α糜蛋白酶

α糜蛋白酶（精选9篇）

α糜蛋白酶 篇1

老年性肺炎是比较常见的一种疾病, 在临床上表现为咳痰、气促、咳嗽、肺部哮鸣音以及呼吸困难等症状, 患者发病后。如果治疗不及时, 出现并发症的几率较高, 比如心律失常、败血症、休克以及脓毒症等[1], 进一步加重患者病情, 不仅加大临床治疗难度, 而且在一定程度上严重威胁患者的生命安全。临床上在治疗老年性肺炎时, 通常以对症治疗为主, 但是效果不尽如人意。因此, 本文重点探讨了氨溴索与α-糜蛋白酶雾化吸入治疗老年性肺炎的临床效果, 现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年3~11月本院收治的老年性肺炎患者70例为研究对象, 随机分为对照组和观察组, 每组35例。纳入标准: (1) 患者入院前, 均出现了咳嗽、气促、咳痰、肺部哮鸣音和或湿啰音等症状体征; (2) 经X胸片检查, 双肺纹理明显增粗、增多、模糊、紊乱, 斑片状模糊致密影。对照组中男20例, 女15例, 年龄61~84岁, 平均年龄 (70.8±9.2) 岁, 病程10~30 d, 平均病程 (19.5±5.8) d;观察组中男18例, 女17例, 年龄62~86岁, 平均年龄 (71.2±9.3) 岁, 病程11~31 d, 平均病程 (19.8±5.9) d。两组患者的病情、年龄等一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2方法

两组患者入院后, 均给予维持电解质、水、酸碱以及盐平衡、支气管扩张和抗感染等基础治疗。对照组在常规治疗的基础上, 再运用α-糜蛋白酶雾化吸入治疗, 运用α-糜蛋白酶4000 U+5 ml生理盐水对患者进行雾化吸入, 2次/d, 1个疗程为7 d。而观察组在常规治疗的基础上, 再给予盐酸氨溴索治疗, 运用2 ml生理盐水+15 mg盐酸氨溴索对患者进行雾化吸入, 2次/d, 1个疗程为7 d。

1.3 疗效判定标准

临床上在评价治疗效果时, 主要依据以下3个标准:显效:治疗后, 患者的咳嗽、咳痰以及气促等症状基本消失, 肺部哮鸣音和湿啰音消失, 7 d后, 经X胸片检查结果确定病灶基本吸收;有效:治疗后, 患者的咳嗽、咳痰以及气促等症状有所缓解, 肺部哮鸣音和湿啰音部分消失, 7 d后, 经X胸片检查结果确定病灶有所吸收;无效:治疗后, 患者的咳嗽、咳痰以及气促等临床症状没有出现任何变化, 7 d后, 经X胸片检查病灶没有被吸收, 甚至病情进一步恶化[2]。总有效率= (显效+有效) /总例数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

经过7 d治疗, 观察组的治疗总有效率97.14%明显高于对照组77.14%, 组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

注:与对照组比较, aP<0.05

3 讨论

近年来, 随着人口老龄化进程的进一步加剧, 老年性肺炎在我国的发病率呈现出逐年上升的趋势。由于该疾病具有较高的死亡率, 仅次于恶性肿瘤和心脑血管疾病, 并且容易出现诸多并发症, 尤其是往往伴消化系统、神经系统以及呼吸衰竭症状, 出现漏诊和误诊的几率较高, 在一定程度上严重威胁患者健康。由于患者年龄较大、身体各项机能明显衰退、免疫力低下、气道平滑肌功能和咳嗽反射减弱, 相比较成人而言, 老年患者的支气管纤毛运动能力较差, 出现感染和损伤的几率较大。呼吸道感染后, 增加支气管内分泌物, 使呼吸道狭窄, 严重情况下甚至阻塞呼吸道, 危及患者性命。

当前, 临床上在治疗老年性肺炎时, 通常以支气管扩张和抗感染等对症治疗为主, 由于感染的病原体具有不确定性和多样性特征, 所以临床治疗难度较大。临床在治疗老年肺炎时, 为了避免支气管阻塞, 关键是要及时清除肺部和呼吸道分泌物, 使呼吸道保持通畅, 将无效死腔消除, 使肺组织保持充分膨胀, 从而维持正常的血流比值/肺通气。现代药理学研究表明, 盐酸氨溴索具有溶解分泌物和促进黏液排出的作用, 能够有效清除肺部和呼吸道分泌物, 保持呼吸道通畅, 使患者的呼吸状况得到有效改善。同时, 运用雾化吸入的给药方法能够使药物直接对气道分泌细胞产生作用, 对浆液性和黏液性分泌进行调节, 增加浆液分泌, 提高纤毛黏液痰的溶胶层, 增加支气管纤毛的活动空间, 提高纤毛的摆动强度和频率, 增强运输能力, 促进痰液及时有效的排出[3]。此外, 盐酸氨溴索还可以对肺泡Ⅱ型细胞的合成产生刺激作用, 使黏液的黏稠力和肺泡表面张力降低, 提高无纤毛区痰液的输送能力, 并将支气管分泌物中抗生素的浓度提高, 有效减少患者的咳痰量, 恢复支气管黏液的分泌功能, 从而充分发挥抗炎和抗氧化作用[4]。虽然α-糜蛋白酶可以对变性蛋白质进行分解, 稀释和分解痰液, 促进痰液排出, 但是相比较盐酸氨溴索而言, 其抗氧化作用较差。在本次研究中, 观察组的治疗总有效率明显优于对照组 (P<0.05) , 治疗效果显著。

综上所述, 临床上运用氨溴索雾化吸入治疗老年性肺炎, 不仅起效快、不良反应小, 在一定程度上还能提高治疗效果, 使患者的预后生活质量得到改善, 具有一定的推广和应用价值。

摘要：目的 探析氨溴索与α-糜蛋白酶雾化吸入治疗老年性肺炎的临床效果。方法 70例老年性肺炎患者随机分为对照组和观察组, 各35例。对照组给予常规治疗, 而观察组则运用氨溴索雾化吸入治疗, 对比分析两组的治疗效果。结果 经过7 d治疗, 观察组的治疗总有效率明显高于对照组, 组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 临床上运用氨溴索雾化吸入治疗老年性肺炎, 不仅起效快、不良反应小, 在一定程度上还能提高治疗效果, 使患者的预后生活质量得到改善。

关键词：氨溴索,α-糜蛋白酶,老年性肺炎

参考文献

[1]郭亚丽.氧驱动雾化吸入氨溴索治疗老年性肺炎疗效观察及护理.实用临床医药杂志, 2011, 15 (24) :188-190.

[2]张菊梅.盐酸氨溴索雾化吸入佐治慢性支气管炎的疗效观察.实用心脑肺血管病杂志, 2011, 19 (1) :54.

[3]田大君.氧驱雾化吸入盐酸氨溴索治疗老年性肺炎疗效观察及护理.实用心脑肺血管病杂志, 2013, 21 (12) :157-158.

[4]杨丽, 万鹏飞.氧驱动雾化吸入氨溴索在老年肺炎患者中的应用及护理.齐鲁护理杂志, 2013, 19 (7) :84-85.

