c-jun（共6篇）
c-jun 篇1
JNK (c-Jun NH2-terminal kinase) 信号通路属于促分裂素活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 家族成员之一, 参与调节细胞增殖与分化、细胞骨架调节、细胞凋亡及细胞恶变等多种生物学行为[1]。肺癌是最常见的呼吸系统肿瘤之一, 其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。本研究采用免疫组化检测JNK和c-Jun在NSCLC中的表达, 进一步明确JNK信号通路在肺癌癌变过程中发挥的作用, 以期为肺癌治疗寻找新的治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 研究对象
齐齐哈尔第一医院病理科2007年3月至2009年6月受术前未接受化疗和放疗的NSCLC手术患者肺癌标本共35例, 正常肺组织5例。依据WHO 2004年定制的肺和胸膜肿瘤组织学分类标准进行分类, 其中鳞癌15例, 腺癌18例, 大细胞癌2例。
1.2 实验试剂及实验方法
一抗JNK多克隆抗体, 一抗c-Jun (Santa Cruz公司) 、二抗山羊IgG (中杉公司) 、免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒 (福州迈新生物技术开发公司) 。石蜡标本进行5μm厚度连续切片, 切片常规脱蜡、水洗、抗原修复, 采用SP法免疫组化染色, DAB显色、复染, 检测JNK和c-Jun的表达。PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定
J N K和c-J u n蛋白表达阳性细胞可在细胞质或细胞核中见棕色或黄色颗粒沉积。阳性细胞百分比:随机选取5个高倍镜视野计数阳性细胞百分比的平均数, 阳性细胞百分比染色范围评分:0分 (0%) , 1分 (1%～25%) , 2分 (26%～50%) , 3分 (51%～75%) , 4分 (76%～100%) ;染色强度评分:3分 (棕褐色) , 2分 (棕黄色) , 1分 (淡黄色) , 0 (无色) 。切片阳性细胞百分比得分和着色强度评分二者的计分相加, 0～1分为阴性, ≥2分为阳性。
1.4 统计学方法
数据采用SPSS13.0软件进行分析, 组间比较采用单因素χ2检验进行分析, P<0.05认为具有统计学差异。
2 结果
2.1 JNK和c-Jun在NSCLC和正常肺组织中的表达
JNK阳性表达主要定位于正常肺泡上皮细胞和肺癌细胞的胞质和细胞核上。C-Jun主要表达于肺癌细胞胞核或细胞质中。在NSCLC组织中JNK的阳性表达率为74.1%, 在正常肺组织中的阳性表达率为40.0%;c-Jun在NSCLC中的阳性表达率为80.0%;在正常肺组织中未见c-Jun的表达。两种蛋白在肺癌组织和正常肺组织中的差异的表达具有统计学意义 (P<0.05) 。
2.2 JNK、c-Jun表达肺癌临床病理特征关系
NSCLC组织中JNK表达与患者性别、年龄、组织学类型、分期均无关, 而与肿瘤的分化程度、是否有淋巴结转移有关, 即肿瘤分化程度越低, JNK表达越高, 有淋巴结转移组表达高于无淋巴结转移组 (P<0.05) 。C-Jun蛋白的表达与患者年龄、性别、组织类型及肿瘤分化程度无关, 但与肿瘤分期及是否有淋巴结转移明显相关 (P<0.05) , 即在Ⅲ-Ⅳ期肺癌组织中阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期, 有淋巴结转移组表达高于无淋巴结转移组 (P<0.05) 。
3 讨论
JNK信号通路将细胞外信号传递至细胞核内, 促进核内一些转录因子的激活, 从而可以引起基因表达的改变, 所以JNK信号通路与细胞分化、增殖、凋亡、癌基因的转化以及人类多种疾病的发生发展有着重要的作用[2]。因此, JNK信号通路可以作为临床治疗上一个潜在的分子靶点。
在哺乳动物细胞中编码JNK的基因包括三种:jnk1、jnk2和jnk3;其相应的编码蛋白产物JNK1、JNK2和JNK3, 其中JNK1和JNK2在各种组织和器官中表达广泛, 而J N K 3仅局限表达于脑、心脏、睾丸等组织[2]。JNK被激活后从细胞质转移进入细胞核, 磷酸化c-Jun的Ser63和Ser73两个位点, 使c-Jun蛋白的N末端磷酸化, 进而增强c-Jun的转录活性, 从而调节下游凋亡相关靶基因的转录和凋亡蛋白的表达。C-Jun是JNK信号通路的的重要作用底物, 它的激活是活化蛋白-1 (activor protein-1, AP-1) 活化过程中的重要因素.
被刺激因子如生长因子、细胞因子和细胞应激等细胞外刺激激活后的JNK, 因其下游作用底物不同可以表现出不同的应答效应。现阶段研究表明, JNK信号通路既可以促进细胞凋亡也可抑制细胞的凋亡, 与其在不同细胞、参与不同通路调节有密切关系[3]。许多实验研究都表明JNK的表达与肿瘤的发生关系密切, 这一作用与其促进细胞增殖的作用有关[4]。在大多数自发人类鳞状细胞癌都有JNK的活化。也有相反的报道, 在对非小细胞肺癌细胞的研究中发现, JNK的激活能够抑制变异细胞的生长及肿瘤形成, 并且能够维持正常上皮细胞分化。JNK具有抑制肿瘤的作用, 可能与JNK激活后的促凋亡机制有关[5]。
有学者研究发现JNK在高中分化NSCLC组织中的阳性率高于低分化肺癌组织, 说明JNK的表达与肺癌的侵袭及进展密切相关[6]。C-jun参与调节细胞的增值分化和凋亡, 它的过度表达可以导致细胞的恶性转化。高分化喉癌组织和中无淋巴结转移喉癌组织中c-Jun高表达[7]。在肺癌组织c-jun m RNA的表达水平高于癌旁组织, 提示c-Jun可能参与了肺癌的发生发展过程[8]。
本次试验研究发现, JNK在肺癌组织中的表达高于正常肺组织, 且其在肺癌组织中的表达与肿瘤的分化程度有关, 即在高、中分化肺癌组织中的阳性表达率低于低分化肺癌组织;并且, JNK的表达与肺癌的淋巴道转移密切相关。C-Jun蛋白在正常肺组织中未见表达, 在肺癌组织c-Jun的表达与肿瘤的分期和淋巴道转移相关。JNK作为一种蛋白激酶, 作用于c-jun的转录活性域, 磷酸化的c-Jun诱导AP-1的激活;活化的AP-1参与机体的炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡等过程中。综上所述, JNK信号通路激活c-Jun介导细胞的增殖, 可能是肺癌发生发展过程中的重要因素, 联合检测JNK和c-Jun在肺癌组织的表达有助于判断肺癌的预后。
参考文献
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c-jun 篇2
关键词：鼻咽肿瘤,复发,c-Jun,磷酸化芯片
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC) 是中国南方地区及亚洲东南部最常见的肿瘤,其发病率和死亡率在头颈恶性肿瘤中居首位。 发病率为30/100 000~ 80/100 000。低分化鳞癌是鼻咽癌最常见病理类型,鼻咽癌因其位于头颅中央,且与颅底密切相连,周围环绕重要器官,极易向周围组织结构侵犯,且淋巴结转移率高,从而使手术较难彻底切除,因此放射治疗是鼻咽癌最主要的治疗手段。 鼻咽癌首程放疗后仍有8.2%~22.0%的复发率[1]。 复发鼻咽癌预后较差,其再程放疗的5年生存率为18.7%~36%[2], 有关鼻咽癌复发的特异性分子标志物的研究成为目前肿瘤研究的热点。
