COI

COI（精选3篇）

COI 篇1

跳虫，隶属节肢动物门弹尾纲(Collembola)。是分布极广的一类小型至微型动物，它们在土壤物质循环、土壤的发育及其微团聚体的形成、土壤理化特性和土壤生物群落的维护等诸多方面都发挥了重要作用[1,2]。跳虫在所有六足动物中化石年代最早，因此跳虫是六足动物起源及进化研究中非常重要的类群。跳虫的起源以及在六足动物中的分类地位、系统关系仍然有争议。由于跳虫种类非常繁多，要对其各类群之间的系统关系进行深入探讨，还有待于对更多类群采用更多的方法进行全面分析[3]。

近年来，分子生物技术在动物分子系统学和系统发育研究中的应用越来越显示出其优越性。相对于外部形态及内部结构特征，生物的遗传物质具有更大的稳定性，并存在着严格的种间差异[4]。利用动物的遗传物质的相似度，采用多种分析方法探索动物的遗传变异、系统发育和进化机制等问题，从生命的本质上探索动物的系统发育和遗传进化已经成为当前系统学研究中的一个新热点[5]。随着分子生物技术的迅速发展和PCR技术的诞生，线粒体DNA(mitochondrial DNA，简称mt DNA)相关基因的研究已经成为目前许多传统研究领域的重要辅助手段。mt DNA是以双链环状的DNA结构存在于线粒体中，具有数量高拷贝、严格遵守母系遗传、进化速率快、基因顺序和组成保守性高等优点，已成为研究系统发育、种群遗传变异和分化、近缘种和种下分类单元鉴定等最为广泛的遗传标记之一[6]。

其中mt DNA细胞色素氧化酶亚基(cytochrome oxidaseⅠgene,COI基因)在mt DNA中的位置比较保守，有较多的进化信息位点，常被用来分析亲缘关系较近的种、种下分类单元以及地理种群之间的系统关系[7,8,9,10,11,12,13]。目前国内外从分子水平上对跳虫进行的研究还较少，由于跳虫的个体极为微小(0.1mm～1mm)，这给mt DNA的提纯造成不便。本实验对弹尾目裸长角虫兆的线粒体COI基因进行PCR扩增，为根据跳虫线粒体COI基因序列信息研究其系统进化提供数据，为通过mt DNA特异基因序列对跳虫的系统分类研究打下了前期基础。另外，对模板DNA的分离方法进行优化。在一定程度上为跳虫的系统进化研究积累了分子生物学方面的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

采自山东省聊城大学院内潮湿的落叶层，经鉴定为裸长角虫兆(Sinella sp.)。采集后用75%酒精浸泡并放在冰箱-20℃保存，备用[14,15]。

1.1.2 试剂

琼脂糖、溴酚蓝、DNA Maker、UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽提试剂盒Tris-HCl,EDTA，冰乙酸、引物、Taq DNA聚合酶等购自上海生工生物工程技术服务有限公司，均为分析纯。

1.1.3 仪器

(1)高速冷冻离心机:Biofuge stratos,Germany Heraeus公司;(2)超纯水系统:Milli-Q,France Millipore公司;(3)紫外分光光度计:GBC916型，澳大利亚GBC公司;(4)电泳仪，Power Pac300,165-5051,Bio-Rad Laboratories公司;(5)凝胶图像分析系统:YCL 550S,Gel-5000图像采集+分析软件。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取与纯化

采取UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽提法提取和纯化基因组DNA。方法:取1只裸长角虫兆于1.5ml离心管中，研磨成粉末。加入300μl ACL溶液和20μl的蛋白酶K。置于55℃下孵育2.5h。取出样品12 000r/min离心5 min。吸取300μl上清至UNIQ-10 Column中，混匀室温静置3min,3 000r/min离心3 min。取下UNIQ-10 Column，倒掉管中废液。将UNIQ-10 Column放回收集管中，加入500μl Wash Solution,8 000r/min离心30s。将柱放入新的洁净1.5ml离心管中，在柱中央加入50μl Elution Buffer，室温放置2 min。10 000r/min、室温离心1 min。离心管中的上清液即为基因组DNA，取上清液放于-20℃保存。

