石蜡切片机（共7篇）
石蜡切片机 篇1
1 故障现象
切片机有时出现左侧的操作小面板快进键和快退键同时点亮的情况。此时，操作小面板上所有按键失灵，呈现“死机”状态，但不出现报警提示，切片机构不能前进或后退。切片机有时会出现蜂鸣报警，此时操作小面板上，除切片和修块功能转换选择按键能起作用外，其余按键均无法使用。有时切片机又完全正常。故障现象不确定，出现时间无规律。
2 故障分析
首先检测操作小面板上的各按键，良好，未出现短路或漏电情况。切片机构不能前进或后退，一般情况是由于机构到达极限位置，但此时按相反方向的控制按键，切片机构未能朝相反方向运动，拆机检查，未发现机构有卡死现象。经检测，机构位置检测光耦也正常。
由于故障现象时有时无，怀疑电路板有虚焊或接口部分接触不良。检查与机构运动和位置检测相关的电路板及接口部分，未发现异常。怀疑周围环境有干扰，将仪器移至另一处，并有效接地，故障依旧。
考虑到切片机有时会出现所有面板按键不能正常使用的故障现象，如果是固化程序出错，不应该是有时正常，有时异常，而是应一直出现问题。逐一断开电路板上各接口，当断开中间板接口JX2时，开机不报警，前进或后退均正常，说明故障是与JX2接口相关部份有关。经检查发现JX2接口与光耦板的JX3接口相连。断开JX2接口，故障现象消失，只断开JX3接口，故障依旧，说明故障就发生在JX2与JX3的之间的连接部份。仔细观察发现JX2与JX3之间相连的是一根排线，随着机构的进退，排线也做相应的运动。厂家为防止排线在运动中被挂住，将排线中间部分对折成90°，并用一金属块压迫对折部分，起固定作用。取下金属块，发现排线有多处折断，裸露出的金属丝部分短路，找到了故障根源。由于仪器在出厂时，排线的中间部分折叠成直角，金属块又挤压得太厉害，原设计排线长度稍短，机构经常运动，容易造成排线折叠处折断。若部份连接线出现短路，造成保护性停机，开机立即报警。机构所处的位置不同，折叠处短路部分有时又可能恢复正常，此时切片机能正常操作，从而故障表现出复杂性、随机性。由于折断处恰好被金属档板遮住，在检查过程中，不易被发现。
3 故障排除
由于排线折断处在中间位置，若重新焊接，不易固定。为彻底解决问题，选相同芯线的电脑硬盘用排线，重新做插件接口，并特意将排线保留长度较原有尺寸稍长，保证运动机构走到尽头时，连线不要绷紧。同时用金属块固定时，在金属块下放置一块厚度约2mm的橡皮垫，防止过度挤压，复位后彻底恢复正常。
参考文献
[1]郭以河,等.徕卡RM2145半自动切片机保养与维护[J].医疗卫生装备,2007,28(2):88.
[2]陈卫伟,等.冷冻切片机的维修保养[J].医疗装备,2006,19(4):42.
[3]叶少荣.Leica RM2135切片机“故障”教训[J].医疗设备信息,2006,21(8):113.
樟子松松针石蜡切片制备 篇2
关键词：樟子松,松针,石蜡切片
樟子松又名海拉尔松, 是我国三北地区主要优良造林树种之一。樟子松叶两针一束, 稀有三针。石蜡切片技术是观察研究动植物形态发育和内部构造的重要技术, 但对于不同植物组织制片需要不同的具体条件, 切片的质量不仅和材料自身的特性以及实验操作的室温相关, 还和固定、脱水、透明、浸蜡、染色等每一步骤的规范操作和时间控制相关, 因而需要根据植物的组织结构特点摸索适用的制片方法。本实验在传统植物石蜡切片技术的基础上, 结合樟子松松针结构特点, 对固定、脱水、粘片、染色等环节进行了摸索, 以便更好地观察松针的微观形态。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料采自春季净月潭公园樟子松林, 选取新鲜、幼嫩松针进行石蜡制片。
1.2 试剂配制
FAA固定剂:70%乙醇:冰醋酸:37%甲醛=90:5:5
乙醇质量分数梯度溶液:70%、80%、85%、90%、95%、100%
伊红染液:称取1g伊红溶于100ml蒸馏水中, 加入1~2%冰醋酸10滴。
其他试剂常规配制。
1.3 实验方法
依据传统的石蜡切片流程:固定、脱水、透明、浸蜡、包埋及修蜡、切片、粘片、脱蜡及染色、封片, 着重在脱水、透明、透蜡、包埋、染色等步骤根据樟子松松针的结构特点进行摸索改进。选取染色效果优良、完整的切片在Olympus DPController数码显微系统下进行显微观察并拍照。
2 结果与分析
2.1 不同固定、包埋时间对切片的影响
单一固定剂使用时乙醇会使原生质收缩, 甲醛的渗透力较慢, 冰醋酸使组织发胀, 混合固定剂FAA使用方便, 效果较好, 应用也最广。松针质地较坚硬, FAA固定液配制中使用70%乙醇, 渗透力最好, 同时具备一定的脱水效果。实验中曾采用过1h、1.5h、2h固定时间, 1h、1.5h都会在切片阶段发生较严重的碎片现象, 2h切片效果好。 (图A1、A2)
由于实验时间在春夏之交, 温度有较为明显的变化, 加上材料质地较硬, 故选择熔点较高的蜡包埋。包埋后将蜡块置于4℃冰箱中充分凝固。切片操作分别在蜡块凝固3d、5d、7d进行, 放置3d、5d的蜡块在切片过程中均出现较为严重的材料与石蜡的分离情况, 放置7d的蜡块较少出现上述情况, 说明凝固效果比较好, 也使浸蜡更为充分。 (图B1、B2)
2.2 不同切片厚度对切片效果的影响
在其他实验条件不变的情况下, 曾选择5um、8um、10um厚度进行切片, 5um切片容易出现不完整现象, 8um、10um切片效果未有明显差异。实验中发现, 切片的质量除了与前面的固定、脱水等步骤相关外, 切片刀是决定因素, 刀片必须锋利, 否则在切片时蜡片会自行卷起或皱起, 或会使组织出现伤痕, 甚至使切片破碎、不完整。 (图C1、C2)
A1固定2h, 凝固3d
A2固定2h, 凝固7d
B1固定2h, 厚度5um
B2固定2h, 厚度8um
C1固定1h, 染色4min
3 讨论
本实验结合材料特点对传统石蜡切片方法进行条件摸索, 除上述提及的固定、浸蜡、包埋及切片外, 脱水、粘片、染色等环节如果处理不当也会影响切片效果。为使材料不致收缩, 实验设计了适合松针的乙醇梯度, 同时松针在无水乙醇中的浸泡时间略长, 保证脱水彻底。本实验由于所切取的材料小, 又轻又薄, 故粘片时只需将其置于39℃水浴锅中, 让其充分展开, 再用防脱载玻片捞取, 摆正位置, 吸去多余水分, 置35℃烘箱24h即可。该方法操作简便, 在后续步骤中很少出现脱片现象。实验中首先选取少数材料染色以摸索适合的染色时间, 伊红染色时间依次按3min、4min、5min进行实验探索, 最终确定伊红中浸泡5min, 苏木精中浸泡1min为宜。石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法, 本实验在借鉴传统植物石蜡切片技术基础上摸索了一套适合樟子松松针石蜡切片的制作条件和方法。切片的质量不仅和材料自身的特性以及实验操作的室温相关, 还和每一步骤的规范操作与控制相关, 所以还需要在不断摸索和探讨中加以完善。
参考文献
[1]杨捷频.常规石蜡切片方法的改良[J].生物学杂志, 2006, 23 (1) :0045-0046.
