TIMP

TIMP（共7篇）

TIMP 篇1

糖尿病肾病是糖尿病最常见、最严重的慢性微血管并发症之一, 是引发终末期肾病并威胁糖尿病患者生命的主要原因, 其病理改变主要为肾脏肥大, 肾小管及肾小球基底膜增厚, 系膜细胞增生, 细胞外基质积聚致系膜区扩张, 最终导致弥漫性或结节性肾小球硬化及肾小管间质纤维化[1~9]。细胞外基质的堆积是导致肾小球硬化、肾间质纤维化的重要病理生理因素, 细胞外基质在生理状态下处于一种快速更新代谢的动态平衡中, 产生增多和 (或) 降解减少引起细胞外基质堆积。其中基质金属蛋白酶 (MMPs) 在细胞外基质的降解中发挥重要作用, MMPs能降解肾小球细胞外基质中胶原和非胶原成分, 占细胞外基质降解酶总活性的70%以上。基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 是MMPs中降解Ⅳ型胶原的最主要酶之一, 在生理p H值下, MMP-9在细胞外基质的降解过程中起主要作用。MMP-9与组织金属蛋白酶抑制物 (TIMP-1) 特异性结合, 保持降解与重建动态平衡, MMP-9及TIMP-1在糖尿病肾病发生、发展中起重要的作用。

1 MMPs与TIMPs系统的生物学特征

MMPs有20种, 按照底物分为5类: (1) 间质胶原酶:MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18; (2) 明胶酶:MMP-2、MMP-9; (3) 基质溶解素:MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11、MMP-12; (4) 膜型MMPs:MMIP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17; (5) 其他MMPs:MMP-19。其分子结构分为N末端信号肽, 催化区域, 酶原肽, 和C末端结合区域4个区域。MMPs均已无活性的潜酶形式存在, MMPs成员中间质胶原酶和基质分解素被活化的纤溶酶活化, 活化的MMPs以瀑布效应激活MMPs其他成员使其活化或超活化。TIMPs是一组多基因家族的编码蛋白, 是MMPs的特异性抑制因子。现已发现TIMPs有4种, 分别是TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMPs还有调控细胞增殖与细胞凋亡等生理功能。TIMPs有两个功能区是结合潜酶的羧基端和酶的有效活性部位。以1∶1的比例以非共价键形式结合活化的MMPs, 抑制其对细胞外基质的降解, 也可与酶原结合, 阻止其活化, 是一种转录后调节机制。现已证实4种TIMP均能在多种肾脏疾病中表达, 其中TIMP-1、TIMP-2是参与细胞外基质积聚和降解关键的酶, 而TIMP-1对MMP-9有较高特异性抑制作用。

2 MMP-9与TIMP-1的功能

MMP-9是降解Ⅳ型胶原的最主要酶之一, 主要降解明胶、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原及弹性蛋白等, 能降解完整的基底膜, 是MMPs家族的主要成员之一, 它在多种肾脏疾病的发病过程中, 发挥着重要的作用。在肾小球系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞、肾小球囊壁层上皮细胞、浸润的巨噬细胞和中性粒细胞等均能不同程度地表达MMP-9。特异性TIMP-1与活化的MMP-9以1∶1非共价结合形成MMP-TIMP复合体, 阻断MMP-9与底物结合, 抑制MMP-9活性, 也可与MMP-9酶原形式结合阻止其活化。两者共同参与细胞外基质的降解过程。

3 TIMP-1、MMP-9与糖尿病肾病

3.1 糖尿病肾病时MMP-9的活性变化

郭清华等[10]对30例2型糖尿病患者血浆MMP-9浓度追踪观察48个月, 发现8例在出现微量尿白蛋白之前血MMP-9已显著升高;ACEI类药物干预后, 尿微量白蛋白降至正常, 同时MMP-9亦显著下降, 故推测MMP-9在糖尿病肾病的发生发展中起一定作用。王秀芬等[11]实验结果证实糖尿病组MMP-9表达较正常对照组明显减弱, MMP-9蛋白表达、活性与Ⅳ型胶原、层粘连蛋白呈负相关, 提示MMP-9在糖尿病肾病早期就开始下降, 并且与病程进展相关。Mclenan等[12]在16只大鼠腹腔注射链脉佐菌素诱导成糖尿病大鼠模型, 另选8只年龄与体重匹配的正常大鼠作为对照, 相比同龄正常大鼠, 注射链脉佐菌素6个月后的糖尿病大鼠肾组织MMP-9酶活性及mRNA表达分别下降51%和21%。李晓玲等[13]通过测定2型糖尿病和正常对照者血清MMP-9, TIMP-1, Ⅳ型胶原水平, 结果显示这3项指标与正常对照者具有显著差异, 且血清TIMP-1和Ⅳ型胶原水平随糖尿病严重程度而明显升高, MMP-9呈降低趋势。再次提示TIMP-1、MMP-9可能参与糖尿病肾病的形成。因此糖尿病大鼠随着糖尿病的发展, 肾局部MMP-9蛋白质表达水平明显下降, TIMP-1明显上升, 提示MMP-9与TIMP-1活性改变和异常表达, 促进了糖尿病肾病发生发展[14、15]。

3.2 糖尿病肾病时TIMP-1、MMP-9发生异常的机制

3.2.1 高血糖的作用

长期高血糖状态, 肾组织的一些局部激素或细胞因子的表达异常导致肾小球系膜基质积聚增加及基质增厚。高血糖可直接改变MMPs和组织抑制因子系统活性, 导致基质合成和分解失衡而引起糖尿病肾病, 有研究显示:MMP-9在高糖环境下, 其表达降低而非升高, 体外实验:Bai Y等[16]通过明胶酶谱法研究发现肾小球足细胞在高糖培养基中培育2~3d, 其MMP-9活性显著升高, 而培育>5d, 其MMP-9活性则下降;高血糖可介导多种细胞因子, 如转移生长因子 (TGF-B1) , 刺激细胞外基质多种成分的形成, 抑制MMPs的合成过程及活性, 使组织抑制因子-2表达增加[17]。

3.2.2 蛋白质非酶促糖基化作用

糖基化终末产物是过量的糖没有酶参与的条件下和蛋白质结合的产物。Ⅳ型胶原富含赖氨酸和羟赖氨酸, 生物半衰期很长, 长期高糖环境使之发生非酶促糖基化, 糖化后的胶原分子结构发生改变, 形成共价交联[18], 可影响MMPs的表达和活性, 同时糖化后的胶原对MMPs的表达不敏感, 不能被MMPs降解, 导致胶原在病变的肾组织中积聚。基质糖基化也会降低MMPs的总体水平。通过糖基化终末产物与人或鼠肾基质细胞共同培养发现Ⅳ型胶原、TIMP-1、mRNA表达及蛋白产物增加, 而MMP-9水平则相应降低, 从而导致基底膜增厚[19]。基质糖基化使系膜细胞的功能发生改变, 打破了系膜基质合成与降解之间的平衡, 导致糖尿病肾病特征性的病理变化—系膜扩张[19]。

3.2.3 细胞因子作用

目前认为一些局部或循环中的生长因子参与糖尿病肾病发生、发展过程, 包括TGF-B1、IGF-1、IL-1和肾素—血管紧张素—醛固酮系统等。TGF-B1被认为是MMPs/TIMPs系统最重要的调控因子。大多数研究证实糖尿病肾病时, 肾脏中TGF-B1的表达及活性明显增加, 这些增加的TGF-B1一方面可刺激基质成分如纤维连接素、胶原及蛋白多糖的合成增加, 另一方面通过抑制Ⅳ型胶原酶的基因表达, 使其mRNA翻译延迟, 酶活性降低及上调TIMP-2表达等一系列过程使基质降解减少, 导致细胞外基质堆积[20]。血管紧张素Ⅱ通过与血管紧张素Ⅱ受体1型 (AT1) 结合不仅能直接抑制系膜细胞中Ⅳ型胶原酶的活性, 降低其降解基质的能力, 而且还可使TGF-B1的分泌量增加, 介导上述效应[6、17]。