1.2.2 引物合成及PCR扩增

扩增两种跳虫线粒体基因的引物均为通用引物，所用引物序列为:

C1-J-1718:5'-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3';

C1-J-2195:5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'。

PCR反应的总体25μl，其中PCR buffer(10×)2.5μl,d NTP(10mmol/L)2μl，引物1 C1-J-1718(100μmol/L)1μl，引物2 C1-J-2195(100μmol/L)1μl,DNA模板5μl,Tap(1U)0.5μl。

反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性50 s,55℃复性50s,72℃延伸50s,35个循环;72℃总延伸6 min。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

反应产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测和Gel Dos图像分析仪观察，应用分析软件对实验结果进行分析。PCR产物经纯化后，以备进行序列测定。

2 结果与分析

提取的裸长角虫兆基因组DNA经引物(引物1 C1-J-1718/引物2 C1-J-2195)PCR扩增后，扩增产物电泳显示有一明亮的条带，见图1。

注:泳道M为DL2000 DNA-Marker。泳道1、2、3为扩增裸长角虫兆不同个体的COI基因。

用Gel Dos图像分析软件计算得知，COI基因片段的长度约为477bp，符合预期，此数据可作为分析跳虫系统进化关系的初步依据。

3 讨论

在对昆虫进行分类及系统进化研究中，有时仅仅利用形态特征对某些昆虫进行分类面临着一定困难，而线粒体DNA结构简单，呈母性遗传，进化速度快且不发生重组，是种应用较广的分子标记。有些线粒体基因已经被广泛用于系统进化研究，其中细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(cytochrome oxidase subunitⅠ，COI)基因包含着丰富的遗传信息，可作为传统分类方法的有益补充。COI基因具有进化速率适中的特点，可作为种属系统进化研究的良好标记。不同分类单元之间COI基因序列的变异程度不同，亚目之间的变异程度最大，其次是科间，最小是属间，与分类关系相符。不同种的COI基因序列不同，种间序列变异较大，可作为种类鉴别标记[10]。COI基因序列含有丰富的遗传信息，在昆虫遗传进化研究中，已被用于分析种内系统地理格局及种间物种分化[11,12]。由于生态习性不同以及生殖隔离机制的存在，同域物种复合体现象可能在昆虫中普遍存在。这些物种在形态上差异不大，在这种情况下，可通过分析COI基因序列变异程度以确定其分类地位。

近年来，随着国内外把mt DNA COI基因应用于物种起源及其分化、种间系统关系重建、物种鉴定和分类等方面的研究上[4]，对COI基因的提取和扩增的研究就尤为重要。与总DNA的抽提相比较，mt DNA的提取相对麻烦，实验条件要求高，所需的标本量大[16]。由于跳虫的个体极为微小，这又给mt DNA的提纯造成更多不便，影响其抽提效率及抽提量。而抽提总DNA每次取5μl就足以保证PCR扩增成功，PCR反应是高度灵敏的，它仅要求在模板中含有微量的目的基因序列(只需1ng目的DNA分子)即可完成扩增。通过多次重复试验表明，抽提的总DNA中已含足够的PCR扩增所需的mt DNA模版。因此认为，在获取跳虫mt DNA COI基因时，可以采用提取总DNA作为模板，通过PCR扩增快捷地获取大量的目的基因。另外，实验所选用的引物对跳虫线粒体细胞色素氧化酶COI基因的扩增可作为其他跳虫研究的参考。

COI 篇2

基于线粒体COI基因序列探讨长江华溪蟹的遗传分化

测定了长江华溪蟹3个亚种,包括指名亚种,桐柏亚种和陕县亚种共39个样本的线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因部分的序列.重建的系统发生结果显示,长江华溪蟹分化成2个分支,一支代表雄性第1腹肢末节呈平直型的指名亚种支;另一支则代表雄性第1腹肢末节弯向背内方的`内弯型支,包括稍向内弯的桐柏亚种和明显内弯的陕县亚种在内.在内弯型支内,桐柏亚种和陕县亚种之间的遗传距离为0.018,是两大分支间的1/10.提示长江华溪蟹COI基因的遗传分化与其雄性第1腹肢末节弯曲程度的形态分化基本一致.