[2]朱莉艳.石蜡切片龟裂的原因分析[J].浙江中西医结合杂志, 2008, 18 (10) :634-635.
提高病理组织石蜡切片质量的体会 篇3
1固定
标本离体后要立即固定(30 min内),这是制片成功的关键。常规固定液为10%中性缓冲福尔马林,固定液的量要充分,为组织体积的5~10倍,小标本的固定时间为4 h~6 h,大标本为18 h~24 h或更久[2]。固定的目的是尽量保持组织的生前状态,防止组织死后的变化、自溶[3]。经过这样处理的标本,做成切片后,在显微镜下能够清晰地观察到细胞内的微细结构[4]。在实际工作中我们遇到的标本各种各样,因而固定的方法也不尽相同,如大标本要沿最大的剖面切开,并平行作多个切面(类似书页式),以便固定液能够尽快地浸入组织内;空腔脏器可以采用灌注的方法固定,也可剪开固定,但应记录腔内容物的颜色、性状及量的多少。
2取材
按照各脏器取材规范的要求取材[2],一般将组织块切取成(1~1.5)cm×(1~1.5)cm×0.3 cm大小,既不能太厚,以免组织处理不完全;也不能太薄,使处理后组织块不平整。另外还要注意先取非瘤性标本,再取肿瘤性标本;并且每取材1例标本都要用流水仔细冲冼器械和台面,避免标本间的污染。取材刀要锋利,切取标本时动作要轻柔,忌用力来回切割。内窥镜等活检小标本要全部取材,用滤纸包裹以防丢失,必要时点伊红标记。要除去组织内的异物。大标本要多处取材,尤其是有不同病变特征的部位。肿瘤根治标本还要取病变部位与正常组织相交的地方。
3组织处理
我们使用的是莱卡TP1020全自动脱水机,在室温25℃左右进行,包括三个步骤:脱水、透明和浸蜡。
取好的组织块,依次从AF固定液、低浓度酒精、高浓度酒精进行脱水。在95%酒精中的时间应长一些,大约4 h左右;100%酒精中时间不能过长,一般1 h~2 h。脱水彻底与否直接影响切片的质量。如果脱水不彻底将导致切片中出现空洞,切片易散,染色时不仅易脱片,还会污染染液;脱水过度,组织将变硬,切片时碎裂,无法制出完整的切片。
组织块在二甲苯中透明的时间要适当,过短会导致透明不彻底;过长造成组织发脆;两道二甲苯透明的总时间要控制在60 min。
AF固定液、酒精和二甲苯都属于易挥发的液体,使用一段时间后纯度会降低,影响到后续的每个过程,导致组织不能充分的固定、脱水、透明及浸蜡;而且第一缸的二甲苯容易混入酒精和水分,因此脱水机中的各种试剂应根据标本量的多少及时进行更换。在实际工作中,更新液体后,要详细记录每次处理的组织块的个数,将其与液体量进行比较,当发现处理的组织块不如以前能顺利制片时,就可考虑更换液体。这样通过几次总结后,可摸索出经验,一般500 m L试剂能处理500个蜡块,然后在此基础上根据大、小标本的数量可适当进行缩短或延长。这样既能保证组织块处理得当,又能最大限度地提高液体的利用率。
我们应用三道缸进行浸蜡。第一道缸用的是低熔点的石蜡(54~56℃),第一缸蜡中易带入二甲苯,时间一长,缸中二甲苯的含量上升,造成组织发脆发硬,因此要及时更换。后两道均为高熔点的石蜡(56~58℃),浸蜡的温度略微调高一些,但要控制在58~62℃比较合适。三道缸的浸蜡时间均为60 min[2]。
4包埋
根据组织块的大小选择合适的不锈钢包埋模(提前做低温处理,可先放入冰箱中),应用二次加蜡的方法[5]进行包埋,这样可以使包埋盒与组织蜡块更好的结合在一起,避免了可能出现的分离现象。
小块组织或者碎组织应尽量包在同一个平面上。大块组织经过脱水机处理后,边缘会不平整,包埋时可用镊子把组织块压平;囊壁组织要立埋,有乳头的组织要沿乳头的纵切面包埋[6]。
5切片
我们使用的是莱卡RM2235切片机,其手感舒适,适用于手动的常规石蜡切片。除每次切片完毕时的清洁外,我们还定期进行保养,精心维护设备,因为好的设备是作出优质切片的保障。切片是一项非常细致的工作,考验的是两手的协调和配合。切片前,蜡块要在冷冻台上冷冻一会儿,切片时,相关的螺丝要拧紧,将蜡块在切片机上固定好,调整好各个角度。先进行粗切,修出整个切片平面后,右手以均匀的力量摇轮,左手持毛笔轻轻的将“蜡片带”托出来,多切几张,以便挑选最好的一张。这是因为从冷却蜡块上切下的第一张切片,因为膨胀的原因,常常比切片机设置的数值厚,所以虽然第一、二张切片看上去“更好”,但实际上第三、四、五张则比较接近实际的厚度(一般为3~4μm)。
这里需要注意的是,如果切片时出现不规则、跳片等情况时,要调整切片刀的角度;另外蜡块在冷冻台上冷冻的时间不可过长,否则切片会出现冻裂。漂片的力度要适中,避免产生气泡。捞片水温设置在45~48℃,不能过热,否则组织容易散开,结构不完整。切片漂在水中时,仔细观察切片组织是否完整,有皱褶、不完整的要重新切片。时刻保持水的清洁,切不同蜡块时需撇清水面;一次只对一个蜡块的切片进行漂片;仔细调控水温和漂片的时间,捞片时将切片摆正,使其与载玻片长轴方向平行,让组织块在玻片中的1/3左右,距玻片上下缘等距离。贴片后,再放入60℃的温箱内烤片30 min。
6染色