蛋白质相关研究在识别与肿瘤发生发展相关的蛋白质及发现肿瘤分子标志物方面具有独特的优势。 筛选初发鼻咽癌和复发鼻咽癌组织的差异表达蛋白, 将有助于探索鼻咽癌的复发机制。 磷酸化是蛋白常见的翻译后修饰方式,磷酸化在调节控制生物过程包括细胞生长、分化、浸润、转移及凋亡的细胞信号通路中起着重要作用。 蛋白激酶活性的改变引起蛋白磷酸化被认为是肿瘤形成及进展的起始。 研究复发相关磷酸化蛋白能为肿瘤的发展提供新的见解。 对初发鼻咽癌和复发鼻咽癌组织中磷酸化差异蛋白的研究,将有助于探索鼻咽癌的复发机制,并可为肿瘤的治疗提供靶向蛋白。
蛋白质印迹法等传统的技术不能敏感、快速地同时检测大量蛋白,而蛋白芯片因其具备高通量、小型化、高准确性及高敏感性的优点,目前应用越来越广。 探索性蛋白芯片由磷酸化特异抗体组成,能在特定位点测量磷酸化蛋白状态的改变,因此能用来检测肿瘤进展和转移相关磷酸化蛋白。 本研究首次采用包含656种蛋白质的Full Moon生物公司磷酸化抗体蛋白质芯片分析初发鼻咽癌(primary nasopharyngeal car- cinoma,p NPC) 和复发鼻咽癌(recurrent nasopharyn- geal carcinoma,r NPC) 患者的鼻咽癌组织中差异蛋白质的磷酸化水平, 可能有助于探索鼻咽癌的复发机制,可能为鼻咽癌的治疗提供新的治疗策略。
1材料与方法
1.1蛋白芯片及免疫组化材料
选择2003年1月~2005年9月温州医学院附属第一医院耳鼻喉科手术切除的8例鼻咽癌组织标本用于蛋白芯片试验,本研究用于免疫组化的石蜡包埋的初发与复发鼻咽癌组织取自2003年8月~2010年5月温州医学院附属第一医院病理科,所有标本均经病理确断均为鳞状细胞癌,已签署知情同意书。 蛋白芯片标本分两组:初发鼻咽癌组(p NPC组,n=4,C1~C4), 男3例,女1例,年龄28~52岁;复发鼻咽癌组(r NPC组, n=4,F1~F4)男3例,女1例,年龄36~53岁。 免疫组化标本(共40例)也分两组:初发鼻咽癌组(p NPC组, n=20)男15例,女5例,年龄29~60岁;复发鼻咽癌组(r NPC组,n=20),男15例,女5例,年龄32~62岁。 初发鼻咽癌组均是首次诊断为鼻咽癌,影像学检查颈部淋巴结及远处器官未见转移(T1N0M0)。 放疗后定期门诊随访5年仍未复发。 复发鼻咽癌组均是初次放疗后局部复发,复发的时间为24~70个月(中位时间为56个月),复发时影像学查颈部淋巴结及远处器官未见转移。 放疗应用同步加速调强放疗技术,肿瘤和肿大淋巴结(GTV)接受2.5 Gy/次,共28次,总量70 Gy。 亚临床灶和预防照射区(PTV)接受常规照射2.0 Gy/次, 共28次,总量56 Gy。 均照射1次/d,5次/周,总治疗时间为38 d。
1.2主要试剂和仪器
Full Moon蛋白磷酸化抗体芯片(上海生物芯片有限公司);脱色摇床(ZHWY-304,中国上海智诚分析仪器制造有限公司);4℃离心机(Eppendorf 5415R, Eppendorf,德国);涡旋振荡器(Votex-Genie 2,Scien tic Industries,美国);芯片扫描仪(Gene Pix 4000B,Axon Instruments,美国);芯片小型离心机(Chip Mate PMC- 082,Tomy,日本);Nano Drop 2000分光光度计(Ther- mo Fisher Scientific, 美国);c -Jun (Ab -243) 抗体及c -Jun (Phospho-Ser243) 抗体(美国Assay Biotech公司);正常山羊封闭血清、生物素化标记二抗(羊抗兔Ig G)及DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);BX生物显微镜(OLYMPUS,日本)。
1.3蛋白芯片及免疫组化步骤
1.3.1蛋白磷酸化抗体芯片的具体步骤
1.3.1.1蛋白质提取及标记使用预冷的PBS洗涤蛋白质提取和标记的组织样本, 彻底将杂质清洗干净, 把一管裂解磁珠加到组织,加入缓冲液100 μL,涡旋振荡器中剧烈混合30 s,放置冰上10 min,共重复5次。 后在4℃离心机中14 000 r/min离心15 min。 上清移入试管中。取50 μL的蛋白质提取物加到离心柱顶部,1000 r/min离心2 min,收集管底纯化蛋白。 用Nano Drop测蛋白浓度。 取20 μL(80 μg)蛋白质样品, 加到10 μg/μL的Biotin/DMF,室温下混合均匀,震荡反应2 h,加入35 μL中止液,室温下震荡反应30 min。
1.3.1.2阻断将蛋白质芯片浸没在30 m L封闭溶液中,摇床上室温55 r/min封闭30 min。芯片放入50 m L离心管,加入45 m L Milli-Q,盖紧后用手震摇10 s,倒掉Milli-Q。换入新的Milli-Q,震摇10 s,倒掉Milli-Q。重复5次。将芯片充分洗涤,从芯片表面移除封闭液。
1.3.1.3芯片杂交把6 m L生物素标记蛋白加入放置蛋白质芯片的培养皿中,芯片需完全浸没,以35 r/min在摇床上反应1~2 h,移到洗脱液中,以55 r/min在摇床上反应10 min,倒掉洗液,重复2次。按前述方法用Milli-Q水洗涤,甩掉多余Milli-Q水。
1.3.1.4荧光孵育将芯片浸没在Cy3-链亲和素,室温下避光,以35 r/min在摇床上反应1~2 h。移到洗脱液中, 55 r/min在摇床上反应10 min,把洗液倒掉,重复2次。 如前述方法用Milli-Q水洗涤, 甩掉表面多余Milli-Q水,使用压缩N2将芯片表面吹干。
1.3.1.5芯片扫描和分析采用Axon Gene Pix芯片扫描仪进行芯片扫描。采用Gene Pix Pro 6.0软件分析芯片图像,将图像信号转化成数字信号,后将芯片数据进行归一。 磷酸化比值=(复发鼻咽癌组磷酸化表达/ 复发鼻咽癌组非磷酸化表达)/(初发鼻咽癌组磷酸化表达/初发鼻咽癌组非磷酸化表达)。 芯片结果用Cluster 3.0软件进行聚类分析,Treeview 1.6软件用来将分析结果转化为可视图。
1.3.2免疫组化的具体步骤
1.3.2.1免疫组化操作步骤将石蜡包埋的复发鼻咽癌组与初发鼻咽癌组鼻咽癌组织3 μm连续切片并晾干,二甲苯浸泡脱蜡及水化,高压修复抗原,室温下5%山羊血清封闭30 min, 滴加50 μL 1∶80的c-Jun (Ab-243)抗体及c-Jun (Phospho-Ser243) 抗体,4℃冰箱过夜,室温复温30 min,滴加生物素标记二抗20 μL, 室温湿盒孵育30 min,DAB显色,用苏木精复染5 min, 用梯度酒精使脱水,用二甲苯使透明,用中性树脂封片,在室温下将其晾干,显微镜下观察。
