枳壳醇提物

枳壳醇提物（共5篇）

枳壳醇提物 篇1

摘要：为了探讨枳壳醇提有效部位及其所含部分单体成分对小鼠原代神经细胞增殖作用的影响,试验采用四甲基偶氮唑盐(MTT)测定细胞活力的方法,比较了枳壳醇提有效部位及其所含的川陈皮素、红橘素、伞形酮和葡萄内酯对小鼠原代神经细胞增殖作用的影响。结果表明:红橘素和伞形酮在试验浓度下对小鼠原代细胞增殖作用无显著影响;枳壳醇提有效部位(浸膏)、川陈皮素和葡萄内酯在试验浓度下对小鼠原代细胞生长有显著影响。说明枳壳醇提有效部位、葡萄内酯和川陈皮素对神经细胞生长有保护作用。

关键词：枳壳醇提物,川陈皮素,红橘素,葡萄内酯,伞形酮,原代神经细胞,增殖作用

为研究中枢神经系统的各种疾病对大脑皮质神经元损伤的作用机理及防治措施,建立合适的体内外模型至关重要。神经元原代培养是神经元发育分化、神经再生、神经系统疾病发生机制等众多研究领域的重要模型之一,为神经系统疾病研究提供了良好的原代神经元生物学材料,因此神经元体外培养已经成为神经科学研究领域的关键技术[1,2]。

枳壳属于柑橘属植物酸橙及其栽培变种的干燥未成熟果实,主要含有多甲氧基黄酮类物质及香豆素类化合物等。杨武亮等[3]从枳壳醇提脂溶性部位分离出了川陈皮素、红橘素等多甲氧基黄酮类物质及伞形酮和葡萄内酯等香豆素类化合物。研究发现,此类香豆素类化合物和多甲氧基黄酮具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、预防心血管疾病及神经保护作用[1,2]。本试验通过研究枳壳醇提有效部位及其所含部分单体成分对小鼠原代神经细胞生长的影响,寻找枳壳中对小鼠原代神经细胞增殖有促进作用的活性物质,为扩大枳壳在中医临床中的新用途和开展下一步抗氧化、神经保护作用研究提供科学依据。

1 材料

1.1 试验动物

出生24 h内的清洁级KM小鼠,合格证号为SCXK(赣)2011-0001,由江西中医药大学实验动物科技中心提供。

1.2 药物

枳壳醇提有效部位,由“枳壳醇提物抗血管性痴呆的试验研究”课题组制备;川陈皮素、红橘素、伞形酮和葡萄内酯均为自制,以光谱确定结构,经HPLC峰面积归一化法计算其纯度≥99%。

1.3 主要试剂

四甲基偶氮唑盐(MTT)、完全DMEM培养基、Neurobasal培养基、B27 Supplement,均为GIBCO公司生产;优质新生牛血清(批号为090903),杭州四季青生物工程材料有限公司生产;多聚赖氨酸和胰蛋白酶均由Sigma公司生产,以D-Hank’s液配制成浓度为0.25%的溶液,以Na HCO3调节p H值为7.4,过滤除菌,4℃保存,备用;L-谷氨酸,Sigma公司生产;阿糖胞苷注射液,上海华联制药有限公司生产。

1.4 主要仪器

酶标仪(型号为XL800),Bioteck公司生产;倒置显微镜(型号为TS100-F),Nikon公司生产;超净工作台(100级),Boxun公司生产;CO2培养箱(型号为Mco-175),SANYO公司生产。

2 方法

2.1 细胞培养

冰台上无菌取出生24 h内的KM小鼠大脑,置盛有D-Hank’s液(p H值为7.2,含6.25 mmol/L Na Cl)的平皿中,分离皮层,去除脑膜,用4℃、D-Hank’s液洗涤2~3次。将脑皮质剪成1 mm3左右的小块,置含0.125%胰酶的D-Hank’s消化液中,37℃水浴25 min;加入10%牛血清DMEM终止反应,1 000 r/min离心3 min;弃上清液,沉淀加入10%马血清DMEM完全培养基(含6.25 mmol/L Na Cl)5 m L,轻轻吹打(不超过10次),静置5 min;取上层细胞悬液过70μm Zellsieb网,将细胞滤液(密度为5×105个/m L)装于另一支干净离心管中;取细胞滤液接种于涂布多聚赖氨酸的24孔、96孔细胞培养板中,24孔细胞培养板每孔加0.4 m L,96孔细胞培养板每孔加0.1 m L,置37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养;4 h后全量换成含2%B27的Neurobasal培养液(含6.25 mmol/L Na Cl)。需要注意的是,在细胞生长旺盛、胶质细胞明显增多时,加入1×10-5mmol/L阿糖胞苷作用2~3 d,以抑制非神经元的过度生长,然后每3 d换液一半,用于观察细胞形态。