染色步骤可参考临床技术操作规范(病理学分册)[2]。需要注意的事项:脱蜡要彻底脱,否则染料难以进入组织和细胞内,影响着色。各染色缸液体量要充足新鲜,新换的染液着色力较强,染色时间可缩短;反之,则延长。仔细观察每张切片呈均匀、透明时即可进行下一步。清洗二甲苯的100%酒精较易失效,若未及时更换,切片水洗时会呈现出乳白色,这时需要重新脱二甲苯。使用时间久的苏木素液体表面容易出现“金属膜”,应提前过滤后再使用;也可加入适量的甘油,形成一层保护膜。苏木素的染色时间可稍长一些,后续的盐酸酒精分化时要在显微镜下观察,以细胞核染色清晰而胞质基本无色为优。伊红避免过染,否则胞核与胞质对比不清晰。切片要湿性封固,中性树胶浓度和量应适当,否则易产生外溢或空泡等。最后切片应当是着色鲜艳,红、蓝分明,对比清晰。
总之,完成一张合格的切片,不仅要对制作过程中近40道工序的规范操作,还要不断地总结,完善各项记录,分析各种问题的成因并及时找出解决的对策。
参考文献
[1]武忠弼.临床病理诊断浅议[J].中华病理学杂志,2006,35(7):444-445.
[2]中华医学会.临床技术操作规范(病理学分册)[M].北京:人民军医出版社,2004:27-31.
[3]杜卓民.实用组织学技术[M].北京:人民卫生出版社,1998:9.
[4]陈俊艳.常规病理切片制作中常见的问题及处理方法[J].实用医技杂志,2012,19(7):761-762.
[5]马恒辉,周晓军.组织固定处理及包埋常见问题与对策[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(6):638-641.
石蜡切片机 篇4
1 TUNEL技术的基本原理
在细胞发生凋亡时, 染色体DNA在内源性的DNA内切酶作用下发生渐进的分阶段断裂过程。一般认为, 凋亡细胞的DNA断裂先产生300 kb的大片段, 随后产生50 kb的小片段, 然后大约30%的大片段DNA在Ca和Mg依赖的核酸内切酶作用下, 在核小体单位之间被随机切断, 形成180~200 bp核小体DNA低聚体片段[2]。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口, 其断端有3′-OH暴露, 在末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 的作用下, 无需模板的存在, 可进行3′端的脱氧核苷酸合成。如果在反应中加入标记的脱氧核苷酸, 则在3′端出现一段带有标记物的寡核苷酸, 通过显色反应, 可以原位地较特异地显示发生凋亡的细胞。正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂, 因而没有3′-OH形成, 坏死细胞DNA断裂是无规则的, 其中也有少数可出现3′-OH的暴露, 但数量极微弱, 不易检测出来, 因此TUNEL法检测可将凋亡细胞与坏死细胞及活细胞区分开。通过DAB显色反应, 凋亡细胞的细胞核呈棕黄色或棕褐色, 正常细胞的细胞核不会着色, 可进行凋亡细胞的观察和统计分析。
2 影响TUNEL检测的因素
2.1 样本的制备
取材时保持组织新鲜, 立即放入固定液。组织和细胞离开机体后, 在一定时间内仍然延续着生命活动, 会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映它生前的正常状态, 必须尽早地用固定液迅速地杀死组织和细胞, 阻止上述变化, 并将结构成分转化为不溶性物质, 防止某些结构的溶化和消失。取材时严格按检测凋亡细胞要求进行, 不能挤压破坏组织, 以免引起细胞的变性、坏死或其他变化, 从而影响细胞形态学观察和试验结果。固定液常用10%甲醛或4%多聚甲醛缓冲液, 体积为组织块的20倍以上;对于有血迹的样本, 可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中。固定的时间也是影响试验的重要因素:时间太短, 组织细胞固定不良, 不论是形态结构还是核酸的保存都不理想;时间过长, 导致交联程度过高, 可能会降低3′端的脱氧核苷酸合成。适宜的固定时间取决于固定剂的种类、所取材料的大小。
脱水和透明效果会影响切片质量。一般选用乙醇进行脱水, 从低浓度到高浓度进行。脱水时间依据组织的类型和大小而定, 一般在各级乙醇中放置30 min到1 h, 如果中间需停顿, 只能脱水至70%乙醇时停留其中。由于低浓度乙醇易使组织变软、解体, 高浓度乙醇有脆化组织作用, 放置时间不能过长。脱水必须在有盖瓶中进行, 以防止乙醇吸收空气中水分或挥发导致浓度降低而使脱水不彻底。切片时组织中间易出现松软空洞, 摊片时切片容易散开, 染色时易于脱片、着色不良。组织用乙醇脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合, 它取代了脱水剂后, 石蜡便能顺利地渗入组织。试验中常用二甲苯透明, 二甲苯作用较快、透明力强, 但组织块在其中停留过久容易收缩、变脆、变硬, 切片时易于碎裂, 在应用时必须掌握好透明时间。透明好的材料按常规石蜡包埋组织的步骤进行组织包埋。切片要厚薄均匀, 展片时要使切片平铺在APES胶处理的载玻片上, 否则在下一步试验中易脱片或影响染色效果。
2.2 蛋白酶的消化