α糜蛋白酶 篇2

摘要：采用傅里叶变换显微红外手段研究了在信号肽缺失的情况下,C-末端酸性蛋白的存在对小麦α-硫素原核表达过程中蛋白质二级结构的`影响.SDS-PAGE表明带有酸性蛋白(Sc样品)的重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达;而酸性蛋白缺失(S样品)可以极大提高外源蛋白的可溶性.通过对含有S及Sc的全细胞在诱导前及诱导后2 h的酰胺Ⅰ带区域图谱求筹谱及二阶导数谱,发现诱导前在1 630cm~1处吸收较弱,而在诱导2 h左右,在1 630 cm~(-1)处检测到明显的吸收峰,该位置的吸收主要来自于聚集体的贡献.进一步对酰胺Ⅰ带区域进行傅里叶去卷积处理,结合高斯曲线拟合,发现在Sc样品中随着诱导时间的增加,聚集体含量逐渐增加,这与SDS-PAGE结果一致.此外,伴随着聚集体的形成,α-螺旋的含量逐渐增加;而β-折叠和无规卷曲的含量却逐渐减少.在S样品中观察到无规卷曲的含量随诱导时间的增加逐渐提高,而β-转角及(1 629±1)cm~(-1)处对应的β-折叠的含量却逐渐减少.上述现象表明:C-末端酸性蛋白的引入导致表达过程中β-折叠和无规卷曲逐渐向聚集体和α-螺旋转化.Abstract：Fourier transform infrared (FTIR) microspectroscopy was used to investigate the effects of C-terminal acidic protein on the secondary structure of wheat α-thionin in the absence of signal peptide during the prokaryotic expression process. SDS-PAGE analysis revealed that the presence of acidic protein gave rise to the formation of inclusion body, however, the absence of acidic protein greatly enhanced the solubility of the heterogenous protein expressed in E. coli BL21(DE3) with the induction of 1 containing S and Sc, which corresponds to the absence and presence of C-terminal acidic proteins, respectively. The second de-rivative of the difference spectra measured 2 h after induction showed one principal component at ～1 630 cm~(-1) , while no signifi-cant peak appeared at the same peak position when the spectra before induction were compared. Combined with SD～PAGE of recombinant protein, the authors presumed that the peak absorption at ～1 630 cm~(-1) is most likey to be assigned to protein ag-gregate within inclusion body. Gaussian curve-fitting was done on the Fourier self-deconvolution spectra within amide I region of intact cells containing S and Sc. The experimental data revealed that the relative content of aggregate absorption at (1 629 ± 1) cm~(-1) gradually increased with induction time, which is consistent with the results of SDS-PAGE. Simutaneously, the formation of aggregate gave rise to the increase of a-helix, as well as the decrease of fl-turn and random coil in the ease of Sc. It was not the case for S, however, where random coil experienced the increase in the relative average fractions, while β-turn and β-sheet at (1 629±1) cm~(-1) behaved in different ways. The above mentioned phenomenon indicated that fl-sheet and random coil are most likely to transform into aggregate and α-helix with the introduction of C-terminal acidic protein. 作者： 刘艳[1]冯娟[1]陶栋梁[2]翁诗甫[2]任正隆[3] Author： LIU Yan[1]  FENG Juan[1]  TAO Dong-liang[2]  WENG Shi-fu[2]  REN Zheng-long[3] 作者单位： 电子科技大学生命科学与技术学院,四川成都,610054北京大学化学与分子工程学院,北京,100871电子科技大学生命科学与技术学院,四川成都,610054;四川农业大学植物遗传育种省级蓖点实验室,四川雅安,625014 期 刊： 光谱学与光谱分析   ISTICEISCIPKU Journal： SPECTROSCOPY AND SPECTRAL ANALYSIS 年，卷(期)： 2009, 29(12) 分类号： Q657.3 关键词： 显微红外    C-末端酸性蛋白    α-硫素    原核表达    二级结构    Keywords： FTIR microspectroscopy    C-terminal acidic protein    α-thionin    Prokaryotic expressio    Secondary structure    机标分类号： R73 O6 机标关键词： 傅里叶    显微红外    酸性蛋白    硫素    原核表达    过程    Prokaryotic Expression    Acidic Protein    Study    acidic protein    SDS-PAGE    inclusion body    aggregate    诱导时间    无规卷曲    聚集体    prokaryotic expression    spectra    含量    secondary structure 基金项目： 国家自然科学基金重点项目，电子科技大学青年基金重点项目

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α糜蛋白酶 篇3

肾脏疾病的实验室检查指标种类繁多，主要包括针对肾小球滤过功能、肾小管重吸收和排泌功能等诸多检查，从而检测和分析肾脏结构和功能的异常變化。α1-微球蛋白（α-Microglobulin，简称α1-MG）是1975年Ekstron等从慢性镉中毒病人尿液中分离出的一种相对分子量较小的糖蛋白，经过国内外学者对α1-MG的来源，生化特性的大量研究，使其临床应用价值得到逐步的肯定。我们在学习文献的同时，结合实际工作经验，对α1-微球蛋白在肾病中的诊断价值进行了总结，现分述如下。

1 认识α1-MG的生物学特性

α1-MG是由人体的肝脏和淋巴细胞合成，分子量约为33000道尔顿的糖蛋白。它由167个氨基酸组成，与人类白细胞抗原HLA-A11，HLA-B20和HLA-51等抗原决定簇有交叉反应。α1-MG广泛存在于人体包括血液、尿液、唾液等在内的各种体液及淋巴细胞膜表面，血液中的α1-MG以三种形式存在，即游离的α1-MG、与IgA结合的α1-MG-1gA、与白蛋白结合形成的α1-MG-A1b。正常情况下，α1MG-1gA约占血液中总α1-MG的40-70%，血液中免疫球蛋白水平对α1-MG及α1MG-1gA之间的比例有明显影响。血液中游离的α1-MG可自由通过肾小球滤过膜，95%-99%在肾近曲小管重吸收和代谢，只有微量α1-MG从终尿排出；而结合型的α1-MG则不能通过肾小球，其在尿液中的浓度为零^[1]。若肾小球滤过膜受损，结合型α1-MG亦可出现于尿液中。因此通过测定血清、尿α1-MG能敏感地反映肾小球滤过功能和近端肾小管重吸收功能的改变，从而用于肾脏疾病的诊断和鉴别诊断。

2 α1-MG在常见肾病中的诊断应用

α1-MG与目前临床上广泛应用于检测早期肾小球、肾小管功能损害的指标β2-微球蛋白（β2-MG）相比，测定影响因素少，不受恶性肿瘤及尿液酸碱度的影响，酸性尿中不会分解而出现假阴性结果，优点明显^[2]。α1-MG的分子量更大，更能敏感地反映肾小球滤过功能的改变。另外当近端小管功能受损时，重吸收效率降低使尿中α1-MG排泄量急剧增加，Piscator^[3]检测后发现当近端小管重吸收率从99.95%下降至99.85%就可使其排泄量增加3倍，因此尿α1-MG被认为是近端肾小管功能轻微损害非常敏感和特异的指标。α1-MG在血清及尿液中增高的原因包括：①肾小管重吸收和代谢α1-MG的能力降低；②肾小球滤过功能受损；③体内合成过多；④淋巴细胞破坏释放。各种肾病导致的肾功能不全，如肾小球损伤早期、原发性肾小球肾炎、间质性肾炎、糖尿病肾病、狼疮肾、急慢性肾功能衰竭等。也见于IgA型骨髓瘤、肝癌等。α1-MG在血清及尿液中降低说明α1-MG合成减少，提示重度肝功能损害，见于重症肝炎、肝坏死等。

另外，α1-MG在其他肾病的诊断和监测中也具有重要价值。①肾脏移植后排斥反应的监测。在同种异体肾移植中，急性排斥反应是术后常见的并发症，是慢性排斥反应发生的高危因素，也是导致移植物长期存活失败的常见原因。发生急性排斥反应时血清α1-MG水平明显升高，而抗排斥治疗有效后，血清α1-MG逐渐降至正常水平^[4]。②妊娠高血压综合征时肾脏损害的早期监测。妊娠高血压综合征发病时肾脏往往首先受累且损害明显，患者除有肾小球功能受损外近端肾小管亦受损，早期监测血尿α1-MG水平可准确评判肾脏损害，可指导临床及时采取有效措施防止重度妊娠高血压综合征的发生，对母子平安和优生优育均有重要意义。③自身免疫性疾病、风湿性疾病累及肾脏、狼疮性肾炎时，尿α1-MG测定也可作为诊断早期肾损害的特异性指标。④高血压肾病。长期高血压会引起全身小动脉硬化，并以肾小动脉硬化最明显，导致肾实质缺血、肾小球纤维化、肾小管萎缩等缺血性肾脏损害。病变的严重程度与高血压的病程长短及血压升高程度成正比。但早期肾损害患者通常无明显症状，常规的血液生化和尿液检查均呈正常，若不及时注意，则会导致肾功能的恶化。此时尿α1-MG测定敏感性高于尿β2-MG、A1b、IgG等指标，对及早发现原发性高血压的早期肾损害具有很大的临床意义。