1.3.2.2免疫组化结果分析c-Jun及p-c-Jun在复发鼻咽癌组与初发鼻咽癌组鼻咽癌组织中免疫组化染色阳性结果为黄色或棕黄色。 采用DMR+Q550型病理图像分析系统对结果进行分析,在每张切片的鼻咽癌组织带中随机选取5个高倍视野(200×),用Image- Pro Plus图像分析软件对免疫组化的图片进行分析。 蛋白磷酸化表达水平用p-c-Jun/c-Jun的值表示。
1.4统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示,以P < 0.05为差异有统计学意义。
1.5蛋白功能分析
筛选出的差异磷酸化蛋白质的磷酸化位点、相关功能及信号通路采用Phospho Site Plu磷酸化蛋白数据库(http://www.phosphosite.org/home Action.do)分析。
2结果
2.1蛋白磷酸化抗体芯片的结果
2.1.1蛋白质磷酸化抗体的芯片反应图
所有蛋白芯片无异常信号,单张芯片重复点表达水平吻合良好。采用Gene Pix Pro 6.0软件分析芯片图像,其将荧光强弱转化成芯片反应图。
2.1.2复发鼻咽癌组和初发鼻咽癌组中差异磷酸化蛋白质表达情况
初发鼻咽癌组与复发鼻咽癌组的蛋白质磷酸化水平不同。 共筛选出6个差异磷酸化蛋白质,在复发鼻咽癌组中KIT、Histone H2A、SEK1、 ATP1A1、Synapsin的磷酸化水平均上调,差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。 6个磷酸化蛋白质的差异位点也被识别。 见表1。
2.1.3差异磷酸化蛋白质的聚类结果
本研究还对筛选出的差异磷酸化蛋白质进行聚类分析,6个差异磷酸化蛋白质的聚类结果见图1(封三)。
2.1.4差异磷酸化蛋白质的相关功能及通路分析
通过在线网络数据库phosphosite (http://www. phosphosite.org/home Action.do) 分析6个差异蛋白的磷酸化位点、相关功能及在信号通路中的作用,发现c-Jun、Histone H2AX、SEK1、KIT的蛋白酪氨酸(Tyr) 或丝氨酸(Ser)磷酸化,通过不同的信号通路参与抑制细胞凋亡、基因调控、促细胞增殖等过程,可能与鼻咽癌复发有关,还可提示预后、评价疗效及提供治疗靶点。 但ATP1A1、Synapsin的磷酸化水平改变在肿瘤复发中的具体作用还不清楚。 目前尚未发现ATP1A1、Histone H2AX及KIT蛋白参与的相关信号通路。 6个差异蛋白的功能、磷酸化位点及在信号通路中的作用详见表2。
注:“-” 表示在phosphosite数据库中目前尚未发现此蛋白参与的相关信号通路
2.2免疫组化结果
所有切片均显色,可见c-Jun、p-c-Jun均表达于细胞核, 阳性表达结果为呈黄色或棕黄色颗粒,见图2。 初发鼻咽癌组p-c-Jun/c-Jun的比值为(0.713± 0.096),复发鼻咽癌组p-c-Jun/c-Jun的比值为(0.621± 0.082),p-c-Jun/c-Jun的比值在两组间比较有明显差异(P=0.048)。 采用免疫组化比较初发鼻咽癌和复发鼻咽癌组织中c-Jun的蛋白磷酸化水平,发现在复发鼻咽癌组中,c-jun磷酸化水平更低,与蛋白芯片的结果相符。
3讨论
鼻咽癌是头颈恶性肿瘤最常见的肿瘤,其发病率和死亡率均位居首位。 鼻咽癌首选治疗方法是放射治疗。 仍有约30%鼻咽癌常规放疗后局部复发。 鼻咽癌放疗后复发的机制目前还不清楚,其可能与细胞周期调控、DNA损伤修复、增殖及细胞凋亡等信号转导通路改变有关。
磷酸化和去磷酸化是蛋白功能修饰调节的重要方式,在整个生命活动过程贯穿始终。 当蛋白的磷酸化和去磷酸化调控异常时, 会导致正常细胞凋亡、分化及激活信号传导通路,最终引发恶性肿瘤。 研究鼻咽癌复发相关磷酸化蛋白质水平的改变可能有助于揭示鼻咽癌复发的分子机制。
传统研究磷酸化蛋白的技术因其非高效及高通量,不能同时满足多重蛋白磷酸化的研究。 Full Moo磷酸化蛋白芯片技术(PEX100)作为一种新型的高通量蛋白质组学技术[3],共包含656种蛋白质,其能检测蛋白特定位点的磷酸化水平的改变。 所选抗体位点均选自文献且经实验证实,每个所含磷酸化蛋白位点都设有磷酸化和非磷酸化的配对特异抗体,能定量检测蛋白的磷酸化水平。 蛋白芯片内所含抗体位点均设置多个重复(2~6个重复),同时含有阳性参照和阴性参照,确保实验结果的准确。 此外,蛋白芯片还具有集成化、微型化和高通量化的特点,它不但能鉴别出特定蛋白激酶的亚型, 还可揭示信号通路之间的相互联系。 故本研究采用磷酸化特异蛋白芯片来鉴别鼻咽癌复发相关的磷酸化蛋白,从而可为鼻咽癌复发提供分子机制和新的治疗策略。
本研究首次采用Full Moon蛋白磷酸化芯片来检测初发鼻咽癌组鼻咽癌和复发鼻咽癌组的差异蛋白磷酸化水平。 结果共发现有6个差异磷酸化蛋白质其中Histone H2A、SEK1、KIT、ATP1A1及Synapsin 5个蛋白质在复发鼻咽癌组鼻咽癌组织中的磷酸化水平显著升高,c-Jun蛋白在复发鼻咽癌组鼻咽癌组织中的磷酸化水平显著下降。 本研究采用免疫组化对c- Jun蛋白进行验证,结果与芯片结果符合,说明芯片结果真实可信。
Phospho Site Plus (http://www.phosphosite.org/) 是一个包含蛋白质磷酸化位点的数据库网站,里面含有大量蛋白质磷酸化位点信息,包括蛋白的相关信息如基本结构,功能及相关信号通路等。 本研究采用此网站分析筛选出的6个蛋白磷酸化位点变化及在信号通路中的作用。
在复发鼻咽癌组中磷酸化水平上调的蛋白质中KIT蛋白是Ⅲ型酪氨酸激酶家族的重要成员, KIT激活后,Grb2衔接其Tyr936及703,与SOS蛋白作用激活Ras蛋白,后激活Mek1/2及ERK1/2,从而影响基因转录。 KIT激活突变会引起肿瘤,超过90% 的胃间质瘤由KIT激活突变所致,鼻咽癌细胞株中KIT也存在过表达。 KIT是酪氨酸激酶抑制剂(如伊马替尼的靶点之一, KIT的突变导致Tyr激活,致胃肠道间质瘤中甲磺酸伊马替尼耐药,引起肿瘤复发[4]。 H2AX属于组蛋白的一种,其主要参与基因组稳定的维持DNA损伤修复和抑制肿瘤。 DNA双链断裂引起位于丝氨酸139位C末端的H2AX磷酸化形成“γ-H2AX” 引起下游分子磷酸化,引起生物级联反应,触发细胞凋亡。 H2AX的翻译后修饰(如ser139磷酸化)可能与放射抵抗有一定相关性[5]。 放疗前测量 γH2AX含量可预测患者的放疗敏感性[6],并对临床放疗剂量的选择具有一定指导意义。 MKK4/SEK1可磷酸化和激活JNK和p38MAPK。 Akt可磷酸化SEK1的Ser78,抑制SEK1介导的凋亡[7]。近来有研究发现,MKK4蛋白在肿瘤发生、发展及转移过程中发挥着重要的作用[8]。 MKK4蛋白表达上调可能在口腔鳞状细胞癌与喉鳞癌的浸润转移过程中发挥了促进的作用[9]。