细胞通透性是试验中阳性信号检出率的关键之一。常用蛋白酶适当消化来增加细胞通透性。在蛋白酶消化前, 应进行充分脱蜡和水化。脱蜡可以先在60 ℃条件下预热几分钟, 再用二甲苯作用5~10 min;水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗。脱蜡不充分会影响蛋白酶的消化及其他试剂进入反应, 以及染色效果和阳性结果的判定。脱蜡和水化后的组织标本经蛋白酶消化后能增加通透性, 允许反应试剂进入细胞内, 并暴露靶序列末端, 用以合成核苷酸。蛋白酶消化不足, 则组织细胞的通透性差, 影响反应试剂的进入和靶序列末端的暴露。而蛋白质与核酸之间交联广泛, 这些交联会干扰3′端的脱氧核苷酸合成、与抗体的结合及显色等, 导致假阴性结果。反之, 消化过度会破坏组织细胞的形态结构, 胞核和胞浆界线模糊, 细胞膜完整性受到破坏, 会使3′端的脱氧核苷酸易于通过破裂的膜结构向外弥散, 使阳性信号丢失或减弱, 切片易从载玻片上脱落, 染色时不易着色等。消化孵育时间与固定剂的类型、固定时间、切片的厚薄有关。蛋白酶的孵育时间通常选为10~30 min, 通过摸索达到既不脱片, 又能够使后面的酶和抗体进入细胞内。在标本的整个操作过程中, 避免组织干燥, 减少染色过程中非特异性背景。
2.3 对照试验的设立
为了保证TUNEL试验操作的准确性, 以及试验结果的特异性, 一定要设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照切片可使用DNaseⅠ部分降解的标本, 也可选用公认的凋亡模型组织;阴性对照不加TdT酶, 其余步骤与试验组相同。同时应设空白对照, 用PBS液代替TUNEL反应液。通过比较试验结果和阳性对照、阴性对照、空白对照组的区别, 才能准确分辨出结果是真阳性还是假阳性。
2.4 封闭的效果
蛋白酶消化后一般要用BSA进行封闭。用BSA封闭可封阻非特异性的结合, 减少核苷酸非特异性标记, 减少背景着色[3]。但是如果BSA浓度过高, 会影响TdT酶的活性, 使阳性细胞数明显降低;如果BSA浓度过低, 会影响封闭效果, 导致背景着色深, 同时易出现假阳性细胞。在试验中, 对BSA的浓度要进行试验筛选, 才能出现最佳结果。
内源性过氧化物酶的封闭也十分关键。不同的组织其封闭液的浓度和封闭时间也不相同。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织, 要适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度, 可以达到很好的封闭效果, 且不影响最终的特异性染色。
2.5 显色时间
要严格控制显色时间。在显色过程中, 要注意观察阳性和阴性对照组细胞核的颜色, 一旦阳性对照组细胞核显现出棕黄色应立即停止显色;如果阴性对照组有背景显色, 则提示显色过度, 可能出现假阳性结果[4]。高质量的阳性结果是高倍镜下细胞核被染成棕黄色, 而细胞的其他成分不显色。在复染过程中, 分化要掌握好时间, 否则会导致背景着色深, 或者阳性着色被褪色。常在复染前先对试验结果拍照, 然后再进行苏木素或甲基绿复染。在试验过程中, 有可能出现颜色的差别, 这主要与DAB显色时间、苏木素或甲基绿染色时间和性质、拍照时调节的参数差异等因素有关, 根据结果对试验过程继续优化, 从而使染色效果达到最佳。
3 TUNEL检测的非特异性问题
3.1 假阳性
3.1.1 内源性酶和非特异性位点造成的假阳性
未进行内源性酶阻断的阻断剂浓度不够或时间过短可造成假阳性。体内许多组织细胞内存在过氧化物酶活性, 从而导致辣根过氧化物酶标记的脱氧核苷酸染色出现非特异性结合, 出现假阳性结果。因此, 组织切片在染色前需采用阻断措施, 以消除内源性过氧化物酶的活性。虽然并不是每种组织均需要进行此步骤, 但对于内源性酶丰富的组织, 如肝脏、肾脏等, 一定要使用H2O2 阻断内源性过氧化物酶。在试验过程中, 需要对阻断剂的浓度、阻断时间进行优化, 找到最佳阻断条件。
未正确进行非特异性结合位点的封闭。在试验中, 常用血清封闭来消除反应溶液中电荷吸附所造成的非特异性背景染色。既可以用二抗动物的非免疫血清孵育切片, 以封闭吸附位点;也可用其他无关蛋白, 如牛血清白蛋白。朱汉华等[5]先后用小牛血清或羊血清2次封闭非特异性反应, 减少了TUNEL染色的假阳性, 使阳性结果背景清晰。
3.1.2 浸洗不充分
在操作过程中, 加PBS缓冲溶液浸洗时一定要充分, 否则会使各步反应多余的反应液都有可能停留在组织细胞中, 从而发生非特异性结合, 产生假阳性结果。当背景染色较深时, 要增加浸洗的次数和每次浸洗的时间。
3.1.3 显色不当
DAB显色时间过长, 易造成背景染色。在显色过程中, 要观察阳性对照的显色情况, 以阳性对照出现棕黄色为准, 此时停止显色。当切片出现背景色较深时要缩短显色时间, 在镜下通过观察控制好时间。严格按要求进行DAB配制, 同时现配现用, 否则可能出现一些颗粒沉积于切片组织上, 产生非特异性着色。在载玻片的样本上, 加入试验用反应液, 然后盖上盖玻片或保鲜膜, 或在湿盒中进行, 这样可以使反应液均匀分布于样本整体, 又可以防止反应液干燥造成边缘处的非特异性染色。
3.2 假阴性