3 讨论

血清和尿α1-MG检测可用于多种肾脏疾病的临床诊断、病情观察、指导用药、判断预后的有效指标。但在实际应用中应注意不同的方法测定的α1-MG值有所差别。目前临床上常用操作简单的乳胶凝集反应法用于α1-MG的定性检测，而定量检测则多用单向免疫扩散法（SRID）、酶联免疫吸附法（ELISA）或放射免疫测定法（RIA）。应该提醒临床的是，利用α1-MG单克隆抗体测定时一般只与游离型的α1-MG结合，结果并不代表体内α1-MG的总水平。

血清α1-MG的水平存在性别与年龄差异，通常认为男性高于女性，婴儿和65岁以上的老人高于成人；婴儿脐带血中α1-MG含量比正常成人高，可能与小儿淋巴细胞含量比正常人相对较高有关。血清中α1-MG水平很少受运动和饮食影响，亦未见昼夜波动，但受体位变化的影响，卧位比立位α1-MG浓度低，因而以晨起空腹采血分离血清为好。

尿液中的α1-MG亦存在性别与年龄差异，但用尿α1-MG和尿肌酐比值（α1-MG/Cr）可消除性别上的差别。运动和发热会使尿液中的α1-MG浓度升高，检查前应予注意。尿液中α1-MG在pH4.0～8.0范围内较为稳定，在4℃可稳定1周；pH5.0以上的尿液，在15℃仍可稳定4d，故测定尿α1-MG，收集晨尿、24h尿或随意尿均可。

参考文献

[1]侯振江，郭桂平.生物化学检验技术[M].北京：人民军医出版社，2012，1（2）：235

[2]王鸿利.实验诊断学[M].北京：人民卫生出版社，2011，4（2）：205

[3]Piscator M.Early detection of tubular dysfunction.Kidney Int Suppl，1991，34：S15-17

α糜蛋白酶 篇4

1 资料和方法

1.1 一般资料

本组254例患者均为我院住院患者, 男158例, 女96例, 年龄23岁~78岁。其中, 肝癌患者138例, 肝硬化患者67例, 急性肝炎患者49例。102例健康者均为我院体检正常体检者, 肝癌患者诊断均符合国际抗癌联盟 (UICC) 肝癌诊断标准, 肝炎患者诊断均符合2000年9月西安全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议方案的诊断标准[5]。本研究获医院伦理委员会批准, 并与研究对象签署知情同意书。

1.2 检测方法

采集研究对象空腹静脉血5m L, 3000转r/min离心15 min, 取血清当日完成检测。SAA、α1-AG检测均采用BNP全自动蛋白分析仪 (Siemens) 及配套试剂检测;AFP采用罗氏公司的电化学发光免疫分析仪及配套试剂检测。

1.3 统计学方法

计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用方差分析和t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清SAA、α1-AG检测结果比较 见表1。

注:q、P为肝癌患者与健康人对照组比较检验值, q1、P1为肝癌患者与肝硬化组比较检验值, q2、P2为肝癌患者与与急性肝炎组比较检验值。

2.2 不同AFP水平肝癌患者血清SAA、α1-AG水平比较

不同AFP水平的2组患者SAA、α1-AG差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表2。

3 讨论

3.1 血清SAA、α1-AG水平可用于肝癌诊断

α1-AG是肝脏分泌的一种蛋白质, 是血清黏蛋白的主要成分, 为人类血浆中含糖量最高、酸性最强的糖蛋白。作为一种急性时相蛋白, 正常人血清中α1-AG含量较低, 在感染、肿瘤发作时其浓度升高, 而在慢性肝炎、肝硬化患者血清中其含量显著降低。本文中, 肝癌患者的血清α1-AG水平显著高于良性肝病患者及健康人群 (P<0.05) , 且健康人群血清α1-AG水平高于良性肝病患者, 与上述结论相符。

血清SAA主要由肝细胞合成, 主要功能为酶类胞外基质降解的诱导、脂类的代谢和转运以及对炎症细胞的趋化作用。本文表明, 肝癌患者血清SAA水平显著高于良性肝病患者及健康人群 (P<0.05) ;但是良性肝病患者血清SAA水平和健康人群没有明显差异。因此, 血清α1-AG、SAA可作为诊断肝病的特异性指标。

3.2

SAA、α1-AG协同AFP检测可显著提高肝癌诊断率肝癌病情进展迅速、病死率高, 因此, 早期诊断对于病情的控制具有重要意义。但目前肝癌的诊断主要依赖于AFP, 特异性差、检出率低, 因此急需一种特异性较强的指标。SAA、α1-AG水平在不同AFP水平的肝癌患者中差异不显著 (P>0.05) , 可与AFP相互补充提高肝癌的诊断率。

综上所述, 肝癌患者血清SAA和α1-AG水平显著升高, 对肝癌的鉴别诊断具有重要意义。如果将SAA、α1-AG、AFP联合检测, 则可大大提高肝癌的诊断率。

摘要：目的 探讨血清淀粉样蛋白A (SAA) 和α1酸性糖蛋白 (α1-AG) 对于肝癌诊断的临床意义。方法 采用免疫透射比浊法对138例肝癌患者、67例肝硬化患者、49例急性肝炎患者及102例健康人血清SAA、α1-AG的含量进行检测, 采用电化学发光法对肝癌患者血清AFP含量进行检测, 并对检测结果进行分析。结果 肝癌组、肝硬化组、急性肝炎组及健康人对照组血清SAA水平分别为 (16.98±2.84) 、 (3.56±0.16) 、 (3.78±0.28) 、 (3.24±0.21) mg/L, α1-AG水平分别为 (0.93±0.17) 、 (0.40±0.27) 、 (0.64±0.17) 、 (0.74±0.16) g/L。肝癌组血清SAA与α1-AG水平显著高于肝硬化组、急性肝炎组、健康人对照组 (P<0.05) ;不同AFP水平肝癌患者血清SAA、α1-AG水平无显著性差异 (P>0.05) 。结论 肝癌患者血清SAA和α1-AG水平显著升高, 对肝癌的鉴别诊断具有重要意义。如果将SAA、α1-AG、AFP联合检测, 则可大大提高肝癌的诊断率。

关键词：肝癌,诊断,淀粉样蛋白A (SAA) ,α1酸性糖蛋白 (α1-AG) ,甲胎蛋白 (AFP)

参考文献

[1]Bachtiar I, Santoso JM, Atmanegara B, et al.Combination of alpha-1-acid glycoprotein and alpha-fetoprotein as an improved diagnostic tool for hepatocellular carcinoma[J].Clin Chim Acta., 2009, 399 (1-2) :97-101.

[2]Kim KA, Lee EY, Kang JH, Diagnostic accuracy of serum asialo-alpha1-acid glycoprotein concentration for the differential diagnosis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma[J].Clin Chim Acta, 2006, 369 (1) :46-51.

[3]Le L, Chi K, Tyldesley S, et al.Identification of serum amyloid A as a biomarker to distinguish prostate cancer patients with bone lesions[J].Clin Chem, 2005, 51 (4) :695-707.

[4]Cho WC, Yip TT, Yip C, et al.Identification of serum amyloid a protein as a potentially useful biomarker to monitor relapse of nasopharyngeal cancer by serum proteomic profiling[J].Clin Cancer Res, 2004, 10 (1 Pt 1) :43-52.