作 者：郑芳 吕秀玲 孙红英 赵强 Zheng Fang Lü Xiuling Sun Hongying Zhao Qiang  作者单位：南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏,南京,210097 刊 名：南京师大学报（自然科学版）  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)： 29(2) 分类号：Q953 关键词：长江华溪蟹   形态变异   遗传分化   COI基因  

COI 篇3

本研究利用线粒体CO I基因和细胞核18S r RNA基因,对药用美洲大蠊及其近缘物种等6种蜚蠊的这两个基因序列特征进行分析,并对它们分子分类的有效性进行比较和探讨,为美洲大蠊药材的准确分类提供依据。

1实验

1.1样品采集

本研究共收集云南省大理州大理大学昆虫医药研究院作邑养殖基地产美洲大蠊实验样本5个。实验样本均根据《中国动物志》及《中国药典》,经大理大学杨自忠教授进行鉴定。

1.2基因组DNA提取

取单个美洲大蠊约50 mg的胸部肌肉,采用SDS-蛋白酶K消化,酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法提取总DNA[5]提取的DNA置于-20℃保存。

1.3 PCR扩增

CO I基因、18S r RNA基因的引物序列设计分别参照Vrijenhoek[6]和Tautz等[7]的研究。CO I基因的引物序列为:LCO1490 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3',HCO2198 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3';18S r RNA基因的引物序列为:18S-ai 5'-CCT GAG AAA CGG CTA CCA CAT C-3',18S-b0.5 5'-GTT TCA GCT TTG CAA CCA T-3'。引物均由上海生工生物工程有限公司合成,PCR扩增在My Cycler Thermal Cycler型PCR仪(美国Bio-Rad公司)上进行。反应体积为50μL,包含2×Taq PCR Master Mix 25μL(天根生化科技(北京)有限公司),10μmol/L引物LCO1490、HCO2198或18S-ai、18S-b0.5各1μL,模板DNA约50 ng,灭菌dd H2O补足至终体积。PCR反应程序为:扩增条件依次为:94℃预变性3 min;35个循环的94℃变性45 s,55℃复性30 s,72℃延伸1 min;72℃延伸7 min;4℃保温。同时以灭菌dd H2O代替模板DNA作阴性对照。取2μL PCR产物上样至1.2%琼脂糖凝胶(含0.5μg/m L EB)电泳检测,其余置-20℃冰箱保存备用。对于扩增无杂带,目的条带明亮的PCR产物送交上海生工生物有限公司测序。CO I基因采用双向测序、测序引物为LCO1490、HCO2198,18S r RNA基因则采用单向测序,测序引物为18S-ai、18S-b0.5。

1.4序列分析和数据处理

用DNASTAR软件包中的Seq Man软件对获得的基因序列进行校对和编辑,并在美国生物信息中心(NCBI)网站的Genbank中搜寻最相关序列,选取蜚蠊科及用于做外群昆虫的相应序列(表1),借助在线Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)[8]进行对位排列。运用MEGA 5.2软件,根据Kimura 2-parameter模型分别构建NJ(Neighbor-joining)和ME(Minimum evolution)系统进化树,采用Bootstrap(重复数=1000)检验分子系统树各分支的置信度。

2结果与讨论

2.1 CO I和18S r RNA基因序列特征

通过美洲大蠊总DNA的PCR扩增、测序,分别得到5个美洲大蠊清晰单一的CO I基因、18S r RNA基因片段扩增产物,5个美洲大蠊个体的CO I基因和18S r RNA基因序列测定结果完全相同。与蜚蠊科其他5种昆虫序列比对,分别选取CO I和18S r RNA基因序列中没有任何碱基插入、缺失的602 bp和751 bp(分别编码和250个氨基酸)的序列片段进行分析。其中CO I基因有140个变异位点、84个简约信息位点、462个不变位点,分别占分析序列碱基的23.26%,19.95%,76.74%。18S r RNA基因有2个变异位点、0个简约信息位点、748个不变位点,分别占分析序列碱基的0.27%,0,99.60%。可变位点、简约信息位点的百分比CO I均要高于18S r RNA基因。

