胞发生凋亡的可能性增加, 反之降低。
注:正常组 (图2a) ;模型组 (图2b) ;氟西汀组 (图2c) ;β-细辛醚组 (图2d)
*与正常组比较, P<0.05;△与模型组比较, P<0.05
该实验结果表明, 模型组经过21 d造模后, 产生明显抑郁症状, HE染色示海马组织发生明显改变, 与前期研究结果一致[8,9]。氟西汀组及β-细辛醚组经过药物灌胃后, 抑郁症状减轻, 并且抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加, 促凋亡蛋白Bax表达降低。
抑郁症的病理机理非常复杂, 目前所做的研究基本是基于某一特定通路展开的研究, 然而其发生与发展是多种通路共同协作产生的结果, 为了更好地结合现有的研究, 需要进一步完善各个通路之间的关系, 以期找到治疗抑郁症的靶向因子, 并使其尽早应用于临床治疗。
参考文献
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Bax/Bcl-2 篇3
1 材料与方法
1.1 动物模型的复制与取材
3个月鼠龄的成年雄性Wistar大鼠14只,体质量210～255 g,同批购于中国医学科学院放射线研究所。全部动物适应性喂养2周后随机分为对照组(N组)6只,糖尿病组(DM)组8只。N组仍给予普通饲料喂养,DM组给予高脂饲料喂养8周后,DM组给予用柠檬酸缓冲液稀释的链脲佐菌素30 mg/kg鼠尾静脉注射,N组给予相同剂量柠檬酸缓冲液鼠尾静脉注射。72 h后测空腹血糖,DM组空腹血糖均超过16.65 mmol/L,DM造模成功。成模后12周末,Wistar大鼠禁食但不禁水12 h后称质量并测血糖,股动脉放血处死大鼠,迅速摘取甲状腺组织,10%中性甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋,4μm连续切片,每隔10张取3张蜡带裱于防脱片剂处理过的载物片,待染。
1.2 免疫组织化学方法
1.2.1 主要试剂
兔抗大鼠Bax多克隆抗体(北京博奥森生物公司)工作浓度1∶100;兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体(武汉博士德生物公司)工作浓度1∶50;兔抗大鼠NF-κB P65多克隆抗体(北京博奥森生物公司)工作浓度1∶50;山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.2.2 免疫组织化学染色
免疫组织化学染色采用快速二步法,按说明书操作,光镜下观察Bax、Bcl-2NF-κB P65在两组甲状腺组织中的表达,细胞胞浆、胞核出现棕黄色或黄色者为阳性细胞,未出现棕黄色或黄色者为阴性细胞,于×400高倍镜视野下随机选取每个指标每张片子5个视场。采用Mias2001病理图像分析系统,定标为μm,图像捕获后测定两个指标的染色阳性面积与视场总面积的比值(阳性面积比)和平均光密度。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,双侧检验以P<0.05判定差异有统计学意义,两组间均数的比较采用t检验,检验水准为α=0.05。
2 结果
光学显微镜下观察两组甲状腺组织:Bax染色均为甲状腺滤泡上皮细胞胞浆染色(见图1);Bcl-2染色均为甲状腺滤泡上皮细胞核和胞浆染色(见图2);NF-κB染色N组甲状腺滤泡上皮细胞胞浆染色呈阴性或弱阳性,细胞核染色呈阴性,DM组甲状腺滤泡上皮细胞胞浆呈阴性或弱阳性,细胞核染色呈阴性或弱阳性(见图3)。图像分析显示,DM组甲状腺组织Bax染色阳性面积比(0.0143±0.0020)较N组(0.0112±0.0037)增高(P<0.05),两组Bax染色平均光密度比较差异无统计学意义;DM组Bcl-2染色阳性面积比(0.0081±0.0019)较N组(0.0104±0.0015)降低(P<0.05),平均光密度(99.11±10.34)较N组(114.79±14.60)减低(P<0.05);DM组Bcl-2/Bax的阳性面积比(0.58±0.16)较N组(0.99±0.31)降低(P<0.001),DM组的Bcl-2/Bax的平均光密度比(0.79±0.10)较N组(1.02±0.17)下降(P<0.001);DM组NF-κB染色阳性面积比(0.0093±0.0017)较N组(0.0072±0.0015)升高(P<0.05),DM组NF-κB染色平均光密度(126.41±16.65)较N组(103.54±18.39)升高(P<0.05)(见附表)。
