克伦特罗（共9篇）
克伦特罗 篇1
盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride,CL)即瘦肉精。其化学名为:羟甲叔丁肾上腺素或2-[(叔丁氨基)甲基-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐,药品名为双氯醇胺、舒喘宁、克喘素等。盐酸克伦特罗由于其具有强力持久松弛支气管平滑肌的功能,首先被用来治疗动物肺部疾病和人类哮喘;由于其具有改变养分代谢途径、能量重分配等作用,因此不法商贩将其作为饲料添加剂,促进动物生长,减少脂肪沉积,明显促进肌肉合成。然而盐酸克伦特罗具有比较稳定的化学性质,在烹调过程中难以破坏其毒性,当人类食用残留瘦肉精过高的肉制品和内脏后可能引发中毒:失眠、低磷酸盐血症、瘫痪、肌肉震颤、血压升高、头晕、口干、心动过速、低血钾等,甚至会引发死亡[1]。因此,对盐酸克伦特罗检测方法的研究具有十分重要意义。本文对免疫分析法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等检测方法进行了探讨,并对各种检测方法进行了比较。
1 盐酸克伦特罗的实验室检测方法
1.1 高效液相色谱法(HPLC)
采用HPLC对盐酸克伦特罗分析时不需要进行衍生。其原理是C18或C8固定相能够与肾上腺素能激动剂分子相互作用,采用反相柱和质谱检测器、紫外检测器、电化学检测器对瘦肉精进行检测。HPLC具有高灵敏性、操作简便、分析自动化、节省时间、重现性好、效率成本比价高、假阳性率低等优点。其缺点是对设备要求高、价格昂贵、检测过程繁琐、样品处理时间长[2]。其具体方法如下:一是检测器为紫外检测器(UV)。波长为215~245 nm;色谱柱为Watersl50×3.9 mmd的symmetry Cl8柱;流动相为醋酸与醋酸铵的甲醇水溶液,梯度洗脱。二是检测器为电化学检测器。柱子为Lichrocart RP-SB;流动相为乙腈水溶液(30∶70),流速0.8 m L/min。工作电极为电压800 mV,参比电极为Ag/Ag Cl。三是检测器为质谱检测器。流动相为含0.05%甲酸和5%乙腈的水溶液,含0.05%甲酸的乙腈溶液,梯度洗脱检测离子为母离子m/z为277,子离子m/z为277、259、204、64;内标物为氘代的克伦特罗;源温为120℃,锥孔电压为19 V,碰撞塌压为-16 V。
1.2 生物传感器技术(BS)
BS是现在非常受关注的综合性很强的技术领域,该技术是将生物技术与微电子技术有机结合,采用生物体内抗原、抗体专一性结合从而改变电化学的特性设计成免疫生物传感器。将瘦肉精单克隆抗体微型化膜固定在换能器的表面,加入已知浓度的酶标激素于待测样品中,CL与标记抗原竞争性地附着在电极上的抗体,电极经过洗涤后与底物溶液接触,标记酶与底物发生化学反应,转变出来的电信号经过输出、处理分析直接显示残留CL的含量。Pizzariello通过分子标记聚合膜(MIP)作为分子识别系统测试了牛肝中盐酸克伦特罗的残留量,同时证明了生物传感器技术特异性强。酶标免疫传感技术[3,4]通过酶的化学放大特性,可将灵敏度提高到0.01 ng/g。同时能够在几分钟之内完成分析过程,相对于ELISA更快速、更简便和灵敏,而且能够测定各种抗原物质,尤其对体液中激素和药物的检测。
1.3 气相色谱-质谱联用法
气质联用通常用来检测血液和组织中残留的盐酸克伦特罗。其原理:在p H值为5.2的缓冲液中,样品用芳基硫酸酯酶或者盐酸葡萄糖醛苷酶进行消化,用MCX小柱净化萃取液,分离的残留样品通过双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后,采用GC-MS测定。检测步骤:①提取,用乙酸调整pH值至5.2。②用SCX柱净化样品。③双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化,用气质联用仪检测。
2 快速检验法
2.1 胶体金法
采用胶体金技术与膜层析技术相结合生产的克伦特罗金标检测试纸,无需检测设备,对检测人员的专业技能要求不高,在20 min内即可得到检测结果,比较适合宰前快速检测。因而作为筛查饲养场、生猪中转站、屠宰场筛查盐酸克伦特罗的重要手段,检测灵敏度为5 ng/mL,但其缺点是假阳性率较高。
2.2 酶免疫分析法(EIA)
由于EIA准确、灵敏、简便,如今已经出现一种新的并得到广泛应用的“瘦肉精”检测方法——酶免疫分析法(EIA)。最初用于盐酸克伦特罗检测的是一种选择性异源和双抗免疫分析,而如今通常都是采用竞争EIA原理。同时随着近年来试剂盒的开发,酶免疫分析法广泛应用在德国rbiophaim和英国Randox Laboratories Ltd公司。其优点是价格便宜,检测迅速,操作简便,灵敏度高。缺点是假阳性率高、不能实现现场检测,且要求样品处理、反应条件要尽可能一致。
2.3 毛细管电泳免疫分析—激光诱导荧光检测(CEIA-LIF)
CEIA-LIF是我国科学家研究的特异性强、灵敏、快速的检测“瘦肉精”的新方法。该法采用牛血清蛋白与盐酸克伦特罗偶联并用荧光素标记,在线毛细管电泳法和离线毛细管电泳分离来检测。在最佳条件下,离线和在线毛细管免疫电泳法的检测限分别为0.7 ng/m L和0.2 ng/mL,相对标准差(RSD)分别为0.88%~1.00%和0.56%~2.80%,回收率分别为88.0%~93.7%和90%~102%。研究出来的CEIA-LIF对CL的检测具有准确快速、可靠、高准确性、高自动化水平等优点。采用这种方法,将避免人为操作的误差和检测的灵敏度,试剂消耗量小,检测成本低,具有现实性和可操作性。
3 主要检测方法的比较
目前在国内,高效液相色谱仅作为瘦肉精的半定性方法,检测限为1~15 ng/g,其优点是假阳性率底、检测精度高;缺点是需贵重仪器、费用昂贵、检测过程繁琐、难以操作、检测时间长。GC-MS的优点是重复性好、准确性、检测灵敏度高,但所需要的仪器设备非常昂贵,同时样品前处理的技术要求很高、检测过程繁琐、难于操作,要求检测人员专业性强且具有丰富的实际操作经验。免疫分析法都是采用固定的试剂盒,检测灵敏度高,检测结果容易把握,成本低,最低检测限能够达到0.5 ng/mL,样品前处理简单,有些样品甚至不需要前处理,其缺点是假阳性高,不能实现现场检测。生物传感器是采用生物活性物质作为敏感元件器,与其他同类物质交叉反应低,特异性强,缺点是灵敏度低,反应时间长。
4 结语
虽然众多的科学家研发出了很多种检测瘦肉精的方法,但都不是非常完美。如GC-MS、HPLC等的检测限都在0.01 mg/kg以上,检测设备昂贵,检测方法繁琐难于操作,而且不能实现现场检测,对于畜产品的一线检测无实际意义。生物传感技术(BS)和金标免疫检测技术(DIGFA)能精确检测瘦肉精残留,使瘦肉精的检验和监测变得高效简单,同时定量和定性实现了现场监测,因此开发和研制瘦肉精的生物传感器或试纸条,对于提高检测效率具有较大的意义及发展前景,值得深入探讨。
摘要：综述了目前盐酸克伦特罗(瘦肉精)的检测方法,对各种检测方法进行了比较,以及分析了各种检测方法的应用。
关键词：盐酸克伦特罗,检测方法,比较,应用
参考文献
[1]刘国艳,柴春彦.如何全面认识“瘦肉精”[J].动物科学与动物医学,2009,19(6):l-3.
[2]杨志凌,陈杖榴,方炳虎,等.高效液相色谱——电化学检测法测定猪组织中的克伦特罗[J].色谱,2008,21(3):245-247.
[3]黄传峰,李晓华,吴宜群.克伦特罗检测方法进展[J].中国卫生检验杂志,2009,12(5):634-636.
[4]PIZZARIELLO.the method of Clenbuterolhydrochloride Compare[J].Rev-ista argentina de dermatologia,2002(63):85-88.