4 中药与MMP-9的关系

本研究表明, 肾康饮可升高MMP-9的水平, 降低TMIP-1的水平, 这可能是通过调节机体内环境, 参与了MMPs/TIMPs系统的激活, 使得MMP-9的含量增高, 活性增强, 而且能够降低TIMP-1的水平, 减少对MMP-9的抑制, 以利于细胞外基质的降解, 从而起到防止糖尿病肾病的作用[14]。大黄酸可抑制E-cadherin表达的减少及a-SMA表达的增加, 即抑制TEMT的进展, 同时发现MMP-9与TIMP-1的表达均随病程延长进行性上升, MMP-9及TIMP-1表达的升高不平衡, MMP-9/TIMP-1比值下降[4]。贞清方对2型糖尿病大鼠有降低尿微量白蛋白排泄率、肌酐清除率以及明显改善糖尿病肾病肾脏病理改变的治疗作用, 其作用途径可能通过调节MMP-9/TIMP-1表达水平平衡, 抑制细胞外基质堆积有关[5]。

5 总结

到目前, 糖尿病肾病的发病机制尚不完全清楚, 可能是多种因素综合作用的结果, 现已通过实验证明MMP-9/TIMP-1在保持细胞外基质合成与降解之间的平衡中起重要作用, 可维护肾小球基膜的完整性, 实验也证实中医早期干预治疗糖尿病肾病的疗效, 为开发新药物提供了理论和实验依据。MMP-9、TIMP-1对糖尿病肾病发生、发展中的作用及中药的干预措施, 越来越受到国内外的重视。

TIMP 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取佳木斯大学附属第一医院呼吸内科2013-12~2014-08就诊的支气管哮喘患者60例, 按疾病程度分为:急性发作期组31例, 其中男15例, 女16例, 年龄28~69岁, 平均 (49.52±9.85) 岁, 临床缓解期组29例, 其中男15例, 女14例, 年龄33~66岁, 平均 (48.25±9.31) 岁, 及健康对照组40例, 男20例, 女20例, 平均 (48.37±8.24) 岁。所有病例均除外肺结核、肺气肿、慢性支气管炎、以及冠心病、心肌病等, 各组在年龄、性别等方面差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理

所有实验对象均于清晨空腹抽取肘静脉血4m L, 室温下静置30min, 以3000r/min, 离心30min后取上清液, 存于EP管密封, 置于-20℃冰箱中储存备测。

1.2.2 检测方法

采用酶联免疫吸附法 (ELISA) 分别检测实验组和对照组的TIMP-1浓度, 具体操作步骤严格按试剂说明书进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计学处理, 计量资料以均数±标准差表示, 两组间均数的比较采用t检验, 多组均数的对比, 采用方差分析, 组间的多重比较采用LSD-t检验, 以P<0.05为差异用统计学意义。

2 结果

哮喘组血清TIMP-1含量明显高于正常对照组 (114.89±41.38) ng/m L, 差异有显著统计学差异 (P<0.01) ;实验组比较:哮喘急性发作期患者血清TIMP-1水平高于临床缓解期, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

注:与对照组比较, △P<0.01, (t1=23.042、t2=21.146) , 与临床缓解期组比较, □P<0.05。

3 讨论

支气管哮喘 (哮喘) 是呼吸系统常见疾病之一, 资料显示我国目前约有3000万人罹患哮喘, 全球约有3亿的哮喘患者。目前认为气道炎症是哮喘发生的基本病变, 哮喘系多种细胞如:肥大细胞、中性粒细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞、气道上皮细胞以及细胞因子等参与的气道高反应性疾病[3], 以反复发作性咳嗽、喘息、胸闷、呼吸困难为典型症状以及广泛的可逆性气流受限为主要特征, 常伴气道高反应性[4]。目前认为, 细胞外基质 (ECM) 的降解和沉积失衡是导致气道壁结果异常构建、肺实质破坏及间质增生的重要原因。基质金属是蛋白酶抑制物 (TIMP) 是一类对基质金属蛋白酶 (MMP) 活性进行抑制的大分子蛋白质, 目前研究TIMP包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3, TIMP-1系有184个氨基酸的蛋白质。研究发现, TIMP-1与参与多种疾病的发生, 如:肝炎、骨关节炎、肺癌、直肠癌、急性心肌梗死、心力衰竭等。TIMP-1特异性抑制金属蛋白酶 (MMP-9) , TIMP-1、MMP-9共同作用于呼吸道的细胞外基质和底模, 调节细胞外基质合成和降解[5]。基质金属蛋白酶 (MMPs) 是调节ECM代谢的关键酶, 具有促进ECM降解的作用, 而TIMP-1是MMPs的特异性抑制剂, 使ECM沉积增多, 参与气道重构[6]。本实验显示哮喘急性发作期患者血清TIMP-1水平为 (133.04±48.19) mg/m L, 临床缓解期血清TIMP-1水平为 (96.74±34.56) mg/m L, 健康对照组血清TIMP-1水平为 (79.11±38.05) mg/m L, 通过实验数据看出哮喘急性发作期患者血清TIMP-1水平显著高于临床缓解期血清TIMP-1水平, 而临床缓解期血清TIMP-1水平也高于健康对照组, 经治疗后的临床缓解期其体内TIMP-1水平仍高于对照组, 通过实验数据提示TIMP-1参与了支气管哮喘的发病过程, 这与国外文献报道一致[7]。TIMP-1有望成为诊断哮喘发生的血清学指标, 尤其对于少数不典型哮喘发作者, TIMP-1可能有助于诊断的确立, 但TIMP-1广泛存在于其他组织器官中, 其特异性不高, 且哮喘者气道重构系多细胞因子参与, 目前认为TIMP-1抑制MMPs, 从而促进气道重构, 但其中机制目前仍有待于进一步探讨。

参考文献

[1]Culpitt#space2;#SV, Rogers#space2;#DF, Traves#space2;#SL, et#space2;#al.Sputum#space2;#matrix#space2;#metalloproteases#space2;#comparison#space2;#between#space2;#chronic#space2;#obstructive#space2;#pulmonary#space2;#disease#space2;#and#space2;#asthma[J].Respir#space2;#Med, 2005, 99 (6) :703

[2]Ostanin#space2;#AA, Petrovskii#space2;#YL, Shevela#space2;#EY, et#space2;#al.Multi-plex#space2;#analysis#space2;#of#space2;#cytokines#space2;#chemokines#space2;#growth#space2;#factors#space2;#MMP-9#space2;#and#space2;#TIMP-1#space2;#produced#space2;#by#space2;#human#space2;#bone#space2;#marrow#space2;#adipose#space2;#tissue#space2;#and#space2;#placental#space2;#mesenchymal#space2;#stromal#space2;#cells[J].Bull#space2;#Exp#space2;#Biol#space2;#Med, 2011, 151 (1) :133-141

[3]石纶.支气管哮喘治疗新进展[J].继续医学教育, 2014, 28 (3) :40-42

[4]孟庆云, 吴祥红, 顾镜月.儿童哮喘发作与肺炎衣原体感染的关系[J].黑龙江医药科学, 2011, 34 (4) :51

[5]黄金元, 林腊梅, 魏圣青, 等.血清基质金属蛋白酶9及其组织抑制剂1与慢性阻塞性肺疾病的关系[J].湖北中医杂志, 2014, 36 (4) :80-89