蜚蠊科6种昆虫CO I和18S r RNA基因平均GC含量特征有很大不同,分别为34.87%和53.35%,CO I基因中GC含量低于AT的平均百分含量(65.13%),表现出线粒体蛋白编码基因的明显偏倚性。18S r RNA基因密码子各位点的平均GC含量为第二位最高、第一位最低,但CO I基因第一、二和三密码子位点的平均GC含量均低于18S r RNA基因的相应位点。黑胸大蠊第3位GC含量(8.50%)在蜚蠊科6种昆虫的2种基因中均是最低的(表2)。

(%)

所有个体CO I和18S r RNA基因序列变异位点信息见表2。相同对百分比在CO I和18S r RNA基因序列中均为90%以上,18S r RNA基因中更是高达99.87%,密码子第3位的相同对百分比均最低,而第1、2位非常近似;对于CO I基因转换和颠换多出现在密码子的第3位和第1位,其颠换100%来自第3位密码子,而18S r RNA基因序列中没有转换位点和颠换位点(表3)。

注:“/”的前者为数值,后者为百分比。

2.2遗传距离

种间和种内遗传距离大小是物种判定的主要标准。基于CO I基因序列的美洲大蠊与其余5种蜚蠊科昆虫种间遗传距离(表4)在0.102~0.164之间,美洲大蠊种内遗传距离在0~0.020之间,前者均大于后者。基于18S r RNA基因序列的美洲大蠊与其余5种蜚蠊科昆虫种间遗传距离(表5)在0~0.003之间,美洲大蠊种内遗传距离在为0,前者与后者有遗传距离的重叠。CO I种间遗传距离均显著高于Hebert等[9]设定的2%的遗传差异。

基于CO I和18S r RNA基因序列最大种间遗传距离均发生在棕色大蠊与侧缘雪蠊之间(0.164)以及东方蜚蠊和其他5种蜚蠊之间(0.003)。美洲大蠊基于CO I基因序列种内平均遗传距离(0.012)高于18S r RNA基因序列(0)。

2.3分子系统进化分析

将获得的美洲大蠊CO I基因和18S r RNA基因序列,以姬蠊科昆虫德国小蠊为外群,分别用于对美洲大蠊及其近缘物种分别进行聚类分析,得到CO I基因和18S r RNA基因片段的NJ和ME系统进化树(图1、图2)。

基于CO I基因构建的NJ和ME两种系统树的拓扑结构基本一致,只是两树的自举置信水平稍有不同。在两种系统树中,美洲大蠊5个体首先相聚,再与同为大蠊属的澳洲大蠊、黑胸大蠊和棕色大蠊聚合。基于18S r RNA基因序列构建的NJ和ME两种系统树的拓扑结构也基本一致,也是两树的自举置信水平稍有不同。在两种系统树中,美洲大蠊5个体与澳洲大蠊、黑胸大蠊、棕色大蠊和侧缘雪蠊聚合,自举置信水平也较高(88),说明利用18S r RNA基因序列不能对美洲大蠊及其近缘物种进行有效分类鉴定。

3结论

对蜚蠊科6种昆虫CO I和18S r RNA基因序列比较分析发现,由于CO I基因序列为线粒体基因,18S r RNA为核基因,所以两种序列存在较多差异性,如:(1)CO I基因序列GC的百分含量较低,表现出明显的反GC偏倚,而18S r RNA基因中则没有这种偏倚(在CO I和18S r RNA中GC的百分含量分别为34.87%和53.35%),CO I的碱基含量分布为典型的昆虫线粒体基因特征[10];(2)CO I基因的变异位点较多,而18S r RNA基因的基本无变异位点,简约信息位点也是CO I较多,而在18S r RNA中未发现简约信息位点,由此导致美洲大蠊与澳洲大蠊、黑胸大蠊、棕色大蠊和侧缘雪蠊种内种间遗传距离相近而无法区分。但CO I、18S r RNA基因也存在一些相似点:(1)相同对百分比在CO I和18S r RNA基因序列中均为90%以上;(2)在CO I和18S r RNA基因序列中,相同对在第1、2和3位密码子中所占比例相似。通过以上分析可知变异位点、简约信息位点百分含量在不同基因、不同类别间存在差异,在本研究中,CO I较18S r RNA基因的变异率更高些,而18S r RNA基因基本无变异。