α糜蛋白酶 篇5

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

同批次健康清洁级Spraque-Dawley (SD) 雄性大鼠56只, 体重 (230±20) g, 购自上海斯莱克实验动物有限公司 (批号:2007000517870) 。盐酸阿霉素 (生理盐水稀释2 mg/m L, 法玛西亚公司, 意大利, 批号:9QL0011) , HRP-标记的羊抗小鼠二抗、小鼠抗大鼠β-actin (Abcam公司, 美国) , nephrin一抗 (Abcam公司, 美国) , MMP-9检测试剂盒 (南京建成生物工程公司) 。

1.2 方法

1.2.1 模型制作与分组

大鼠适应性饲养1周, 称体重, 检测24 h尿蛋白阴性后按照随机数字表分为两组。对照组28只, 模型组28只。实验期间自由进水, 饮食。模型组大鼠尾静脉各注射阿霉素4 mg/kg, 2周后再次注射阿霉素3.5 mg/kg, 对照组大鼠分别于相同时间尾静脉注射等量生理盐水。从第2次注射后连续观察12周末。

1.2.2 大鼠尿蛋白、血生化的检测

各组分别于阿霉素注射前1天, 注射后2、4、8、12周末用代谢笼收集24 h尿液, 双缩尿法测定24 h尿蛋白定量。每次尿液采集结束后对照组及模型组随机取大鼠各7只水合氯醛麻醉后处死, 心脏采血3 m L, 全自动生化分析仪检测血清白蛋白、总胆固醇、肌酐。

1.2.3 肾组织病理观察

甲醛固定的部分肾皮质常规石蜡包埋, 切片, 作HE和Masson染色, 光镜下观察肾小球基本病理改变。戊二醛固定的部分肾皮质, 送检至南京医科大学大型仪器设备中心制备切片, 作透射电镜观察。

1.2.4 Western blot法检测肾皮质部nephrin表达

用蛋白提取液RIPA (含蛋白酶抑制剂PMSF) 提取肾皮质组织总蛋白, 采用BCA法测定蛋白浓度。每组加100μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳, 转膜, 5%脱脂奶粉室温封闭120 min, 分别加入nephrin (1∶5000) 和β-actin (1∶1000) 一抗4℃孵育过夜, 以HRP标记的Ig G室温孵育90 min, 洗膜后加入发光显色液显色, X光片显影、定影。以β-actin作为内参, 使用Image J软件分析灰度值。

1.2.5 逆转录聚合酶链反应检测肾组织α-SMA m RNA的表达

用TRIzol试剂 (美国Invitrogen公司) 提取肾组织总RNA, 紫外分光光度仪测其纯度及含量。在反转录酶催化下合成c DNA, 以适量c DNA为模板, 在Taq DNA聚合酶催化下进行扩增。聚合酶链反应引物由美国Invitrogen公司上海分公司合成, 引物序列:GAPDH:5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3', 5'-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3', 产物149 bp, α-SMA:5'-CTCTTCCAGCCATCTTTCATT-3', 5'-GCATTT GCGGTGGACAATGGA-3′产物为374 bp。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳、凝胶图像扫描系统成像并进行灰度扫描, 以密度代表其表达量, 用GAPDH的表达量校正, 将两者吸光度的相对量进行分析。重复3次独立的半定量PCR全过程。

1.2.6 ELISA法检测大鼠血清MMP-9含量

取大鼠血清40μL, 按说明书要求操作, 按浓度梯度稀释标准品后取50μL依次加入空白微孔中, 各样品取40μL加入抗-MMP-9抗体10μL, 链酶亲和素-HRP 50μL, 轻轻晃动混匀。盖上封板膜后, 37℃温育60 min。洗涤后显色, 37℃避光反应15 min, 终止反应。酶标仪测定450 nm处OD值。根据标准曲线计算样本含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件, 计量资料数据以均数±标准差 (±s) 表示, 组间差异比较进行单因素方差分析 (ANOVA) , 方差不齐时采用Dunnett T3检验, 相关性采用Spearman相关分析法。两两比较采用LSD-t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠尿蛋白、血生化的检测

模型组2周时即出现大量蛋白尿, 随着时间的进展, 蛋白尿持续增加, 各时间点尿蛋白与对照组比较差异有统计学意义 (均P<0.01) 。见表1。模型组2周时出现血浆白蛋白降低及总胆固醇轻度升高, 随着时间的进展, 血浆白蛋白持续降低, 总胆固醇持续升高, 4周起各时间点血浆白蛋白、总胆固醇及肌酐与对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。白蛋白降低与前一时间段组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

注:与对照组同时段比较, *P<0.05, **P<0.01;与同组前一时段比较, #P<0.05, ##P<0.01

2.2 肾脏病理形态学变化

光镜及电镜观察染色标本肾小球的形态, 实验中正常对照组肾小球整体变化不大, 肾病组第2周电镜可见肾小球的体积增大, 足突间裂隙消失, 足突变形、融合或消失;肾病组第4周时, 足细胞肿胀明显, 并有小新月体形成及球囊壁纤维化;肾病组第8周, 系膜细胞轻度增生, 部分大鼠有肾小球毛细血管襻阶段性硬化伴肾小管萎缩、系膜基质增生。肾病组第12周, 肾小球局灶阶段性硬化明显, 肾小管萎缩, 系膜细胞和系膜基质增生明显。见图1。

2.3 肾皮质部nephrin蛋白的表达变化

实验中, nephrin蛋白的相对表达量随时间进展逐渐减少, 与对照组相比差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。各时间点与前一时间点相比差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见图2。

2.4 α-SMA m RNA在肾组织表达的变化

与对照组相比, α-SMA m RNA的表达均明显升高, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) , 随模型时间的推移, α-SMA m RNA的表达逐渐升高, 每组与前一时间段相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图3。

与对照组同时段比较, **P<0.01;与同组前一时段比较, ##P<0.01;nephrin:肾病蛋白图两组各时间点的结果

与对照组同时段比较, **P<0.01;与同组前一时段比较, #P<0.05, ##P<0.01;α-SMA:α-平滑肌肌动蛋白

2.5 血清MMP-9表达情况

血清MMP-9的表达自2周起即出现下降, 8周时显著下降, 与对照组相比, 差异有计学意义 (P<0.05) , 随模型时间推移, MMP-9的表达呈持续下降趋势, 每组与前一时间段相比差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图4。

2.6 相关性分析

Nephrin的表达与24 h尿蛋白定量呈显著性负相关 (r=-0.529, P<0.05) , 血清MMP-9的表达量与24 h尿蛋白定量呈显著性负相关 (r=-0.454, P<0.05) , α-SMA m RNA的表达与nephrin (r=-0.858, P<0.01) 及MMP-9 (r=-0.686, P<0.01) 均呈显著负相关, nephrin的表达与MMP-9 (r=-0.872, P<0.01) 则呈显著正相关。

与对照组同时段比较, *P<0.05, **P<0.01;与同组前一时段比较, #P<0.05, ##P<0.01;MMP-9:基质金属蛋白酶-9

3 讨论

在肾脏纤维化的过程中, 经典的观念认为肾脏的纤维化是细胞外基质 (ECM) 大量聚积导致肾脏广泛纤维化所致, 近年来, 大量研究证实包括足细胞、系膜细胞、上皮细胞、小管细胞在内的肾脏固有细胞的变化均参与肾脏纤维化。Kim等[4]研究证实足细胞减少是肾小球硬化的基础, 而足细胞的损伤犹如连锁反应般影响着其他足细胞, 从而加速肾小球硬化的形成[5,6]。体内外多项研究表明系膜细胞在肾小球硬化过程中起重要作用, Weigert等[7]及Brosius等[8]研究发现糖尿病肾病纤维化过程中, 系膜基质降解减少固然是重要环节, 系膜细胞也独立的发挥着影响糖摄取及糖代谢导致肾脏纤维化的作用。肾小管上皮细胞经历多重生物学改变获得间充质细胞表型的过程称为上皮细胞间充质转化 (EMT) , Iwano等[9]首次应用近端小管上皮细胞遗传标记小鼠证实, 单侧输尿管梗阻 (UUO) 模型小鼠小管间质区成纤维细胞中36%来源于近端小管, 从而有力地说明EMT是炎症环境下肾脏固有细胞发生的重要生物学事件。因此, 肾脏纤维化是一个复杂多因素参与的过程, 最重要的就是肾脏固有细胞及结缔组织细胞等, 而其作为慢性肾脏病 (CKD) 进展至终末期肾脏疾病 (ESRD) 的共同病理表现, 其逆转机制一直成为众多学者研究的焦点。然而至今仍未发现关键性的时机及关键性的途径。

