PLGA

2024-09-30

PLGA（共4篇）

PLGA 篇1

0 引言

生物可降解高分子材料的开发与应用在材料和医用领域备受关注。其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA) 、聚己内酯 (PCL) 等已经通过FDA的认证, 被正式作为药用辅料收录进美国药典[1]。组织工程支架材料是组织工程研究的桥梁和纽带, 作为支架材料的聚合物应具有无毒、可控的生物降解性, 优良的生物相容性以及和一些组织细胞有一定的相互作用能力[2]。此类生物医用材料制成的支架在结构上还应具备细胞生长及输送营养所必须的孔状结构, 以及指导细胞生长所必须的足够的机械强度和韧性。聚乳酸-羟基乙酸 (PLGA) 有良好的生物相容性和生物降解性能且降解速度可控, 在生物医学工程领域有广泛的用途[3,4,5]。但聚乳酸-羟基乙酸 (PLGA) 材料也有一个很大的缺点, 即脆性太大且韧性不够, 而且降解周期比较短, 不能满足临床对于长期修复组织工程支架材料的要求。聚ε-己内酯 (PCL) 为半结晶型聚酯, 韧性好且断裂伸长率大, 因此两者共混可以改善PLGA的力学性能, 同时也可以调节材料的降解周期[6,7,8]。

静电纺丝因能制备纳米级纤维, 且所制纤维具有高比表面积和高空隙率等优点, 进而成为组织工程医学领域研究的热点[9,10,11]。目前, 国内外已有通过静电纺丝制备PLGA膜状支架[12,13,14]的研究。Boland[15]制备了不同直径及形态的PLA/PCL共混物纤维/膜以满足不同组织工程支架的应用需求, 但后期临床跟踪显示PLA/PCL共混膜支架会产生一定的局部肿胀症状, 这与PLA降解时局部酸性增大有关。Yang等[16]也发现平滑肌细胞及内皮细胞在PLGA/PCL共混聚合物支架上的生长情况都要优于单一PLGA组分的支架。本实验采用柠檬酸三丁酯 (TBC) 作为增容剂制备PL-GA/PCL共混材料, 然后对共混材料进行溶解、静电纺丝, 研究了PLGA/PCL共混材料的制备、力学性能及静电纺共混膜与涂膜降解性能的对比。

1 实验

1.1 原料与助剂

聚乳酸-羟基乙酸 (PLGA) :Mw=8.1×104, η=0.58, n (LA) ∶n (GA) =50∶50, 济南岱罡生物工程有限公司;聚ε-己内酯 (PCL) :谱振, Mn=7.0×104, 医用级, 上海天清生物材料有限公司;柠檬酸三丁酯 (TBC) :上海紫一试剂厂;N, N-二甲基甲酰胺 (DMF) /1, 2-二氯乙烷:分析纯, 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

真空干燥箱, ZK-82A, 上海市实验仪器总厂;Testometric M350-20KN型力学拉伸机, 单轴拉伸, 100N传感器, 拉伸速度为5cm/min, 东莞市鸿企机械有限公司;螺旋测微器, 精确到0.01mm;JBS-300CD/450CD液晶数显简支梁冲击试验机, 济南科汇试验设备有限公司;SS-2533H型静电纺丝机, 北京永康乐业科技发展有限公司。

1.3 材料的制备

1.3.1 PLGA/PCL共混材料的制备

把PLGA固体颗粒置于真空干燥箱中干燥, 温度60℃, 真空度-0.05 MPa, 时间24h。将干燥好的PLGA与PCL混合均匀, 以共混材料的总质量为100份按设定的比例分别加入一定质量分数的TBC, 制备PCL含量分别为10%、20%、30%、40%、50%的PLGA/PCL共混材料;然后取含PCL 20%的共混材料加入V (DMF) ∶V (二氯甲烷) =1∶2的N, N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷为溶剂, 配制质量分数分别为5%、6%、7%、8%、9%、10%的PLGA/PCL共混溶液, 取一定量8%的共混溶液于90℃干燥8h后注塑成标准样条 (模温32℃) 。同样方法制得如下样条:纯PLGA、PLGA80/PCL20、PLGA80/PCL20/TBC2%、PLGA80/PCL20/TBC4%、PL-GA80/PCL20/TBC6%、PLGA80/PCL20/TBC8%、PL-GA80/PCL20/TBC10%, 分别编号为 (1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 、 (5) 、 (6) 、 (7) 。