在复发鼻咽癌组中磷酸化水平下调的蛋白质中c-Jun属于转录因子(activating protein-1 ,AP-1 ) 家族。 在外界信号如紫外线照射作用下,Jun激酶(JNK与Jun的N段连接从而使Jun磷酸化。 c-Jun的Ser- 243磷酸化可促进其与SP1结合,从而增强c-Jun调控基因的能力[10]。 研究发现宫颈癌中Ser-243磷酸化减少后,c-Jun蛋白的稳定性增加,致瘤能力增强[11]c-Jun/AP-1是信号转导通路末端的转录因子, 与多种细胞行为如肿瘤细胞的侵袭、细胞癌变和转移等有密切关系。 Jun激酶的激活与细胞凋亡与细胞增殖有关。c-Jun通过抑制凋亡促进肿瘤细胞增殖。更多的证据表明JNK在头颈部肿瘤发生和进展中有非常重要的作用,JNK影响蛋白1(JIP-1)是JNK的较强抑制剂, 在鼻咽癌细胞的增殖中起着重要的阴性调节作用,并代表鼻咽癌新的治疗靶点[12]。 研究表明Jun通路在辐射诱发的凋亡中有着至关重要作用,其可为干扰SAPK通路提供新的策略,利于肿瘤的治疗[13]Gee等[14]研究发现活化的c-Jun可与MAPK信号通路成员相互作用。c-Jun可能对预后有一定的提示作用但目前尚存在争议[15,16]。c-Jun蛋白涉及多条相关通路如MAPK信号通路、SAPK/JNK信号通路及Erb B/HER信号通路等,提示鼻咽癌复发是多通路作用的结果。 因此阻断单一通路靶点可能无法成功阻断肿瘤下游信号转导, 提示多靶点药物合并治疗可能提高治疗效果,有利于克服鼻咽癌复发。
c-jun 篇3
1 资料与方法
1.1一般资料
收集2012年8月~2014年9月于北京市海淀医院普通外科手术切除的50例结直肠癌组织和20例正常大肠组织(非结直肠癌)。结直肠癌患者50例中,男37例,女13例;年龄37~78岁;结直肠癌Dukes分期:A期5例,B期17例,C期20例,D期8例; 有淋巴结转移者35例,无淋巴结转移者15例;术前均未接受放、化疗及免疫治疗,术后均经病理检查证实。非结直肠癌患者20例中,男14例,女6例,年龄30~72岁。本研究经医院伦理委员会审查通过,患者均签署知情同意书。
1.2 c-JUN、E-selectin、VEGF-D 蛋白检测
试剂盒购自武汉博士德生物技术公司,所有组织均经10%甲醛固定,石蜡包埋,制成4μm厚病理切片,贴附于多聚赖氨酸的载玻片上。采用免疫组化SP法检测, 一抗均为鼠抗人单克隆抗体,DAB显色,全部操作过程均按试剂说明书进行,用已知阳性切片作为阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定标准[4]
采用双人双盲法判定,免疫组化阳性初步判定标准为细胞核或细胞核与细胞质中同时出现棕黄色颗粒,1阳性细胞百分比评定标准:随机选取4个高倍镜视野,每个视野计数100个细胞,计算阳性细胞的百分比,0分为阳性细胞数百分比为0,1分为阳性细胞数≤10%,2分为10%<阳性细胞数百分比≤50%,3分为50% < 阳性细胞 数≤75% ,4分为阳性 细胞数>75%。2染色强度评分标准:0分为无显色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。免疫组化最终结果判定标准: 阳性细胞百分比与染色强度评分的乘积< 3为免疫组化结果阴性,≥3为免疫组化结果阳性。
1.4 统计学方法
所有数据用SPSS 12.00对数据进行分析,计数资料以率表示,采用χ2检验;相关性分析应用Spearman相关分析法,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 c-JUN、E-selectin、VEGF-D 蛋白表达
c-JUN、E-selectin、VEGF -D蛋白在结直肠癌组织中表达的阳性率明显高于正常结直肠黏膜表达率,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见表1。
注:c-JUN:c-JUN 氨基末端激酶;E-selectin:E-选择素;VEGF-D:血管内皮生长因子-D
2.2 c-JUN 与 E-selectin、VEGF-D 在 结直肠癌 中 的表达与病理特征的关系
c-JUN与E-selectin、VEGF-D阳性表达率与患者年龄、性别、肿瘤发生部位无关(P > 0.05),与Duckes分期、有无淋巴结转移有关(P < 0.05)。见表2。
注:c-JUN:c-JUN 氨基末端激酶;E-selectin:E-选择素;VEGF-D:血管内皮生长因子-D
2.3 c-JUN 与 E-selectin、VEGF-D 相关性
c-JUN与E-selectin呈正相关(r = 0.6394,P < 0.05),c-JUN与VEGF-D呈正相关(r = 0.6592,P < 0.05)。
3 讨论
结直肠腺癌作为一种发病率较高的消化道恶性肿瘤,已经被基础与临床研究工作者所关注,从病理特征上观察,其具有其他恶性肿瘤的共同特点:瘤体失控性迅速生长,并发生原发肿瘤部位以外的远端转移。对于恶性肿瘤的生长及转移,虽然其确切的机制未完全阐明,但大量病理研究结果表明:肿瘤组织内可见新生血管及淋巴管大量形成,这些新生血管一方面可以为肿瘤细胞的生长提供营养支持,另一方面可能为肿瘤细胞的转移提供条件。所以,肿瘤组织内新生血管与淋巴管的大量增生是肿瘤生长与发展的必要条件,研究分析这些病理改变的相关因素可能为进一步了解肿瘤的发病机制提供新的途径。
在正常生理情况下,机体内存在一个“精密”的调控体系,对于一般性损伤所需要的修复可以通过一些“免疫因子”来完成 ,VEGF是一类能促进血管内皮生长的免疫因子,可以由血管内皮细胞产生释放,促进血管形成及生长[5],在正常生理条件下 ,VEGF表达较少,但在病理条件下,在某些恶性肿瘤组织中可以检测到其高表达,已有研究报道在乳腺癌、肝癌、大肠癌等肿瘤疾患中VEGF有高表达[6,7,8]。VEGF-D是VEGF的一个亚型,与VEGF-C有近50%的基因同源性,据研究主要作用是促进新生血管生长,并且可以增加血管内皮细胞的通透性。在以往的研究中发现[9],在胃肠道肿瘤疾患中,VEGF-D在肿瘤组织内特异性染色检查显示有高表达, 表明可能有促进肿瘤组织中新生血管形成的作用, 即VEGF-D对肿瘤的生长有促进作用。所以,最新的观点认为VEGF-D是一种较强的肿瘤生长刺激因子。本研究观察也验证了这一观点:在结直肠腺癌中,VEGF-D表达增高,并随肿瘤的病理分期进展而持续增加, 同时在有淋巴结转移的病例中有较高表达, 提示其与结直肠癌的发展及转移密切相关。
恶性肿瘤细胞的转移是恶性肿瘤特征的另一大表现,据研究,恶性肿瘤细胞可以浸润性生长并突破血管的基底膜进入血液循环发生远端转移,其相关作用机制较为复杂, 可能有多种相关免疫蛋白参与,经过多年研究,现在一致的观点认为:首先,是恶性肿瘤细胞自身会发生变异,逃避机体免疫免疫系统的发现与清除;其次,某些活性免疫蛋白分子可以在瘤体局部活性增高,诱使肿瘤细胞较易发生局部位移,突破血管基底膜进入血液循环,最终发生距离较远的迁移与种植[10]。E-selectin是一种免疫因子,属于选择素家族中的一个重要成员, 可以由血管内皮细胞分泌,作用为促进炎性反应细胞(中性粒细胞、巨噬细胞等)与血管内皮细胞发生黏附,为炎性细胞到达炎症部位发挥作用而创造条件[11]。在某些肿瘤疾患中,E-selectin的高表达与肿瘤细胞的转移可能存在密切的联系,如胃癌患者肿瘤组织内和血清中都可以检测到E-selectin分泌水平高于正常健康人,并与肿瘤分级和有无淋巴结转移有密切关系[12]。本研究结果也可以观察到E-selectin在肿瘤组织内的表达增高, 与VEGF-D一样, 随肿瘤病理分期加深和淋巴结转移而进一步增加。