3 讨论
Bc1-2基因是重要的抑凋亡基因,而其同源蛋白Bax具有促进凋亡的作用。研究表明Bc1-2、Bax表达水平的平衡结果是细胞是否发生凋亡的决定因素[5,6,7],正常甲状腺虽亦存在Bc1-2、Bax表达,却较少发生凋亡,分析与两者表达水平处于平衡有关。本研究结果表明DM组甲状腺组织Bax表达增多,而Bcl-2较N组下降;N组Bcl-2/Bax接近1,DM组Bcl-2/Bax小于1,因此笔者推测DM状态下甲状腺组织Bc1-2/Bax表达比例失衡进而导致甲状腺细胞凋亡增多。与BOJUNGA等人[8]对于糖尿病心肌病中凋亡因子表达的变化研究以及SUSZTAK等人[9]对于糖尿病大鼠肾皮质细胞中凋亡因子研究的结果一致。
NF-κB是由Rel蛋白家族任意两种蛋白所组成的同源或异源二聚体。细胞处于静息状态时,NF-κB与它抑制因子IκB结合在一起,以无活性的形式存在于细胞质中。炎症、肿瘤等可以激活IκB激酶,从而使IκB发生磷酸化后从NF-κB上解离下来,NF-κB被释放出来,在核定位信号的作用下进入细胞核内,启动靶基因的表达[10,10,11,12],进而参与机体的炎症反应、免疫反应、细胞分化与凋亡及其他应激反应。本研究发现DM组甲状腺滤泡上皮细胞NF-κB表达增多,且核染色为弱阳性,而N组细胞核染色为阴性,提示DM组甲状腺NF-κB表达增多,且部分向细胞核转移,呈激活状态,与陈瑛等人[13,13]对NF-κB在糖尿病大鼠肺组织中表达的研究,以及陈思娇[14,14]在糖尿病大鼠肾脏中表达的研究结果一致。NF-κB在糖尿病状态下激活的机制为:高糖状态下产生的晚期糖基化终产物(AGEs)与其特异性细胞受体———晚期糖基化终产物受体(RAGE)的相互作用促进了还原辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的激活,进而促进细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成。ROS作为高糖激活NF-κB的主要介质可以激活NF-κB。
NF-κB与细胞凋亡的关系密切,具有抑制细胞凋亡及促细胞凋亡的双向作用。本研究中DM大鼠甲状腺组织NF-κB异常激活、同时伴Bax上调,Bcl-2表达减少、细胞凋亡增多,其可能机制为:(1)NF-κB直接促进Bax上调,Bcl-2表达减少,(2)NF-κB通过介导促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α和白介素-1β等的合成,从而促进细胞凋亡,其具体机制尚待进一步研究。另外,NF-κB的激活还可能激活多种下游炎症因子通过加速DM甲状腺微血管病变的发生和发展、抑制甲状腺的功能等多种途径造成甲状腺功能的损伤。
Bax/Bcl-2 篇4
关键词：胰岛素样生长因子-1,MC3T3-E1成骨细胞,无血清,凋亡
近年来研究证明骨系细胞的异常凋亡与骨质疏松的发生发展存在着密切的联系。成骨细胞由骨髓基质细胞分化而来, 其主要功能是形成骨基质和调节破骨细胞的骨吸收, 在骨的生成、构塑和重建中起着重要作用。胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 以自分泌和旁分泌的形式作用于成骨细胞, 不依赖于其他因素, 独立地发挥作用。本研究旨在探讨IGF-1对成骨细胞凋亡率和凋亡调控蛋白Bax、Bcl-2表达的影响及量效关系以及其治疗骨质疏松症的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验材料及试剂 小鼠前成骨样细胞株MC3T3-E1 (浙江大学医学院病原生物学教研室) ;小鼠IGF-1 ( Peprotech Asia 公司) ;免疫组化染色试剂盒 (武汉博士德公司) ;胎牛血清 (杭州四季青生物公司) ;DMEM培养基 (自配:DMEM粉剂13.4 g, NaHCO3粉剂2.5 g, 青霉素粉剂0.1 g, 链霉素粉剂0.1 g, 去离子水1 000 mL) ;pH 7.4的D-HANK, S液 (自配:NaCl粉剂8 g, KCl粉剂0.4 g, KH2PO4粉剂0.06 g, NaHCO3粉剂0.35 g, Na2HPO4粉剂0.06 g, 去离子水1 000 mL) ;二甲基亚砜、碘化吡啶及MTT粉剂 (美国Sigma公司) ;流式细胞仪 (美国BD公司FACSCalibur型) 。
1.2 方法