1.3.2 降解膜的制备

(1) 静电纺膜

喷丝头与接收转桶的间距为10cm, 在15~25kV范围内调节纺丝电压, 电极距离为16cm, 在1.0~2.0mL/h范围内调节流速进行静电纺丝, 收集、干燥后获得不同的PLGA/PCL共混纤维膜。

(2) 溶液涂膜

通过溶液涂膜法制备共混物薄膜, 将PCL含量分别为10%、20%、30%、40%、50%的PLGA/PCL共混聚合物溶于V (DMF) ∶V (二氯甲烷) =1∶2的N, N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷溶剂中配成质量分数为8%的溶液, 将共混膜料倒在自动涂膜机上进行涂膜, 然后放置于通风橱中让溶剂自然挥发后放入真空烘箱干燥, 成膜后撕下并裁剪成相同规格 (50mm×20mm×0.1mm) 的试样备用。

1.3.3 缓冲溶液的配制及膜降解实验

配制pH=7.2的KH2PO4/NaH2PO4缓冲溶液, 在缓冲溶液中加入K蛋白酶, 人工模拟降解环境, 38℃摇床中恒温振荡, 每隔一段时间取出, 并更换缓冲溶液和K蛋白酶, 取出的试样膜用去离子水淋洗, 真空干燥至恒重后进行表征[17]。

1.4 性能测试与形貌观察

按GB/T 528-1998标准, 将静电纺PLGA/PCL共混膜试样裁剪为哑铃形, 在TCS-2000型拉力试验机测定试样的力学性能, 拉伸速度为100mm/min。

冲击强度测试:按标准要求制备规格为120 mm×15mm×10mm、中间部位的宽和厚准确至0.05mm的标准试样各5条, 缺口尺寸及角要严格控制, 按力学测试总要求对试样进行预处理。每做一组试样校正试验机零点一次, 试验后由刻度盘读取冲断试样所消耗的功。

DSC测试:称取样品8mg左右, 氮气保护并以5℃/min的恒定速度从-20℃升温至240℃, 记录熔融曲线。

降解实验:将通过两种方法制得的厚为2mm、直径约为3cm的膜试样于40℃真空干燥24h左右至恒重;把处理好的样膜置于pH=7.2缓冲溶液降解瓶中, 38℃恒温降解, 每隔1周取出一块样膜, 并及时更换缓冲溶液。

采用S3400型扫描电子显微镜观察共混PLGA/PCL膜和未共混PLGA/PCL膜的表面形貌, 观察静电纺PLGA/PCL共混膜的降解情况。

2 结果与讨论

2.1 共混材料力学性能

图1是在不添加TBC的情况下, PLGA/PCL质量比对共混材料力学性能的影响。由图1 (a) 可以看出, 随着PCL用量的增加, PLGA/PCL共混材料的拉伸强度呈下降趋势, 这可能是因为PLA和PCL不相容, 当PCL组分逐渐增大时, 共混材料中出现了应力集中区或者是晶区缺陷增多的缘故, 使得材料的拉伸强度降低。而图1 (b) 中, 随着PCL用量的增加, PLGA/PCL共混材料的断裂伸长率总体来看并未有明显提高, 说明单纯的PLGA/PCL共混并未起到增加韧性的作用。

图2为不同质量比的PLGA/PCL共混材料在加入TBC后的力学性能对比。从图2 (a) 可以看出, 拉伸强度总的趋势是随TBC用量的增加而下降。这是由于TBC加入后, PL-GA分子间的连接点被溶剂化, 降低了分子间的次价力, 使得共混材料的拉伸强度下降[18,19,20]。从图2 (b) 可以看出, 在不同质量比的PLGA/PCL共混材料中, 断裂伸长率首先随TBC用量的增加而增加。除了PLGA/PCL (质量比70/30) 共混材料在TBC质量分数为4%时达到最大断裂伸长率之外, 其他比例的共混材料断裂伸长率都在TBC的质量分数为6%时达到最大值。而TBC用量继续增加时断裂伸长率反而下降, 这是由于加入增塑剂TBC后, 增塑剂降低了PLA的结晶度, 软化了PLA, 使PLA分子间作用力变小, 提高了PLA的链段乃至整个大分子的运动能力, 增加了PLA与PCL的相容性, 使材料的韧性得到改善, 断裂伸长率提高, 随着TBC含量的继续增加, 可能造成局部增塑剂堆积过多, 导致共混材料的断裂伸长率下降。未加入TBC时材料呈现出高强度和极低的断裂伸长率, 其断裂方式为脆性断裂。随着TBC用量的增加, 材料出现明显的屈服现象。各比例的PL-GA/PCL共混材料中质量比为80/20、6%TBC的体系增韧效果最好, 其断裂伸长率可达到130%。