样片制备不合格。如果用乙醇或甲醇固定样本则标记效率较低, 由于在固定时染色质未能与蛋白质交联, 而在操作中丢失;用4%多聚甲醛或甲醛或戊二醛固定, 固定时间过长会导致交联程度过高, 试剂不易进入其内, 形成假阴性。在制片过程中, 脱蜡不充分, 含有蜡的组织细胞不易染上颜色。在操作过程中, 有气泡产生, 也易出现假阴性。
蛋白酶消化不够或消化过度都易产生假阴性的结果。蛋白酶消化不足, 则组织细胞的通透性差, 影响反应试剂的进入和靶序列末端的暴露, 使阳性信号减少。反之, 消化过度会破坏组织细胞的形态结构, 使阳性信号丢失或减弱, 切片从载玻片上脱落, 染色时不易着色等。优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间, 使消化达到最佳效果。
显色时间不够, 其显色速度会因温度不同而有一定程度减慢, 如室温低于20 ℃, 则应适当延长显色时间[6]。PBS清洗后, 为了使各种反应有效进行, 应尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。在进行复染时, 如果用苏木素等核染料复染时间一定要短, 过染的红色可以掩盖棕褐色。
4 结语
由于TUNEL方法具有特异、敏感、定性、定量检测凋亡细胞的特点而被广泛应用, 但极少数细胞凋亡时没有DNA断裂, 此时不适合用TUNEL方法检测。在用TUNEL方法检测的过程中, 会因多种因素造成假阴性或假阳性, 因此要注意操作的各步骤和各关健环节, 优化出反应的最佳条件, 确保准确地检测凋亡细胞。
参考文献
[1]GAVRIELI Y, SHERMAN Y, BEN-SAMSSON S A.Identificationof programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNAfragmentation[J].J Cell Biol, 1992, 119 (3) :493-501.
[2]WALKER P R, KOKILEVA L, LEBLANC J, et al.Detection of theinitial stages of DNA fragmentation in apoptosis[J].Biotechniques, 1993, 15 (6) :1032-1040.
[3]LABAT-MOLEUR F, GUILLERMET C, LORIMIER P, et al.TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections:critical evaluationand improvement[J].J Histochem Cytochem, 1998, 46 (3) :327-334.
[4]王志军.应用TUNEL方法的注意事项及阳性结果的质量控制问题[J].眼科研究, 2009, 26 (11) :844.
[5]朱汉华, 李浪, 汪熠.TUNEL检测心肌细胞凋亡的影响因素探讨[J].广西医科大学学报, 2009, 26 (1) :24-27.
石蜡切片机 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
供试蚕品种：桑蚕(7532)，由广东省蚕业技术推广中心提供。分别取五龄6天蚕和蚕蛹，投入近沸水中将其迅速杀死。95℃热水1min杀死，再放入冷水，用吸水纸吸干，蚕蛹因其体壁较厚且不透水，在放入冷水后，先剪开腹体壁，用卡尔纳氏固定液[冰醋酸(CH3COOH) 1份、三氯甲烷(CHCl3) 3份、无水酒精 (CH2CH3OH) 6份]固定时间24小时，更换95%酒精二至三次后，用75%酒精保存。
1.2 实验方法
横切：取全蚕先用锋利的刀片去头尾，采用针刺扎孔，剪开体壁，切成3段，放入脱水篮，置于抽气装置内，分别经80%、90%、95%酒精2h，无水酒精2次各1h, 1/2 100%酒精+1/2二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各0.5h。组织完全透明后，经54℃、62℃石蜡各透蜡1h;然后包埋，切片机切片(10um)，然后在40℃水浴锅内展片，60℃烤片1 min左右，HE染色，封固。
纵切：与横切处理方法的基础上增加80%、95%酒精各24h，无水酒精2次各12h。1/2 100%酒精+1/2二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2h，经54℃、62℃石蜡各透蜡2h。
2 结果
从肉眼观察，全蚕(5龄和蛹)体大切片各部分结构完整，不脱落。显微镜下观察可见体壁脂肪、丝腺、中肠等组织层次分明，质核清晰，染色清楚，便于进行形态学研究(如图1，图2)。
3 讨论
使用常规方法，制作组织大切片难以取得理想的效果。对于组织大切片的制作常会造成组织收缩过甚，切片亦碎而不整，各层间联系紊乱，很难制作完整的大切片，并且固定、脱水、透明及透蜡时间难以撑控，如时间不足会最终造成碎片及丢片。过长又会造成组织发硬，变脆，扭曲或者收缩过剩。蚕蛹的组织结构特殊，蛹体各种组织软硬度不同，各层次间连续性差，并且气管系统内还存在着大量气体，使组织固定、脱水、透明、浸蜡带来困难。