1.2.1 细胞株传代培养 小鼠MC3T3-E1成骨样细胞置于37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO2培养箱中传代培养, 待细胞融合至70%~80%, 0.25%胰蛋白酶与0.4%EDTA 1∶1混合消化, 离心后计数备用。
1.2.2 MC3T3-E1细胞分组培养 正常血清对照组:细胞用含10%胎牛血清的DMEM液培养;无血清对照组:用不含胎牛血清的DMEM液培养;IGF-1组:用无血清的DMEM培养基在恒温CO2培养箱中培养, 倒置相差显微镜下观察, 待细胞融合至40%~50%, 加入相应的浓度干预24 h。
1.2.3 流式细胞技术检测细胞凋亡率 调整小鼠MC3T3-E1成骨样细胞悬液密度, 以4×103/L接种于6孔板上, 每孔1 500 μL培养基, 每组设3个复孔。待细胞融合至40%~50%, 加IGF-1干预, 24 h后消化离心制成单细胞悬液收集, 4 ℃预冷的70%乙醇固定。上流式机检测前离心去固定液, PBS液重新悬浮细胞, 调整细胞密度, 加入DNA染料, 碘化吡啶染色, 室温避光20 min。采用Cell Quest软件获取细胞信号, 并在Midfit软件下进行凋亡率分析。
1.2.4 免疫组化染色测定凋亡调控蛋白Bax/Bcl-2的表达 无血清对照组、IGF-1各浓度组做细胞玻片, Bax、Bcl-2两个检测指标做平行对照各3孔。将盖玻片上生长的小鼠MC3T3-E1成骨样细胞用4%的多聚甲醛室温固定1 h, -20 ℃保存备用。参照文献方法进行免疫组化对照, 用PBS代替一抗作阴性对照。阳性表达为细胞胞浆内出现棕褐色颗粒。通过与计算机相连的显微镜采集染色后细胞玻片的图像, 并存入微机, 采用BI-2000医学图像处理系统进行分析。统计图像中所有提取出的阳性信号, 计算平均灰度值。灰度值越小, 阳性染色越强, 表明免疫反应越强。用Bcl-2/Bax灰度值比表示Bax/Bcl-2蛋白表达强度的相对比。
1.3 统计学处理 计量资料以均数±标准差
2 结 果
2.1 形态学观察
倒置相差显微镜下, 刚接种的MC3T3-E1细胞呈圆球形, 悬浮状态, 4 h~5 h后贴壁生长。IGF-1干预24 h后, 正常血清对照组细胞状态良好, 呈短梭形贴壁生长, 融合80%~90%;无血清对照组贴壁细胞数目明显减少, 融合约50%, 形态有短梭形、多角形、不规则形、圆形, 培养液中出现悬浮细胞;IGF-1组细胞形态、生长情况随加药浓度增加渐接近于正常血清对照组, 融合稍慢约70%~80%。
2.2 IGF-1对MC3T3-E1细胞凋亡率的影响
流式细胞仪检测结果表明, 正常血清对照组也存在MC3T3-E1细胞自发性凋亡, 但均不大于5%。与正常血清组相比, 无血清对照组细胞凋亡率明显升高 (P<0.05) 。与无血清对照组相比, IGF-1组在 (1~50) ng/mL的浓度范围内, 细胞凋亡率明显下降 (P<0.05) , 且呈剂量依赖性降低 (P<0.05) 。详见表1。
2.3 IGF-1对MC3T3-E1细胞凋亡调控蛋白Bax、 Bcl-2表达的影响
免疫组化染色及图像分析结果表明, 与无血清对照组相比, IGF-1组Bax表达均减弱 (P<0.05) , 且随着IGF-1 (1 ng/mL~50 ng/mL) 浓度的增大Bax表达呈下降趋势 (P<0.05) ;而Bcl-2表达均增强 (P<0.05) ;与其他浓度组相比, 50 ng/mL组表达明显增强 (P<0.05) 。对Bax/Bcl-2的表达强度比与细胞凋亡率作Pearson相关性分析, 两者呈显著正相关 (r=0.917, P<0.01) 。详见表2。
3 讨 论
最近的研究表明成骨细胞凋亡的增加是低骨量或骨形成减少的原因之一。成骨细胞能重建骨质缺损, 控制其增殖和凋亡很重要[1]。IGF-1在骼中含量极其丰富, 对骨代谢有重要的调节作用。
本实验采用无血清培养基, 即培养液中不含有胎牛血清, 去除了细胞生长分化所必需的生长因子, 从而导致营养缺乏, 诱导其凋亡。实验结果证实MC3T3-E1细胞在此实验条件下确实存在凋亡增加。实验组在无血清培养基中加入不同浓度的IGF-1, 以评价IGF-1单一作用于MC3T3-E1细胞后的药理效应及描绘两者的量效关系。