表1为PLGA纯样以及含不同用量TBC的PLGA/PCL (质量比80/20) 共混材料冲击强度值。

由表1可以看出, 加入PCL后, 材料的冲击强度较纯PLGA有所提高。当用TBC作为增容剂时, 冲击强度可达到纯PLGA的3倍左右, 而当TBC质量分数为6%时, 冲击强度达到最大值。这是由于TBC改善了两种聚合物的相容性, 使得两相之间界面粘合力增加了, 如图3所示, 提高了PCL的增韧效果。由于PLGA/PCL (质量比80/20) 共混材料的增韧效果最好, 所以下面仅以此配比材料为例讨论TBC对PLGA/PCL共混材料热性能的影响。

2.2 DSC分析

表2为共混材料的DSC性能测试数据。由表2可以看出, 相对于纯PLGA, 共混材料的玻璃化转变温度和熔融温度都向低温方向移动, 即随着TBC用量的增加逐渐降低。PCL的加入使得纯PLGA的冷结晶温度降低, 结晶度提高, 这是因为PCL分散在PLGA基体中起到了异相成核的作用, 使得结晶比较容易。随着TBC的加入, 共混材料的冷结晶热焓大幅降低。

2.3 PLGA/PCL共混膜降解性能分析

2.3.1 静电纺PLGA/PCL共混膜性能

在相同条件下, 制备了PLGA及PCL质量分数为20%的PLGA/PCL的静电纺丝膜, 其扫描电子显微镜照片如图4所示。从图4中可以看出, PLGA纤维表面比较光滑, 纤维结点处部分发生了粘连, 纤维比较粗, 平均直径达到 (860±350) nm, 直径分布比较宽, 在400~2000nm范围内, 大部分集中在600~1400nm范围。PLGA/PCL共混材料静电纺丝, 其纤维呈现均匀形貌, PCL的加入明显降低了纤维的直径, 远小于PLGA纤维直径。

图5为PLGA电纺膜和PCL质量分数为20%的PL-GA/PCL共混电纺膜的SEM图, 可见随降解时间的延长聚合物膜表面粗糙程度增加。这可以认为, 聚乳酸-羟基乙酸 (PLGA) 和聚己内酯 (PCL) 分子链中存在众多的酯键, 首先是小分子的水移至聚合材料的表面, 扩散进入酯键或亲水基团的周围, 酯键在酸催化下发生断裂, 使聚合物分子量下降, 同时也使聚合物的规整结构受到破坏, 表现为聚合物薄膜由较光滑的表面逐渐转变为粗糙表面, 并出现一些微孔。从图5中可以看出在降解过程中纤维发生了溶胀现象, 其直径变粗, 随着降解时间的延长纤维发生了收缩且表面变得越来越粗糙;由图5还可知, 加入PCL的共混聚合物相比单一组分PLGA, 其降解周期会延长。

2.3.2 涂膜的降解性能

在降解过程中用电镜观察涂膜的表面形态变化, 图6为PCL质量分数为20%的PLGA/PCL共混涂膜降解前后的SEM图。

没降解时涂膜表面致密无孔, 随着降解的进行, 薄膜由透明变为乳白色, 且有少许膨胀, 变硬变脆, 力学性能下降;降解1周时, 表面变得粗糙, 开始有直径在10μm以下的小凹槽;降解2周后, 凹槽的直径扩大到10μm左右, 表面大致比较平滑;降解3周之后, 表面上的凹槽变得越来越大且在凹槽里又有新的小槽出现;第4周时整个膜变得非常脆, 但还保持原来的大体上的外观形貌;第5周后整个膜已经破碎萎缩成团。