克伦特罗 篇2
猪尿中克伦特罗残留的ELISA检测研究
对自主开发研制和德国r-Biopharm公司的β-兴奋剂酶联免疫(ELISA)试剂盒的标准曲线线性范围、斜率、B/B0抑制浓度、板内变异系数、板间变异系数、阳性检出率、回收率和交叉反应率等进行了比较试验.结果表明:自制试剂盒的线性范围为0.3～8.1 ng/ml时,50%抑制率浓度IC50的平均值为0.93 ng/ml;板内变异系数小于2.2%;板间变异系数小于13.8%;样品回收率为85%～96%;实际样品检测和德国r-Biopharm公司的.试剂盒阴阳性符合率100%;与克伦特罗和甲基克伦特罗交叉反应率均为100%,与沙丁胺醇和特布他林的交叉反应率分别为88%和86%.
作 者：李艳 张明洲 陈宗伦 刘军 胡华军 LI Yan ZHANG Ming-zhou CHEN Zong-lun LIU Jun HU Hua-jun 作者单位：中国计量学院,生命科学学院,浙江,杭州,310018刊 名：浙江农业学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS年，卷(期)：18(5)分类号：Q852.4 Q859.7关键词：克伦特罗 β-兴奋剂 ELISA试剂盒 猪尿
克伦特罗 篇3
猪肉是我国人民的主要肉食消费品, 同时生猪生产又是当前添加盐酸克伦特罗的重灾区, 因此加大与普及对生猪 (特别是商品猪) 盐酸克伦特罗的检测力度刻不容缓。国家兽医卫生行政监督机构为确保人民的肉食品安全工作加大了以生猪为重点的盐酸克伦特罗检测工作的检测力度和普及程度。2009年底江苏省金湖县动物检疫站就在全县范围内开展了针对盐酸克伦特罗的检测工作, 取得了较好的效果, 现将笔者在实际工作中取得的一些经验与体会介绍如下。
1 检测过程
金湖县是猪肉消费大县, 全县约37万人, 年消费生猪达11万头。金湖县生猪饲养并不发达, 主要为1家1户生产的一种当地黑毛猪, 全县土种猪生产量不足4万头, 其余主要依靠从山东、河南、安徽等省调运。本地猪大部分是使用剩饭菜和农作物副产品作为饲料土法饲养, 很少存在“瘦肉精”的问题, 因此, 检测的重点主要集中在外调生猪上。全县共有1个县级生猪定点屠宰点和4个生猪交易市场, 生猪交易较发达, 特别是4个生猪交易市场已经逐步形成为江苏省黑毛猪交易的集散地, 从此中转发往南京等地, 因此对外调生猪的盐酸克伦特罗检测工作尤为重要。
目前应用于盐酸克伦特罗的检测方法主要有以下3种。一是金标检测卡定性检测, 主要用于对可疑生猪的初步检测, 该方法成本较低、检测速度快、操作简便, 但结果不易保存。二是酶联免疫法定量检测, 用于金标卡测试后的确认, 该方法检测灵敏度高, 可保存结果, 但易受到交叉反映干扰。三是气相色谱-质谱联用法定量确证检测, 该方法用于终审, 但投入大检测成本高适用于专业实验室笔者所在的基层动物检疫检验单位主要采用按一定比例随机抽检和根据经验定向抽检相结合的方法选择测试生猪, 主要采用盐酸克伦特罗快速检测卡 (广州景同生物科技有限公司) 进行检测, 该检测方法具有简单快速、无需特殊仪器设备的特点, 既可在实验室进行, 也可在生猪交易市场、屠宰场、养猪场等进行实地检测, 适用于对大量检测生猪的初步抽检。
1.1 样本的采集
1) 宰前采集。当外调生猪抵达交易市场或屠宰场后, 先让生猪下车并休息20～30 min后。通过仔细观察, 一般饲喂盐酸克伦特罗的生猪都具有皮毛异常光亮、皮肤白里透红、被毛少而松软, 后臀部饱满突出, 背部体表驱打后容易留下持久伤痕, 呼吸急促, 个别会出现腿抽搐、站立不稳、爬坡困难、行走不灵活、容易发生蹄损伤和跛行或非外因倒地不起等特征, 根据以上特征可以对可疑猪设法采集尿液作为样本进行检测, 采尿的方法主要有蹲守接尿法 (比较适合母猪) 和使用简易的接尿器接尿法 (比较适合公猪) 。
2) 宰后采集。根据对宰后生猪的感官检验选择可疑生猪, 含有盐酸克伦特罗的猪肉色泽比普通猪肉深, 肌肉特别鲜红, 后臀较大且肌肉饱满, 肌纤维比较松软, 瘦肉与脂肪间有黄色液体流出, 脂肪非常薄, 腹股沟的脂肪层内毛细血管分布较密, 甚至呈充血状态。对可疑猪在其开膛后, 用一次性注射器从膀胱中抽取尿液作为样本, 组织的采样一般以无菌采取肝组织较好。
1.2 抽取样品
1) 抽样数量的确定。在抽样前, 要准备好接尿用具、一次性注射器、采样瓶、以及抽样文书等。样本量一般按照10%的比例采取, 对出现肌肉震颤、站立不稳、异常丰满的可疑生猪, 要加大抽检比例;每头猪采取尿液量约100 mL, 平均分成3份, 每份约30 mL, 分别装入采样瓶并编号后密封, 抽样用具在每次使用前要彻底清洗;组织样品一般以采取肝组织为好。
2) 抽样记录。抽样时, 要如实填写抽样单, 注明生猪来源、抽样时间、同群数量等内容, 并由抽样人和畜主共同签名确认, 一式三联分别贴在3个重复的样品瓶上。3份抽样样品中, 2份由抽样人员带回用于检验和留样用, 另1份封存于被抽检单位, 作为对检验结果有争议时复检用。
3) 样品贮运。取样后, 样品应立即在0～4℃条件下冷冻保存。运输过程中, 样品温度不得超过4℃, 时间不超过24 h。
1.3 样本处理
样品必须收集在洁净、干燥不含任何防腐剂的塑料杯或玻璃容器内。有条件的可将尿液在4℃、3 000 r/min以上离心, 取上清液备用。肉样或组织样品可将样品剪碎, 装入1.5 mL离心管中, 盖紧管盖, 放在100℃水中加热5 min以上, 使有液体浸出, 取出离心管放至室温, 取上清液备用;也可称5克样品剪碎, 加入25、50 mmol盐酸溶液, 振荡3 min并静置5 min后取上清液1 mL, 加入氢氧化钠溶液, 再振荡3 min并静置5 min后取上清液备用。
1.4 样本的检验方法
取出试剂板 (在室温高于30℃, 在高度潮湿的环境中应尽快使用) , 将试剂板置于平坦的台面上, 用塑料吸管垂直滴加3滴尿样或处理过的样品 (约120μL) 于加样孔内, 等待紫红色条带的出现, 测试结果应在3～5 min时读取。超过时间结果无效。
1.5 结果判定
阳性 (+) :仅质控区 (C) 出现1条紫红色带, 在测试区 (T) 内无紫红色条带出现。此阳性结果表明尿液中含有克伦特罗残留物。阴性 (-) :2条紫红色条带出现。1条位于测试区 (T) 内, 另1条位于质控区 (C) 内。阴性结果表明尿液中不含有克伦特罗残留物。无效:质控区 (C) 不出现紫红色条带, 表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。具体示意图见图1。
1.6 检后处理
将检测结果及时通知货主及相关人员, 对经检测合格 (阴性) 的生猪允许屠宰或交易, 开具盐酸克伦特罗检测合格的报告单;对经检测不合格 (阳性) 的生猪禁止屠宰, 并就地封存, 及时上报上级主管部门, 按有关规定处理。
2 检测结果
按照以上检测方法笔者于2009年11月和12月在全县范围内的1个县级生猪定点屠宰点和4个生猪交易市场按照不同场所、不同产地、以整车为单位按照10%的比例共计检测生猪227头。检测结果见下表1, 通过共计30个批次的检测结果汇总情况来看, 其检测结果都为阴性, 阴性率为100%, 没有出现盐酸克伦特罗残留问题猪。
3 讨论
在基层的盐酸克伦特罗实际检测中, 多数检测单位会选择猪尿作为样本, 因为使用盐酸克伦特罗快速检测卡检测尿样的方法比较简单方便。一般对猪的盐酸克伦特罗检测工作首先是在宰前进行, 即与宰前检疫同步实施, 对每批进场生猪随机进行抽检, 没有问题的生猪才能待宰或交易;但是生猪宰前尿样的采集有一定的难度, 一般可在猪下车后10～20 min或当猪进圈后休息一段时间后人为驱赶, 检测人员在一旁仔细观察, 当发现猪有排尿倾向后, 及时用长柄集尿盆收集 (此法比较适合母猪) , 而公猪的生殖器在腹下, 一旦伸出长柄集尿盆它就会发现, 立即会停止排尿, 因此对待宰前公猪尿的收集, 一般使用自制的简易接尿器接尿法, 有条件的可对猪进行卧式保定, 还可将猪关到小的自制隔离框 (2 m×2 m) 中进行采尿。一般生猪经过长途运输后, 体内的尿量已经很少, 条件许可的话, 可在猪卸车后适当补水, 这样有助于猪增加排尿次数以及宰后膀胱中的存尿量。