近年来,在肿瘤相关研究中,基因调控的观点备受关注,即许多免疫蛋白的表达都可能有一个或几个信号传导途径参与调控,在这些途径上的关键调控因子则成了研究的热点[13]。C-JUN是机体内一个重要的调控通路的位点,属于有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen actived protein kinase,MAPK) 的一个重要的细胞内信号传到通路,与细胞的代谢、生长、增殖有关[14]。有研究表明[15,16]:肿瘤组织内免疫组化检测可见c-JUN蛋白呈强染色表达, 提示肿瘤细胞增生分化可能有c-JUN蛋白信号传导通路参与,但具体作用机制未完全阐明。在本研究中也可以观察到c-JUN的表达增高,统计学分析显示c-JUN与VEGF-D和E-selectin的表达均有正相关性, 此结果提示c-JUN蛋白可能是VEGF-D和E-selectin蛋白分泌的一个上位调控位点,c-JUN增高, 促进VEGF-D和E-selectin的相应增高, 提示c-JUN对VEGF-D和E-selectin有调控作用。c-JUN是上位控制蛋白, 而VEGF-D和Eselectin是下位“靶蛋白”,在正常情况下 ,应该存在负反馈调节,但肿瘤疾患中,原有的调节系统会出现紊乱,可能出现与正常调节相反的正反馈调节,促进肿瘤的生长。依据以上推论,假设如果能控制肿瘤组织中c-JUN的高表达,是否可以控制VEGF-D和E-selectin的过量分泌,但从现今的研究进展看,肿瘤的发生、发展是一个多种免疫蛋白参与的复杂过程,更加复杂的是多种免疫蛋白还存在相互作用的网络性[17,18],c-JUN信号传导通路可能并非是结直肠癌中唯一的信号传导调控通路,随着分子生物学的研究进展势必有更多的信号传导通路会被发现,所以现在的研究结果并非能全面阐述肿瘤的发生与演变,特别是仅几个免疫蛋白的表达变化并不能完全反映机体整体的免疫变化,还需要大量的研究提供重要的线索来充分阐明肿瘤发生与发展的确切作用机制,为将来更多的有效治疗提供新的依据。
本研究对结直肠癌组织中VEGF-D和E-selectin的表达进行检测,结果提示两者表达的共同增加是一个明显的特征性改变,VEGF-D可以促进血管及淋巴管不断增生,瘤体血运丰富,肿瘤细胞生长活跃,但肿瘤细胞仅在局部生长而不能移动, 则不会发生转移。恶性肿瘤细胞的转移必然需要其他免疫因子的帮助,E-selectin可能起到了关键作用, 其在肿瘤组织内部大量表达,推测可能促进了肿瘤细胞与血管内皮细胞或淋巴管内皮细胞的黏附,一旦突破了基底膜,肿瘤细胞便会发生转移。两者之间还可能存在协同促进作用,但具体机制还需要更加深入的研究。
c-jun 篇4
1) 为湖南省教育厅科研基金项目(No.07C484),湖南省教育厅青年科研基金项目(No.05B034)
平滑肌细胞增殖的原因在于细胞外的各种因子刺激了丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号转导通路,引起了通路上相关因子的级联反应,c-fos、c-jun是该通路的下游效应因子。动脉粥样硬化又属于中医血瘀证范畴。中医药在防治动脉粥样硬化特色鲜明,疗效颇佳,血府逐瘀汤可谓其代表方之一。本实验以c-fos、c-jun为研究对象,开展血府逐瘀汤抗动脉粥样硬化血瘀证的机制研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 日本大耳兔60只,体重1.8 kg~2.2 kg,雄雌各半,由湖南中医药大学实验动物中心提供,合格证号:湘医动字2001-003。
1.1.2 实验药物 血府逐瘀汤[3]:桃仁12 g,红花9 g,当归9 g,生地黄9 g,川芎5 g,赤芍6 g,牛膝9 g,柴胡3 g,桔梗5 g,枳壳6 g,甘草3 g。根据血府逐瘀汤以上药物的组成及剂量,对其进行治法拆方。桃红四物汤加减:桃仁12 g,红花9 g,当归9 g,生地黄9 g,川芎5 g,赤芍6 g,牛膝9 g;四逆散加减:柴胡3 g,赤芍6 g,枳壳6 g,桔梗5 g,甘草3 g。购于湖南中医药大学附属第一医院。全方各药物先加冷水浸泡30 min,水漫过药面3 cm左右,沸腾后煎40 min,过滤取汁,再进行第2次煎煮,两煎所得滤液混合后浓缩,分别含生药0.71 g/mL、0.55 g/mL、0.21 g/mL,4 ℃冰箱保存。以70 kg成人体表面积换算给药剂量,按2倍剂量给药,分别为7.1 g/kg、5.5 g/kg、2.1 g/kg。胆固醇:上海试剂一厂生产,蛋黄粉:大连绿雪蛋品发展有限公司生产。
1.1.3 实验试剂 c-fos免疫组化染色试剂盒:由武汉博士德生物工程有限公司提供;c-jun免疫组化染色试剂盒:由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.1.4 实验仪器 Motic B3双目生物摄影显微镜:麦克奥迪实业集团公司提供;MIASE医学图像分析管理系统:北航公司提供;Finesse 325切片机:英国Thermo ShanDon公司提供;JY3002高精度电子天平:上海友声衡器有限公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及造模[4] 将60只兔随机分为空白组、模型组、血府逐瘀汤组(血府组)、桃红四物汤组(桃红组)、四逆散组(四逆组),共5组,每组12只。空白组每日给予普通饲料,其余各组每天给予高脂饲料100 g(含胆固醇1 g、猪油5 g、蛋黄粉7.5 g),待全部吃完后补充足量普通饲料;造模同时灌胃给药10 mL/(kg·d),按上述生药量给药,相当于成人每日用药量的2倍;空白组和模型组给予等体积凉开水。连续12周。
1.2.2 标本采集与处理 造模后,动物体重增加,但中途灌死、病死较多,剔除后每组7只,实验至12周,禁食8 h后处死动物,速取主动脉组织,去除上面附着组织。将标本浸入4%多聚甲醛溶液中,固定48 h,取块石蜡包埋。
1.2.3 指标检测方法 免疫组化染色采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法。实验步骤按试剂盒操作进行。
1.2.4 结果判断 c-fos、c-jun蛋白以细胞质呈棕黄色颗粒为阳性。每张切片在40倍物镜下随机选取5个视野,用MIAS医学图像分析系统测定c-fos、c-jun 蛋白质在平滑肌细胞中表达的阳性颗粒总数。
1.3 统计学处理 计量资料以均数±标准差
2 结 果
2.1 主动脉c-fos免疫组化蛋白表达结果
主动脉c-fos阳性表达为棕黄色颗粒,主要存在于主动脉平滑肌细胞质中。空白组有一定量的基础表达,模型组阳性颗粒明显高于空白组(P<0.01)。与模型组比较,血府组和桃红组主动脉c-fos阳性颗粒表达均降低(P<0.05或P<0.01),四逆组差异无统计学意义(P>0.05)。各药物组与空白组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。四逆组c-fos蛋白表达的降低不及血府组(P<0.05),桃红组与血府组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。
2.2 主动脉组织c-jun免疫组化蛋白表达结果