3 结论

(1) PLGA和PCL相容性较差, 把PLGA和PCL共混时若不加入增容剂, 共混材料的拉伸强度随PCL用量的增加而下降, 断裂伸长率并未提高, 并不能增加PLGA的韧性。

(2) 以TBC作为增容剂提高了PLGA/PCL共混材料的韧性, 但材料的强度有所下降。力学性能测试结果表明, 当PLGA/PCL质量比为80/20、TBC质量分数为6%时, PLGA的韧性达到最佳。

(3) 由两种不同成膜方式可知, PLGA和PCL的降解可认为主要是酯键的酸碱水解所致, 水解初期, 聚合物酯键水解断裂是随意的, 链的分子被酸碱水解的位点多, 故分子量下降快。静电纺纤维膜刚开始降解速率不太大, 相对于流延法所制得的膜, 纤维膜具有大比表面积, 随着降解周期的延长, 纤维的降解率越来越大。相同情况下PLGA/PCL共混材料的降解速率较大, 且随着PCL含量的增加而减小。

PLGA 篇2

聚乳酸-羟基乙酸 (PLGA, 分子量为25000) , 聚乙烯亚胺 (PEI, 分子量为25000) , 聚乙二醇 (PEG) , 叶酸, 阿霉素 (DOX) 。方法

首先利用双乳化法合成包覆DOX的PLGA的空心微囊 (PLGA-DOX HMs) ;然后用EDC及NHS合成PEI-PEG-FA接枝聚合物, 最后用静电吸附法将PEI-PEG-FA修饰在PLGA-DOX空心微囊的表面, 通过不同的方法对产物进行粒径, 表面电势, 内部结构等表征。并评价了材料的生物相容性、癌细胞靶向性、药物缓释性及超声成像性能。

结果与讨论

图1a和b是PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的扫描电镜 (SEM) 和激光共聚焦显微镜 (CLSM) 图片。SEM测试结果显示这些微囊的形貌为球形;CLSM测试结果显示微囊内部的空心结构及PEI与PLGA的核壳结构, DOX均匀吸附在PLGA微囊内核, 外部壳层为PEI-PEG-FA接枝聚合物。图1d是不同叶酸受体的KB细胞分别与PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊在37℃下共培养2小时后的流式细胞仪测试结果。从图中可以看出, 与低叶酸受体KB细胞相比, 高叶酸受体的KB细胞显示了较高的荧光强度, 说明制备的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊能被高叶酸受体的KB细胞更好的结合。图1c是制备的微囊体外超声实验图片, 显示制备的空心微囊具有良好的体外超声成像效果。

图1 PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊SEM图 (a) 、CLSM图 (b) 和体外超声成像图 (c) 。图d是不同叶酸受体的KB细胞分别与PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊在37℃下共培养2小时后的流式细胞仪测试结果。

结论

本课题中我们设计并制备了PLGA-DOX-PEI-PEG-FA孔状微球。该微球具有较好的药物输送及酸性环境下具有更好的缓释性能, 具有良好的超声成像性能。PLGA为链状大分子, 较难进行修饰改性;PEI分子具有较多的氨基, 可以通过酰化接枝反应与肿瘤细胞靶向分子叶酸结合, 且PEI分子表面大量存在的氨基使得分子在中性溶液中带正电, 可通过静电吸附, 将制备的靶向分子PEI-PEG-FA接枝聚合物通过静电吸附作为壳层结合在制备的PLGA-DOX孔状微球表面, 吸附在表面电势为负电的PLGA-DOX微球表面, 成功赋予了制备的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA孔状微球肿瘤细胞靶向性

参考文献

[1]H.T.Ke, et al., Angew.Chem.-Int.Edit., 2011.50, 3017-3021.