本实验中, 笔者采用了2次尾静脉注射多柔比星成功建立了肾小球硬化模型, 该模型成功模拟了肾脏疾病的进展过程, 与临床所见的慢性肾脏病过程极为相似。在模型中, 第4周出现系膜细胞增生, 新月体形成, 8周时出现毛细血管袢阶段性硬化, 12周时肾小球硬化超过50%, 提示第8周为肾小球硬化期。Nephrin是位于足细胞裂孔膜区域的一种跨膜糖蛋白, 是第一个被确定的肾小球滤过屏障结构蛋白分子, 其正常表达对维护足细胞功能结构的完整性及对维持裂孔膜结构和功能起重要作用, 其分布和表达的异常已被证实与多种先天性及获得性蛋白尿相关[10,11]。本实验研究发现其在第2周时已开始发生变化, 8周时变化最为显著, 直至12周时这种下降趋势仍未见扭转。α-SMA为真核细胞的一种细胞骨架蛋白, 参与构成微丝结构, 是肌成纤维细胞的特征蛋白, 被普遍作为检测肾脏固有细胞向肌成纤维细胞表型转化的一项指标[12,13]。本研究发现, α-SMA的表达在第2周时开始升高, 随病程不断进展, 至12周时居高不下。MMPs是ECM降解的主要酶系, MMP-9是降解Ⅳ型胶原的最主要成员之一[14,15]。本实验中MMP-9的表达也自第2周起下降, 持续下降趋势至12周时未恢复。MMP-9的产生用来消除基质的聚积, 然而病变却仍不可避免的进展, 说明在疾病过程中其他正性作用更为突出, 机体自身的免疫应答在此过程中发生了变化, 受到抑制从而使疾病不可逆。

综上所述, 本研究从动物整体水平上发现, nephrin蛋白的表达减少最早发生, MMP-9及α-SMA虽也在早期即开始出现变化, 但在肾小球硬化期变化更为显著, 由此为寻找逆转肾脏纤维化的关键时间点找到证据。既然肾脏纤维化是一个多种因素共同参与的疾病, 原因多样复杂, 且多多少少存在着相互促进或抑制的关联, 因此在寻求逆转的肾脏纤维化的方法时需要多重考虑多靶点共同治疗。

摘要：目的 研究阿霉素肾病模型不同时相中肾病蛋白 (nephrin) 、α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 、基质金属蛋白酶 (MMP) -9表达变化。方法 采用间隔2周2次尾静脉注射阿霉素的方法复制大鼠阿霉素肾病模型, 实验分对照组 (正常大鼠28只) 和模型组 (阿霉素肾病大鼠28只) , 观察2、4、8、12周各项指标的变化, 包括24 h尿蛋白、血浆白蛋白和总胆固醇的检测, 采用Western-blot法检测肾皮质部nephrin的蛋白表达, 采用荧光定量PCR检测肾组织α-SMA的表达, 采用ELISA法检测血清MMP-9的表达。结果 阿霉素肾病大鼠模型组蛋白尿持续增加, 12周末病理表现为肾小球节段性硬化。Nephrin蛋白的表达2周时已出现减少, 8周时明显减少, 持续至12周时仍未见恢复, 与尿蛋白定量呈负相关。α-SMA mRNA的表达2周时开始增加, 呈时间相关性递增, 其表达与尿蛋白定量呈正相关。血清中MMP-9的表达2周时出现显著减少, 呈时间相关性递减, 与24 h尿蛋白定量呈负相关。结论 通过间隔2周尾静脉注射阿霉素的方法复制阿霉素肾病动态进展模型, nephrin、α-SMA、MMP-9在各不同时相均参与肾病进展。

α糜蛋白酶 篇6

入院后每日三餐前短效胰岛素加睡前中效胰岛素皮下注射, 并每天监测4次血糖, 同时给予抗高血压药物和低蛋白饮食+开同 (α-酮酸) 等治疗。2周后血糖控制在6.0～8.8mmol/L, 血压明显下降, 水肿基本消失, 好转出院。出院后除胰岛素降糖及控制血压药物之外, 继续指导患者进行低蛋白饮食+开同治疗。3月后复诊, 血肌酐196.5umol/L, 24小时尿白蛋白定量148毫克。

病例点评:

糖尿病肾病是特别常见和比较麻烦的一种并发症, 属于糖尿病全身性微血管病变之一, 也是糖尿病最严重的并发症之一, 其发生率随着糖尿病的病程延长而增高。临床特征为蛋白尿, 渐进性肾功能损害, 高血压, 水肿, 晚期出现严重肾功能衰竭, 是糖尿病患者的主要死亡原因之一。目前, 对糖尿病肾病蛋白尿的治疗, 通常只重视积极控制血糖、血压和血脂, 同时配以血管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI) 或血管紧张素受体拮抗剂 (ARB) 等药物降低肾小球跨膜压力, 而低蛋白饮食却常常被忽略, 重要原因在于人们没有充分认识到低蛋白饮食对肾病进展的重要性。通过限制蛋白摄入, 可阻断蛋白尿形成进程的核心环节, 避免了肾小球的高灌注和高滤过, 降低蛋白尿, 延缓肾小球硬化和肾功能衰竭。因此, 低蛋白饮食应作为糖尿病肾病治疗的基础。开同在低蛋白饮食治疗过程中起着非常重要的作用。

开同降低蛋白尿, 延缓糖尿病肾病进展

开同可以从以下几个方面减少蛋白尿: (1) 酮酸主要补充的成分为支链氨基酸, 不引发肾脏高滤过, 直接减少蛋白尿。 (2) 酮酸使慢性肾病患者的蛋白质降解和支链氨基酸氧化增加而合成降低, 在保证充分热量条件下给予低蛋白饮食合并酮酸, 机体将会适应性增加蛋白合成而减少氨基酸氧化及蛋白降解, 调整蛋白质代谢, 间接治疗蛋白尿。 (3) 酮酸可改善肾小管转运功能, 使肾小管对支链氨基酸的重吸收功能增强, 从而降低尿中支链氨基酸的排泄量, 减少蛋白尿。

开同改善糖尿病肾病的代谢紊乱

开同主要通过减少氮质废物堆积、改善代谢性酸中毒、降低血中甲状旁腺激素 (PTH) 浓度、增进肌肉摄取葡萄糖等多种途径增加胰岛素敏感性改善糖代谢;通过降低总胆固醇和甘油三酯, 增加高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) , 降低心血管传统危险因素, 还可降低引起脂代谢异常的非传统危险因素, 如高同型半胱氨酸血症、C反应蛋白、血清甲状旁腺激素和氧化型LDL等。

开同避免低蛋白饮食导致营养不良

α糜蛋白酶 篇7

1 对象与方法

1.1 对象

选取2007年10月至2008年10月在包头市中心医院产科住院分娩的产妇80例。排除有妊高征、心脏病、肝炎、肿瘤等其他病史及其它因素致胎膜早破的患者。根据妊娠周期、有无胎膜早破, 分为早产早破组、早产临产组、足月早破组、足月临产组4个组, 每组20例。各组孕妇成功分娩后, 取胎膜组织2块 (早破孕妇在其早破周围) , 取材大小约为1 cm×1 cm, 生理盐水冲去组织表面残留, 放于10%甲醛中固定。