针对蚕蛹体壁较厚且不透水，在放入冷水后，先腹剪开体壁，以便固定、脱水、透蜡完全。适当增加固定、脱水、透明及透蜡时间可以解决蛹体较大，渗透时间长的问题。蛹体等大组织气管系统发达，固定、保存虽然是在液体中，但仍然存在大量气体，如果不对其进行处理，切片往往会形成空泡，而空泡容易使切片变形和破裂，严重时将使切片失败。将组织移入真空抽气装置中脱水，能够将气体抽出，因其仍然在液体中，组织不易被压缩，效果明显。并视空气是否抽尽可延长置入80%、90%酒精的时间。如果中途因故不能继续进行下去，应将标本退回至70%-80%的酒精中。脱水要彻底，无水酒精应定期更换新的，更换时可新旧搭配，即节约又减少组织收缩和硬化。为保持酒精保持无水，也可置入无水硫酸铜[2]。组织在100%酒精中容易变硬，时间不宜过长。更换酒精过程要迅速，要在组织中的酒精未滴落之前快速放入下一个酒精中，以防更换过程中空气重新进入或形成空泡。二甲苯的透明能力强，但易使组织收缩、变脆。故组织块在二甲苯中不宜久留，也应严格控制好时间。
由于石蜡冷凝后脆性变大，此过程所用石蜡可以加入一定量的蜂蜡以增加石蜡的韧性，可按9份石蜡加1份蜂蜡进行。包埋过程中组织块四周应留足够的距离，便于修切蜡块。修整蜡块时，可将蜡块修切成梯形，保证所切上下面平行即可。为了使蜡带上每一张切片易于分离，可在蜡块右上角修去一个小角。
摘要：本文对全蚕 (蛹) 这一偏大的材料进行石蜡组织切片技术改进。通过采用针刺扎孔, 剪开体壁, 适当增加固定、脱水、透明及透蜡时间, 并采用真空抽气消除机体内存在的气体。实验证明, 本改良技术可使大机体 (组织) 切片染色层次分明, 结构完整, 达到满意的效果。
石蜡切片机 篇6
石蜡切片技术作为一项基本技术在病理学、发育生物学、分子细胞学和组织学等领域内广泛应用, 但石蜡切片技术也是一门复杂的技术。它程序繁多, 耗时较长, 用药量大, 安全性差, 要想在本科实验教学中开展也成为一个不可小觑的难题。为了扬长避短, 我们在教学中将传统的石蜡切片技术与德国徕卡公司最新石蜡切片制作系统相结合, 学生在实验既即能掌握整个实验技术的关键点又能了解当今实验技术的发展趋势, 合理有效的利用实验资源。通过这种教学模式, 学生基本掌握了石蜡切片技术的原理和操作步骤, 并为后续动植物切片制作、免疫组织化学以及原位杂交等一系列实验的开展奠定了基础。
一、实验材料
1. 主要试剂及实验动物
主要试剂:10%福尔马林 (饱和甲醛溶液10 mL+p H7.4磷酸缓冲液90mL) ;4%多聚甲醛 (4g多聚甲醛溶于100mL PBS, pH7.4) ;乙醇质量分数梯度溶液为30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%;二甲苯;石蜡;苏木精染液;伊红染液;冰醋酸;氨水;中性树脂。
实验动物:实验选用健康清洁级昆明鼠, 购自中国医学科学学院中国协和医科大学实验动物研究所。
2. 实验仪器及耗材
恒温箱、Leica TOP1020脱水机、Leica EG1160包埋机、Leica RM2235切片机、摊片机、通风橱、热台、制冰机、显微镜、切片刀、镊子、剪刀、包埋盒、包埋皿、毛笔、解剖针、染缸、酒精灯、多聚赖氨酸载玻片。
二、实验方法
学生3人为一小组, 共同完成一套石蜡切片。首先, 断颈法处死不同年龄阶段的小鼠, 解剖小鼠, 取血后用剪刀小心的剪取小鼠各器官, 剪成片状, 大小为5mm×5mm×2mm, 放入标记好的包埋盒中并立刻置于固定液中 (1 0%福尔马林或4%多聚甲醛) , 固定时间为24h。然后, 将固定后的组织放入50%的酒精, 室温下进行由低浓度到高浓度的梯度酒精脱水、二甲苯透明, 以及浸蜡包埋。石蜡包埋好的材料可用于切片, 片厚8微米, 42℃水浴展片, 多聚赖氨酸载片粘片。最后, 常规HE染色, 光学显微镜下观察组织结构。脱水、透明、浸蜡条件见表1。
在教学过程中主要采用了两种实验方法。方法一是采用德国徕卡公司的石蜡固定包埋操作系统, 材料从固定到包埋均在自动脱水机和包埋机内完成。方法二是传统的石蜡切片技术, 即材料从固定到包埋主要由人工在常规设备内完成。
三、技术要点
1. 取材
取材要新鲜、迅速。在教学过程中, 学生应争取在动植物死后15min内完成材料的选择。取材要完整, 还要尽可能注意到整个器官的结构特点, 避免手术器械对取材部位造成机械损伤。组织块的大小、厚薄、形状视实验的具体要求而定, 一般5mm×5mm×2mm为宜。夹取组织时不要用力压、揉、挤, 避免机械损伤组织。
2. 固定
固定要及时、充分。对于不同的材料我们根据材料的特点选取不同的固定液。对于动物组织来说, 固定液一般采用l O%中性福尔马林溶液或4%多聚甲醛溶液。固定液以新配为好, 固定液的量必须充足, 一般为材料的20到30倍。固定时间视材料大小、性质以及类型而定, 一般情况不超过24h。
3. 脱水
脱水必须彻底。组织经固定水洗后, 内含大量水分, 只有将水分彻底除尽才有利于透明、浸蜡。我们采用的脱水剂是酒精, 采用逐级提高酒精浓度进行样本脱水。逐级提高酒精浓度脱水法可以防组织过度收缩、变脆以及脱水不完全。如果采用传统的脱水方法, 在教学中可让组织在70%酒精中过夜, 因为大多数材料均可在70%的乙醇中长期保存, 不影响材料的脱水状态。此外, 组织块不宜在高浓度的酒精中长时间放置, 因为高浓度酒精容易使组织块变硬变脆。
4. 透明