2.2 细胞给药分组

试验分为正常对照组和枳壳醇提有效部位及其所含的川陈皮素、红橘素、伞形酮和葡萄内酯的不同剂量组。小鼠神经元细胞培养3 d后,正常对照组换入普通培养液,各给药组加入不同浓度的含药培养液,继续培养24 h后测定细胞存活率。

2.3 MTT法细胞活力检测

采用24孔细胞培养板进行形态学观察,96孔细胞板进行MTT法细胞活力检测。细胞培养至第3天时状态稳定,给药组加入相应的含药培养基100μL(全量换液),并以其作为相应的药物终浓度,空白对照组加入等量的空白培养基,37℃、5%CO2条件下培养24 h。在作用结束前4小时,每孔加入20μL终浓度为5 mg/m L的MTT,继续培养4 h后吸去原培养液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,待孔内颗粒完全溶解后,用酶联免疫检测仪测定490 nm波长处的吸光度值(OD值),对给药后的细胞进行细胞活力检测。以空白底板值为恒定值,计算给药后的细胞存活率,以反映试验药物对神经元的保护和诱导分化作用的影响。计算公式:存活率=(OD值-OD空白值)/(OD正常值-OD空白值)。

2.4 统计学分析

计算给药后的细胞存活率,并以平均值±标准差表示,采用SPSS 19.0统计学软件进行方差分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

3 结果与分析

3.1 小鼠原代神经细胞培养的形态学观察

细胞接种6 h后开始贴壁,呈单个圆形或椭圆形,直径为8~12μm,折光性强,核不可见;第2天可见神经元轴突伸出,之后细胞体积增大,突出数增多且伸长;培养5~7 d后,神经细胞生长旺盛,胶质细胞明显增多、增长并交织成网,以双极型、三极型居多,偶见单极型,长出轴突;至第8天后网状更明显,神经细胞生长良好,长出树突,形态典型,呈短梭形、锥形,见287-288页彩图1。

3.2 枳壳活性成分对正常原代神经细胞增殖功能的影响

各试验药物作用小鼠原代神经细胞24 h后,采用MTT法在490 nm波长处检测OD值,结果见表1。

注:与空白对照组比较,数据肩标**表示差异极显著(P<0.01)。

由表1可知,与空白对照组比较,红橘素和伞形酮在试验浓度下小鼠原代细胞增殖作用虽无显著差异,但有增长趋势;而枳壳醇提有效部位、川陈皮素和葡萄内酯在试验浓度下对小鼠原代细胞生长有极显著影响(P<0.01),且呈浓度效应关系。

4 讨论

本试验研究了枳壳醇提有效部位及其部分单体成分对小鼠原代神经细胞增殖作用的影响,结果表明:红橘素和伞形酮单体在试验浓度下对小鼠原代神经细胞的增殖作用与正常对照组无显著差异,但整体有促进作用的趋势;葡萄内酯、川陈皮素及枳壳醇提有效部位(浸膏)在试验浓度下对细胞生长均有极显著促进作用。

参考文献

[1]CHOI S Y,HWANG J H,KO H C,et al.Nobiletin from citrus fruit peel inhibits the DNA-binding activity of NF-Band ROS production in LPS-activated RAW 264.7 cells[J].J Ethnopharmacol,2007,113(1):149-155.

[2]KLEINER H E,XIA X,SONODA J,et al.Effects of naturally occurring coumarins on hepatic drug metabolizing enzymesin mice[J].Toxicol Appl Pharmacol,2008,232(2):337-350.

[3]杨武亮,陈海芳,余宝金,等.枳壳活性化学成分研究[J].中药材,2008,31(12):1812-1815.