[6]潘春香, 曹亚芹, 罗昌明, 等.哮喘患者血清MMP-9及TIMP-1的变化及意义[J].江苏医药, 2010, 36 (5) :534-535

TIMP 篇3

浸润和转移是恶性肿瘤的重要特征,是肿瘤细胞、宿主细胞及细胞外基质之间一系列复杂、多步骤相互作用的结果。首先,具有转移潜能的肿瘤细胞从肿瘤母体脱离,通过释放蛋白水解酶降解细胞外基质和基底膜,侵袭到周围组织并进入血管和淋巴管,随循环到达远处。然后,穿出管壁再次进入组织中,继续增殖形成转移灶。在这一过程中包含着多次细胞外基质及基底膜的降解。己经证明,肿瘤细胞侵袭转移的能力与其产生或诱导产生降解细胞外基质的蛋白酶的能力密切相关。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,M M Ps)是一组重要的细胞外基质降解酶,可通过对细胞外基质的降解促进肿瘤细胞对周围组织的侵袭,而由宿主细胞或肿瘤细胞本身所产生的金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metolloproteinases,TIM Ps),能抑制其水解活性,从而对肿瘤的侵袭转移起抑制作用。在MMPs中,目前研究最热的是MMP-2,因为其能有效地降解Ⅳ、V型胶原及层粘连蛋白成分,在肿瘤的浸润转移中起着重要的作用,但是它的活性却受到其组织抑制物TIMP-2的影响。

1 MMPs的一般特性

机体中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)不是一成不变的,而是处于一种时刻生成与降解的动态平衡中,许多酶可以降解ECM中的胶原成分,有关降解ECM的蛋白酶可分为六类,其中MMPs是一组降解ECM的最重要的蛋白酶[1]。这是因为:(1)MMPs直接以酶原的形式分泌到ECM中,并在正常生理条件下发挥作用。(2)MMPs的表达及活性均受到严格调控,且在ECM重组的部位易于诱导表达。(3)MMPs中的一些酶是迄今为止已发现的唯一能分解纤维类胶原的酶。MMPs是一组含Zn2+的、能够降解细胞外间质的蛋白酶,通常在中性条件下发挥活性;一般情况下,MMPs以酶原形式存在,而在特定的情况下,MMPs既可被体内存在的天然激活剂激活,也可以在体外被特定的化学物质所激活发挥水解效应;相反,机体内也存在许多抑制剂,可抑制MMPs的活性[2]。MMPs有一套严格的调控体系,在基质的许多重要部位直接表达,并且也是机体中惟一能分解纤维素类胶原的蛋白酶类。它们可以清除胶原分子、明胶分子等一些生物大分子,可以降解胶原蛋白以及蛋白多糖,为新细胞的生长提供空间。

2 MMPs在肿瘤发生和发展中的作用

MMPs在癌症的侵袭、生长、转移等生物学行为中起着至关重要的作用。其导致癌细胞增长及扩散的作用可分为以下3个过程[3](1)发病—MMPs分解健康组织的基质结构使肿瘤增生。(2)转移—MMPs使组织结构松弛,以便癌细胞转移。组织的自我分解也促使MMPs释放,从而引起进一步的肿瘤增生。(3)血管生成—在胞外基质降解的同时,MMPs有助于为新的血管生长提供空间。

肿瘤发生的细胞生物学特征有六个:(1)自我生长刺激;(2)生长抑制消失;(3)凋亡逃逸;(4)无限增殖;(5)持续的血管生成;(6)组织浸润与转移[4]。以前认为,MMPs只与肿瘤浸润和转移有关,然而近年研究证实MMPs在肿瘤发展的每个阶段都具有重要作用。

2.1 MMPS与肿瘤生长

间质细胞和肿瘤细胞分泌的MMPs不仅使ECM降解,还引起ECM中游离的生长因子的释放,以及肿瘤和间质细胞表面的潜在促细胞分裂剂(丝裂原因子)的脱落和释放。MMPs通过提供生物活性因子,能促使肿瘤的生长和进展,而且这些因子还可以上调MMPs的表达。MMPs对生长信号的调节是通过以下三条途径实现的。第一,MMPs或ADMS(解整合素)能够水解释放结合于细胞膜上的某些生长因子前体,如TGF-a[5];第二,MMPs通过降解ECM蛋白,而使包埋其中的多肽生长因子暴露并发挥活性;第三,通过影响ECM重构,MMPs还可间接调节整合素介导的增殖信号跨膜转导[6]。

2.2 MMPs与肿瘤的浸润和转移

大量研究表明,基质金属蛋白酶主要通过以下途径促进肿瘤的侵袭和转移:(1)降解细胞外基质:细胞外基质特别是基底膜是肿瘤浸润转移过程中必须克服的生理屏障,MMPs可以降解绝大多数ECM的成分。(2)调节细胞粘附:细胞粘附因子在肿瘤侵袭中起着重要的作用。研究证实许多肿瘤存在着细胞粘附因子(如E-cadherin和连环蛋白)的丢失和(或)重新分布,MMPs可以调节细胞间粘附力,有利于肿瘤细胞在血管内聚集及迁移出血管形成转移灶。(3)促进新生血管形成:在血管形成与肿瘤浸润转移过程中,血管内皮细胞与肿瘤细胞均能分泌蛋白水解酶降解ECM,在血管生成中有重要作用。MMPs可能从6个方面促进毛细血管形成:a、降解ECM直接促进毛细血管内皮细胞侵入;b、通过改变ECM刺激内皮细胞增殖和对抗细胞凋亡;c、通过释放与ECM有关的生长因子活化内皮细胞;d、活化血管源性细胞表面受体;e、增强作为辅助因子的血管源性信号系统;f、聚集骨髓干细胞。(4)影响免疫功能:原位杂交技术(insitu hybridization)证实,肿瘤细胞表达的MMPs主要由肿瘤间质细胞和炎症细胞产生,巨噬细胞更是经常出现在有侵袭的恶性肿瘤中。IL-2激活的NK细胞(A-NK细胞)可识别并杀伤肿瘤细胞,并能渗出血管到肿瘤内部与肿瘤细胞直接接触。有研究发现A-NK细胞能产生MMPs,后者通过水解诱导炎性细胞浸润的信号分子和(或)细胞因子而参与肿瘤细胞的免疫逃避过程。(5)调节肿瘤细胞凋亡:凋亡逃逸使肿瘤在不利情况下得以继续生存和生长,MMPs具有促凋亡和抗凋亡的双重作用。MMP-3,MMP-7,MMP-11均有调节细胞凋亡的功能。MMP-3通过降解层粘连蛋白(LN)诱导细胞凋亡。MMP-7通过降解细胞膜上的FASL(Fas跨膜刺激剂)使其从细胞膜上释放,诱导邻近细胞凋亡或抑制肿瘤细胞凋亡,MMP-11的高表达使肿瘤细胞的自发性凋亡明显减少。

3 TIMPs的一般特性

TIMPs是一种分泌蛋白,目前已发现有4种不同的TIMPs(TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3和TIMP-4)[7],每种TIMP可以分别与几种不同的MMPs结合。TIMP-2与MMP-2有很强的亲和力,主要抑制MMP-2活性,对MMP家族其他成员的活性也有抑制们用,能阻断所有被激活的MMP的水解酶活性[8],TIMP-2多随MMP-2的表达而表达,很少受细胞因子的诱导。在正常组织中,TIMP-2和MMP-2相互作用又保持动态平衡。MMP-2/TIMP-2比例失调可导致ECM及BM降解,是肿瘤侵袭和转移的关键步骤之一。

4 TIMPs在肿瘤发生和发展中的作用

4.1 TIMPS对MMPS的抑制作用

TIMPs对由MMPs产生的基质降解起着重要的平衡作用,通常情况下,组织中MMPs与TIMPs之间保持着相对动态平衡,二者之间的相对水平决定着细胞基质是降解还是聚集。在侵袭性肿瘤组织中,存在MMPs的高表达和TIMPs的低表达,正是由于这两者之间的平衡紊乱,才导致了肿瘤的侵袭和转移。TIMPs主要通过两个方面调节MMPs的作用:(1)酶原活化阶段:如TIMP-2与pro-MMP-1可形成稳定的复合物而阻碍pro-MMP-1酶原的自我激活;(2)活化的MMPs阶段:如TIMP-1和TIMP-2可直接与活化的MMPs结合而抑制MMPs的催化活性。