PLGA 篇3

关键词：聚乳酸-羟基乙酸,成肌细胞,相容性,组织工程

在干细胞的研究中,一种新的干细胞——成肌细胞,因其具有易于取材、培养繁殖快的优点,成为了研究者们新的关注。为了能使成肌细胞更多的应用于组织工程,许多学者在积极的寻找支架材料,使成肌细胞能在受体内更好的生长分化,更好地行使其功能[1]。

1 主要仪器和材料

新生5 d的SD大鼠(由辽宁医学院实验动物中心提供)。CDMP-2(Peprotech USA),胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco),L-DMEM培养液,二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Sigma 公司),鼠抗desmin(Zymed公司),脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司), 倒置显微镜(Olympus),超净工作台,CO2培养箱(Sanyo)。

2 实验方法

2.1 成肌细胞的制取与培养

参照张力等[2,3]的方法,取新生5 d的SD大鼠,在无菌条件下取四肢骨骼肌,冷PBS液冲洗,组织剪成0.5 mm3的肌糜,培养液冲洗2次,去除上层液。加入混合消化酶,置入CO2细胞培养孵箱中消化3次,终止消化,过滤,离心,去上清液,加入含双抗的DMEM培养液重悬细胞。重悬细胞经细胞计数后高密度接种于60 cm培养皿中,置于CO2细胞培养孵箱中培养, 吸取上层悬液,再次离心重悬计数,按2×105/mL的细胞密度接种,加入生长培养液培养。

2.2 CDMP-2基因转染成肌细胞

采用脂质体转染方法将CDMP-2基因转染P3代成肌细胞。按invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明,转染前,以3×105/mL的细胞密度接种到6孔培养板上。转染时,细胞要达到90-95%的融合。溶液A:将5μg CDMP-2质粒DNA溶于100 μL无血清培养基中;溶液B:将10μL脂质体稀释于无血清培养基中,终体积100μL。合并溶液A于溶液B,轻轻混合,室温放置15min。与此同时,将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后,加入2mL无血清培养基。将溶液A与溶液B的混合液逐滴加入孔中,摇动培养板,轻轻混匀。在37℃,5%的CO2中保温5-6h。

2.3 PLGA材料预处理及接种成肌细胞

将制备的PLGA支架材料低温等离子干燥消毒后,剪成约1cm2大小,分别置于孔板的孔内,先加入生长培养基浸泡24h、再换成小牛血清浸泡2h,经紫外光照射及预湿处理,第3代成肌细胞及转染CDMP-2成肌细胞按2×107/L的浓度接种于24孔板(1mL/孔),2次沉淀法接种于材料。

2.4 MTT比色法检测PLGA的细胞毒性

MTT法检测转染CDMP-2基因的成肌细胞与PLGA支架前后细胞活力,分 4 组:①成肌细胞组、②成肌细胞+PLGA 组、③转染CDMP-2基因成肌细胞组、④转染CDMP-2基因成肌细胞+PLGA 组。培养24h后,选择 492nm(检测波长)、629nm(参比波长),在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。

2.5 生长曲线绘制

于培养1,2,3,4,5,6 d时分别取出每组4个孔的细胞,在570 nm波长下测定其吸光度(A值)值,结果以undefined表示,并绘制生长曲线。

2.6 成肌细胞的生物学鉴定

标本置于枸橼酸缓冲溶液中 (0.01M,pH=6.0),煮沸10min,冷却30min暴露抗原。PBS荡洗3min,反复3次。3%过氧化氢室温下浸泡,阻断内源性过氧化物酶活性。再次PBS荡洗。滴加非免疫牛血清,孵育10min。滴加一抗(小鼠IgG),1:50,4℃过夜。PBS荡洗,滴加生物素化标记的桥抗,室温下孵育10min。再次荡洗,加入链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液,孵育10min。DAB显色:使用DAB显色试剂盒 (ED1022)。取1mL蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂各1滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,一般5-10min之间。充分水洗,苏木素轻度复染。脱水、透明,封片,显微镜观察。

3 结果

3.1 成肌细胞的培养情况

细胞最初接种于PLGA支架后,倒置相差显微镜下观察不到细胞在支架表面的生长和附着,只能看到支架纵横交错的纤维网状支架。原因可能是PLGA支架材料的折光性与细胞相近,造成粘附在支架材料表面的细胞外形无法分辨。但是,可以从材料的边缘以及材料周围培养板上的细胞生长变化,间接了解细胞的培养状况。培养24h后,就可以观察到成肌细胞已经贴壁,胞质突起伸展,呈长梭形、纺锤形。到72h即可见细胞充分铺展、增殖,细胞数量明显增多。从细胞能够紧贴在材料周围充分增殖生长的状态,可以初步认为PLGA支架材料具有良好的细胞生物相容性。