枳壳醇提物 篇2

1 仪器与试剂

1.1 仪器

T2000电子天平(美国双杰兄弟集团有限公司),恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂),RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 药物

当归藤药材采自广西金秀县,经广西中医学院刘寿养副教授鉴定为紫金牛科酸藤子属植物当归藤的根与老茎。水提物制备:取当归藤粗粉200 g,加8倍量水,浸泡后加热回流提取2次,每次2 h,滤过,合并滤液。滤液水浴浓缩至2.25 g生药/mL,置冰箱备用。醇提物制备:取当归藤粗粉23 kg,加8倍量95%乙醇,置多功能提取罐中提取3次,每次2 h,滤过,合并滤液。提取液用旋转蒸发仪浓缩至无醇味。取适量,蒸馏水配成2.25 g生药/mL,置冰箱备用。

1.3 实验动物

SPF级昆明种小鼠,体质量(20±2)g,雌雄兼用,由广西医科大学实验动物中心提供,动物生产许可证号:SCXK桂2009-0002,动物质量合格证号:0001757。小鼠分性别饲养于空调室内,室温(22±2)℃,湿度(70±5)%,喂标准颗粒饲料,自由饮水和摄食,照明时间随同自然变化。

2 方法与结果

2.1 预实验

选取SPF级昆明种小鼠18只,体质量(20±2)g,随机分成三组,每组6只,雌雄各半并分笼饲养。实验前禁食12 h,自由饮水。将当归藤水提物和醇提物用生理盐水配制成高浓度药液,最大浓度均为2.25 g生药/mL,每鼠灌胃给药,给药体积0.4 mL/10 g,给药1次/d,对照组灌胃给予等容量的生理盐水,给药后先禁食3 h,然后常规饲养。于给药后1、24、72 h至第7天,每天观察并记录小鼠的体质量、皮肤毛发、眼和黏膜的变化、呼吸、四肢活动等变化及其中毒和死亡情况。

经预实验发现小鼠灌胃给予当归藤水提物和醇提物后,7 d内未见死亡,且精神与活动状态亦无明显异常。可知本药的毒性较小,无法测得半数致死量(LD50),故拟按照《中药新药审批办法》的要求用最大耐受量(MTD)的测定来观察动物对当归藤水提物和醇提物的耐受量,测定其能达到人用量的多少倍,从而对其安全性作出估价。

2.2 正式实验

采用MTD法进行小鼠急性毒性试验,取SPF级昆明种小鼠40只,随机分成两组,体质量(20±2)g,雌雄各半并分笼饲养,实验前禁食不禁水12 h,分别按预实验所测当归藤水提物和醇提物最大给药浓度2.25 g生药/mL进行灌胃给药,给药体积0.4 mL/10 g,给药1次/d,实验小鼠给药后先禁食3 h然后常规饲养。同样于给药后1、24、72 h至第7天,按郑爱华等[7]所述动物急性毒性表现和症状自发活动进行观察,每天观察并记录小鼠的体质量、皮肤毛发、眼和黏膜的变化、呼吸、四肢活动等变化及其中毒和死亡情况。以死亡为主要观察指标。如有死亡,则以刚不出现死亡组为准,此时的用药量即为小鼠的最大耐受量。然后按公式计算出耐受量倍数。7 d后处死小鼠进行尸体解剖检查。观察项目如表1。

小鼠按最大给药浓度、最大给药体积1次灌胃给药后,部分小鼠出现对身体某些系统的影响症状:对肌肉的影响主要表现为自主活动减少、倦卧不动;对自主神经系统的影响主要表现有:反应迟钝;另有闭目现象,其他观察项目则无异常情况,24 h后各鼠均恢复正常。连续观察7 d,小鼠无死亡情况出现。实验结束时,称重,将全部动物处死,解剖,观察其心、肝、脾、肺、肾等主要组织脏器的外观:心脏大小、颜色正常,跳动有规律,未见充血水肿及心衰;肝脏大小正常有润泽,未见水肿及变色;脾脏颜色、质地显正常的暗红色、软而脆,未见变色及病变;肺大小、颜色均显正常,未见明显病变;肾显正常暗红色且表面光滑,大小正常,未见水肿;胃内尚有未消化完全的食物残渣,肠内有成型大便,均无胀气且无黏膜充血及出血等异常病变。实验表明当归藤水提物和醇提物无明显毒副作用。结果见表2。