1.2 试剂

MMP-2、TIMP-2、TNF-α一抗及二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。一抗均为兔抗人多克隆抗体。

1.3方法

将所取得组织置于10%甲醛固定, 常规脱水及石蜡包埋组织标本, 连续4μm切片。采用免疫组化方法的链霉亲和素生物素过氧化物酶法, 实验步骤按说明进行。用捷达801图像分析系统分别测定各组羊膜上皮阳性细胞面积积分光密度值, 用阳性积分光密度值表示MMP-2、TIMP-2、TNF-α蛋白表达的相对含量。

1.4 统计学分析

实验结果以均数±标准差表示, 应用SPSS11.5统计学软件分析系统进行t检验分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 羊膜和绒毛膜细胞中MMP-2蛋白表达情况比较

MMP-2蛋白表达主要分布在羊膜和绒毛膜上皮细胞及间质细胞, 其中, 在羊膜上皮细胞中的表达最强。早产早破组MMP-2蛋白表达的相对含量高于早产临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。足月早破组MMP-2蛋白表达的相对含量高于足月临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见表1。

a为与早产临产组比较P<0.01;b为与足月临产组比较P<0.01

2.2 羊膜和绒毛膜细胞中TIMP-2蛋白表达情况比较

TIMP-2蛋白表达主要分布在羊膜和绒毛膜上皮细胞及间质细胞, 其中, 在羊膜上皮细胞中的表达最强。早产早破组TIMP-2蛋白表达的相对含量低于早产临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。足月早破组TIMP-2蛋白表达的相对含量低于足月临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见表2。

a为与早产临产组比较P<0.01;b为与足月临产组比较P<0.01

2.3 羊膜和绒毛膜细胞中TNF-α蛋白表达情况比较

早产早破组TNF-α蛋白表达的相对含量高于早产临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。足月早破组TNF-α蛋白表达的相对含量高于足月临产组, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见表3。

a为与早产临产组比较P<0.01;b为与足月临产组比较P<0.01

3 讨论

PROM是37周后孕妇分娩的常见并发症, 及时有效的护理至关重要。PROM的致病机制尚不清楚, 研究发现可能与生殖道感染、胎位不正、宫颈相关病变等因素相关。研究表明PROM可能由MMP和TIMP之间的失衡引起, 从而导致了胎膜细胞外基质中维持胎膜张力和弹性作用的Ⅰ~Ⅳ型胶原的降解, 降低胶原纤维含量, 以致其它成分排列紊乱, 进而发生PROM。Fortunato[4]在实验中发现在发生PROM时羊水中MMP-2的浓度和活性增加, 同时羊水中的TIMP-2浓度降低, TIMP-2能与MMP-2结合成非共价键化合物, 抑制MMP-2发挥作用。此外, MMP-2能激活MMP-9, MMP-2和MMP-9是Ⅳ型胶原酶, 它们是唯一能降解细胞外基质主要骨架蛋白-Ⅳ型胶原的蛋白水解酶。Riley通过动物实验研究发现, MMP-2在整个孕期均存在, 但中孕水平渐降, MMP-9孕期含量甚微, 但分娩发动前, 羊水中含量急剧上升, 而其抑制物TIMP-2随孕龄增加反而降低。Vadillo等[5]研究发现发生PROM孕妇与足月分娩和早产孕妇相比, 胎膜组织和羊水内的MMP-2和MMP-9含量升高, 而TIMP-2降低, 与Riley的研究结果不同。

MMP可受到内源性抑制物、基质金属蛋白酶抑制剂TIMP家族的抑制。TIMP是MMP的天然活性抑制物, 研究已证实TIMP能抑制MMP的所有活性。已发现的TIMP有4种, 即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIPM主要在3个方面调节MMP的作用: (1) 酶原活化阶段:TIMP-2与MMP-1前体结合, 形成稳定复合物, 阻碍其自我激活; (2) 活化的MMP阶段:如TIMP-1和TIMP-2可直接与活化的MMP形成紧密的1:1复合体; (3) MMP降解阶段:TIMP对MMP降解有抑制作用。

TNF-α主要由革兰阴性细菌的内毒素刺激单核-巨噬细胞产生, 感染、创伤、缺血或者中毒均可刺激TNF-α表达。在正常的生理状态下, 组织的TNF-α表达很低。但巨噬细胞一旦激活, 组织中就分泌大量的TNF-α。

本研究发现, 胎膜组织中MMP-2表达升高, TIMP-2表达降低是PROM发生的重要原因, MMP-2通过大量降解胎膜中的胶原, 在胎膜早破发生、发展中起重要作用, TNF-α等炎性因子的释放与聚集会促进MMP的活性。

参考文献

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[2]Maymon E, Roero R, Pacora P, et al.A role for the 72KDa gelatinase (MMP-2) and its inhibitor (TIMP-2) in human parturition, premature rupture of membranes and intraamniotic infection[J].J Perinat Med, 2001, 29 (4) :308-316.

[3]Riley SC, Webb CJ, Leask R, et al.Involvement of matrix metalloproteinase 2 and 9, tissue inhibitor of metalloproteinases and apoptosis in tissue remodeling in the sheep placenta[J].J Reprod Fertil, 2000, 118 (1) :19-27.

[4]Fortunato SJ.Distinct molecular events suggest different pathway for preterm labor and premature rupture of membranes[J].Am J Obstet Gynecol, 2001, 184 (7) :1399-1400.

α糜蛋白酶 篇8

由α-醇溶蛋白基因序列推导的氨基酸一级结构有比较明显的特征:首先是由19/20个氨基酸残基组成的信号肽, 之后分别是N端重复区、多聚谷氨酰胺Ⅰ区、特征区Ⅰ、多聚谷氨酰胺Ⅱ区和特征区Ⅱ。不同基因的差异主要集中在重复区和多聚谷氨酰胺区。6个保守的半胱氨酸残基 (Cys) 分布于特征区, 两两之间形成分子内二硫键[4]。

密穗小麦 (Triticum compactum Host.) 为古老的六倍体 (AABBDD) 裸粒栽培种, 是普通小麦 (T.aestivum) 的一级基因源[5]。本研究利用特异性引物, 采用PCR克隆的方法对密穗小麦α-醇溶蛋白基因序列进行分析, 以期丰富α-醇溶蛋白基因信息, 同时也为深入了解密穗小麦醇溶蛋白基因的遗传变异和作用机理奠定基础。

一、材料和方法

1. 材料

供试材料为5份密穗小麦PI566594、PI269250、PI191874、PI159101和PI352302, 均由美国种质资源库 (GRIN) Dr.Bockelman惠赠, 分别来自美国、意大利、葡萄牙、南非和奥地利。

2. 方法

(1) DNA提取

植物总DNA的提取采用CTAB法[6]。

(2) PCR引物设计和扩增基因组DNA

根据已报道的α-醇溶蛋白基因序列设计引物:F1:GGTGGAATGATAG TGCA ACAA;F2GTCCGAGAATACACTTGTAAGTA;F3:CCACACAAGATTACGAA CTAAG;F4:AGGCAGTCTAGAATAGTGTTTG;R:GGATGTAGACAT TGCACATTG。PCR反应总体积为25μL, 其中含10×buffer 2.5μL, 1.5mmol/L Mg Cl2, 4种d NTP各100μmol/L, 引物各6pmol, 1U Taq plus DNA polymerase (高保真) , 100ng基因组DNA。PCR反应程序为:94℃预变性4min;然后94℃变性1min, 55℃退火1min, 72℃延伸1min30s, 共35个循环;最后72℃延伸10min。

(3) PCR产物回收纯化、T-载体克隆与阳性克隆筛选

PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上检测, 将目的片断回收纯化后连接到载体p MD18-T上, 并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。对白色菌落进行PCR扩增, 确认阳性克隆。