主动脉c-jun 蛋白阳性表达为棕黄色颗粒,主要存在于主动脉平滑肌细胞质中。空白组有一定量的表达,模型组阳性颗粒数显著高于空白组(P<0.01)。各药物组与模型组比较,血府组、桃红组和四逆组主动脉c-jun蛋白阳性颗粒均降低(P<0.05)。血府组、桃红组和四逆组主动脉c-jun蛋白阳性颗粒均显著高于空白组(P<0.01)。详见表1。
3 讨 论
c-fos、c-jun是ERK1/2蛋白激酶的作用底物[4],ERK1/2通过磷酸化Thr79和Thr396而激活P90RSK。P90RSK活化的结果之一就是移位入核,并在c-fos羧基端的转录抑结构域的ser362位点磷酸化c-fos。因此,有人把c-fos、c-jun称为“第三信使”。c-jun编码的jun蛋白属于激活蛋白-1(AP-1)家庭成员之一,jun亚类成员可与任何AP-1家族转录因子能通过亮氨酸拉链结合形成同源或异源二聚体,而fos亚类只能和jun亚类之间形成异源二聚体。
c-fos与c-jun形成的异源二聚体可对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖产生作用,温进坤等[5,6,7]研究发现,细胞增殖的刺激引起c-fos、c-jun基因的高表达,随后出现细胞迅速增生。本研究结果与其报道基本相符,长时间用高胆固醇饲喂动物,模型组与空白组比较,发现其主动脉内膜明显增厚,大量脂质沉积,出现大量泡沫细胞,Vsmc发生增殖,同时,模型组的原癌基因c-fos、c-jun蛋白表达增强。但在使用血府逐瘀及其拆方后,情况却发生了变化。与模型组比较,血府逐瘀汤和桃红四物汤都能降低c-fos、c-jun蛋白的表达,而四逆散只能降低c-Jun蛋白的表达,说明血府逐瘀及其拆方可以通过抑制MAPK信号转导通路下游效应因子c-fos、c-jun蛋白表达来抑制VSMC增殖。
通过免疫组化实验,本研究发现血府逐瘀汤及其活血拆方桃红四物汤和行气拆方四逆散对平滑肌细胞c-fos、c-jun蛋白分别具有降低的作用,说明在抗动脉粥样硬化治疗过程中,血府逐瘀汤及其活血、行气拆方有一致性的作用靶点,活血、行气药物的配伍可能对血府逐瘀汤降低平滑肌细胞c-fos、c-jun蛋白的功效都有一定的影响。活血、行气药物的有机配伍可能会产生功效的交互或叠加,从而使全方功用齐备、主治确切、疗效显著。
参考文献
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c-jun 篇5
关键词：脑缺血,一氧化氮,海马,JNK3
缺血再灌注神经元损伤能诱导多种神经性疾病,如急性退行性神经失调、亨廷顿舞蹈病、帕金森综合征、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化等慢性退行性神经疾病,对人类尤其是对老年人健康危害更大,而缺血再灌注神经元损伤的分子机制至今尚未完全探明。一氧化氮(nitric oxide,NO)是非经典神经递质和细胞功能调节因子,其维持神经系统的正常功能和对缺血性脑损伤的保护作用日益受到关注,但具体机制不十分清楚。JNK3是c-Jun氮末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)的3种异构体之一,能比较特异性地在脑组织中表达,Bad(ser128)和c-Jun是JNK3的下游底物,已被生物学家看成细胞杀手[1]。本实验通过观察一氧化氮供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡、JNK3、Bad(ser128)和c-Jun磷酸化的影响,以明确一氧化氮的脑保护作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组
健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠90只,体重250~300 g,清洁级,由徐州医学院实验动物中心提供。大鼠被随机分为3组,缺血15 min再灌5 d为甲组,再灌30 min为乙组,再灌6 h为丙组。各组又分为假手术组、缺血再灌注组(对照组)、硝普钠组、硝普钠+阻断剂组(阻断剂组)和溶剂组,各6只。甲组用于海马CA1区神经元凋亡检测,乙组用于JNK3和Bad(ser128)磷酸化测定,丙组用于c-Jun磷酸化测定。
1.2 动物模型制备及给药方式
用20%水合氯醛(300~350 mg/kg)腹腔注射麻醉动物后,参照胡薇薇等实验[2]分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第2天于动物清醒状态下结扎双侧颈总动脉,使全脑缺血15 min,然后再灌注不同的时间,缺血时保持其直肠温度36.5~37.5℃,以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组的处理同实验组,但不结扎双侧颈总动脉。硝普钠组于缺血前20 min给药,腹腔注射硝普钠5 mg/kg,阻断剂组同时腹腔注射硝普钠5 mg/kg和阻断剂DTT(DL-Dithiothreitol,二硫苏糖醇)60μg/kg,溶剂组给予相同体积的生理盐水。
1.3 焦油紫染色
甲组于再灌注第5天,以水合氯醛麻醉大鼠,接着以生理盐水和4%多聚甲醛进行心室灌注。取脑组织在4℃多聚甲醛中固定1 d以上后,于梯度乙醇溶液中脱水并在二甲苯中透明。包蜡后的脑块进行切片(5μm),经脱蜡、二甲苯,最后放于焦油紫溶液中染色。取海马CA1区1 mm内的细胞数量作为计数标准。
1.4 J NK3和Ba d(s e r128)磷酸化免疫沉淀和免疫印迹检测
乙组于再灌30 min将大鼠快速断头取脑,分离双侧海马,置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行。从液氮中取出海马,加1.7 m L匀浆缓冲液(50 mmol MOPs,pH7.4,100 mmol氯化钾,0.5μmmol氯化镁,0.2 mmol DTT,1 mmol正钒酸钠,0.1 mmol EDTA,1 mmol EGTA,0.5 mmol鸟本苷,0.1 mmol PMSF,5μg/m L Ieupeptin和5μg/m L pepstatin A,0.32 mol蔗糖),用Teflon匀浆器高速匀浆(10 s×6次),800 g×10 min离心,弃上清液,加入0.6 m L buffer B振荡摇匀,12 000 g×10 min离心,取上清,按改良Lowry法,以牛血清白蛋白为标准蛋白测蛋白,经过计算,各组试样配成相同蛋白浓度后分装,置-80℃冰箱待用。免疫印迹法检测Bad(ser128)磷酸化:等量蛋白试样经7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,以湿转法电转移至NC膜上,转移缓冲液(25 mmol Tris、190 mmol甘氨酸、20%甲醇和0.05%SDS。转移后的NC膜经封闭液(10mmol Tris,pH7.5,10 mmol氯化钠,0.1%Tween 20)室温封闭3 h后加入一抗p-JNK3、p-bad(ser 128),4℃过夜。用洗涤液洗膜3遍,加入二抗羊抗兔IgG-AP,37℃反应2 h,洗膜。以NBT/BCIP显色,水洗终止反应。免疫沉淀法检测JNK3磷酸化:试样蛋白400μg,加入SDS和DTT至终浓度分别为0.5%和1mmol,煮沸5 min后,用缓冲液(20 mmol MOPs,pH7.4,150 mmol氯化钠,1%Triton X-100,0.5%NP-40,1mmol EDTA,1mmol正钒酸钠,0.2 mmol PMSF)稀释4倍。加入p-JNKs和蛋白A-Sepharose(50μL)保温(4℃)45 min,离心除去非特异结合到蛋白A-Sepharose上的蛋白。上清与特异p-JNKs抗体保温(4℃)4 h(轻轻摇动),加入蛋白A-Sepharose(50μL)继续保温(4℃)4 h,离心收集免疫沉淀物,用上述缓冲液洗涤3次,收集沉淀试样然后以JNK3为二抗再按上述免疫印迹步骤操作即可检测JNK3磷酸化。用图像处理仪(Gene Company)对结果进行分析处理,假手术组的灰度设为1,其他各组以假手术组为标准分别计算出相对值。