3 讨论

实验结果表明,当归藤水提物和醇提物以最大给药浓度、最大给药体积1次灌胃给药后小鼠无死亡及明显的中毒情况出现。当归藤水提物和醇提物的MTD>90 g/kg,该药材临床常用量15～30 g,本次试验小鼠用量相当于成人(50 kg)用量的150倍。根据中药制剂毒理学要求,即按体重计算小鼠最大给药量相当于人日用剂量100倍以上则安全,可以提供临床应用[8]。因该药材急性毒性实验观察时间较短,故还应结合长期毒性实验的毒性表现及多种检查结果综合分析评价其毒性,此方面的研究还需深入进行。

摘要：目的 对当归藤水提取物和醇提取物的急性毒性进行初步研究,评价其安全性,为新药开发提供理论依据。方法 采用最大给药量测定法,小鼠灌胃给药测定当归藤水提取物和醇提物的半数致死量(median lethal dose,LD50)或最大耐受量(maximum tolerated dose,MTD),研究其安全性。结果 当归藤水提取物和醇提取物的毒性都很小,未测得灌胃给药小鼠半数致死量LD50,水提取物和醇提取物的MTD>90 g/kg,最大耐受量倍数相当成人(50 kg)用量的150倍。结论 当归藤无明显毒性,临床常用量安全可行。

关键词：当归藤,急性毒性实验,最大耐受量

参考文献

[1]广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准(1990版)[S].广西科学技术出版社,1992:44.

[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1999,6:76-77.

[3]中国科学院中国植物志编委会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1979,58:113.

[4]陈家源,卢文杰,王雪芬,等.小花酸藤子化学成分的研究[J].华西药学杂志,1998,13(2):95-96.

[5]杨瑞云,管海波,张革,等.当归藤中总黄酮提取工艺研究[J].食品工业科技,2011,4(32):217-219.

[6]管海波,银小玲,覃江克,等.紫外分光光度法测定当归藤中儿茶素含量[J].安徽农业科学,2011,39(18):10854-10855.

[7]郑爱华,蔡光先,刘红梅.不同粒径的超微参附汤对小鼠的急性毒性实验[J].中华中医药学刊,2010,28(6):1222-1223.

枳壳醇提物 篇3

为进一步明确江香薷醇提物中石油醚部位的化学成分, 从而更好的利用该种草本植物, 相关部门应深入分析江香薷的生长特性, 采用科学合理的分析、研究以及实验鉴定技术手段, 对其进行准确的分析。本文主要采用GC—MS联分析和鉴定化学成分方式, 在最佳分析环境中, 将植物毛细管色谱分离, 并参照相关文献, 对石油醚部位的化学成分进行了分析, 该技术具有快速、稳定、重现性好的特点, 有利于充分提取江香薷的有效化学成分, 以期为深度研究开发该药材提供必要的基础数据, 促进我国医药测试技术飞速发展。

一、江香薷醇提物石油醚部位化学成分研究

1.材料

江香薷材料在江西的道地药材, 主要产于江西分宜、宜春等地, 经相关资料表明江香薷药材是唇形科石荠属植物江香薷的干燥全草, 并且可以将其作为试验主要材料, 那么其余试剂为市售分析纯。本文采用的测定设备是GC—MS型气相色谱质谱联用仪。

2.方法与结果

(1) 准备样品。将8kg阴干的江香薷全草和10倍量的乙醇加热回流提取, 且乙醇的浓度应保持在95%左右。醇提物采用 (75±15) ℃的石油醚萃取, 回收溶剂得到石油醚部位的浸膏。在纯石油醚的作用下, 将浸膏溶解为浓度3g·L-1的溶液, 作为供试品溶液。

(2) GC—MS分析。GC—MS分析的条件包括质谱条件和色谱条件。色谱条件是色谱柱DB—5MS石英毛细管色谱柱, 通常情况下进口温度应保持在260℃, 检测器温度为230℃, 程序升温应遵循以3℃·min-1的速率升温到120℃, 以5℃·min-1速率升温到260℃, 并保持大于10min的时间。进样量为1μL, 载气为氮气, 其浓度在99.199%以上, 流速保持在1.0m L·min-1, 分流比为20.0m L·min-1。而质谱条件是离子源在电子轰击 (EI) 下, 电离电压70e V, 离子源温度230℃, EM电压相对值为1094V;扫描质量为m/z55—550。