3.2 MTT比色实验

示成肌细胞组与成肌细胞转染CDMP-2基因组、成肌细胞+PLGA组与成肌细胞转染CDMP-2基因+PLGA组在492nm和629nmOD值差异都无统计学意义(P>0.05)。

各组间相比,P>0.05。

3.3 生长曲线绘制

MTT结果可见实验组和对照组的成肌细胞随着培养时间的延长而增殖。第一天到第三天生长较缓慢,第四天翻倍,第五天生长速度达到高峰,是第一天的3倍以上,之后细胞数量略有回落。各组成肌细胞间的数量无显著性差异。

3.4 免疫细胞化学检测desmin表达结果

将第3 代的成肌细胞用desmin 抗体进行免疫酶染色(免疫组化SP法),细胞胞浆呈阳性反应,胞浆为黄色或棕黄色,细胞核为紫色者为成肌细胞。

4 结论

自MAURO等(1961)发现骨骼肌卫星细胞后,成肌细胞修复组织损伤已成为组织损伤修复研究的焦点,成肌干细胞来源中胚层,属多能干细胞,可以分化为成骨细胞[4]、肌细胞[5]、心肌细胞[6]、软骨细胞[7]等。

目前,比较有效的提取方法是:用二步消化法获得细胞悬液,再用差速贴壁法进行纯化。这种方法发现,用新生3d内的乳鼠能够获得足够的成肌细胞,并且获得的成肌细胞形态一致,极性排列[8]。成功地培养出成肌细胞后,支架材料的选取就转变成了工作的重点。支架材料就是指细胞依托生长的框架结构,应具有良好的组织相容性、细胞相容性、良好的降解过程。聚乳酸-羟基乙酸(pLGA)是由聚乳酸(pLA)和聚羟基乙酸 (PGA)按照一定配比聚合而成的可降解高分子聚合物,被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工领域,是已取得美国FDA批准,可应用于人体的高分子合成材料[9]。具有优异的生物相容性、生物可降解性和可调控的降解速率,在构建软骨和韧带等组织方面发挥了巨大的作用[10,11,12,13]。

组织工程的目的就是研制生物组织替代品并植入体内。替代品须满足国际上医疗器械生物安全的相关规定,对机体无毒害作用。中国依照国际标准ISO 10993也制定了相应的医疗器械生物学评价的国家标准,即GBT 16886。GBT 16886将细胞毒性试验分成3类:浸提液试验、直接接触试验、间接接触试验,同时还规定了评价的指标,如形态学、细胞损伤的测定、细胞生长的测定、细胞代谢特性的测定。

本实验采用直接接触试验评价了成肌细胞的生长情况。统计分析后发现各组之间的成肌细胞增殖差异无显著性意义(P>0.05)。说明以PLGA支架材料对成肌细胞无细胞毒性。根据各组的吸光度及MTT生长曲线,发现各实验组的成肌细胞增殖情况均良好。成肌细胞数量明显增多,细胞呈长梭形,排列规律,细胞长轴相互平行,甚至还可以见到成肌细胞集落形成。细胞间以短的突起紧密接触,似有融合形成肌小管的趋势。

PLGA 篇4

1材料与方法

1.1材料:大白兔3只, 月龄3个月, 体质量2.5~3.0 kg, PLGA/HA (沈阳工业大学材料系制作) , 异体骨 (异种异体骨) , 低糖DMEM培养基 (海克隆) , 胎牛血清 (新西兰进口) , 胰蛋白酶, 四环素盐酸盐 (Sigma) , 碱性磷酸酶 (AKP) 测试盒+4 (南京建成) , 层流超净台, 三洋 (SANYO) CO2培养箱, Nikon TE2000-S倒置显微镜, 中佳 (Zokia) 低速离心机, 25 cm2及75 cm2培养瓶, 六孔培养皿。

1.2方法

1.2.1分离培养兔BMSCs:局部麻醉起效后, 无菌条件下在兔股骨大转子部位抽取2 m L骨髓, 无菌管收集后添加肝素, 离心 (1500 r/min) 10min, 去除上清液, 添加标准培养液, 吹散细胞团置于培养瓶中在37℃、5%CO2环境中培养, 隔日换液1次。待约80%细胞发生融合后, 去净培养液, 添加0.25%胰酶消化2 min, 待细胞团缩后, 添加培养液, 吹打未脱落细胞置入离心管, 吹打分散均匀, 计数细胞数量。细胞悬液再次离心, 弃上清液, 添加标准培养液, 均匀接种在培养皿内培养, 3 d换液1次, 待80%细胞融合时再次传代。