透明要适度。最常用的透明剂是二甲苯, 二甲苯透明力强, 但易使组织收缩和变硬变脆。组织在二甲苯中贮留时间必须严格掌握, 时间稍长, 则使组织脆硬易碎;时间过短, 石蜡又不易渗透进去。另外, 二甲苯具有一定的毒性, 且挥发性很强, 易被人体吸收, 因此整个操作过程应该在通风橱内进行, 并做好各种防护措施。如果教学条件不允许采用这类毒性的试剂, 我们可以考虑其它无毒或毒性较低的透明剂, 如松节油。
5. 浸蜡
浸蜡要充分。浸蜡的目的是让石蜡替换组织中的透明剂 (二甲苯) , 使石蜡填充整个组织块。此步骤是在温箱内进行, 温度一般调至60℃左右, 恰好使石蜡溶解。浸蜡的时间和温度是关键, 浸蜡的温度过高或时间过长, 会使组织块发生较大的收缩和脆变;如温度低了或时间短了, 石蜡将得不到充分的饱和, 组织块与石蜡结构不严, 将会给制片带来许多困难。
6. 包埋
包埋要快速认真。包埋是指将组织埋入石蜡, 凝固成块。包埋之前应将包埋皿与包埋镊子一起放在温箱中加热。包埋时速度要快, 防止包埋蜡与组织块的温度相差太大、蜡与组织块结合不紧密而导致切片困难。有条件的前提下可以使用包埋机完成包埋实验。
7. 切片
切片是整个切片制作过程中的另一个关键环节。首先切片刀一定要锋利, 不能有缺口, 否则易造成切片断裂、破碎、不完整等现象。也可采用一次性刀片, 可使上述现象得到改善。切片时, 将蜡块固定在切片机上, 调整好切片机的各个角度, 使切片连贯流畅。另外, 学生在使用切片机前, 教师一定要亲自示范强调切片机的安全使用规则, 避免发生意外。
8. 贴片
贴片、烤片要牢固。展片时将一个盛水的恒温水箱, 加温到45~5O℃, 温度太高易导致组织片上的细胞组织间隙分散, 温度太低展片不充分, 组织片易皱折。将切片光泽面向下铺在温水上, 等切片展开后用处理过的载玻片将切片从水中捞出, 把贴好切片的载玻片放在染色架上竖立排水, 晾干后即可烤片。烤片的温度和时间很重要:温度太高, 时间太长, 会造成对组织的损伤;温度太低, 时间不足, 染色时易发生脱片或脱蜡不净, 切片着色浅, 不上色或灰染。
9. 染色、封片
常规HE染色, 封片。
四、结果
各组学生基本都能掌握两种石蜡切片技术。组织切片平整, 组织粘附牢固, 不易掉片, 染色均匀, 结构清晰, 为开展免疫组织化学及原位杂交实验奠定了良好的基础。学生石蜡切片HE染色结果见图1。
五、总结与讨论
1. 传统石蜡制片技术与全自动石蜡制片技术的优劣
我们在整个教学过程中采用了两种石蜡制片技术, 并对两种石蜡切片技术的教学效果进行了对比。
首先, 传统的人工石蜡固定包埋技术的优点在于可以进行少量样品的制备, 所需仪器简单, 成本低。学生能够亲自实践此项技术的各个环节, 有利于技术的掌握。缺点则在于不利于大量样品的制备, 整个操作过程复杂费时。整个实验过程均需要人工完成, 接触有害气体的可能性增大, 不适合长期操作, 不利于本科教学的安全开展。自动组织脱水机的优点则在于可以同时进行大量样本的制备, 试剂可以反复使用, 节约成本, 从固定到最后的浸蜡均可以由机器完成, 即使在夜间也能按时完成工作任务, 能够严格遵循工作流程。另外通过机器操作可以降低有害物质的接触, 有利于教学过程的安全进行。缺点则在于不利于少量样品的制备, 所需消耗的试剂量大。所需设备昂贵, 需要一定资金的前期投入。
其次, 在石蜡包埋技术环节中, 包埋机的工作效率和效果均大大优于普通石蜡包埋技术。包埋机带有一个热台、一个冷台、一个熔蜡箱和两个热箱, 操作非常方便迅速, 避免了传统石蜡包埋过程中的由于动作不迅速导致石蜡凝固过快而影响包埋结果。在这一操作系统下, 所有的学生均能按时优质的完成石蜡包埋操作。此外, 通过徕卡脱水包埋系统制作的石蜡材料, 在切片效果上也优于普通石蜡固定包埋方法。
我们在教学过程中将这两种实验技术有效的结合起来, 一方面充分利用传统制片的优势, 让学生了解石蜡切片技术的各个环节, 在普通实验条件下也能制备石蜡切片;另一方面, 优化配置资源, 让学生紧跟现代科学技术的发展步伐, 充分了解现代科技发展的前沿动态, 培养与国际接轨的一流人才。
2. 实验教学中的注意事项
在教学过程中也存在一些值得注意的地方。首先, 在教学内容的设计方面, 石蜡切片技术程序繁多, 耗时较长, 用药量大, 安全性差。因此, 在实验设计上, 教师要结合实验条件合理有效的设计实验内容。其次, 树立学生的安全意识, 培养学生科研素养。在实验中有时会接触到一些有害试剂, 教师要培养学生的安全实验意识, 纠正学生的不良实验态度和习惯。再次, 合理的安排教学时间。学生实验不同于科研实验, 学生主要集中在一个时间段内完成一项实验, 因此教师在安排新的实验时需要考虑实验的各个环节, 妥善安排好实验内容, 确保实验有效进行。最后, 要充分调动学生的积极性, 培养学生的创新精神和实践能力。这也是教师在教学过程中不断探索的动力和源泉。
总之, 在本科实验教学中, 石蜡切片技术作为一门新引入的实验技术还需要我们在教学方法和内容体系上不断的改进和提高。在本科实验教学中坚持不懈地探索新技术新方法是我们始终不渝的目标, 也是实验教学跟上技术进步, 时代发展步伐的根本所在。我们将努力建设具有特色的课程内容, 培养具有高素质的综合型人才。