1.5 c-J un磷酸化免疫印迹检测
丙组于再灌注6 h将大鼠快速断头取脑,分离双侧海马,按1∶10(W/V)加入冰冷的匀浆液,Teflon匀浆器匀浆,1 000 g 4℃离心10 min,取上清液15 000 g 4℃离心30 min,收集沉淀(颗粒部分),所得沉淀用含0.5%Nonidet P-40(NP-40)、0.1%Brij 35和0.1%去氧胆酸钠的匀浆液悬浮,4℃孵育30 min后,15 000 g 4℃微量离心机离心15min,所得上清作为胞核部分。按改良Lowry法,以牛血清白蛋白为标准蛋白测蛋白后,经过计算,各组试样品配成相同蛋白浓度后分装,置-80℃冰箱待用。等量蛋白试样经7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,以湿转法电转移至NC膜上。转移后的NC膜经3%BSA室温封闭3 h后加入一抗p-c-Jun,4℃过夜。用洗涤液洗膜3遍,加入二抗羊抗兔IgG-AP,37℃反应2 h,洗膜。以NBT/BCIP显色,水洗终止反应。用图像处理仪(Gene Company)分析处理结果。
1.6 统计学分析
以SPSS 11.0统计软件进行分析处理。所有数据经检验方差具有齐性,以均数±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
因本实验室以前的研究已证实,与假手术组相比,脑缺血再灌注组第5天海马神经元损伤严重;再灌注30 min脑组织中JNK3和Bad(ser 128)的磷酸化程度显著增高(P<0.05);再灌注6 h c-Jun的磷酸化程度显著增高(P<0.05),而JNK3、Bad(ser128)和c-Jun磷酸化的升高会给神经元带来显著损伤[8]。故本文仅取甲组的存活神经元数、存活量表示大鼠海马CA1区神经元细胞存活情况,用乙组的JNK3和Bad(ser 128)及丙组的c-Jun数值表示大鼠JNK3、Bad(ser 128)和c-Jun的磷酸化情况,见附表。
注:1)与假手术组比较,P<0.052)与对照组、阻断剂和溶剂组比较,P<0.05
2.1 神经元凋亡
假手术组海马CA1区仅仅有少量细胞凋亡,对照组凋亡细胞与假手术组相比明显增多(P<0.05),硝普钠组凋亡细胞较对照组、阻断剂组和溶剂组显著减少(P<0.05)。阻断剂组、对照组和溶剂组之间差异无显著性(P>0.05),见附表。
2.2 J NK3和Ba d(s e r128)的磷酸化
假手术组JNK3和Bad(ser128)的磷酸化有一定水平,对照组较假手术组显著升高(P<0.05),硝普钠组JNK3和Bad(ser128)的磷酸化较对照组、阻断剂组和溶剂组显著降低(P<0.05)。阻断剂组、对照组和溶剂组之间差异无显著性(P>0.05),见附表和附图。
2.3 c-J un的磷酸化
假手术组c-Jun的磷酸化有一定水平,对照组较假手术组显著升高(P<0.05),硝普钠组c-Jun的磷酸化较对照组、阻断剂组和溶剂组显著降低(P<0.05)。阻断剂组、对照组和溶剂组之间差异无显著性(P>0.05),见附表和附图。
3 讨论
在脑缺血再灌注损伤机制的研究中,一氧化氮的保护作用已经引起广泛关注。一氧化氮作为细胞间信使物质在中枢神经系统行使多种生理功能,同时它还是一种重要的脑缺血损伤介质,参与血管调节、神经递质传递、炎症、免疫反应等过程[3~5]。脑海马CA1区是对缺血最为敏感而发生大量细胞凋亡的区域之一[6],本实验通过焦油紫染色法检测海马CA1区神经元的凋亡情况证实了这一点。在本实验中以硝普钠作为一氧化氮的供体,实验结果显示:硝普钠组海马CA1区神经元凋亡明显少于对照组、阻断剂组和溶剂组,说明一氧化氮对脑缺血再灌注引起的海马CA1区神经元凋亡具有很好的保护作用。
近几年,研究脑中风神经元凋亡的热点之一是MAPK(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路。MAPK由上游蛋白激酶MAPKK激活,而MAPKK由其上游MAPKKK激活,形成三酶级联反应。MAPK是一个丝/苏氨酸蛋白激酶家族,由ERK、JNK和p38MAPK组成,每一个都各自形成独立的三酶级联信号通路[7]。其中,JNK信号通路是:MLK→MKK4/7→JNKs。JNK有JNK1、JNK2和JNK3三种异构体,分别由jnk1、jnk2和jnk3 3种基因编码[6]。转录因子c-Jun是JNK的天然底物,而JNK主要分布于胞质,接受胞外的信号后可转至胞核,通过对c-Jun的磷酸化而改变基因的表达水平,从而引起生长阻滞、细胞凋亡等。Bad(ser 128)是JNK3的下游信号物质,它可以和Bcl-xl及Bcl-2二聚化结合使与之结合的Bax置换出来形成Bax的同源二聚体,从而逆转Bcl-xl和Bcl-2对凋亡的抑制作用,进一步促进细胞凋亡[8]。本实验室研究报道,在脑缺血再灌30 min时JNK和Bad(ser 128)的磷酸化达到高峰,6 h时c-Jun的磷酸化达到高峰,这两个高峰都促使神经元的凋亡[9]。本实验分别检测了脑缺血再灌30 min时JNK3和Bad(ser 128)的磷酸化及6 h时c-Jun的磷酸化情况,结果显示它们的磷酸化程度在给硝普钠后明显降低,提示一氧化氮能够抑制JNK3、Bad(ser 128)和c-Jun的磷酸化程度。
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c-jun 篇6
1 材料与方法
1.1 动物 雄性Wistar大鼠60只,体质量(200±12)g,由北京医科大学动物中心提供。随机分为10组,分单纯缺血30min再灌流0、0.5、1、3、6、12、24、48天8个时点组和正常对照组、假手术组,每组6只大鼠。各组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 主要试剂 细胞凋亡原位检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司,c-fos、c-jun抗血清购自santa crnz Biotechnology Inc USA。羊抗兔IgG-HRP购自华美生物工种公司,DAB购自上海一厂。
1.3 方法