常用的盐酸克伦特罗检测方法多是使用快速检测试纸检测尿液。国内生产盐酸克伦特罗检测卡的厂家很多, 各个厂家的检出量和判定标准都不太一样, 在检测试剂的选择上应尽量选择权威部门推荐的生产厂家。测试前要将未开封的检测卡恢复到室温, 检测卡包装袋打开后要立即使用, 当发现有疑似阳性结果的标本时, 应对同头样本进行重复检测, 以增加检测的准确性。现在盐酸克伦特罗抽检率一般为10%, 在特殊时期可提高到20%, 如果发现某批次生猪有问题, 则需要进行100%的检验。尿液中的杂质会导致假阳性结果, 有条件的, 应离心后使用。
金湖县的盐酸克伦特罗检测工作具有一定的长期性和艰巨性, 因为金湖县的生猪来源主要是外调生猪, 原产地的情况笔者不了解, 也不能控制, 因此只有依靠加大本地的检测力度, 紧抓不懈, 同时应提高检疫手段、加强法规宣传以及加大对违法人员的处罚力度来加强金湖县的瘦肉精检测工作。目前盐酸克伦特罗检测的成本还很高。如果按照上级要求进行抽检, 还存在检测经费上的困难, 还需要地方政府的大力支持。
在盐酸克伦特罗作为一种畜牧业生产的违禁药品遭到严厉查处的同时, 就会出现部分盐酸克伦特罗的替代品, 目前发现的替代品有“盐酸莱克多巴胺”、“沙丁胺醇”等, 金湖县在紧抓常见盐酸克伦特罗检测的同时, 应密切关注替代品的检测。从检测结果看没有发现盐酸克伦特罗问题猪, 但是此结果并不能说明在金湖县在检测期间没有出现或今后不会出现盐酸克伦特罗问题生猪, 这一结果准确性有可能受到试剂或仪器的选择、检测水平、抽检比例等因素的影响, 下一步金湖县应加强检疫人员的业务培训, 提高业务水平, 并添置必要的检疫设备。同时要提高抽检率, 保证采样送检质量, 增加检测内容, 选用不同厂家、不同类型的快速检测卡进行配合检测, 如选用盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二合一快速检测卡, 以提高检测的准确性, 同时应加强对生猪重点产地的监控, 对相关部门通报的阳性高发地区的生猪应重点加以监控, 并及时加大检测力度, 提高检测频率和抽检率。
摘要：通过对金湖县2009年11、12月份的待宰猪盐酸克伦特罗的检测与结果分析, 阐述了金湖县主要工作方法、经验、以及对当前盐酸克伦特罗检测工作的建议。
克伦特罗 篇4
动物性食品中盐酸克伦特罗(瘦肉精残留危害 及其检测方法研究进展 张清安 范学辉(陕西师范大学食品工程系,西安,710062 摘 要 介绍了盐酸克伦特罗(瘦肉精的理化特性,分析了它在动物性食品中残留对人体和国民 经济所造成的危害,同时又综述了动物肌肉组织中残留盐酸克伦特罗(瘦肉精的各种分析检测方 法并作了展望。关键词 动物性食品,盐酸克伦特罗,残留,检测方法 第一作者:硕士,讲师。收稿时间:2004-06-22 1 盐酸克伦特罗的理化特性及药用机 理 1.1 盐酸克伦特罗的理化特性 盐酸克伦特罗(clenbuteerol ,CLB ,又名克 喘素、氨哮素、双氯醇胺,俗名瘦肉精,化学名为 α2[(叔丁氨基甲基]242氨基23 , 52二氯苯甲醇 盐酸盐,分子式为C12 H18 Cl12 N2O·HCl ,相对分 子质量为313165。它是一种选择性β2肾上腺 素受体激动剂,白色或类似白色的结晶体粉末, 无臭、味微苦,易溶于水、甲醇、乙醇,微溶于氯 仿,不溶于苯和乙醚,化学性质稳定,加热到 172℃才开始分解,经260℃油煎5 min才会破 坏减半[1 ,2 ]。口服后在胃肠道中迅速吸收,10～20 min起效,2～3 h血液浓度达到峰值,作用 维持5 h左右,半衰期为25～39 h ,消除5个半 衰期(消除97 % ,约需5～8 d ,在动物眼睛、毛 发、肝、肺、肾等组织中易引起蓄积[3 ]。112 盐酸克伦特罗的药用机理 盐酸克伦特罗(CLB于1964年首次在美 国合成,属于β类兴奋剂,最初在临床上主要用 于防治人、畜支气管哮喘和痉挛。研究证明作 为药物CLB对呼吸、生殖、泌尿、骨骼、神经等 系统疾病具有较好治疗作用。其机理在传出神 经系统,β受体主要分布于血管、支气管、骨骼 肌和平滑肌等部位,盐酸克伦特罗与β受体选 择性结合后,使β2受体出现兴奋效应,主要表 现为平滑肌舒张、通气改善等[ 4 ]。1984年美国(> 1μg/ kg· 明显促进动物生长、改善胴体品质、提高瘦肉 率,于是欧美等国开始将CLB广泛用于动物饲 一家公司意外发现高于治疗剂量5～10倍以上 d CLB添加于饲料饲喂动物后,可 料[5]。20世纪 80年代后期 ,我国部分大专院 校和科研机构也开始向饲料企业和养殖户推广 该物质作为饲料添加剂使用。由于 CLB能使 饲料转化率和瘦肉率提高 10 %～15 %,骨骼肌 脂肪降低 8%～15 %,所以养殖户和饲料企业 经常把 CLB叫作“瘦肉精”或“肉多素”。其提 高瘦肉率机理在于 CLB通过肾上腺素刺激腺 苷酸环化酶的合成 ,从而升高环磷酸腺苷(cAMP的浓度 ,提高激素敏感脂酶的活性 ,加 快脂肪分解 ,使血液中游离脂肪
酸(FFA进入 肌肉量增加 ,进一步为蛋白质的合成提供物质 基础;同时 ,CLB作为一种植物性神经调节剂 , 可降低血液中抑制肌肉兴奋性的 Mg2 +浓度 , 间接促进肌肉兴奋 ,改变细胞膜的通透性 ,参与 机体内的代谢调控及营养重新分配 —— ——抑制蛋 白质的分解和脂肪的合成 ,进而增加氮的组织 沉积[6]。2 动物性食品中盐酸克伦特罗的残留 危害 211 动物性食品中盐酸克伦特罗的残留 108
2004 Vol.30 No.9(Total 201 分析与检测 由于盐酸克伦特罗在动物生产中有明显的 促生长和提高瘦肉率的作用 ,受此利益驱使国 内外 CLB在养殖业中滥用问题非常严重。又 因 CLB在生产中的用量是治疗量的 5～10倍 , 而且持续添加时间(3周以上 和在体内消除半 衰期(25～39h都很长 ,所以极易在动物组织中 蓄积残留 [6]。在机体的各个组织中 ,CLB在眼 和毛发中残留的浓度最高 ,如眼中 CLB残留量 比血浆中浓度高 107倍。原因是 CLB对不同 组织有选择性 ,首先选择有色素沉着的眼组织 和毛发组织沉积 ,且在眼组织中主要结合在有 色素沉着的视网膜和脉络膜上 ,而在无色素的 眼的其他部位则蓄积较少。除了眼和毛发 ,其 他器官的残留情况是:肺、肝、肾约为血浆浓度 的20～90倍,肌肉和脂肪为3～15倍。如果在 屠宰前没有休药期,则残留量将更高[6 ,7 ]。早在1987,欧盟、美国已宣布禁止使用 今世界范围内已有数以千计甚至万计因食用残 留有瘦肉精的动物源食品而中毒的人员。人食 用残留有盐酸克伦特罗的畜产品后表现为肌肉 兴奋性增强,有的人中毒后表现为肌肉震颤,重 症者腓肠肌痉挛;同时引起心肌收缩加强,心率 加快[8 ];对高血压患者危害更大, CLB分解脂 肪成游离脂肪酸进入血液,使血管壁弹性降低, 引起血压升高,微循环血管膨胀,压迫刺激周围 的神经,引起头痛头晕;引起人内脏横纹肌和平滑肌兴奋性增强,表现为呕吐和腹泻;又因体内 K+、Ca2 +、Na +和Mg2 +等浓度的平衡破坏,导 致细胞膜生物电位去极化能力增强,复极化能 力减弱,细胞膜对离子通透性改变,心电图可呈 “T波倒置或底平”, ST段下移等,若患者发生 死亡,则死于心脏舒张期或心肌梗死。CLB中 毒的患者群中,对患心、脑血管疾病、糖尿病、甲 状腺亢进、青光眼、前列腺肥大者可造成威胁生 CLB作为兽用饲料添加剂我国政府也于,1997 年在“浓牧发 [1997 ]3号《关于严禁非法使用兽 药的通知》 ”中已明确禁止其在饲料中添加使 用。但也有许多国家并没有确定动物性产品中 CLB的最大残留限量(MRL。美国
食品药物 管理局(FDA和世界卫生组织(WHO建议盐 酸克伦特罗在动物组织中最高残留限量为 :肉 012μg/ kg、肝 016μg/ kg、肾 016μg/ kg、脂肪 012μg/ kg、乳 0105μg/ kg;部分欧盟成员国如英 国规定可食性组织中 MRL值为 015μg/ kg ,荷 兰规定牛、马肝脏组织中 MRL值 015μg/ kg[8]。212 动物性食品中盐酸克伦特罗的残留危害 虽然盐酸克伦特罗的毒性并不是很强 ,小 鼠、豚鼠静脉注射的半数致死量分别是每公斤 体重 2716 mg和 1216 mg[2]。但是由于它的半 衰期长 ,在体内代谢慢 ,极易蓄积残留于动物体 内 ,在动物肝脏中 CLB平均浓度可达 45 mg/ kg ,也就是说 ,按临床最高治疗剂量每天 018 μg/ kg计算 ,人食用 100 g被 CLB污染的动物 肝脏摄入体内的 CLB就相当于一次治疗剂量 的 10倍以上 ,因而极有可能通过食物链使人体 中毒而对健康构成威胁 [9]。自上世纪 80年代 中期欧美国家发现瘦肉精的毒副作用以来 ,至 命的恶果。孕妇中毒又可导致癌变、胎儿致畸 的严重危害性 [ 10 ,11 ]。欧盟成员国已将 CLB残 留作为肉品进口必检项目 ,因而这也成了 WTO成员国之间进行国际贸易的技术壁垒。由此可见 ,CLB的非法使用及残留不但严重地 威胁着消费者的健康 ,而且也影响着一个国家 的对外贸易和声誉。我们应借鉴美国、欧盟等 国家在动物产品生产和食品工业上实施的良好 生产规范(GMP、危害分析与关键控制点(HACCP和全过程质量控制(IKB等管理经 验 ,并结合我国动物产品生产的特点 ,引入全过 程质量控制的新理念 ,加强养殖、屠宰加工和销 售环节的质量管理 ,减小甚至消除 CLB残留造 成的危害 [12 ]。3 动物性食品中盐酸克伦特罗的检测 方法