TIMP-2与大肠癌淋巴转移、病理分期呈负相关,提示其有抑制肿瘤细胞的侵袭和转移的能力。而MMP-2与TIMP-2的表达呈负相关,说明MMP-2与TIMP-2之间的平衡在肿瘤的侵袭和转移中起着重要作用,MMP-2/TIMP-2比例失衡在肿瘤转移过程中可能较单纯的MMP或TIMP的变化意义更大[9]。由于机体MMP与TIMP的平衡打破,MMP增高,无足够的TIMP去抑制MMP活性,则M M P活性被激活,降解细胞外基质促使瘤细胞突破基底膜而向外扩散甚至通过血液及淋巴造成远处转移,也就证明MMP和TIMP与肿瘤的侵袭和转移有关。金属蛋白酶抑制基因的研究,为肿瘤的基因治疗提供了新途径。设想如通过转染TIMP-2基因做基因治疗,有可能增强大肠癌组织中TIMP-2蛋白的表达及其对MMP-2的分泌和活性的抑制作用,为基因治疗大肠癌提供参考依据,从而抑制肿瘤侵袭与转移,改善预后[10]。

参考文献

[1]Ohtake Y,Tojo H,Seiki M.Multifunctional roles of MTI-MMP in myofiber formation and morphostatic maintenance of skeletal muscle[J].Cell Sci,2006,119(18):3822-3832.

[2]Kim HS,Kim HJ,Park KG,etal.Alphalipoic acid inhibits matrix metalloproteinase-9expression by inhibiting NF-kappaB transcriptional activity[J].Exp Mol Med,2007,39(1):106-113.

[3]Herszenyi L,Hritz I,Pregun I,etal.Alterations of glutathione S-transferase and matrix metalloproteinase-9expressions are early events in esophageal carcinogenesis[J].World Gastroenterol,2007,13(5):676-682.

[4]Hanahan D,Weinberg RA.The hallmarks of cancer cell[J].Science2000,100:57-70.

[5]Peschon JJ.An essential role for ectodomain shedding in mammalian development[J].Science,1998,282:1281-1284

[6]Agrez M,Chen A,Cone R I,etal.The integrinpromotes proliferation of colon carcinoma cells through a unique region of the cytoplasmic domain[J].Cell Biol,1994,127:547-556.

[7]Gomez DE,Alonso DF,Yoshiji H,etal.Tissue inhibitors of metalloproteinases:structure,regulation and biological functions[J].Eur Cell Biol,1997,74:111-122.

[8]Wojtowicz-Praga SM,Dickson RB,Hawkins MJ.Matrix metalloproteinase inhibitors[J].Invest New Drugs,1997,15:61-75.

[9]Davidson B,Gwant-Horwitz V,Lazarovici P,eta1.Matrix metalloproteinases(MMPs),EMMPRIN(extracellular matrix mettalloproteinase induces)and mitogen-activated protein kinases(MAPK):co-expression in metastatic serous ovarian carcinoma[J].Clin Exp Metastasis,2003,20(7):621-631.

TIMP 篇4

关键词：基质金属蛋白酶-9,金属蛋白酶组织抑制剂-1,川崎病,发病机制

川崎病(Kawasaki Disease,KD)于1967年由日本川崎富首先报告,曾称皮肤黏膜淋巴结综合征,是一种主要累及冠状动脉的以全身性中、小血管炎为主要病变的急性发热出疹性小儿疾病。本病成一定的流行性及地方性,是一种自限性疾病,大多数患儿预后良好,由于可以发生严重的心血管并发症,未经治疗的患儿发生率达20%~25%,引起人们的重视。北京<5岁儿童发病率由1955年18/10万升高到2009年87/10万,已成为我国儿科住院的常见病之一[1]。KD被人们认识50多年来,其病因和发病机制得到了广泛的研究,病毒和细菌的感染、自身免疫因素、遗传因素等均参与川崎病的发病[2]。在发达国家,KD已经成为儿童获得性心脏病的最常见原因[3],报告显示其很快会取代风湿热成为发展中国家最常见的儿童获得性心脏病[4]。

基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是基质金属蛋白酶家族中的一员,以无活性酶原形式分泌、储存在细胞外基质(ECM),在刺激因素的作用下经一系列蛋白酶级联而激活,其活性主要被蛋白酶清除剂抑制。金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)是TIMP中活性最强的蛋白酶,可抑制MMP-9的活性。MMP-9与TIMP-1共同参与机体重要的生理功能如参与胚胎的发育、创面的愈合、血管的形成等过程[5],亦参与多种疾病的病理过程,如炎症反应、慢性阻塞性肺疾病、肿瘤细胞转移和动脉粥样硬化等[6,7,8,9]。因MMP-9和TIMP-1的生物学功能广泛而重要,在生命学科领域里已经受到广泛的关注,同时在众多疾病的发病机制中起着重要作用,所以研究其功能及其在发病机制中的作用,对治疗肿瘤等疾病及评估疾病预后具有重要作用。研究表明,MMP-9/TIMP-1在KD及其冠状动脉病变的发病机制中扮演重要角色[10]。此外,MMP-9和TIMP-1基因多态与对KD发病机制的研究也逐步深入。因此,研究其在KD及其并发症中的发病机制对预防及治疗KD有积极作用。

1 MMP-9/TIMP-1的概述

基质金属蛋白酶(matirx metalloproteinases,MMPs)是一类锌钙离子依赖性的中性蛋白水解酶家族,介导细胞外基质的降解和组织重塑,参与人体的许多病理和生理过程。按其作用底物的不同,主要分为以下几类:胶原酶(collagenases):包括MMP-1、MMP-8、MMP-13;明胶酶(gelatinases):包括MMP-2、MMP-9;基质溶素(stromelysins):包括MMP-3、MMP-10、MMP-11;膜型金属基质蛋白酶(memberane-type MMPs,MT-MMPs):包括MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17;其他:包括MMP-7、MMP-12、MMP-23、MMP-19。MMP-9又称明胶酶B,是已发现的MMPs中分子量最大的酶,分子量大约92 KD,其基因定位于人16号染色体,前体可由中性粒细胞、单核细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞分泌,几乎可以降解细胞外基质的所有蛋白成分,主要参与多种炎症反应且与血管病变有密切关系。包浆合成的MMP-9以酶原形式分泌到ECM,通过胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶、其他MMPS等作用,水解掉前态结构域,酶原中心暴露而被激活[11]。

金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)是一个低分子质量蛋白质家族,由MMPs细胞同时分泌,是MMPs的天然抑制剂。迄今为止发现有4种TIMP,分别是TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP不仅对维持细胞外基质的正常生理功能有重要作用,而且与细胞的生长、发育和分化及刺激血管生成等生理或病理过程关系密切[12]。TIMP-1是其中活性最强的,它主要由巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞合成,并以可溶性的形式分泌到ECM中。TIMP-1在酶原活化阶段通过与MMPs形成稳定复合物来阻碍MMPs的自我激活,或者在活化阶段可以直接与活化的MMPs形成1∶1复合体来抑制其活性[13]。

2 MMP-9/TIMP-1的生物学作用

MMP-9与TIMP-1共同参与机体的多种重要生理功能和多种疾病的发病机制,因此研究其功能及作用,可以为疾病的预防和治疗提供理论依据。正常生理状态下,MMP-9和TIMP-1协同作用,保持动态平衡,在组织重建、血管生成、伤口愈合等过程中发挥着重要作用,一旦这种平衡被打破,则可导致各种疾病发生,如炎症过程中炎性细胞的浸润、肿瘤细胞的侵袭和转移、动脉粥样硬化的形成发展等。