很多调节成骨细胞增殖和分化的因素都是通过调节凋亡发挥作用[2]。成骨细胞凋亡受体内激素和生长因子等因素调节, Xian等[3]研究发现IGF-1能对多种因素引起的细胞凋亡有抑制作用, 保护成骨细胞免于有害物质的毒性作用, 使成骨细胞增加。本实验流式结果也显示, IGF-1干预呈剂量依赖性抑制MC3T3-E1细胞凋亡。在正常血清培养条件下, 也存在MC3T3-E1细胞的自发性凋亡, 但均不高于5%。无血清培养条件下, 高浓度IGF-1 (30 ng/mL~50 ng/mL) 组的细胞凋亡率低于正常血清组, 提示可能一定浓度的IGF-1即可完全抑制无血清诱导的凋亡增加, 高于此浓度水平的IGF-1发挥了促增殖作用。
凋亡的调控基因主要有Bcl-2基因家族、Fas和P53基因等。Bcl-2家族在调节成骨细胞凋亡中起重要作用[4]。Bcl-2和Bax是Bcl-2基因家族的重要成员。Bcl-2是凋亡抑制基因, Bcl-2蛋白表达能够阻止多种刺激因素引起的细胞凋亡, 如生长因子缺失、应激和化学治疗药物等[2]。而Bax是凋亡促进基因, Bax蛋白过表达加速细胞凋亡进程。两者比值决定了凋亡的启动, 并在凋亡中起重要调节作用。Bcl-2和Bax在软骨和成骨细胞中的表达, 维持骨基质合成和降解的平衡, 调节着骨形成和骨吸收的平衡。Morales等[1]研究证实两者表达的上调和下调, 介导了生长因子和激素等对成骨细胞的凋亡效应。本研究也得出类似的结论。与无血清对照组相比, IGF-1所有浓度组Bcl-2表达均增强, 而Bax表达均减弱。经组间比较得出, IGF-1高浓度组 (50 ng/mL) 显著影响Bcl-2表达, 而Bax表达在 (1~50) ng/mL浓度范围内存在剂量依赖性效应。且Bax/Bcl-2的表达强度比与细胞凋亡率呈显著正相关。提示IGF-1主要通过调节Bcl-2和Bax在MC3T3-E1成骨细胞中的相对表达比例, 对抗无血清诱导的细胞凋亡, 从而调节骨代谢平衡。
目前对骨质疏松症的治疗主要应用雌激素、降钙素、二磷酸盐等药物, 作用机制多集中在抑制骨吸收方面。而对促进骨形成作用的药物则研究和应用较少, 外源性IGF-1的使用确实可以促进MC3T3-E1细胞的增殖[5] 并抑制其凋亡。Rosen等[6]认为促进骨内细胞合成代谢的药物可增加骨量, 减少骨折危险性。IGF-1 治疗骨质疏松, 尤其对糖尿病伴发的骨质疏松, 有较好的治疗前景。然而, 由于体内环境的复杂性以及IGF-1作用的广泛性, 对于骨质疏松严重的病人, 较长时间低剂量使用的安全性仍有赖于临床实验。
参考文献
[1]Morales O, Samuelsson MK, Lindgren U, et al.Effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and growth hormone on apoptosis and pro-liferation in UMR 106 osteoblast-like cells[J].Endocrinology, 2004, 145:87-94.
[2]Chen RM, Chen TL, Chiu WT, et al.Molecnlar mechanism of ni-tric oxid einduced osteoblast apoptosis[J].J Orthop Res, 2005, 23:462-468.
[3]Xian CJ, Howarth GS, Cool JC, et al.Effects of acute 5-fluo-rouracil chemotherapy and insulin-like growth factor-I pretreat-ment on growth plate cartilage and metaphyseal bone in rats[J].Bone, 2004, 35:739-749.
[4]Chen RM, Liu HC, Lin YL, et al.Nitric oxide induces osteoblastapoptosis through the de novo synthesis of Bax protein[J].J OrthopRes, 2002, 20:295-302.
[5]Kim SK, Kwon JY, Nam TJ, et al, Involvement of ligand occupancy ininsulin-like growth factor-1 (IGF-1) induced cell growth inosteoblastes like MC3T3-E1 cells[J].Biofactors, 2007, 29 (4) :187-202.
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