当前 ,造成盐酸克伦特罗屡禁不止的原因 之一就是国内外检测 CLB的方法、手段还不完 善 ,还没有建立宰前监测体系和准确、迅速、方 便、精确的检测方法 ,从而使不法分子有机可 乘。目前国内外用于检测动物性食品中盐酸克 伦特罗的方法主要有以下几种。109 2004年第 30卷第 9期(总第 201期
分析与检测 国已将 HPLC法作为检测饲料中 CLB残留的 半确证法 ,将 GC2MS法定为确证性方法 ,主要 用于最后确认和仲裁 ,而对于动物性食品中 CLB残留尚未有检测标准。HPLC法中常用的 检测器有电化学检测器、紫外检测器;HPLC法 优点是检测精确度高 ,其最低检测限范围为 1～15 ng/ g ,而且假阳性率低 ,与 GC2MS法相 比样品不必衍生;缺点是检测过程烦琐、检测时 间长 ,需贵重仪器、难
于操作、价格昂贵 [18 ]。GC2MS法优点是能在多种残留物同时存在情 况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析。与 HPLC相比 , GC2MS法灵敏度更高 ,假阳性 率更低 ,其缺点也同 HPLC法一样。CE法非 常适用于难以用传统的液相色谱法分离的离子 化样品的分离与分析。优点是有很大的灵活 性 ,许多分离参数 ,如缓冲液的组成和 pH值 , 毛细管的类型以及所使用的电场的波形都可以 调节 ,操作简便 ,所需样品量极少 ,一般只需几 纳升。缺点是检测时间仍很长 ,不能满足在线 检测 ,仪器复杂、缺乏配套的检测器 [19 ]。((TLC [4 ,12 ,15～17 ] GC2MS、毛细管区带电泳法。其中前3种方法最常用,中、薄层色谱法F TIR 2GC((CE、高效液相 傅立 的 R2biopharm公司分别开发出了检测肉品、饲 色谱 2质谱联用法
(HPLC2MS、气相色谱 2料中 CLB残留的 EL ISA试剂盒 ,但其价格费 叶红外联用法 用极高 ,每检测一份猪肉是否含 CLB的费用是 1 200～1 400元。正因如此 ,国内许多科研院 311 感官识别 [ 13 ,14 ] 凡饲喂盐酸克伦特罗比较严重的猪宰后肉 色特别鲜红、后臀肌肉饱满突出 ,脂肪非常薄 , 肉皮紧贴着瘦肉、瘦肉纤维比较疏松 ,肉皮与瘦 肉之间无肥肉(肥膘厚度不到 115 cm ,有时有 少量“汗水”渗出肉面 ,这种肉就很可能含有 CLB;而一般健康肉淡红色 ,肉质弹性好 ,也不 会有 “出汗”现象。通过这种感官识别方法就可 以快速、简单、定性对动物性食品中有无 CLB 作出初步判定。312 色谱检测技术 目前 ,检测 CLB残留常用的色谱技术有高 效液相色谱(HPLC、气相色谱 2质谱联用法 313 免疫分析技术(IA 标记免疫分析技术是 “迈向 21世纪的医学 检验技术”之一 ,其发展趋势是 :新标记物的发 110
2004 Vol.30 No.9(Total 201 展与联合应用、单克隆以及基因工程抗体的应 用和免疫放大技术 ,可明显提高检测特异性 ,灵-敏度可达 zepto(10-20、yocto(10 24 水平,即 可实现分子水平的检测 [20 ]。目前 ,用于检测 CLB残留的免疫分析技术主要有放射免疫分 析技术(RIA和酶免疫分析技术(EIA。国外 已生产出运用 RIA测定 CLB残留的试剂盒 , 还建立了类似放射免疫分析法的放射受体分析 法 ,这种方法是用受体代替抗体结合 CLB ,检 测限可达 214 ng/ g ,国内在此方面的研究尚属 空白 [21～23 ]。对于 EIA分析技术中检测 CLB 残留较高效的是酶联免疫吸附技术(EL ISA。目前 ,英国的 Randox Laboratories Ltd和德国 所都在开发研制检测 CLB残留的 E
L ISA试剂 盒。据报道 ,中国疾病预防控制中心营养与食 品安全研究所和上海市畜牧兽医站与上海赛群 生物科技有限公司联合开发研制的瘦肉精 EL ISA检测试剂盒也已分别问世 ,且后 2家单 位联合开发产品已投入商品化生产及实际应用 中。经与同类进口试剂进行对比试验 ,结果显 示国产试剂盒在灵敏度、准确性上都已达到进 口试剂盒的水平,而在稳定性、回收率方面要优 于进口试剂盒 ,且价格费用要下降很多 [24 ]。EL ISA的优点是灵敏度高、操作简便、检测迅 速;缺点是仍不能实现在线检测 ,而且假阳性率 较高。314 综合化学法 根据 CLB的化学结构与性质 ,参照国家药 典标准方法可以进行综合鉴别 [25 ]。因其溶于 水和乙醇 ,故可以用水进行提取。CLB可显示 芳香一胺类的鉴别反应 ,也可以显示氯化物的 鉴别反应 ,同时 ,用分光光度计检测 ,可在 243 nm与 296 nm的波长处得到最大吸收。综合分 析可以判定动物性食品中是否存在 CLB类物 质 ,且该法不需昂贵的仪器与试剂 ,也没有复杂 的样品前处理 ,操作简单 ,无疑是基层卫生防疫 分析与检测 CLB的高效在线检测 [15 ] 原理为当分子识别部分与被识别物质相接触 光变化以及直接 诱导电信号 ,而后利用电学测量方法进行检测、控制和显示输出。国外已有用生物传感器技术 检测 CLB残留的资料报道 [26] ,其优点是特异 性强、假阳性率低、高效、方便 ,国内未见有开发 成功的相关报道。总之 ,尽快研制出高效、方 便、迅速的 DIGFA试纸条和生物传感器是检 测 CLB残留较为理想的方法和途径 ,也是今后 发展趋势。及准确度均很理想。如果研制出检测。对于生物传感器,其 时,可发生化学变化、热变化、CLB的13 闫红军,马巧娥.提高卫生知识水平严防 中毒[J ].动物医学进展,2003 ,24(5 :127 “瘦肉精” 滴金免疫试纸条或滴金免疫测试盒则可实现 14 李 杰.瘦肉精残留危害与动物性食品安全 [J ].中国饲料 ,2003 ,4 :31～32 工作者初选 CLB残留的有效方法 ,但最低检测 限较高 ,灵敏度低。4 盐酸克伦特罗检测技术的未来趋势 和发展方向
根据目前国内外检测 CLB各种方法的进 展情况以及 CLB滥用及残留的严峻性 ,建立一 种克服上述各种检测方法缺点的简便、快速、精 确、可实现在线检测的 CLB技术势在必行。滴 金免疫技术(DIGFA 和生物传感器技术(biosensor ,BS是 2种快速、高效的残留物分析 技术。其中 DIGFA技术已成功的运用于早孕 诊断、弓形虫病诊断、血吸虫病诊断等 ,灵敏