2.1参与炎症过程中炎性细胞的浸润炎症反应过程中,炎性细胞如中心粒细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞等的迁移和外渗到局部组织中离不开MMP-9和TIMP-1的参与,MMP-9对组织的破环和重建起着非常重要的作用。MMP-9/TIMP-1平衡失调,而过表达的MMP-9有特异的胶原酶和弹性蛋白酶活性,可降解血管内皮细胞,有助于炎性细胞向血管壁深层移动,参与炎症过程中炎症细胞的浸润[14]。MMP-9通过一系列细胞因子介导的机制调节白细胞的功能,将IL-1β和IL-8、转变为有活性的形式,IL-1β和IL-8又可促进MMP-9从中性粒细胞中脱颗粒[15]。大量的研究发现,MMP-9的过表达与炎症初期释放的某些炎性介质比如TNF-α、IL-6成正相关。目前笔者已经明确MMP-9表达的增加与许多炎性疾病的病理状态有关,如心肌梗死、类风湿性关节炎、肝脏纤维化、牙周炎。Kalela等[16]研究发现MMP-9与白细胞计数呈显著正相关,血清MMP-9可以作为有价值的炎性反应标志物。

2.2参与肿瘤细胞的侵袭和转移MMP-9与肿瘤的关系是近年来研究的重点,被认为是肿瘤侵袭和转移的一个重要分子标记物。肿瘤细胞在侵袭过程中必须克服ECM中的基底膜,通过与基底膜受体结合后分泌MMP-9等降解酶降解基底膜和基质。MMP-9还可能通过调节肿瘤细胞与宿主细胞之间的粘附,影响肿瘤组织内血管的生成,激活具有抑制肿瘤细胞转移的蛋白等参与肿瘤的侵袭和转移。现已证明,MMP-9与膀胱癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌、舌鳞状细胞癌等各种肿瘤息息相关,已经成为上述癌症的一种主要癌症生物标记。魏莉等[17]在研究MMP-9与肺癌的关系时还发现,MMP-9不仅在肺癌患者中高表达,而且临床分期越高、肿瘤侵袭性越强,其水平也越高。抑制MMP-9的表达,可能会抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,所以研究其与肿瘤的关系对未来肿瘤的治疗、预防肿瘤的转移有非常重要的意义。TIMP-1与肿瘤也有着密切的关系,研究发现,高浓度的TIMP-1与卵巢癌发生、侵袭转移性行为有关[18]。

2.3参与动脉粥样硬化发生及演变过程动脉粥样硬化(AS)是血管壁的一种慢性炎症反应,免疫反应参与发病的各个阶段,炎性细胞分泌的细胞因子在斑块的发生、发展及破裂中起到关键作用。MMP-9和TIMP-1作为参与其发病的重要细胞因子已经得到了明确的证实。炎性细胞因子TNF-α激活NF-κB信号通路,通过s LZIP因子诱导MMP-9的转录,MMP-9可以促进平滑肌细胞迁移、增殖,在AS的发病中起到非常重要作用[19]。MMP-9的过度表达,还可以降解细胞外基质蛋白而导致平滑肌细胞凋亡,使斑块不稳定而易于破裂,因此,MMP-9与斑块的不稳定息息相关。内源性TIMP-1的作用是阻止MMP-9的活化,亦参与AS的形成。研究显示,TIMP-1 m RNA在AS的表达明显减低,减少对MMP-9的抑制性调控,也是AS发生发展的机制之一[20]。各种药物对AS患者的MMP-9、TIMP-1表达的影响已经受到人们的广泛研究,抑制MMP-9表达的药物可能预防AS斑块的破裂而预防急性冠脉综合症的发生。

3 MMP-9/TIMP-1与KD的关系

病理研究证实,全身性血管炎为KD的基本病理改变,免疫系统的活化状态在发病机制上起重要作用。活化的T淋巴细胞分泌TNF-α等细胞因子,与分布在单核/巨噬细胞等免疫细胞的TNF受体结合,通过PKR、IRAK及NAK途径下调IκB-α蛋白合成,活化包浆中的NF-κB,进入细胞核促进MMP-9等细胞因子的转录,MMP-9的活性过高及MMP-9/TIMP-1平衡失调,导致细胞外基质降解加速及基底膜破坏,引起炎症细胞和细胞因子向血管深层浸润,扩大炎症的损伤,参与KD血管炎的发生及进展。MMP-9/TIMP-1与KD的关系是近年来研究的热点,其在KD的血管病变中的作用被人们所共识。

3.1 MMP-9/TIMP-1在KD患儿的水平KD全层血管炎、冠状动脉病变及动脉瘤的形成,首先是血管内膜炎性细胞的浸润,然后发生内皮细胞降解和弹性层的破坏,而血管弹性层的破环与局部MMP-9的活性有关。早在10多年前,美国学者就发现KD患儿急性期血清MMP-9和TIMP-1浓度显著升高[21]。随着对MMP-9/TIMP1的进一步研究,其与KD的关系受到学者们的重视,可能成为早期诊断KD及早期预防冠状动脉病变的客观生化指标。我国学者赵建美等[22]也研究发现,KD患儿急性期血清MMP-9和TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比值较对照组明显上升,并且冠状动脉扩张组比冠状动脉未扩张组更显著,这与国内外其他学者的结论一致。相关学者研究发现丙种球蛋白可能通过抑制KD小鼠模型的MMP-9过度表达或激活从而减少血管炎的发生发展而起到治疗作用[23]。NF-κB可以与MMP-9启动子调控区特异的结合位点结合,调节MMP-9的转录,最终导致炎性病理损伤,急性期KD患儿外周血单个核细胞中NF-κB、MMP-9表达增强[24]。

3.2 MMP-9/TIMP-1 m RNA在KD患儿的表达MMP-9和TIMP-1在KD患儿血清的表达调节机制尚不十分清楚,检测MMP-9/TIMP-1 m RNA在细胞内的水平进一步能了解KD的发病机制。韦翊等[25]动态观察KD患儿外周血单核细胞中MMP-9和TIMP-1的m RNA水平,发现在急性期外周血单个核细胞MMP-9 m RNA和TIMP-1 m RNA明显升高,恢复期MMP-9 m RNA与急性期比较有所上升,差异有统计学意义(P<0.05),TIMP-1 m RNA有所下降,差异无统计学意义(P>0.05)。更有研究表明,KD患儿急性期不仅外周血MMP-9 m RNA表达、蛋白水平及酶活性均较对照组显著升高,而且冠状动脉损伤的患儿较冠状动脉未损伤的患儿更显著,对早期预测冠状动脉损伤有一定价值[26]。机体可能通过复杂的调节机制来调节MMP-9和TIMP-1转录和翻译过程来参与KD的发病。

3.3 MMP-9/TIMP-1基因多态性与KD因KD发病具有特定的种族和家庭易感性,基因多态性与KD易感性的相关研究成为近年来研究的热点。与KD有关的细胞因子,如白介素、肿瘤坏死因子、生长因子、粘附分子等的基因多态性与KD的易感性已经得到证实,并且某些细胞因子基因多态性与冠状动脉病变及IVIG耐药相关[27]。目前认为MMP-9在KD患儿血清水平明显升高并且与冠状动脉损伤发展的病理生理有关,研究MMP-9基因多态性对了解KD的发病非常重要。国外有关研究表明,存在于MMP-9基因启动子部位的-1562C/T与多种血管疾病有关,当C突变为T,可以从转录水平影响基因表达调控蛋白酶的合成[28]。国内学者张园海等[29]研究MMP-9基因-1562C/T多态性与KD冠脉损害及丙种球蛋白耐药的关系发现,-1562C/T等位基因是KD发生冠脉损害的危险因素,与丙种球蛋白耐药无明显关系。国内外尚没有关于TIMP-1基因多态性与KD关系的报道,MMP-9/TIMP-1基因多态性仍需要笔者继续探究。

TIMP 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集青岛市城阳区第二人民医院病理科2010年1月-2013年6月间石蜡包埋结直肠癌组织60例及正常结直肠黏膜组织20例。60例患者中男36例, 女24例;年龄43~84岁。

1.2 试剂

MMP-11兔抗人单克隆抗体购于北京康为世纪生物科技有限公司;TIMP-1兔抗人单克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 检测方法