(3) 数据处理。根据上述条件, 将供试品进行GC—MS分析, 得到GC—MS的总离子图, 其中各组分的分子离子峰、基峰以及碎片离子峰的m/z、丰度数据等, 在质谱数据库检索中, 对质谱裂解方式以及同属物质类似研究的进行确认, 最后采用气相色谱峰面积归一法进行计算, 得出各成分的相对百分含量。

2.讨论

采用GC—MS型气相色谱质谱联用仪一共检测出50个峰, 鉴定出江香薷中有38种成分, 采用气相色谱峰面积归一法计算占总峰面积的88.09%, 其中有20种化学成分的相对含量大于1%。在江香薷石油醚部位化学成分分析中, 发现其主要化学类型是萜类, 芳香化合物、长链烃类以及脂肪酸等成分, 其中含量较高的成分有百里香酚, 二十二烷等, 占了化学成分总含量近30%;其次是长链脂肪烃占了28%左右, 另外脂肪酸类物质含量也比较高, 比如软脂酸、硬脂酸等等。利用GC—MS对江香薷石油醚部位的化学成分进行分析, 不仅简单方便, 同时具有一定的稳定性, 重现性较好, 鉴定的结果精确性较高, 为江香薷质量控制提供了科学依据, 也为江香薷石油醚部位化学成分的研究奠定了坚实的基础。

3.结果

通过上述鉴定实验, 发现江香薷含有多种萜烯类物质, 萜类化合物不仅具有较强的香气, 并且在调整人和动物生理活性方面具有不错的功能, 比如抗肿瘤、止痛消炎等。萜类化合物包括了单萜化合物、倍半萜类化合物以及二萜类化合物, 比如百里香酚、乙酸百里香酚脂等为单萜化合物;而蛇麻烯氧化物、石竹烯环氧化物、α-石竹烯等物质为半萜类化合物;二萜类化合物有叶绿醇等。正是由于这类化合物的存在, 江香薷才具有独特的香气, 以及杀菌、止痛、抑制肿瘤的功能。

结束语

综上所述, 江香薷是一种具有杀菌、止痛、消炎的重要药材, 在恶寒发热、腹痛吐泻、小便不利等症方面具有较大的研究价值。本文采用GC—MS联分析对江香薷石油醚部位化学成分进行了鉴定, 分离了50个峰, 鉴定了38个化学成分, 由此可见GC—MS分析和鉴定结果精准性和稳定性较高。通过对江香薷化学成分分析, 包括极性较大的部位, 即醇提物中石油醚部位, 为该药材研究利用奠定了良好的基础。

参考文献

[1]王萍萍, 陈现民, 肖远灿, 杜玉枝, 魏立新.藏药材印度獐牙菜石油醚部位化学成分研究[J].安徽农业科学, 2009, 04:1625-1626.

[2]林清.壮骨止痛胶囊A部分石油醚部位抗骨质疏松活性成分研究[D].中南大学, 2012.

枳壳醇提物 篇4

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

ICR小鼠:重量 (22±4.0) g, 共计110只, 随机分为5大组。其中:半夏组, 厚朴组, 半夏厚朴组分别30只, 醇提物以药物浓度计, 高剂量组500 mg/ (kg·d) , 中剂量组300 mg/ (kg·d) , 低剂量组100 mg/ (kg·d) ;其中半夏厚朴组的醇提物则以1:1配比。西药组10只, 灌服盐酸氯丙嗪30 mg/ (kg·d) 。空白组10只。

1.2 实验方法

①强迫游泳实验:将单只小鼠放入烧杯中, 保证水温为 (25±2) ℃。实验共进行6 min, 计算后4 min内小鼠的游泳不动时间。②悬尾实验:将小鼠尾端倒挂于铁杆上, 尾部以胶带固定, 头部距离箱底10 cm。实验共进行6 min, 计算后4 min内小鼠不动的时间。

1.3 统计学方法

实验结果以SASS 8.0 进行分析组间对比用x2检验, (P<0.05) 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 强迫游泳实验结果 具体结果见表1。

由结果可知, 随着浓度的不断下降, 药物的抗抑郁效果显著降低。但是复配组下降趋势较为缓慢, 当药物浓度为100 mg/ (kg·d) 时, 各组同对照组相比, 均无显著性差别。