摘要：本文介绍了两种石蜡切片技术在本科实验教学中的应用, 重点介绍了石蜡切片技术在实验教学中的内容安排、技术要点、关键环节及实施效果。先进实验设备在教学中的运用, 促进了高校教学资源的优化配置和高校教学体系的建设。
关键词：石蜡切片技术,实验教学
参考文献
[1]杨捷频.常规石蜡切片方法的改良[J].生物学杂志, 2006, 2
石蜡切片机 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料
新城疫病鸡。
1.1.2 试验器材
切片刀, 切片机, 恒温箱, 电炉, 酒精灯, 手术刀, 解剖剪, 解剖盘, 镊子, 单面刀片, 包埋纸盒, 染色缸, 盖玻片, 载玻片, 玻片盘, 树胶, 显微镜, 水浴锅。
1.1.3 主要试剂
2×PBS缓冲液:1%SDS、20m MTrisHCL (p H7.6) , 0.2M Na CL, 固体石蜡, 蒸馏水, 无水乙醇, 二甲苯, 甲醛, 氯化钠, 氯化钾, 磷酸一氢钠, 磷酸二氢钾, 苏木素、伊红等。
1.1.4 主要病理材料
心脏、肝脏、肠。
1.2 试验方法
1.2.1 取样
把病鸡解剖, 取心肌, 肝脏和肠置于10%中性福尔马林溶液。 (1) 固定:选用甲醛来作为固定液, 取心肌和肝脏合肠固定于10%中性福尔马林溶液, 使组织发生硬化。固定时间为24h。 (2) 冲洗:将在固定过程中残留于组织块中的甲醛充分除去利用流水对组织块进行冲洗, 连续冲洗24h。 (3) 脱水:从30%或50%酒精开始, 经70%、85%、95%直至纯酒精 (无水乙醇) , 每次时间为30~90min, 以两次95%酒精, 两次100%酒精重复进行脱水, 以保证组织的水分脱净。 (4) 透明:经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1~2h, 再转入纯透明剂中浸渍。在透明之前利用乙醇和二甲苯1:1的混合溶液浸泡组织块30min, 共两次, 然后再用二甲苯透明5~20min。 (5) 浸蜡:在60℃恒温箱内进行, 将已经透明的组织块置于已经融化的石蜡烧杯中, 放在60℃的恒温箱中, 2h左右后取出倒入另一只含有融化的石蜡烧杯中2h。浸蜡完毕后便可包埋。 (6) 包埋:包埋时在恒温箱内进行, 倒入包埋盒的蜡在恒温箱内放0.5h后取出自然冷却, 可以有效的避免蜡块分层。 (7) 修块:将已经包埋的组织块修理成合适的大小便于储存和切片。
(min)
(min)
1.2.2 切片
用切片机将已经包埋好的石蜡组织块进行切片, 切片厚度为5微米。切好的石蜡切片放入水浴锅中 (水温为37℃) 使其平展, 再用载玻片从切片下方将切片置于在玻片上, 并于50℃恒温箱中烘干4h。
1.2.3 染色和封片
用HE染色法进行染色。
2 结果与分析
2.1 新城疫病鸡临床表现及解剖症状
剪开嘴发现口腔内积有大量灰白色粘液;嗦囊空虚但是囊内有较多量液体或带有酸臭味的液体;消化道里可见到食道与腺胃的交界处有出血点, 腺胃与肌胃交界处有出血点、条或斑;腺胃乳头出血, 肌胃角质层下面可见到出血或溃疡。肠道的浆面可见多处呈枣核状紫红色出血, 剪开肠管在肠黏膜表面见到枣核状出血、坏死;盲肠扁桃体肿大、出血、坏死和溃疡;直肠及泄殖腔、黏膜出血点或条状出血。心冠和腹部脂肪出血。
2.2 肠的病理变化
肠内形成大溃疡, 肠壁深部的集合淋巴滤泡坏死, 最初淋巴细胞肿大, 胞浆淡染, 与相邻的细胞融合, 同时核也增大, 色淡, 进一步这些细胞细胞轮廓模糊, 变为粉红浓染不均匀的块状物, 其中散在的核的残屑, 以后坏死的淋巴滤泡与周围的坏死组织融为一体, 坏死部小动脉和静脉管壁发生纤维素样坏死, 血栓形成和血管破裂引起该部的严重出血与血浆浸润, 使坏死组织中出现大量的红细胞和血浆凝结物。黏膜上皮变性、坏死、并大量脱落。固有膜中有大量淋巴细胞浸润, 以及浆液渗出、充血和出血等病变
2.3 心肌的病理变化
心肌颗粒变性, 光镜下细胞肿大, 胞浆内出现多量微细颗粒, HE染色成淡红色, 胞核无明显的变化, 间质内可见渗出性变化, 毛细血管充血﹑出血﹑个别部位可见心肌纤维出现明显断裂, 局部有轻微的小灶状出血等急性病理变化
2.4 肝脏的病理变化
主要表现肝小叶中的肝细胞可见体积肿大, 胞浆内密布细小红染的颗粒。视野中肝细胞出现胞核略微肿大, 淡染。有的胞浆内出现大小不等的脂肪空泡, 较严重时形成一个大空泡, 将胞核挤向一侧。新城疫, 肝脏的病理变化主要表现为变性, 颗粒变性和脂肪变性。
3 结论
新城疫病毒为细胞外播散, 主要入侵呼吸道和消化道的上皮细胞, 表现出高度的杀细胞作用。病毒感染还能引起炎症反应导致局部组织损伤。本试光镜下的病理主要表现心、肝、肠等, 部分上皮细胞坏死、出血, 这些病变主要是由于病毒直接作用和机体抗病毒反应所导致的损伤。心肌颗粒变性, 肝脏的病理变化主要表现为变性, 颗粒变性和脂肪变性, 由于新城疫病毒主要侵害呼吸道和肠道上皮细胞, 加之肠相关淋巴组织丰富, 因而出现的局部损伤相应也较为严重。肠相关淋巴组织的阳性染色最强, 组织损伤最为严重, 这与肉眼病变的严重程度相吻合。
参考文献
[1]林绍仪.鸡新城疫研究进展[J].国外兽医学一畜禽传染病, 1982 (2) :41-43.
[2]殷震, 刘景华.动物病毒学[Ml.北京:科技出版社.1997.