1.3.1 大脑中动脉闭塞/再灌流模型:采用线栓法[3]制成。大鼠麻醉后仰卧固定,取颈正中切口,分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉。结扎并剪断颈外动脉,剪口将尼龙线栓插入,并稍结扎以防溢血。将线栓插入,经颈内动脉入颅到大脑前动脉起始处,阻断自颈内动脉和大脑前动脉流向大脑中动脉的血流。术后鼠苏醒,出现右前肢屈曲和前进时右侧划圈症状,证明左侧大脑中动脉阻塞成功。到时拔出线栓使栓子头部退到颈外动脉残留盲端,这样即可使大脑中动脉继续从Willis环获得供血,又不致影响同侧颈内动脉供血。插入前栓子涂布肝素,平均插入深度为(20.0±0.2)mm。假手术组插入栓子15mm,因栓子短不足以闭塞大脑中动脉起始部,其余步骤同上。
1.3.2 Tunel法:石蜡切片常规脱蜡,乙醇梯度入水,加蛋白酶K(20μg/ml)消化,加0.3%过氧化氢(H2O2)灭活内源性过氧化物酶,用通透液处理后,加入Tunel混合液50μl在湿盒中孵育,加50μl抗荧光抗体-POD孵育,DAB显色、苏木精复染,将切片烤干,封片。阳性反应细胞核呈棕褐色。
1.3.3 免疫组化法:采用S-P法免疫细胞化学染色法:切片经常规脱蜡、乙醇梯度入水后3%甲醇过氧化物灭活内源性过氧化物酶,分别加入1∶100的c-fos、c-jun抗血清,孵育后加1∶1000的羊抗兔IgG-HRP,DAB显色,苏木精复染,将切片烤干,封片。阳性反应胞核棕黄色。阴性对照:省去一抗后操作。
1.4 结果分析 将原位杂交和免疫组化染色的切片用CM-200B彩色医学图像分析系统分析,用细胞总个数/mm2表示。实验计量数据用
2 结 果
2.1 脑缺血再灌流对脑细胞凋亡的影响(见图1)
脑梗死0.5h,再灌1h后凋亡细胞散在出现在纹状体周围,12h后扩散到皮质,24~48h后整个大脑中动脉供血区均有散在的凋亡细胞,提示细胞凋亡参与了脑梗死的扩散,尽管凋亡细胞散在分布,但大量凋亡细胞集中在梗死灶周围边缘带。
2.2 脑缺血再灌流c-fos和c-jun表达的变化
2.2.1 c-fos表达的变化(见图2):
本实验发现缺血30min再灌流30min在皮质、海马即出现c-fos和c-jun阳性细胞,3h c-fos的表达达高峰。
2.2.2 c-jun表达的变化(见图3):
本实验可见c-jun一直在较高水平,24h达高峰,随后缓慢下降。
2.3 三七皂苷Rg1、Rb1对大鼠脑缺血再灌注脑细胞c-fos和c-jun表达的影响
三七皂苷Rg1、Rb1明显抑制c-fos(3h)、c-jun(24h)的表达,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
注:与假手术组比较,*P<0.01;与IR组比较,#P<0.01
2.4 Rg1、Rb1对大鼠脑缺血再灌注脑细胞凋亡的影响
正常组及假手术组偶见Tunel阳性脑细胞。缺血0.5h再灌1h可见凋亡细胞出现在纹状体周围,再灌12h在海马、皮质阳性细胞开始增多,再灌48h凋亡细胞数达高峰,同时从HE染色切片可见海马1区、皮质出现大量神经细胞丢失,坏死细胞减少。三七皂苷Rg1、Rb1明显抑制脑细胞凋亡。见表2。
注:与假手术组比较,*P<0.01;与IR组比较,#P<0.01。海马凋亡细胞F(3,20)=98.3,P<0.01;皮质凋亡细胞F(3,20)=176.4,P<0.01
3 讨 论
脑梗死0.5h、再灌1h后凋亡细胞散在出现在纹状体周围,12h后扩散到皮质,24~48h后整个大脑中动脉供血区均有散在的凋亡细胞,提示细胞凋亡参与了脑梗死的扩散,尽管凋亡细胞散在分布,但大量凋亡细胞集中在梗死灶周围边缘带。
转录因子c-fos和c-jun又被称为立早基因,其蛋白产物可通过激活DNA结合转录因子调节基因的表达。c-fos、c-jun在细胞受刺激后以非蛋白合成依赖方式表达,因而可快速而短暂诱导。因此被认为与蛋白合成依赖性凋亡有关[4]。研究发现脑缺血后c-jun出现在小鼠的脑梗死区内并与凋亡相伴随[5],c-fos mRNA在大脑中动脉阻断30min即在皮质、海马诱导[6]。本实验发现缺血30min再灌流30min在皮质、海马即出现c-fos和c-jun阳性细胞,3h c-fos的表达到高峰,c-jun一直在较高水平,24h达高峰,这支持Dragunow等[4]的实验,可认为c-fos和c-jun的早期诱导和在皮质、海马等缺血易感部分的表达与激活凋亡相关基因,诱发细胞凋亡有关。
Fos和Jun家族均含有亮氨酸链,必须合成二聚体以执行其转录作用。转录因子蛋白结合形成二聚体以形成复合物结合到DNA上影响转录。Takemoto等[7]认为c-fos和c-jun参与神经兴奋到目的基因表达的偶联过程。脑缺血时神经递质向细胞外间隙的释放增加,激活NMDA等受体引起c-fos和c-jun等磷核蛋白在第二信使c-AMP/CGMP、DAG和Ca2+等诱导下表达,产生脑细胞凋亡。
本结果显示,三七皂苷Rg1、Rb1明显抑制c-fos(3h)及c-jun(24h)的表达,差异有统计学意义(P<0.01);明显抑制大鼠缺血再灌后脑细胞凋亡,Rg1、Rb1的抑制作用无明显差异。由于c-fos和c-jun的早期诱导在皮质、海马等缺血易感部分的表达与激活凋亡相关基因有关,故此诱发细胞凋亡。由此可见,三七皂苷Rg1、Rb1对大鼠缺血再灌注脑细胞凋亡的抑制作用是通过抑制c-fos和c-jun的表达而实现的。本资料为三七皂苷Rg1、Rb1在临床防治脑损伤提供理论依据,考虑到Rg1、Rb1可透过血脑屏障进入中枢,这为三七皂苷Rg1、Rb1在脑损伤防治中的开发利用提供新的思路。
参考文献
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[3]Li Y,Chopp M,Jing N,et al.Temporal profile of in situ DNA fragmenta-tion after transient middle cerebral artery occlusion in the rat[J].JCereb Blood Flow Metab,1995,15:389-397.
[4]Dragunow M,Beilharz E,Sirimanne E,et al.Immediate-early gene pro-tein expression in neurons undergoing delayed death,but not necrosis fol-lowing hypoxic ischaemic injury to the young rat brain[J].Brain ResMol Brain Res,2004,25(1-2):19-33.
[5]Guegan C,Levy V,David JP,et al.C-jun and cyclin D1 proteins as med-iatiors of neuronal death after a focal ischaemic insult[J].Neurorepcrep-ort,2009,18(4):1003-1007.
[6]王占祥,章翔,易声禹,等.脑缺血后C-fos基因表达的意义及机理研究[J].卒中与神经疾病,1998,5(1):1-3.
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