2.2 悬尾实验结果 具体结果见表2。

由结果可知, 单一组分的高剂量组均会对于小鼠的悬尾实验结果带来一定促进作用。但是效果并不明显。组间比较, (P>0.05) 。但是两者复配后, 则效果明显, (P<0.05) , 差异有统计学意义。而且在中剂量复配组也呈现了较好的改善状态。但是该结果在100 mg/ (kg·d) 组内消失。

3 讨论

小鼠强迫游泳和悬尾模型由于操作便捷、对药物敏感而被广泛的应用于各种抗抑郁的药物筛选之中[3]。本研究的结果显示, 半夏, 厚朴及两者的醇提物均有效的缩短了小鼠不动时间, 有效的改善了小鼠的抑郁状态。虽然半夏在两个实验组内均体现了较低的活性 (同厚朴组及复配组相比) 。但是经过复配, 两者的混合物相比与厚朴呈现了明显的促进作用。证明半夏厚朴汤的[1]物质基础不仅仅是依靠厚朴的成分而实现, 还需半夏的辅助才能得到更好的发挥。

参考文献

[1]李建梅, 孔令东.中医药治疗抑郁, 焦虑症的研究进展.中国中药杂志, 2001, 26 (12) :805-807.

[2]王业民, 周建军, 孔令东.半夏厚朴汤及其组成中药抗焦虑和抑郁研究进展.世界科学技术:中医药现代化, 2003.

枳壳醇提物 篇5

中药在控制细菌耐药性方面有着独特的优越性。中草药抑菌成分较多且有效成分含量较低, 可作用于细菌的不同靶位点和代谢繁殖的不同阶段, 作用缓慢、持久, 故不易产生耐药性。目前, 国内外对中草药进行了大量的抑菌作用的筛选, 在实验和临床研究中都有很大进展, 证明中药可抑制β-内酰胺酶和耐药菌主动外排, 也可同时增强对耐药菌质粒的消除作用和作为抗菌增效剂。蜂房性平味甘, 归胃经, 具有祛风止痛、攻毒杀虫、抗过敏之功效, 有文献报道蜂房提取物对口腔中的变形链球菌、内氏放线菌、粘性放线菌和乳酸杆菌的生长有较强的抑制作用[1], 但对于耐药菌的体外抗菌效果国内外尚没有研究报道。笔者应用蜂房醇提取物对耐药铜绿假单胞菌进行了体外抗菌实验, 对蜂房逆转耐药铜绿假单胞菌耐药性的机理讲行了初步探讨。

1材料与方法

1.1 菌株来源

标本取自浙江省中医院细菌室临床分离的菌株 (5株多重耐药铜绿假单胞菌) 。

1.2 质控菌株

质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.3 方法

1.3.1 体外药敏实验

参照CLIS药敏实验标准, 对临床分离多重耐药铜绿假单胞菌采用纸片扩散法进行药敏实验, 以确定其耐药表型。

1.3.2 蜂房提取物的制备[2]

1000g蜂房粉碎, 先后以95%乙醇, 50%乙醇浸渍后, 渗漉, 将渗漉液浓缩至稠膏, 为蜂房醇提物。

1.3.3 蜂房药液应用液配置

取蜂房醇提物0.5ml, 倍比稀释6个浓度, 成1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32;分装至EP管中, 每管0.3ml。

1.3.4 蜂房MIC实验

取选择的菌株分别配制成0.5麦氏单位的菌液, 取1μl分别加入到上述配制的不同浓度的药液中, 置35℃孵箱培养过夜;培养后, 取培养液移种于血平板, 置35℃孵箱培养过夜。

1.3.5 总RNA提取

选择与蜂房作用第1天、第5天、第10天的耐药铜绿假单胞菌 (醇提1∶8) 标本, 用Trizol法提取总RNA。

1.3.6 cDNA合成

取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管, 依次加入RNA模板2μl, oligodT Primer 1μl, 用H2O调整体积至12μl, 轻轻混匀, 65℃孵育5分钟, 然后在冰上加样;依次加入5×reaction Buffer 4μl, rRNasin RNA酶抑制剂1μl, 10MMdNTP mix 2μl, M-MLV (H-) 反转录酶1μl, 用双蒸水调至总体积20μl, 轻轻混匀, 42℃孵育60分钟后, 置-20℃冷冻, 备用。