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分离与提纯 表 3 不同抗氧剂对猪油的抗氧化 作用(POV值 mmol/ kg 样 品 时间 /d 0 48 013 %提取液 01062 01068 01287 013 %抗坏血酸 01062 01089 01301 013 %柠檬酸 01062 01132 01413 013 %EDTA 01062 01066 01279 3 结 论 比较了几种不同提取方法的提取效果 ,实 验显示 :体积分数 75 %乙醇提取法提取率较 高 ,提取物比较容易浓缩和干燥 ,是一种较好的 提取方法。柿叶黄酮类化合物的抗氧化性较强 ,通过 对猪油的抗氧化效果试验发现 :其抗氧化效果 比抗坏血酸和柠檬酸稍强。参考文献 1 谭仁祥 1植物成分分析 [M]1北京 :科学出版社 , 2002.486～502 2 万素英 ,赵亚军 ,李 琳等 1食品抗氧化剂 [M]1北 京 :中国轻工业出版社 ,1998 Study on Extraction Method and AntiSong Changchun Bao Qingsheng(Department of Basic Courses , Anhui Technical Teachers College , Bengbu , 233100 2oxidation Property of Flavonoid Compound from Leaves of Diospyros kaki ABSTRACT The extraction method of flavonoid in leaves of Diospyros kaki was studied1 The opti2 mum extracting process was put forward , and anti2oxidation property of the extract from the leaves of Diospyros kaki was studied1 The results showed that the optimum extracting technical process was 75 % alcohol1 Effect of flavonoid from the leaves of Diospyros kaki was higher than ascorbic acid and citric acid1 Key words leaves of Diospyros kaki , flavonoid ,extraction method ,antioxidant(上接第 111页 和国药典 [M].北京 :化学工业出版社 ,1995.62923 彭笑蓉 ,孙文梅.竞争酶标免疫法检测“瘦肉精” ～630 [J ].河北畜牧兽医 ,2003 ,19(4 :42～43 26 Pizaariello A , Stred’ansky M , Stred’ansky S et al.24 张苏华 ,黄士新.国产“瘦肉精” EL ISA试剂盒与A Solid binging matrix/ molecularly imprinted poly2 同类进口试剂盒的对比试验 [J ].上海畜牧兽医通mer-based sensor system for the determination of 讯 ,2003 ,4 :20～21 clenbuterol in bovine liver using differential-pulse 25 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共
克伦特罗 篇5
60例盐酸克伦特罗中毒患者系我院2007年5月15日-22日急诊科、内科的住院病人, 本文重点讨论其心电图改变及临床特点。
1资料和方法
1.1 一般资料
60例本院住院患者, 男40例, 女20例, 年龄3～81岁。中毒方式为食用喂有瘦肉精的猪肉、猪内脏、猪骨头汤。食入后30min～3h入院。主要临床特点全部有心电图异常、低血钾、心悸、乏力、头晕、四肢颤动, 部分呕吐等。
1.2 方法
此60例均采用上海-6511型心电图机做常规检查。记录时间为中毒后30min～3h, 2～7d复查1～4次。60例首次心电图分析, 其中心电图表现为窦性心动过速60例 (100%) , U波增高51例 (85%) , ST-T改变30例 (50%) , 室性期前收缩11例 (18%) 。
2结果
所有病例经输液补钾, β-阻滞剂治疗后, 心电图2～7d内恢复正常。
3讨论
克伦特罗 篇6
克伦特罗属于β类兴奋剂, 我国规定禁止在动物生产中添加使用, 但受经济利益的驱使, 非法添加屡禁不止, 中毒事件时有发生。当前全国市、县级以下实验室主要采用酶联免疫吸附法来检测猪尿、组织中克伦特罗的残留。笔者通过试验对猪尿、猪肝及猪血清中克伦特罗检测的回收试验分析, 判定实验室过程是否处于可控范围, 对判定检测结果准确性有一定的实际意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1) 试验仪器。Sunrise酶标仪 (滤光片波长为450 nm/630 nm) , 离心机 (3 000~4 000 r/min) , 微量移液器 (10~300μL, 单道、多道) , 氮吹仪。
2) 试验材料。试验用6头育肥猪所采食饲料中添加5 mg/kg盐酸克伦特罗, 连续饲喂20 d后停止, 休药期满20 d时, 同时采集猪血清、猪尿及猪肝样品, 对应编号。
3) 试验试剂。酶联免疫检测试剂盒 (购自北京维德维康生物技术有限公司) 、乙酸乙酯 (分析纯) 、异丙醇 (分析纯) 等。
1.2 方法
1) 试样的制备。猪尿、猪血清:3 000 r/min离心10 min, 取上清液作为供试样品。猪肝:准确称取 (2.00±0.01) g样品, 加入6 m L 0.2 mol/L高氯酸溶液;室温 (25℃) 下, 剧烈涡动2 min, 4 000 r/min离心10 min, 将上清液转入新的离心管中, 用1 mol/L Na OH溶液调p H值至11.6左右;加入8 m L乙酸乙酯-异丙醇 (8:2) 溶液, 室温下剧烈涡动2 min, 4 000 r/min离心10 min, 取4 m L上层有机相于新的离心管中, 于60℃水浴中, 氮气吹干;加入500μL样品稀释液, 充分涡动1 min, 取上清液作为供试试料。
2) 加标回收方法。回收试验分为空白加标回收和样品加标回收。回收率是判定分析结果准确度的量化指标, 相对标准偏差是衡量结果精密度的量化指标。本试验主要研究ELISA方法测定盐酸克伦特罗时, 平行样测定结果的相对标准偏差、空白加标回收率、实际样品加标回收率、空白加标回收率相对标准偏差及样品加标回收率相对标准偏差5个质控指标的定量评价标准。
3) 加标量。加标量为检出限的2~6倍。根据农业部盐酸克伦特罗的最低检测标准1μL/L标准, 猪尿、猪血清试料空白加标和实际样品加标的加标量为分别2、4和6μL/L3个浓度, 每个加标量浓度作6个平行, 同时做6个平行的样品检测;猪肝试样分别在样品处理前和处理完成后进行加标试验。检测过程始终在相同的试验条件下进行, 减少人员、仪器、环境等条件变化对结果产生的影响。
4) 检测步骤。按ELISA试剂盒说明书操作。超出标准曲线的样品按一定的比例用蒸馏水稀释后进行检测。
5) 回收率、相对标准偏差的计算。
相对标准偏差 (RSD) 是样本标准偏差和回收率平均值间的百分比值, 相对标准偏差值越小, 检测结果精密度越高。其计算公式为:
2 结果与分析
猪尿、猪血清加标回收率见表1, 样品中克伦特罗含量见表2, 猪肝加标回收试验结果见表3, 空白加标回收试验结果见表4。
1) 由表1和表2可知, 不同样品中添加不同浓度标准品, 加标回收率为60.2%~100.5%, 在试剂盒规定的回收率范围 (60%~120%) 内;精密度均在相同的范围内, 表明检测结果在实验室内得到了有效控制。
2) 由表3可知, 样品处理前加标回收率为60.2%~79.6%, 样品处理后加标回收率为85.6%~95.6%, 样品处理后加标回收率明显高于样品处理前的加标回收率。表明样品处理过程对试验结果准确性产生很大的影响, 试验时应考虑样品处理过程中对试验结果产生影响的因素。
3) 由表2和表4可知, 试样及空白加标重复测定结果相对标准偏差均小于0.5%, 说明检测操作过程对测定结果的影响相对较小, 在试验误差允许范围内。
3 讨论
1) 加标回收率反映了检测结果的准确度, 相对标准偏差反映了检测结果的精密度, 可有效的运用到克伦特罗药物残留的检测中, 对试验分析的准确度有着较好的监控作用, 能够及时发现试验过程中存在的问题是由于系统误差产生还是偶然误差产生的, 并提出改进的方法, 有效提高检测人员的技术水平。
2) 由试验结果可知, 向含有克伦特罗的猪尿、猪血清添加不同浓度标准品, 回收率和空白添加回收率基本相同, 因此, 设计回收试验时, 可直接用空白加标回收作为质量控制的手段之一。猪肝样品需进行复杂的样品前处理程序, 设计回收试验时, 最好在样品处理前添加克伦特罗, 以便能及时发现影响结果准确性的因素, 采取有效措施加以改正。
3) 在检测过程中应控制好试验条件, 避免影响试验结果的各种因素 (如人员、仪器、环境、检测方法等) 发生变化。应合理设计回收试验, 评价试验结果的可信度, 对发现结果存在较大偏移的, 应立即采取有效措施, 取得满意的结果。