所有标本均经10%中性福尔马林固定、常规包埋、4μm厚连续切片。采用PV-9000二步法进行免疫组化染色。已知阳性结直肠癌切片作为阳性对照, 用PBS液代替一抗作阴性对照。

1.4 评判标准

记分采用双评分半定量记数方法, 阳性细胞数<5%为0分、5%~25%为1分、26%~50%为2分、51%~75%为3分, >76%为4分。阳性强度淡黄色为1分, 黄色为2分, 棕黄色为3分。两积分相乘, 0分为阴性 (-) , 1~4分为弱阳性 (+) , 5~8分为阳性 (++) , 9~12分为强阳性 (+++) 。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件, 两组及多组间的差异比较采用等级秩和检验, 两变量之间的相关性分析采用Spearman等级分析。

2 结果

2.1 MMP-11及TIMP-1在正常结直肠黏膜组及结直肠癌组中的表达

正常结直肠黏膜组20例标本中, MMP-11及TIMP-1的阳性表达率分别为50.00% (10/20) 、40.91% (11/20) ;两者在黏膜腺体中的表达呈散在单个或灶状着色。结直肠癌组60例标本中, MMP-11、TIMP-1阳性表达主要以胞浆着色为主, 呈灶状或弥漫性着色;两者的阳性表达率分别为81.67% (49/60) 、60.00% (36/60) 。两者在正常结直肠黏膜组与结直肠癌组中的表达有显著差别 (μ=264.000、408.000, P均<0.05) (表1) 。

2.2 MMP-11及TIMP-1表达与结直肠癌临床病理指数的关系

MMP-11在结直肠癌组织中的表达与浸润深度 (χ2=16.564) 、淋巴结转移 (μ=304.000) 及Dukes分期 (χ2=15.534) 有关 (P均<0.05) ;TIMP-1表达与淋巴结转移 (μ=268.500) 及Dukes分期 (χ2=7.865) 有关 (P均<0.05) , 见表1。

2.3 MMP-11及TIMP-1在结直肠癌中表达的相关性

MMP-11表达与TIMP-1表达呈正相关关系 (γ=0.496, P<0.05) , 见表2。

3 讨论

MMPs家族主要包括五大类:胶原酶类、明胶酶类、基质溶解素类、膜型金属蛋白酶类和其他分泌型MMPs。MMP-11属于基质溶解素类[2]。可降解蛋白多糖、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原。TIMPs是MMPs的天然抑制剂, 广泛存在于组织及体液中, TIMP-1对所有类型MMPs均有抑制作用。

近年来研究发现, MMP-11在大多数肿瘤中显著表达, 并认为与肿瘤的发生、发展和预后不良相关。Zhao等[3]发现在进展期的胃癌组织中MMP-11在蛋白及基因水平上均升高。覃宇周等[4]采用免疫组化方法检测到在早期乳腺癌患者中, MMP-11的表达与绝经状态、ER蛋白表达有关。段世宏等[5]检测到喉癌组织中MMP-11的蛋白表达明显高于相应癌旁正常组织。本实验也发现结直肠癌与正常结直肠黏膜组织间MMP-11表达有显著差异 (P<0.05) , MMP-11在结直肠癌组织中的表达与浸润深度有关 (P<0.05) , 表明MMP-11参与了肿瘤的侵袭过程, 而MMP-11与淋巴结转移 (P<0.05) 、肿瘤Duke's分期 (P<0.05) 有关, 提示其与远处转移有关。

尽管TIMPs可抑制肿瘤的侵袭和转移, 但多数研究表明, TIMP-1水平增高与肿瘤的较差预后间呈正相关。Aimori K等[6]发现胃癌患者中有淋巴结转移及远处转移组MMP-11表达明显增高。丁力[7]等采用免疫组化检测TIMP-1在胃肠道间质瘤中的表达, 结果其在中度侵袭危险性 (IR) 组、肿瘤直径>5 cm组、有淋巴结转移组均表达显著增高, 提示TIMP-1与胃肠道间质瘤的恶性进展、侵袭转移有关。本研究结果也显示, TIMP-1在正常结直肠黏膜组织中呈阴性表达或低表达, 而在结直肠癌组织中呈阳性表达且表达明显升高, 二者表达的差异具有高度显著性 (P<0.05) 。结直肠癌组织中TIMP-1表达与淋巴结转移及Dukes分期有关 (P<0.05) , 差异具有显著意义。

本实验表明, TIMP-1与MMP-11的表达存在正相关关系 (P<0.05) 。TIMPs在肿瘤组织中的表达随MMPs的升高而升高。但是尽管TIMP-1的表达是上调的, 其水平与MMP-11相比仍存在不平衡性。正是这种失衡加速了细胞外基质的降解, 促进了肿瘤细胞的浸润与转移。

综上所述, MMP-11及TIMP-1在结直肠癌的发生、发展中起重要作用。MMP-11与TIMP-1之间的平衡失调更是肿瘤进展与转移的重要因素, 因此对两个指标的联合检测更加具有临床指导意义。

摘要：目的 探讨基质金属蛋白酶-11 (MMP-11) 和基质金属蛋白酶抑制因子-1 (TIMP-1) 在结直肠癌组织中的表达及意义。方法 采用免疫组织化学方法检测MMP-11及TIMP-1在结直肠癌和正常结直肠黏膜组织中的表达。结果 结直肠癌组织中MMP-11和TIMP-1的表达与正常结直肠黏膜组织比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。MMP-11的表达与浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期有关 (P<0.05) ;TIMP-1的表达与淋巴结转移、Dukes分期有关 (P<0.05) 。MMP-11表达与TIMP-1表达呈正相关关系 (P<0.05) 。结论 MMP-11和TIMP-1参与了结直肠癌的发生、发展, 可以作为预测结直肠癌浸润和转移的指标。

关键词：结直肠癌,MMP-11,TIMP-1

参考文献

[1]Egeblad M, Werb Z.New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression[J].Nat Rev Cancer.2002, 2 (3) :161-174.

[2]Deng H, Guo RF, Li WM, et al.Matrix metalloproteinase 11 depletion inhibits cell proliferation in gastric cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun, 2005, 326 (2) :274-281.

[3]Zhao ZS, Chu YQ, Ye ZY, et al.Overexpression of matrix metalloproteinase 11 in human gastric carcinoma and its clinicopathologic significance[J].Hum Pathol, 2010, 41 (5) :686-696.

[4]覃宇周, 欧海玲, 刘剑仑.MMP-11蛋白在早期乳腺癌的表达及其临床意义[J].中国癌症防治杂志, 2009, 1 (3) :208-210.

[5]段世宏, 郭玉芬.基质金属蛋白酶-11在喉癌中的表达[J].临床耳鼻喉头颈外科杂志, 2008, 22 (3) :104-107.

[6]Aimori K, Mori M, Shiraishi T, et al.Clinical significance of tissue inhibitor of metalloproteinases expression in gastric caicinoma[J].Br J Cancer, 1997, 76:531-536.