1.3.7 细菌DNA提取

选择以上相同处理的细菌以加热裂解法提取以上细菌标本的DNA。

1.3.8 耐药基因检测

根据参考文献[3,4,5,6,7]设计引物, 引物序列见表1。PCR试剂购自TakaRa宝成生物工程 (大连) 有限公司, PCR操作:操作过程按说明书进行, 50μl PCR反应体系:10×Buffer5.0μ1 (含镁离子) , dNTP (2.5mM) 4.0μl, Taq酶 (5U/μl) 0.25μl, 引物 (10mM) 各1.0μl, DNA模板或cDNA5.0μl, 用双蒸水补至50μl;PCR反应条件为94℃预变性5分钟, 94℃变性30秒, 56℃退火30秒, 72℃延伸40秒, 循环30次, 最后72℃延伸10分钟, 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 用紫外检测仪检查分析结果并用凝胶图像处理系统照相, PCR扩增产物送英俊 (上海) 生物公司进行正反向测序, 测序结果与GenBank进行Blast以明确耐药基因。

2结果

2.1 蜂房的MIC

醇提蜂房对5株多重耐药铜绿假单胞菌MIC为1∶4。

2.2 蜂房对多重耐药铜绿假单胞菌部分耐药基因表达的影响

提取醇提1∶8 (低于MIC) 蜂房液中培养的多重耐药铜绿假单胞菌的第1、5、10天的总RNA和DNA, 相应的耐药基因及其转录产物RNA检测结果见表2。

3讨论

蜂房又名露蜂房, 为胡蜂科昆虫果马蜂Polistesolivaceous (DeGeer) 、日本长脚胡蜂Polistes Japonicus Saussure或异腹胡蜂Parapolybiavaria Fabricius的巢, 蜂房化学成分主要是蜂蜡、蜂胶和房油三种物质, 其成份含水分10.3%、灰分11.3%、铁0.013%、氨7.51% (相当于蛋白质46.94%) , 另外, 蜂房中有丰富的锌、铁、硅、锰、铜等微量元素[8]。蜂蜡有解毒、生肌、定痛之功效, 能治疗下痢脓血、久泻不止等症, 蜂胶和树脂、蜂蜡、芳香挥发油和一些花粉等夹杂物, 外敷能治疗鸡眼和寻常疣。蜂房含有的化学成分, 具有抗菌、抗炎、调节免疫、镇痛以及抗肿瘤等多种药理活性, 临床应用广泛, 常用于治疗顽固性感染、抗肿瘤、类风湿性关节炎、痛风、急慢性扁桃体炎、急慢性咽喉炎、急慢性支气管炎、肺炎等病症, 效果显著。

尽管抗生素的使用大大降低了感染发病率和死亡率, 但细菌耐药性的出现和蔓延却严重影响和破坏着人类的抗感染治疗。特别是铜绿假单胞菌多重耐药菌株出现已成为全球关注的焦点。如何控制耐药的发生及合理使用抗生素, 发展新的抗菌药物, 已成医疗工作的重点, 在这方面, 中医药可以作为抗多重耐药菌的有益补充。

本研究将蜂房置无水乙醇浸泡过液, 将其中的醇溶性成分充分提出, 作用于细菌具有很好的抗菌效果, 最小杀菌浓度可以达到2.5g/ml或1.25g/ml, 而乙醇的浓度为25%和12.5%, 乙醇的杀菌浓度为70%～75%, 所以乙醇的效果基本上可以忽略不计。将醇提蜂房与不同的抗菌药物联合使用, 不但可以降低蜂房本身的最低杀菌浓度, 还可以将联合使用抗菌药物的杀菌浓度降低一到两个浓度梯度, 蜂房联合不同抗菌药物使用, 具有协同杀菌效果。

多重耐药铜绿假单胞菌携带多种耐药基因, 这些耐药基因大多可以通过耐药质粒进行传播, 表达大量的β-内酰胺酶。本实验研究表明, 多重耐药铜绿假单胞菌经与不同浓度的醇提蜂房作用后, 其携带的耐药基因仍然存在, 但是, 其转录产物RNA可以被抑制, 因此, 初步认为, 蜂房逆转细菌耐药的机理之一可能是抑制细菌耐药基因的转录, 进而使得耐药酶无法表达而丧失耐药性。

参考文献

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