(4) 序列测定与比较分析

随机选取阳性克隆进行测序, 序列测定由商业公司完成。序列分析采用NCBI网站的blast (http://www.ncbi.nlm.nib gov/BLAST/) 程序, 以及DNAMAN5.2.2和MEGA3.0软件进行。

二、结果与分析

1. α-醇溶蛋白基因的分离

引物F1、F2、F3和F4分别与R组合 (分别用字母A、B、C、D表示) , 其PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 结果显示在1200bp左右有一条目的条带。将目的条带分别回收、纯化并连接到p MD18-T载体, 然后将连接产物转入感受态细胞。筛选阳性克隆测序, 共获得41条序列。经序列相似性搜索确认为α-醇溶蛋白基因片段, 包含了部分编码区序列及5′侧翼序列 (序列具体信息见表1) 。其中有25条序列具有提前终止密码子, 推测为假基因。

2. 氨基酸结构分析

分析比较的α-醇溶蛋白基因氨基酸序列 (图1) , 发现所有序列的编码区内均无内含子, 并具有α-醇溶蛋白基因的基本结构特征。首先是由19个氨基酸组成的信号肽, 之后分别是N端重复区、多聚谷氨酰胺Ⅰ区、特征区Ⅰ、多聚谷氨酰胺Ⅱ区和特征区Ⅱ, 不同基因的差异主要集中在重复区和多聚谷氨酰胺区。

(1) N-端重复区

α-醇溶蛋白的重复区可划分为若干重复短肽。本研究中重复区均有一致的重复单元PQPQPFP和PQQPY。此外, 还分离出重复单元LPYPQPQ, 在序列PI35202-9-B中重复出现3次 (见表2) , 并且在PI159101-3-B等序列中出现2次。

L:亮氨酸;P:脯氨酸;Y:酪氨酸;Q:谷氨酰胺

(2) 多聚谷氨酰胺区及微卫星结构

两个多聚谷氨酰胺区是所有α-醇溶蛋白一级结构的主要特征, 其中几乎全为谷氨酰胺残基。本研究中两个多聚谷氨酰胺区氨基酸残基差异较大, 区Ⅰ含有的氨基酸残基个数变幅为7~35个, 区Ⅱ的变幅为4~22个, 同时还出现了其它氨基酸残基, 如丙氨酸 (A) 、组氨酸 (H) 、赖氨酸 (K) 、谷氨酸 (E) 、脯氨酸 (P) 、精氨酸 (R) 、亮氨酸 (L) 等。这些非谷氨酰胺残基的出现, 主要是单个碱基替代的结果, 如:CAA到GAA、CAA到CAT的突变。根据其核苷酸序列还可以看出, 编码谷氨酰胺的两个密码子CAG和CAA以串联重复形式出现, 形成类似微卫星结构 (表3) 。

.代表缺失密码子, ◆代表半胱氨酸残基

三、讨论

本研究分离的41个α-醇溶蛋白基因之间存在一些差异, 主要表现在: (1) 单碱基替换导致多聚谷氨酰胺区出现非谷氨酰胺残基; (2) 重复区结构同Anderson等[7]的研究相似, 由两个基本的重复单元POPOPFP和POOPY组成, 部分序列还出现了LPYPQPQ单元。

Du Pont等[8]推测α-醇溶蛋白基因大约有50%是假基因。主要原因是α-醇溶蛋白基因中C到T的碱基转换频率很高[9]。α-醇溶蛋白基因序列中含有丰富的谷氨酰胺密码子CAA和CAG, C到T的转换很容易导致提前终止密码子的出现。本研究中, 密穗小麦41条α-醇溶蛋白基因序列中, 有25条序列中出现了提前终止密码子, 占总数的61%, 据此可推测其终止密码子可能是由此转换造成的突变。

绝大多数α-醇溶蛋白有六个保守的半胱氨酸残基, 分布在两个特征区, 它们之间形成分子内二硫键。极少数α-醇溶蛋白包括奇数个半胱氨酸残基, 可能形成分子间二硫键而后参与形成谷蛋白聚合物[7]。本研究得到的α-醇溶蛋白基因序列中有少数出现了奇数个半胱氨酸残基, 且序列PI269250-6-B、PI352302-5-C、PI566594-7-B中没有出现提前终止密码子, 其多余的半胱氨酸, 能形成分子间二硫键, 可能对面粉品质有重要作用。对于半胱氨酸残基与面粉品质之间的关系还需要进一步的研究。并且在本研究发现多聚谷氨酰胺区有位点的谷氨酰胺突变为赖氨酸, 提高了赖氨酸的含量, 如能利用醇溶蛋白的突变大多是单碱基变化这种特征来改变某些氨基酸, 就有可能提高醇溶蛋白的营养价值。

参考文献

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α糜蛋白酶 篇9

关键词：胃肿瘤,富含半胱氨酸61,低氧诱导因子-1α,免疫组织化学,蛋白免疫印迹法

胃癌是常见的消化道肿瘤,其发病率仅次于肺癌,居第2位,大约65%的患者确诊时已经出现局部或远处转移[1]。因此对于侵袭与转移机制的研究一直是胃癌研究的重要课题。目前认为肿瘤的侵袭转移过程涉及多分子作用机制和信号传导通路。近年来研究发现,富含半胱氨酸61(cysteine rich61,Cyr61)可通过PI3K/mTOR和MAPK依赖的信号通路促进低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducing factor-1α,HIF-1α)蛋白合成增加,而且可诱导HIF-1α的HRE(hypoxia response element,低氧反应元件)依赖的转录活性,使HIF-1α调控的侵袭相关基因纤溶酶原激活因子抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)表达上调,从而促进胃癌细胞的侵袭性[2],但目前国内外有关Cyr 61和HIF-1α与胃癌的研究鲜见报道。本研究应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同胃癌组织中Cyr 61和HIF-1α蛋白的表达,并分析其与临床病理参数之间的关系,旨在进一步明确两者与胃癌侵袭的关系,为胃癌的诊断和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 标本来源

取自青岛市市立医院普外科2008年10月~2009年12月手术切除的标本共49例,标本均经病理科两位以上的资深医师证实,术前均未接受任何化疗或放疗,且均进行了局部淋巴结的清扫。

49例标本分为3组,分别为原发性胃癌组,配对癌旁组(距离边缘2 cm)及配对的手术切缘正常组(距离边缘5 cm以上),将胃癌手术切除标本均分为两部分,一部分立刻固定10%的甲醛溶液中,包埋在石蜡中,以备病理检查用;一部分手术切除的标本立即放于-70℃冰箱中冻存用于Western blot检测。

1.2 主要试剂和仪器

RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司),Cyr61和HIF-1α兔多克隆抗体(武汉博士德公司)、β-actin兔多克隆抗体(武汉博士德公司)为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(武汉博士德公司)为第2抗体。

第2抗体试剂:EnVision试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司。染色剂:二氨基联苯胺四盐酸盐(Diamino benzidine,DAB)购于福州迈新。

1.3 实验方法和主要步骤

1.3.1 免疫组织化学检测胃癌组织中Cyr61和HIF-1α的表达

采用EnVision两步法。主要步骤如下:石蜡切片常规脱蜡水化后,浸于0.01 mol/L枸橼酸溶液(pH为6.0),微波中火4 min进行抗原修复。操作严格按说明书进行,取已知阳性切片作为阳性对照,用PBS液代替第一抗体试剂作为阴性对照。

1.3.2 Western blot法检测Cyr61和HIF-1α蛋白的表达

用RIPA裂解液裂解组织(400μl RI-PA+4μl PMSF)提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,取50μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳后的蛋白转移至PVDF膜,封闭液封闭(4℃过夜),分别用Cyr 61和HIF-1α兔多克隆抗体(1∶200)和β-actin兔多克隆抗体(1∶1 000)孵育,室温轻摇180 min后,再用TBS洗涤3次(10min/次)后,再分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶2 000)室温孵育120 min,TBS洗涤3次(15 min/次)后,最后X线片曝光、显影和定影后观察结果。