4) 加标回收试验是实验室质控手段的一种, 具有简单、易操作等特点, 特别适合于样本数量大的检测, 但在实际检测工作中需要结合其他质控方法, 对实验室检测结果实施全面质量控制。
摘要：为判定用酶联免疫吸附法测定克伦特罗及其残留的结果准确性, 笔者对猪尿、猪肝及猪血清中克伦特罗进行了检测及回收试验分析。结果发现:用酶联免疫吸附法测定克伦特罗及其残留的实验室过程处于可控范围内, 检测结果准确、可靠;但猪肝样品的处理会对检测结果产生一定影响, 应加以避免。
克伦特罗 篇7
盐酸克伦特罗(俗称瘦肉精),能促进动物骨骼肌中蛋白质的合成,抑制脂肪的合成,提高瘦肉率。然而其易在动物组织中蓄积残留,过量误食后会引发中毒,影响身体健康。1997年我国政府就已发文禁止CLB在饲料和畜牧生产中使用。但是近年来我国各地盐酸克伦特罗中毒事件仍时有发生,严重危及到人的身体健康。因此,研究动物组织中盐酸克伦特罗残留的测定方法及测定结果的不确定度评估有着重要的意义[1]。
目前国内用于盐酸克伦特罗残留阳性确证检测方法中,气相色谱-质谱法(GC-MS),高效液相色谱-质谱法(LC-MSMS)以其灵敏度高、假阳性低的特点成为首选方法,其中GC-MS已经得到较广泛的应用[2,3]。
本文参照NY/T468-2006,在碱性条件下以乙酸乙酯为提取液,利用GC-MS法测定猪肉组织中盐酸克伦特罗残留的含量,分析检测中测量不确定度的主要来源,依据JJF1059-1999[4]和JJF1135-2005[5],对测量结果的不确定度进行评定。
1 实验部分
1.1 仪器
气质联用仪:岛津GCMS-QP2010;电子天平:XP204型,JM-B3002型;高速匀浆机;冷冻离心机;漩涡振荡器;PH试纸;固相萃取装置;SCX固相萃取柱500mg/3mL,Supelco公司;氮吹仪;烘干箱。
1.2 药品和试剂
盐酸克伦特罗标准品,含量98.5%;双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA);甲醇、乙酸乙酯、甲苯为色谱纯;碳酸钠、盐酸、氢氧化钠、氨水为分析纯;水为超纯水。
1.3 实验方法
参照NY/T468-2006,将样品在碱性条件下用乙酸乙酯提取,利用稀盐酸反萃取,萃取样液调pH到5.2后用SCX小柱净化,分离的药物残留经BSTFA衍生,甲苯定容后,进行GC/MS分析。
1.4 实验结果
根据标准曲线,测得样品液中盐酸克伦特罗含量为164.09ng/mL,计算得到试样中盐酸克伦特罗含量为16.41μg/kg。
2 实验结果评定
2.1 数学模型与灵敏度系数
试样中盐酸克伦特罗含量按下式计算
式中,X试样中克伦特罗残留含量(μg/kg);c样品液中盐酸克伦特罗含量(μg/L);V样液最终定容体积(mL);m最终样液所代表的试样量(g)。
由式(1)可见,试样中盐酸克伦特罗含量的不确定度主要由输入量c、V、m引入,各输入量的灵敏度系数为
2.2 输入量的标准不确定度评定
2.2.1 输入量c的标准不确定度评定
主要来源于由标准溶液引入的不确定度,标准溶液系列浓度-峰面积拟合的标准曲线求得c时引入的不确定度,以及样品液重复测量引入的不确定度。
(1)标准溶液引入的不确定度u1(c):标准溶液的不确定度主要由标准物质本身的不确定度、称取标准物质引入的不确定度及标准溶液配置过程引入的不确定度决定。
根据标准品的证书,标准品的相对扩展不确定度为0.5%,包含因子k=2,则标准物质本身引入的相对不确定度为0.25%。
标准物质称量使用最小分度值为0.0001g的电子天平,准确称量0.020g,由于天平数显非常稳定,称量重复性引入的不确定度忽略不计。最大允许误差为±0.5mg,根据JJG1036-2008电子天平检定规程,称量结果扩展不确定度为0.5mg/3=0.17mg,按矩形分布,天平引入的不确定度为0.098mg,相对不确定度为0.49%。
标准溶液的配制,先后经定容、逐级稀释、氮气吹干、衍生等过程,其间先后使用A级10mL、25mL容量瓶、200μL可调移液器,此过程中包括人员因素引入的最大相对不确定度不超过±1%,按均匀分布计算相对不确定度为0.58%。
以上3者互不相关,故标准溶液引入的相对标准不确定度为
标准不确定度为。
(2)标准曲线引入的不确定度u2(c):制备6个不同浓度盐酸克伦特罗标准溶液,每个浓度2平行,各重复进样2次(见表1),用最小二乘法拟合,获得直线方程Y=707.46X-29.316,线性系数R=0.9995,a=-29.316,b=707.46。
制备6个平行样品液,各重复进2针(见表2)。
其平均峰面积为116060,代入直线方程,求得样品质量浓度为164.09ng/mL。
由标准曲线求得c时引入的不确定度为
其中
P待测样品的测量次数(=12);n配制的标准溶液浓度数(=6);m:每个浓度的测量次数(=4);c:待测样品的浓度值;:标准溶液的平均值。
(3)样品液重复测量引人的不确定度w3(c):6个平行样品液各重复进样2次测得峰面积数据(见表2)，按A类不确定度评定，其合并样本标准差为实际测量是以12次峰面积测量的算术平均值作为测量结果，可得其相对不确定度为：则重复测量引人的标准不确定度为：w3(c〇=1.53ng/mL。
(4)输人量c的标准不确定度m(c):以上各不确定度分量互不相关，所以输人量c引人的不确定度为
2.2.2 输入量V的标准不确定度评定
最终定容体积为0.5mL,即使用可调移液器加200μL甲苯2次,加100μLBSTFA1次,不确定度来源主要是移液器引入的不确定度。
根据移液器检定证书,200μL和100μL的允差分别为±1.5%和±2.0%,按均匀分布考虑,,则两者的相对不确定度分别为0.9%和1.2%,标准不确定度分别为1.8μL和1.2μL。则移液器引入的标准不确定度为
2.2.3 输入量m的标准不确定度评定
样品称量使用最小分度值为0.01g的电子天平,准确称量5.0g,由于天平数显非常稳定,称量重复性引入的不确定度忽略不计。该准确级的天平在(0～50)g称量范围的最大允许误差(使用中)为±0.0005g,由称量误差导致的不确定度按矩形分布计算(B类评定),则标准不确定度为u(m)=0.0003g。
2.3 合成标准不确定度和扩展不确定度
2.3.1 灵敏系数计算。
2.3.2 标准不确定度汇总(见表3)。
2.3.3 合成标准不确定度的计算
以上各输入量互不相关,所以合成标准不确定度为
其中，且各分量的计算结果(见表3)。
2.3.4 扩展不确定度
置信水平为95%,取k=2,则扩展不确定度为:U×k=0.54μg/kg
相对扩展不确定度为:
2.3.5 测量结果表示
称样量5.0g,置信水平为95%,测得结果为:16.41±0.54μg/kg
3 结语
GC-MS法测定猪肉组织中盐酸克伦特罗残留的含量,测量结果不确定度主要来源于样品称量、样品最终定容体积和样品液中盐酸克伦特罗的浓度的测定,前两项主要取决于所用移液器和电子天平的不确定度,对测量结果不确定度的贡献较小,样品液浓度的不确定度主要来源于标准溶液引入的不确定度,标准溶液系列浓度-峰面积拟合的标准曲线求得c时引入的不确定度,以及重复测量引入的不确定度,对测量结果不确定度的贡献较大。工作中应有针对性地采取措施,提高所用仪器的精密度,增强仪器测定的稳定性,减少标准溶液制备过程中的人员误差,从而提高样品检测结果的准确度。
摘要：讨论标准曲线法测定猪肉中盐酸克伦特罗的不确定度分析。通过对影响样品测试结果的不确定度分量的分析和量化,求出各分量对测量结果不确定度的相对贡献,得出被测量(猪肉中盐酸克伦特罗)的合成标准不确定度和扩展不确定度分别为u=0.27μg/kg和U=0.54μg/kg,并对测量结果进行表述:16.41±0.54μg/kg。如实反映测量的置信度和准确度。
关键词：标准曲线法,盐酸克伦特罗,不确定度
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[4] JJF 1059-1999测量不确定度评定与表示[S]
克伦特罗 篇8
盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检测卡 (试纸条) 在使用前进行质量验证是确保试纸条检测结果准确有效的重要手段, 必不可少。笔者在实际工作中对6个厂家的12批次产品进行了质量验证, 现将验证方法及体会写下来, 供同行商榷。为了便于叙述, 下面以盐酸克伦特罗检测卡为例, 进行叙述。
1 验证参数及判定标准