TIMP 篇6

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

DMEM培养液 (Gibco) , 胎牛血清 (杭州四季青生物公司) , LipofectamineTM2000 (Invitrogen) , 带绿色荧光蛋白的TIMP- 2真核表达载体:pcDNA3.1 (+) /GFP- TIMP- 2 (由本实验室构建) 。

1.2 方法

1.2.1 人AM细胞体外培养

在无菌条件下切取标本, 在超净工作台中将新鲜组织标本转移到培养皿内, 将组织剪成1～2 mm3大小的组织块, 接种于25 cm2细胞培养瓶培养。

1.2.2 脂质体介导的TIMP-

2基因转染人成釉细胞瘤细胞 用LipofectamineTM2000 将带有不同浓度的质粒pcDNA3.1 (+) /GFP- TIMP- 2, 即1 μg (P1组) 、 2 μg (P2组) 、 3 μg (P3组) 转染至人AM 细胞, 培养24、 48、 72 h后观察分析。

1.3 观察及检测指标

1.3.1 倒置相差荧光显微镜观察转染情况

观察不同时间各组细胞的形态、大小、密度等变化;观察绿色荧光的分布、强弱变化情况。

1.3.2 流式细胞仪检测转染效果与效率

检测转染后不同时间GFP 的表达强度及转染效率。

2 结 果

2.1 TIMP- 2 基因转染人AM细胞的结果

人AM细胞转染pcDNA3.1 (+) /GFP- TIMP- 2后24 h细胞生长良好 (图 1) 。转染后72 h可见细胞形态有改变, 细胞体积增大, 细胞排列变疏松, 部分细胞出现核溶解 (图 2) 。更换含有血清的培养液后细胞形态恢复正常。在普通光和蓝色激发光源共同激发下, 可以同时观察绿色荧光和细胞形态 (图 1～4) 。

2.2 TIMP- 2转染人AM细胞的转染效率检测结果

流式细胞仪 (flow cytometry, FCM) 检测发现转染24 h后, 出现阳性转染的细胞, 随后, 阳性转染细胞继续增多, 到72 h时, 转染阳性的细胞维持在一个稳定的水平。不同浓度的pcDNA3.1 (+) /GFP- TIMP- 2表达质粒的转染效率有差别。通过对不同时段转染效率的检测, 发现P1组的转染率与P2、 P3组的转染率在各个时段都有明显的差别, 经统计学分析证明, 差异有显著性。在P1、P2、P3组中, P3组的转染效率最高, 72 h达到53.9%, 但P3组与P2组的转染率差异无显著性 (表 1) 。

3 讨 论

成釉细胞瘤为良性肿瘤, 但具有局部侵袭生长特性, 肿瘤细胞常向骨小梁间侵袭生长, 故临床复发率高, 据报道其复发率在10%～90%之间[1]。TIMP- 2与MMP以1∶1的比例形成MMP- TIMP复合体, 从而阻断MMP与底物结合, 抑制MMP的活性[2]。外源基因转染真核细胞的方法很多, 如磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE- 葡聚糖和polybrene 法、机械法和阳离子脂质体试剂法[3]。本研究采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体将我们构建的质粒pcDNA3.1 (+) /GFP- TIMP- 2成功转染入人成釉细胞瘤细胞。阳离子脂质体试剂在水中可以形成微小的 (平均大小约100～400 nm) 单层脂质体。这些脂质体带正电, 可以靠静电作用结合到DNA 的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂, DNA 并没有预先包埋在脂质体中, 而是带负电的DNA 自动结合到带正电的脂质体上, 形成DNA- 阳离子脂质体复合物。Lipofectamine 2000 是一种高转染效率的阳离子脂质体试剂, 而且该试剂的细胞毒性很低, 很多研究者采用这种试剂进行基因转染的研究, 取得了理想的转染效果[4]。脂质体相对于病毒载体而言, 其安全性高, 对细胞的毒性很小。本研究结果显示, 仅转染pcDNA3.1 (+) /GFP质粒组和未转染组的细胞其TIMP- 2 mRNA的表达量无明显差别, 提示该转染方法对细胞的活性影响很小。倒置相差显微镜的观察结果也表明转染有质粒的人成釉细胞瘤细胞在转染后仅有体积和分散度的改变, 未见到明显的细胞死亡和生长停滞。更换培养基后, 细胞的生长恢复正常。相对于其它人工合成的载体 (如纳米材料等) 而言, 脂质体的转染效率较高, 本研究的实验结果也证实了这一点。

本实验以阳性脂质体做介导, 利用基因转染技术, 将TIMP- 2目的基因导入体外培养的人AM细胞。为了提高转染率, 可以使用更有效的载体, 如病毒载体, 但当病毒载体应用于动物体内实验时, 具有致畸致瘤的危险。本实验成功进行了原代培养细胞的基因转染研究, 而且转染率较高, 转染效率具有时间依存性, 随着时间的延长转染效率增加, 72 h转染率可达53.9%。质粒转染率的大小和质粒浓度密切相关。本研究发现, 需要一定的起始浓度才能更顺利的转染AM 细胞, P2、P3 组的起始浓度为2 μg 以上, 随着时间的延长, 转染率也逐渐增高, 而P1 组为1 μg 质粒, 即使到了转染后72 h, 转染率的增加也不明显。然而, 即使转染时质粒的初始浓度超过了一定的值, 其转染率也不会显著性的增加, 如P2 组、P3 组的质粒初始浓度分别为2 μg和3 μg, 但其转染率差异并无显著性, 可能是因为AM本身具有比较难以转染的特性, 也可能是因为质粒本身的转染率有一定的域值, 超过了一定的域值, 即使增加质粒的转染浓度也不能增加转染率;从生物学角度来讲, P2组是最优的转染浓度。

参考文献

[1]于世凤.口腔组织病理学[M].5版.北京:人民卫生出版社, 2003:316-321.

[2]Hammani K, Blakis A, Morsette D, et al.Structure andcharacterization of the human tissue inhibitor of metallopro-teinases-2 gene[J].J Biol Chem, 1996, 271 (41) :25498-25505.

[3]Nishimura K, Li W, Hoshino Y, et al.Role of AKTin cy-clic strain-induced endothelial cell proliferation and survival[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2006, 290 (3) :C812-821.

TIMP 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年12月-2014年12月在本院治疗的患者152例, 其中A组60例为肺结核合并糖尿病患者, 男28例, 女32例, 平均年龄 (43.9±7.3) 岁, 肺结核确诊依据胸片及胸部CT或者痰菌培养阳性, 糖尿病确诊依据空腹血糖、尿糖及糖耐量实验确诊;B组47例为肺结核非糖尿病患者, 男23例, 女24例, 平均年龄 (45.0±8.1) 岁, 肺结核合并糖尿病根据其病史、胸部X线检查、痰菌检查确诊;C组45例为对照组, 无肺部病变, 无其他器质性病变, 男21例, 女24例, 平均年龄 (46.0±7.8) 岁。三组患者的年龄、性别比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。经本院伦理委员会批准, 纳入的所有患者均签署知情同意书后留取肺部组织。保留的肺组织10%甲醛溶液固定48 h, 待免疫组化法测定。

1.2 诊断与排除标准

(1) 诊断标准:肺结核诊断均由病理证实。2型糖尿病诊断标准按2010年ADA糖尿病诊断标准: (1) 糖化血红蛋白A1c≥6.5%;或 (2) 血糖FPG≥7.0 mmol/L。空腹定义为至少8 h内无热量摄入;或 (3) 口服糖耐量试验时2 h血糖≥11.1 mmol/L;或 (4) 在伴有典型的高血糖或高血糖危象症状的患者, 随机血糖≥11.1 mmol/L。而在无明确高血糖时, 应通过重复检测来证实标准 (1) ~ (3) 。 (2) 排除标准:合并免疫系统相关疾病, 心、肾功能衰竭, 支气管结核, 肿瘤;人免疫缺陷病毒阳性;近期应用免疫调节剂。

1.3 方法

采用免疫组化方法测定肾脏组织TIMP-1、MMP-9。选择TIMP-1、MMP-9兔抗人多克隆抗体作为检测抗体, MMP-9测定时组织无需处理, TIMP-1组织进行抗原热修复。新鲜配制的3%H2O2去离子水孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶, PBS (0.01 mol/L, p H 7.25~7.35) 冲洗2 min, 3次。滴加MMP-9, 37℃孵育1~2 h, PBS冲洗2 min, 3次。滴加兔Ig G抗体-HRP多聚体, 37℃孵育30 min, PBS冲洗2 min, 3次, 选用DAB显色, 蒸馏水充分冲洗, 用中性树胶封固, 空白对照采用PBS代替一抗[2,3,4]。结果判断:显微镜下观察各组中HE染色后的组织结构, 观察免疫组化反应的定位、分布及染色强度, 每张切片阳性细胞的着色为棕黄色和棕褐色, 并且阳性细胞数>5%认为阳性表达。每例均设有HE切片作对照观察, 并设阳性和阴性对照, 用IPP 6.0 (Image pro plus 6.0) 分析图片, 计算平均光密度 (Average optical density, AOD) 值。