1.2.2制备支架材料:PLGA/HA材料和异体骨材料分别用诱导培养液浸泡, 预湿24 h后, 用滤纸吸干材料内液体, 备用。

1.2.3接种细胞:取第3代兔BMSCs, 经消化后调整细胞浓度至1×106/m L, 将细胞悬液分别接种在支架材料和异体骨上至饱和。培养板放在培养箱内孵育4 h, 再次接种细胞达1×105/m L, 添加诱导培养液将材料浸泡后在培养箱内培养, 隔日换液。

1.3检测指标:应用倒置相差显微镜观察细胞形态和生长情况。计数细胞, 测定细胞黏附率和增殖情况, 用酶联免疫法定量检测碱性磷酸酶 (alka line phosphatase, ALP) 活性。用荧光显微镜下利用四环素荧光染色法观察钙结节形成情况。

1.4统计学处理:采用SAS6.1版本软件分析数据, 定量资料用t检验分析, P<0.05, 差异具有显著性。

2结果

兔BMSCc原代细胞培养5d后开始贴壁生长并形成克隆, 而且经过复合培养后, 材料表面均可见绿色荧光, 提示钙结节形成。PLGA/HA组细胞黏附率为34%, 异体骨组细胞黏附率为32%, 接种后第3天和第7天时PLGA/HA组和异体骨组细胞计数相仿, 接种培养第7天, PLGA/HA组ALP活性为 (4.31±0.26) , 异体骨组ALP活性为 (4.41±0.23) , 第14天时, PLGA/HA组ALP活性为 (7.01±0.51) , 异体骨组ALP活性为 (7.25±0.53) , 经统计学分析上述各项指标两组间均无明显差异 (P>0.05) 。

3讨论

随着组织材料的发展, 骨缺损修复效果得到了明显提高, 支架材料作为骨组织工程重点研究课题, 一直受到临床的广泛关注, 尤其是复合材料研究更是备受关注[1]。PLGA和HA作为最常用的复合物, 其中PLGA属于有机高分子材料, 具有较好的生物相容性, 但是由于亲水性较差, 而且缺乏骨诱导性, 因此黏附能力、机械强度以及功能修复存在一定的缺陷。HA作为骨组织重要的无机成分, 细胞亲和度较好、抗压强度较高, 相关研究认为将PLGA和HA复合后不仅能够降低降解速度, 而且能够提高材料强度、中和部分酸性产物。虽然关于PLA/HA组织支架制作的研究较多[2,3], 但是目前临床极少涉及应用PLGA/HA支架材料进行骨组织修复。本实验结果显示, 兔BMSCs于PLGA/HA支架材料和异体骨分别进行体外复合培养后, 两种支架材料均能够在组织表面存活、增殖, 而且二者间的细胞黏附率、钙结节形成情况、细胞增殖情况以及ALP活性均无明显差异, 表明PLGA/HA材料与骨细胞的结合能力与异体骨相似, 而且其生物相容性与异体骨不存在明显差异, 因此我们认为PLGA/HA可以替代异体骨进行骨修复, 进行PLGA/HA支架修复骨缺损动物在体实验研究具有科学依据。

摘要：目的探讨新型多孔聚乳酸乙醇酸 (polylac-ficglycolic acid, PLGA) /羟基磷灰石 (hydroxyap-atite, HA) 的复合支架材料 (即PLGA/HA) 相容性。方法兔骨髓基质细胞 (即BMSCs) 用贴壁法行体外矿化诱导培养、扩增后, 分别与实验A组 (含10%HA的PLGA/HA和实验B组 (即异体骨) 行体外复合培养, 定性和定量法检测材料表面BMSCs的黏附能力和增殖活力以证实复合体成骨活性, 并对检测结果进行比较。结果两组均可见兔BMSCs生长, 并在支架材料表面形成钙结节, 两组细胞黏附和增殖能力无明显差异。结论兔BMSCs与PLGA/HA支架材料和的异体骨具有相似的体外相容性, PLGA/HA可以作为异体骨替代材料。

关键词：兔骨髓基质细胞,聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石支架,异体骨,组织工程