1.1 检测阈值、假阴性率、假阳性率
即试剂条能检测出来的最低浓度值。当检测阈值等于试纸条标示的检测限时, 该试纸条为合格。当其小于或大于检测限时, 会导致高的假阳性率或高的假阴性率, 此试纸条判为不合格。
1.2 判定标准
国内外对于快速检测技术的一个基本原则是“绝不能有假阴性, 但允许有假阳性”。按照农业部兽药残专家委员会评审快速检测卡 (试纸条) 备案时的有关要求, 快速检测卡 (试纸条) 的假阳性率应<10%。
2 材料
2.1 空白猪尿样品
20头份, 分别编号为A1、A2、A3、……、A20。从鹤壁市某养猪场采集, 用液-质联用仪方法检测, 未检出盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇。
2.2 盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品
从中国计量科学研究院购买。
2.3 盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准储备液 (1 mg/mL)
配制方法:准确称取盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品约10.0 mg, 分别置于10 m L容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度。贮存于-18℃冰箱中, 有效期为1年。
2.4 盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准中间工作液 (10μɡ/mL)
配制方法:用微量移液器移取标准储备液100μL, 置于10 mL容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度。贮存于-18℃冰箱中, 有效期为1个月。
2.5 微量移液器0~1 000μL。
2.6 瘦肉精试纸条
盐酸克伦特罗试纸条 (检测限为3ng/mL) 、莱克多巴胺试纸条 (检测限为2 ng/mL或5 ng/mL) 、沙丁胺醇试纸条 (检测限为5 ng/mL或3ng/mL)
2.7 阴性猪尿样品一
制备方法:取2.1空白猪尿样品任1头份 (比如:A1) 5 mL, 置于50 mL塑料瓶中。
2.8 阴性猪尿样品二
制备方法:取2.1空白猪尿样品任1头份 (比如:A1) 5 mL, 置于50 mL塑料瓶中。再分别移取适量盐酸克伦特罗的标准中间工作液加入空白猪尿中, 配制浓度为盐酸克伦特罗检测卡 (试纸条) 标示的检测限-1的阴性猪尿样品 (即盐酸克伦特罗的浓度为2 ng/mL) , 混匀备用, 现配现用。
用同样的方法分别制备莱克多巴胺、沙丁胺醇的阴性猪尿样品 (莱克多巴胺的浓度为4 ng/mL或1 ng/mL、沙丁胺醇的浓度为2 ng/mL或4 ng/mL) 。
2.9 阳性添加样品
2.9.1 阳性猪尿样品一:
制备方法:取2.1空白猪尿样品任1头份 (比如:A1) 5 mL, 置于50 mL塑料瓶中。再移取适量盐酸克伦特罗标准中间工作液加入空白猪尿中, 配制浓度为盐酸克伦特罗检测卡 (试纸条) 标示的检测限的阳性猪尿样品 (即盐酸克伦特罗的浓度为3 ng/mL) , 混匀备用, 现配现用。
用同样方法, 制备莱克多巴胺、沙丁胺醇阳性猪尿样品一 (莱克多巴胺的浓度为5 ng/mL或2 ng/mL、沙丁胺醇的浓度为3 ng/mL或5 ng/mL) 。
2.9.2 阳性猪尿样品二:
制备方法:取2.1空白猪尿样品任1头份 (比如:A1) 5 mL, 置于50 mL塑料瓶中。再移取适量盐酸克伦特罗标准中间工作液加入空白猪尿中, 配制浓度分别为10ng/ml的盐酸克伦特罗阳性猪尿样品混匀备用, 现配现用。
用同样方法, 制备莱克多巴胺、沙丁胺醇阳性猪尿样品二 (莱克多巴胺的浓度为10 ng/mL、沙丁胺醇的浓度为10 ng/mL) 。
3 方法
3.1 试纸条的使用步骤及结果判读
3.1.1 将未开封的试纸条恢复至室温。
3.1.2 将试纸条水平放置, 用滴管向试纸卡孔缓慢逐渐加入3滴不含气泡的检测液 (约80μL) 。
3.1.3 反应3~5 min后判读结果。
3.1.4 结果判定:用肉眼观察, 依照说明书进行结果判定。
3.2 检测阈值的测定
用盐酸克伦特罗试纸条分别对阴性猪尿样品一、阴性猪尿样品二、阳性猪尿样品一、阳性猪尿样品二进行检测, 每个样品两个重复, 记录下来呈现阳性的最低浓度值。如果阳性猪尿样品二也不呈现阳性, 则配制浓度更高的阳性猪尿样品进行检测, 直至出现阳性结果为止。然后, 在出现阳性的最低浓度值和该值前一个浓度值之间配制数量差为1 ng/mL的系列浓度的阳性猪尿样品, 每个浓度各用2条试纸条进行检测, 出现阳性的最低浓度值即为该试纸条的检测阈值。
3.3 假阳性率的测定
取空白的猪尿样品A1、A2、A3、……、A20各1份, 每份量为10 mL, 然后, 按照阴性猪尿样品二的制备方法, 制备A1′、A2′、A3′、……、A20′等20份阴性猪尿样品。对A1、A2、A3、……、A20, A1′、A2′、A3′、……、A20′等40份猪尿样品用检测卡检测, 每个样品做2个重复, 在常温 (20~30℃) 条件下, 按照说明书, 进行结果判定, 统计假阳性数, 按照下面的公式计算假阳性率。
假阳性率=假阳性数/80х100%
3.4 假阴性率的测定
按照阳性猪尿样品一的制备方法, 制备A1″、A2″、A3″、……、A20″等20个阳性猪尿样品, 用检测卡进行检测, 每个样品做两个重复, 在常温 (20~30℃) 条件下, 按照说明书, 进行结果判定, 统计假阴性数, 按照下面的公式计算假阴性率。
假阴性率=假阴性数/40х100%
4 结果
笔者在工作中, 对6个厂家12批次的试纸条进行了验证, 现将结果简要整理如表1。
5 讨论
5.1 验证参数有哪些
试纸条在使用前, 应对3个参数进行验证, 分别是:检测阈值、假阴性率、假阳性率。
但是, 从表格中我们发现, 检测阈值高于检测限的情况 (7/12) 较为常见, 有的产品检测阈值甚至达到30 ng/m L, 是检测限的6倍。另外, 根据国家相关规定, 试纸条用于筛选方法时, 假阴性率必须为零。因此笔者认为, 如果没有条件对3个参数都进行验证时, 应至少对“检测阈值”、“假阴性率”这两个参数进行验证。
5.2 每批产品是否都要验证
从表中可以看出, 试纸条产品质量参差不齐, 差别极大。即使有备案文号的试纸条每批产品的质量也有差异, 如杭州B公司生产的两批莱克多巴胺试纸条。因此建议, 每批产品使用前, 均须进行验证。
5.3 检测阈值的问题
“检测阈值”这个参数应先验证, 根据它的结果, 再考虑其它参数是否需要验证。当其高于或低于检测限时, 由于出现高的假阴性率或假阳性率, 导致问题畜产品流入市场或增加了监管部门确认经费的负担, 因此均应判为不合格。只有二者相等时, 才进行另外两个参数的验证。
5.4 假阳性率的问题
由于尿液中样本成分复杂, 特别是在含有盐酸克伦特罗结构相近的代谢物时, 都将导致出现假阳性, 因此, 试纸条出现假阳性是不可避免的。但由于检测卡主要用于筛选方法, 可以允许一定的假阳性率。根据相关规定, 假阳性率允许10%以下。
摘要：当前, 国内生产盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检测卡 (试纸条) 的厂家众多, 试剂条的质量参差不齐, 同一厂家不同批次的产品质量差异很大, 致使现场检测过程中, 要么假阳性样品数量太多, 增加了监管部门确认经费的负担, 要么出理假阴性样品, 导致兽药残留超标的畜产品流入市场, 造成畜产品质量安全隐患。如何在使用前进行质量验证是确保试纸条检测结果准确有效的重要手段。文章探讨了快速检测试纸条的质量验证试验, 提出三个验证参数"检测阈值、假阴性率、假阳性率"。指出“检测阈值”是个重要参数。
关键词：试纸条,质量验证,方法
参考文献
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[2]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会.GB/T22147-2008饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定.2008.