1.4 统计学处理

使用SPSS 20.0进行分析, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用F检验, 计数资料采用X2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺结核活动性比较

A组的活动性肺结核患者27例 (45.0%) , 非活动性结核患者33例 (55.0%) ;B组的活动性肺结核患者12例 (25.5%) , 非活动性结核患者35例 (74.5%) 。A组活动性肺结核患者的比率较肺结核非糖尿病组高, 说明肺结核合并糖尿病可能是肺结核活动性的影响因素。两组患者中活动性及非活动性患者比较, 肺结核的活动度差异存在统计学意义 (字2=4.312, P<0.05) 。

2.2 三组患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达比较

三组患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达进行统计学比较, 发现A组患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达水平较B组和C组患者的高, B组患者的较C组患者高, 且A组患者的MMP-9/TIMP-1的值较B组高, B组的较C组高。说明MMP-9和TIMP-1蛋白的表达在患者组较正常组高, 而A、B组的比值中糖尿病患者组的MMP-9/TIMP-1更高, 见表1。

*与C组比较, P<0.05;△与B组比较, P<0.05

2.3 不同活动性肺结核患者MMP-9及TIMP-1蛋白表达的比较

活动性肺结核患者MMP-9及MMP-9/TIMP-1的蛋白的表达值比非活动性肺结核患者高, 而活动性肺结核患者TIMP-1蛋白的表达却比非活动性肺结核患者的低, 差异均有统计学意义 (P>0.05) , 见表2。

*与非活动性肺结核比较, P<0.05

3 讨论

近年来ECM重塑在肺纤维化形成中的作用已成为当今的研究热点, 而ECM重塑的有两种重要的细胞外基质表达MMPS和TIMPs[5,6]。MMPs是一组锌、钙离子依赖性的蛋白水解酶家族, 主要功能是在正常的重塑和修复过程中降解基底膜和间质胶原等细胞外基质成分, 其活性主要受其特异性抑制剂TIMPs的调节[7]。组织金属蛋白酶抑制剂-1 (TIMP-1) 是MMP-9的特异性抑制剂, 它以共价键的形式与MMP-9相结合成复合体, 特异性抑制MMP-9活性是重要的蛋白质降解调控因子。MMPs及TIMPs所调节的细胞外基质降解减少可能是肺纤维化发生的重要因素, MMP-9能够降解分布于基底膜和肺间质的Ⅳ型胶原, TIMP-1是MMP-9的特异性抑制剂, 由于胶原沉积在肺纤维化过程中起着关键的作用, 胶原酶具有切割纤维胶原蛋白的天然螺旋结构能力的下调, 可能对疾病的进展也可以发挥显著作用[8,9,10]。根据此观察, TIMPs的过度表达导致MMPs和它的抑制因子之间失衡, 从而引起不利于胶原活性的微环[11,12]。TIMP-1主要来自于肺泡巨噬细胞及上皮细胞, TIMP-2和TIMP-3的基因表达成组成型, TIMP-1在纤维化过程表达上调, TIMP-1的表达与疾病的进展阶段相关联, 并且可能会阻止MMP导致的细胞外基质的降解, 并且作为结果可能参与了细胞外基质的沉积, MMP-9的检测被建议可作为肺纤维化的预后因素。

糖尿病为临床常见的内分泌代谢疾病, 由于糖尿病的存在使肺结核恶化或难以治愈, 肺结核的存在又可使糖尿病不易控制, 两者之间互为因果, 造成恶性循环。而肺结核合并糖尿病的病因机制尚不完全清楚, 近年来研究发现EMC的酶降解系统异常可能对糖尿病合并肺结核发病有一定的作用。而MMP-9的表达会抑制TIMP-1, MMPs的合成、分泌及激活过程的各个环节都受到严密监控, 一些细胞因子、生长因子及激素等能调节MMPs合成[13,14]。

本研究发现, 在本院入院的糖尿病合并肺结核的患者中活动性肺结核患者的比例显著高于非糖尿病肺结核的患者, 说明糖尿病对肺结核的活动性在一定程度上有影响, 这可能与糖尿病会造成体内高糖的环境, 改变正常的代谢有关[15]。糖尿病的发生影响了EMC酶降解系统的异常表达, 增加了肺结核的活动性。在分别检测了肺结核合并糖尿病组、肺结核非糖尿病组、正常肺部组的MMP-9、TIMP-1及MMPs三组指标的比值, 发现肺结核合并糖尿病组比值都较其他两组显著较高, 且肺结核非糖尿病组的三项指标也较正常组的高, 这也直接说明糖尿病对肺结核的发生有促进作用, MMP-9、TIMP-1及抗蛋白酶系统对糖尿病患者肺部纤维组织的形成有较大的影响, 且MMP-9、TIMP-1及其比值与疾病的发生有着较为密切的关系。MMP-9及TIMP-1比率失衡是细胞外基质重塑和气道阻塞的关键, MMPs和其抑制因子的在其他呼吸道纤维化疾病时有研究, 提示他们可能是气道炎症及气道重塑有用的生物学标志。在笔者的研究中, 灌洗液中细胞基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 表达显著升高, MMP-9/TIMP-1比率明显失衡, 笔者的结果提示基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 可能参与糖尿病合并肺结核的致病过程, 对肺结核患者的预测及诊治可能有一定的参考价值。随后, 笔者又将活动性肺结核患者和非活动性肺结核患者的三项指标进行对比, 免疫组化的结果显示活动性肺结核患者的MMP-9、MMP-9/TIMP-1值较非活动性的高, 但TIMP-1蛋白的表达值却较非活动性肺结核患者的低, 差异均存在统计学意义 (P<0.05) 。这再次说明MMP-9、TIMP-1的值与肺结核的病变程度密切相关, 活动性肺结核患者的肺部纤维化更为严重, 多项证据证实MMPs/TIMPs功能紊乱, 尤其是TIMP-1的增多, MMP的活性会受到限制, 可促进肺间质纤维化形成。MMP-9/TIMP-1比率失衡可能是导致糖尿病合并肺结核患者发生肺部纤维化的重要因素。

本研究提示TIMP-1、MMP-9与糖尿病合并肺结核病变程度密切相关, 尤其是对肺部纤维化有着重要影响, 可作为鉴别糖尿病是否已合并肺结核的指标。MMP-9/TIMP-1比值的失衡在肺结核合并糖尿病的发病过程中发挥着重要作用。此研究为糖尿病合并肺结核的病因学机制提供实验支持, 并为深入探索糖尿病合并肺结核机制提供一定的理论依据。

摘要：目的:探讨不同程度的糖尿病合并肺结核患者的肺部病变基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 、组织金属蛋白酶抑制剂-1 (TIMP-1) 表达水平的差异。方法:选取本院住院的肺结核合并糖尿病患者肺组织60例 (A组) , 肺结核非糖尿病患者肺组织47例 (B组) 及正常肺组织45例 (C组) , 采用免疫组化方法检测肺组织中MMP-9、TIMP-1表达水平, 并收集患者肺结核相关临床资料进行统计分析。结果:A组的MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1显著高于B、C组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。B组的MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1较C组高, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。活动性肺结核患者MMP-9、MMP-9/TIMP-1高于非活动性肺结核患者, 活动性肺结核患者TIMP-1表达低于非活动性肺结核患者 (痰抗酸杆菌阴性, X片显示增殖性病变、纤维包囊紧密的干酪硬结灶及纤维钙化灶) 。结论:MMP-9、TIMP-1及其比值与肺结核患者的病变程度密切相关, MMP-9/TIMP-1表达失衡在肺结核合并糖尿病的发病过程中发挥着重要作用。