1.4 结果判断

1.4.1 免疫组织化学结果判断

CRY61阳性判断标准:以胞质呈棕黄色为阳性。免疫标志的阳性标准:无阳性细胞为阴性;阳性细胞<10%为弱阳性;阳性细胞10%~50%为阳性;阳性细胞≥50%为强阳性。HIF-1α参照ZHONG等[3]的方法,以细胞核或细胞质内呈棕黄色为阳性,高倍镜下(400倍)对每张切片随机选择5个视野,每个视野计数200个细胞,共计1 000个。0分:无着色;1分:<1%的细胞核着色;2分:1%~10%的细胞核着色和(或)胞质弱着色;3分:10%~50%的细胞核着色和(或)胞质明显着色;4分:>50%的细胞核着色和(或)胞质强着色。评分结果:0~1分定为阴性,2~4分定为阳性。

1.4.2 Western blot结果分析

应用BIO-RAD图像分析软件对Western blot杂交条带进行密度扫描,以Cyr61及HIF-1α条带灰度值与β-actin条带灰度值比值表示各组织中Cyr61及HIF-1α表达水平(灰度值为条带密度值及面积值的乘积,设空白对照相对密度值为0)。

1.5 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件,Cyr61蛋白及HIF-1α蛋白的表达以均数±标准差(x±s)表示。组间计量资料的比较采用t检验,计数资料的比较采用χ2检验。Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中表达的相关性用Spearman进行相关性检验分析。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 免疫组织化学方法检测Cyr61和HIF-1α的表达

2.1.1 Cyr61在各组中表达水平的比较

Cyr 61在各组中的表达情况见图1及表1。图1显示Cyr 61在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达。由表1可见,Cyr61在胃癌中表达的阳性率(91.8%),高于癌旁组(75.5%)和正常组(49%),差异有显著性(χ2=4.780,P<0.05;χ2=21.598,P<0.01);癌旁组与正常组比较差异有显著性(χ2=7.338,P<0.01)。

注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与正常组比较,P<0.01;3)与癌旁组比较,P<0.05

2.1.2 HIF-1α在各组中表达水平的比较

HIF-1α在各组中的表达情况见图2及表1。图2显示Cyr61在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达,由表1可见,HIF-1α在胃癌中表达的阳性率(83.17%),高于癌旁组(38.8%)和正常组(0%),差异有显著性(χ2=6.186,P<0.05;χ2=70.491,P<0.01),癌旁组的表达高于正常组(χ2=23.57,P<0.01)。

注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与癌旁组比较,P<0.01

2.2 Western blot检测各组Cyr61和HIF-1α蛋白的表达

2.2.1 Cyr61蛋白在各组表达的比较

Cyr61蛋白在胃癌组、癌旁组及正常组的表达量分别为(0.2767±0.02200)、(0.2145±0.02209)和(0.1055±0.02082)。统计学分析显示3组间比较,差异有显著性(F=785.8,P<0.01)。癌组织组的表达明显高于癌旁组和正常组(t=14.618;t=38.957,P<0.01),癌旁组的表达明显高于正常组(t=23.962,P<0.01)(图3和表2)。

2.2.2 HIF-1α蛋白表达的比较

HIF-1α蛋白在胃癌组、癌旁组及正常组的表达量分别为(0.2663±0.02682)、(0.2120±0.04087)和(0.1008±0.03867)。统计学分析显示3组间比较,差异有显著性(F=269.3,P<0.01)。癌组织组的表达明显高于癌旁组和正常组(t=7.772;t=24.619,P<0.01),癌旁组的表达明显高于正常组(t=13.837,P<0.01)(图3和表2)。

2.3 胃癌中Cyr61和HIF-1α的表达及其与胃癌临床病理参数的关系

对49例胃癌患者按照性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期进行分组,观察Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中的表达情况(表3)。由表3可见,Cyr61和HIF-1α蛋白的表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期密切相关,差异具有显著性(均P<0.05),与胃癌患者的性别、年龄及肿瘤大小无关,差异无显著性(P>0.05)。

2.4 胃癌组织中Cyr61和HIF-1α表达的相关性

Spearman相关性检验结果表明,在胃癌组织中,Cyr61蛋白表达与HIF-1α蛋白表达呈明显正相关(r=0.411,P<0.05)。

3 讨论

Cyr61是CCN(Cyr61/CTGF/NOV)蛋白家族成员之一。人类Cyr61基因定位于染色体Ip22.3,含有5个外显子和4个内含子,编码381个氨基酸的蛋白,其中38个为保守的半胱氨酸,Cyr61的相对分子量为42 kD。Cyr61由信号肽(signal peptide,SP)及4个保守结构域组成。Cyr61可调控内皮细胞和成纤维细胞的黏附、迁移与增殖,分泌细胞外基质、诱导血管生成,参与多种重要的生理、病理过程。在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥着不同作用。研究发现,在不同的组织细胞及肿瘤中,Cyr61的表达水平不同,其功能也不同。如Cyr61在神经胶质瘤、骨肉瘤中高表达,促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织血管形成[4,5]。而Cyr61在子宫内膜癌、子宫平滑肌瘤、前列腺癌中、非小细胞肺癌中低表达,起到类似抑癌基因的作用[4,5,6,7]。

目前有关Cyr61与胃癌的研究国内外罕见报道,均采用免疫组织化学方法检测,LIN等[7]用免疫组织化学方法对81例胃癌石蜡切片研究发现,Cyr61表达与胃癌肿瘤分期、淋巴结转移及组织学分型相关。在此基础上本研究联合Western blot技术检测了49例胃癌手术患者,发现Cyr61蛋白在胃癌组织中呈高表达,明显高于配对癌旁组织及配对的正常组织,差异有显著性。同时分析Cyr61与临床病理参数的关系发现,Cyr61蛋白的表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移及TNM分期呈正相关。提示Cyr61可用于胃癌的检测及作为胃癌侵袭转移的判断指标。

低氧诱导因子-1是由HIF-1α及HIF-1β亚单位构成的异二聚体[8]。HIF-1α是其活性调节亚单位;HIF-1β在常氧和缺氧条件下均可表达,而HIF-1α在氧浓度正常时,其表达量维持在较低水平。在常氧条件下,88%的正常人体组织中不表达HIF-1α,而53%的恶性肿瘤组织中表达HIF-1α,在相应的良性肿瘤中没有检测到HIF-1α[9]。当周围环境的氧浓度下降时HIF-1α的转录、翻译水平呈指数增加,但主要是蛋白水平的表达改变[10]。ZHONG等[9]利用HIF-1α单克隆抗体检测了HIF-1α在多种肿瘤组织中的表达,发现90%的结肠癌、肺癌及前列腺癌组织中HIF-1α表达升高,而在肿瘤附近正常组织中则不表达。关于HIF-1α在胃癌组织中表达的研究报道甚少:TAKAHASHI等[11]研究发现HIF-1α与胃癌肿瘤大小及肝转移密切相关;CHEN等[12]研究发现HIF-1α的高表达与胃癌的复发及远处转移密切相关。

本研究采用免疫组织化学和Western blot技术检测了HIF-1α蛋白水平的表达,发现HIF-1α蛋白在胃癌组织中的表达高于配对癌旁组织及配对的正常组织,癌旁组织高于正常组织,差异均有显著性。同时分析HIF-1α与临床病理参数的关系发现,HIF-1α蛋白的表达与胃癌TNM分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移、细胞分化程度显著相关,而与患者年龄、性别、原发肿瘤大小无关。韩冰等[13]对96例胃癌患者研究发现,HIF-1α表达阳性的患者总生存率明显低于表达阴性的患者,提示HIF-1α在胃癌患者的预后中起着重要作用。本研究显示HIF-1α的表达与胃癌的进展、浸润、转移等恶性生物学行为密切相关。HIF-1α可作为评估胃癌发展、转移及预后的参考指标。