[3]农业部.农业部1025号公告-16-2008动物尿液中盐酸克伦特罗残留检测气相色谱-质谱法.2008.
克伦特罗 篇9
1 材料
标准品:盐酸多巴胺 (纯度为98.5%) , 购自Fluka公司;硫酸沙丁胺醇 (纯度为98%) 、盐酸克伦特罗 (纯度为98%) , 购自Sigma公司;盐酸莱克多巴胺 (纯度为95.1%) , 购自Sigma-Aldrich公司。
LC-10A型高效液相色谱仪[包括SPD-M10A二极管阵列检测器、SIL-10AD自动进样器、ODS C18反相色谱柱 (150 mm×4.6 mm, 5 μm) ], 购自SHIMADZU公司;1 mg C18SPE小柱, 购自江苏汉邦公司;SORVALL台式高速冷冻离心机, 德国Heraeus公司制造; BS210S分析天平 (0.1 mg) , Sartorius公司制造。以上仪器由军事医学科学院军事兽医研究所空气生物学与呼吸道病原学实验室提供。
2 方法
2.1 标准贮备液的配制
精确称取上述标准品溶于1 mL的过滤水中, 使之成为1 mg/mL标准储备液, 置于-20 ℃冰箱中保存, 备用。
2.2 样品的提取
提取方法参照参考文献[1]并做适当调整。取10 g鸡肝, 加入2倍体积的乙腈匀浆, 在高速离心机上以5 000 r/min速度离心10 min;取上清液, 沉淀物再用乙腈洗涤, 离心后合并上清液, 用旋转蒸发器蒸至2～3 mL, 最后定容至5 mL作为样品提取液, 置冰箱保存, 以备净化。
2.3 样品的净化
取1 mg SPE小柱用5 mL甲醇进行活化, 然后用5 mL水冲洗小柱并抽干, 加入1 mL 提取的样品, 用0.5%甲醇溶液3 mL 进行清洗, 弃去洗脱液;再用含12%乙腈的甲醇溶液5 mL进行洗脱, 收集洗脱液, 用氮气吹干, 再用5 mL流动相A液溶解。将此净化的样品溶液过滤后进行HPLC分析。
2.4 高效液相色谱的测定条件
色谱柱, SHIMADZU ODS C18反相色谱柱 (150 mm×4.6 mm, 5 μm) ;流动相, 10%乙腈的0.02 mol/L磷酸盐溶液 (pH值为2.50) 为流动相A, 含50%乙腈的0.02 mol/L磷酸盐溶液 (pH值为2.50) 为流动相B, 在6 min内由A液变为B液进行梯度洗脱。柱温为25 ℃, 流速为1 mL/min。
3 结果与分析
3.1 色谱条件的选择
采用SPD-M10A二极管阵列检测器对盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸莱克多巴胺、盐酸克伦特罗进行紫外光谱分析。结果表明, 四者分别在197, 197, 193, 210 nm有最大吸收峰。
3.2 标准曲线的制作
将盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸莱克多巴胺和盐酸克伦特罗标准贮备液进行一系列稀释, 按上述色谱条件进行色谱测定。以进样量对峰面积作图, 线性范围为5～100 ng, 其线性方程和相关系数见表1。
注:x为峰面积, Y为进样量。
3.3 重复性试验
将浓度为10 μg/mL的盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸莱克多巴胺、盐酸克伦特罗的混合标准溶液按上述方法重复进样10 μL (n=5) , 其面积的积分值分别为 (611 838.40±1 824.23) 、 (450 197.00±630.35) 、 (669 304.60±687.01) 、 (405 097.20±1 168.38) , 变异系数分别为0.29%、0.14%、0.11%和0.28% (见表2) 。说明该检测方法重复性良好。
3.4 标准回收率试验结果
将系列浓度的盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸莱克多巴胺、盐酸克伦特罗的混合标准溶液按上述色谱条件进行分析, 分别按各自的回归方程求得各自的含量, 与实际进样量比较, 分别计算各自的标准回收率, 其结果见表3。混合标准液相色谱图见图1。
3.5 加标样品回收率试验结果
取1 mL样品提取液, 加入适量混合标准溶液, 按2.3的方法进行净化, 同时设空白对照, 进行HPLC分析。结果表明:鸡肝组织样品中盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸莱克多巴胺和盐酸克伦特罗的加样回收率分别为 (63.23±1.54) %、 (100.39±2.24) %、 (101.78±1.79) %和 (72.57±2.19) %, 变异系数分别为2.45%、2.24%、1.76%和3.01% (见表4) 。空白鸡肝样品和加标鸡肝样品的HPLC色谱图见图2、图3。
4 讨论
从试验结果来看, C18SPE小柱对盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸莱克多巴胺、盐酸克伦特罗的吸附能力存在较大差异, 在用不同浓度的甲醇水清洗杂质时, 对结果的影响不同。在试验中, 用0.5%、0.7%及1%甲醇溶液各清洗2, 3, 5次 (每次1 mL) , 结果表明:用0.5%甲醇溶液清洗效果最好;但由于吸附能力的差异, 洗2次时盐酸多巴胺的回收效果很好, 但杂质尚存;洗5次时可显著去除杂质的影响, 但盐酸多巴胺被洗掉了, 致使回收率很低。为同时检测4种β-受体激动剂, 选择了0.5%甲醇溶液清洗3次。样品的回收率除与清洗次数有关外, 还与SPE小柱洗脱溶液有关, 经测定用12%乙腈的甲醇溶液对样品进行洗脱的效果较好。
本方法检测的4种β-受体激动剂的加标回收率在63.23%～101.78%之间, 变异系数在5%以内, 结果可靠。盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸莱克多巴胺检测下限为0.25 ng, 盐酸克伦特罗为0.5 ng。试验成功建立了盐酸多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸莱克多巴胺、盐酸克伦特罗同时富集、分离和检测的方法, 并对固相萃取柱的净化、HPLC检测条件等进行优化, 具有良好的灵敏度和准确度。
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