O-糖基化

O-糖基化（共6篇）

O-糖基化 篇1

0 引言

糖基化是蛋白质翻译后的一种非常重要的修饰过程,在生物学过程中扮演重要的角色,它能参与免疫防御,病毒复制,细胞生长等过程。蛋白质的糖基化有N-糖基化、O-糖基化、C-甘露糖糖基化,磷脂酰肌醇(GPI)锚区4种类型。糖蛋白的蛋白链与糖链通过共价键相连蛋的位点称为糖基化位点,对于给定的蛋白质,表达宿主细胞类型的改变,培养介质成分的变化,以及生产过程中的发酵条件都会使糖基化位点发生改变[1]。O-糖基化作为生物体内重要的生物过程,迄今为止还未发现固定的模式,它的糖基化位点的确切序列片段还不清楚,但通常存在于糖蛋白分子表面丝氨酸(Serine,S)或苏氨酸(Threonine,T)比较集中且周围常有脯氨酸(Proline,P)的序列片段中[2,3]。

虽然O-糖基化的研究还没有确定性的结果,但是许多基于实验和计算的方法已经被应用。Wilson等发现糖基化位点中脯氨酸在位置-1和+3有一个较高的频率[4],Elhammer等发现脯氨酸,丝氨酸和苏氨酸在糖基化位点的所有位点都有很高的频率[5]。

本文采用稀疏编码方案,对BP神经网络结构及其训练算法进行研究的基础上,提出了一种改进传统BP算法缺陷的动量梯度下降算法,运用BP神经网络对O-糖基化位点进行预测和分析。实验表明蛋白质序列特征向量的维数(蛋白质编码序列的长度)是影响预测性能的最主要因素。

1 蛋白质序列和稀疏编码

本研究的实验数据来源于糖基化数据库Uniport(v8.0)[6]。我们随机挑选了哺乳动物的99个蛋白质序列用于分析。由于O-糖基化是将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基的氧原子上,根据对S和T的特异性,将蛋白质序列分成四类,分别注释为糖基化的丝氨酸、苏氨酸称为positive T和positive S,没有这种注释的称为negative T和negative S。我们将所有的positive T和positive S混合在一起称为positive set(糖基化位点),而negative T和negative S称为negative set(非糖基化位点)。从每一类中随机选取300个样本用于训练,随机选取10个样本用于测试,实验样本数目如表1所示。

没有编码的氨基酸序列不能被神经网络识别,预测前必须对原始的氨基酸序列进行编码。已经研究出许多种氨基酸编码方案,诸如3字母编码方案,5字母编码方案,水疗编码方案等。本文采用稀疏编码方案,用21位的二进制序列表示一个氨基酸或一个空位,以区分20种氨基酸和空位。每一个被选择的氨基酸序列被一个窗口分成若干个子序列,S或T位于中间。

假设一个原始的氨基酸序列窗口大小为Ws,编码后的序列的长度即为21*(Ws-1)。窗口大小和相应的编码长度如表2所示。可知,随着窗口Ws的增大,特征向量的维数D也增大,当Ws=51时,D=1050。

2 位置概率分布和模式分析

糖链的生物合成没有模板可以遵循,同一个糖基化位点可能存在不同的糖链形成所谓的微观不均匀性。我们计算氨基酸序列在每一个位点的直方图得到位置概率函数(Positional Probability Functions,PPFS)来表示这种不均匀性。窗口大小Ws=7的糖基化位点和非糖基化位点的PPF如图1如示。由图可见,糖基化位点中所有的位点不仅脯氨酸,而且丝氨酸,苏氨酸和丙胺酸(alanine,A)都有一个很高的含量;并且糖基化位点中脯氨酸,丝氨酸,苏氨酸和丙胺酸的含量高于非糖基化位点的含量。我们也计算脯氨酸,丝氨酸,苏氨酸和丙胺酸在每一个位点的PPFS,如图2-图5所示。很明显,糖基化位点中脯氨酸在位置-1和+3相对于其他的三种氨基酸有一个较高的含量,此结果与Wilson的研究结果一致。

3 BP算法的改进

BP(Back Propagation)神经网络是多层前馈神经网络最普遍的模型之一,基本结构分为输入层,隐含层,输出层三层。BP神经网络最初使用梯度下降搜索技术,对网络连接权值进行修正,使网络实际输出与期望输出之间的均方误差最小[6,7]。设第P个学习样本,期望输出为dpj,实际输出为tpj,网络输出与期望输出间的误差为:

如果E值超过误差许可范围,则需要调整网络的权值,权值修正公式如下:

其中n为学习速率。

传统BP网络训练时间较长,学习性能不理想,为了提高检测的性能和速度,本研究运用动量梯度下降反向传播算法,综合运用本次训练和上一次训练权值的改变修正权值,以平滑训练收敛曲线的震荡,提高网络的收敛性能。

第K次训练的权值公式为:

其中D(k)表示k时刻的负梯度,η为学习速度,α∈[0,1]是动量因子。

此方法所加入的动量项实质上相当于阻尼项,它能减小学习过程的振荡趋势以改善收敛性。

4 预测和校验

糖基化位点的预测在本研究中是一个二分类问题,我们建立一个三层的BP神经网络进行预测。根据不同的窗口大小,输入到网络的是不同编码长度的蛋白质序列,输出为与此序列相关的糖基化信息。输入层神经元的数目等于特征向量维数,隐含层神经元的数目根据实验确定,隐含层和输出层的转换函数是sigmoid型的激活函数。

实验中从糖基化位点和非糖基化位点中随机选取300个样本序列用于训练,选取10个测试样本用于测试。如果蛋白质序列长度太短,对于同一个序列有可能出现糖基化或非糖基化的情况,即使对于训练数据,网络也不能有效地学习。因此,我们取Ws=7,11,21,31,41,51进行实验,训练时间和预测性能如图6和图7所示。由实验结果可知,当Ws增大时,特征向量的维数随着增大,预测时间延长,预测性能提高。

5 结论

本文采用稀疏编码方案,对BP神经网络结构及其训练算法进行研究的基础上,提出了一种改进传统BP学习算法缺陷的动量梯度下降算法,运用改进的BP神经网络对O-糖基化位点进行预测和分析。分析表明,预测性能与蛋白质序列特征向量的维数(蛋白质编码序列的长度)直接相关。当窗口的大小控制在一定范围时训练速度快,误差较小,具有很好的预测性能,随着窗口大小的增大,网络变得越来越复杂,训练时间延长,有可能出现局部优化或过拟合的倾向。因此,我们下一步的目标一方面是探索其他的编码方式,另一方面是对蛋白质序列进行特征提取,降低神经网络的复杂度,更好地发挥神经网络的预测性能。

参考文献

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[5]Elhammer,A.P.,Poorman,R.A.,Brown,E.et al.The specificity of UDP-Ga1NAc:polypeptideN-acetylgalactosaminyltrans-ferase as inferred froma database of in vivo substrates and from the in vitroglycosylation of proteins and peptides[J],Biol.Chem.1998,(268):10029-10038.

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[8]阎平凡,张长水.人工神经网络与模拟进化计算[M].北京清华大学出版社,2004.

O-糖基化 篇2

1 材料与方法

1.1 试验动物

SD大鼠, 购自大连医科大学。

1.2 主要试剂

鲎试剂和细菌内毒素标准品, 湛江安度斯生物有限公司生产;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒, 购自武汉博士德公司;ALT-711, 购自加拿大Paul Wakfer公司;D-葡萄糖为分析纯。

1.3 主要仪器

荧光分光光度计 (型号为RF-5000) , 购自日本岛津制作所;超薄切片机 (型号为LKB-Ⅲ) , 购自瑞典LKB公司;透射电镜 (型号为JEM-1200EX) , 购自日本电子公司。

1.4 外源性AGEs的制备

将D-葡萄糖 (0.5 mol/L) 、大鼠血清蛋白 (5 mg/m L) 及双抗溶于PBS中, 过滤除菌, 于37℃避光孵育12周, 透析除去D-葡萄糖, 即得外源性AGEs。取相同浓度的大鼠血清蛋白在上述不加D-葡萄糖的体系中孵育, 制成单纯血清 (RSA) 。应用考马斯亮蓝法测定蛋白含量, 荧光分光光度计 (370 nm/440 nm) 测定AGEs含量。按照《中华人民共和国兽药典》2005年版二部附录方法, 使用灵敏度 (λ) 为0.25 EU/m L (批号为0711142) 和0.125 EU/m L (批号为0809012) 的鲎试剂和细菌内毒素标准品 (批号为0808220) 对制备的AGEs及RSA进行内毒素检测。

1.5 试验动物分组及处理

取体重为200~250 g的雌性SD大鼠32只, 随机分为青年对照组、单纯血清组、AGEs组和AGEs+ALT-711组。AGEs组大鼠尾静脉注射AGEs100 mg/ (kg·d) ;单纯血清组大鼠尾静脉注射RSA100 mg/ (kg·d) ;AGEs+ALT-711组大鼠尾静脉注射AGEs 100 mg/ (kg·d) 的同时灌服ALT-71110 mg/ (kg·d) ;青年对照组大鼠尾静脉注射PBS1 m L/d;同时选取16月龄大鼠8只作为老龄对照组, 尾静脉注射PBS 1 m L/d。各组大鼠给药45 d后, 乙醚麻醉处死, 检测指标。

1.6 胸腺组织结构的观察

对大鼠胸腺组织进行常规H.E.染色, 镜检。胸腺组织用超薄切片机常规超薄切片, 再用2%醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色, 然后用透射电镜观察组织的超微结构。

2 结果与分析

2.1 外源性AGEs的鉴定结果

大鼠血清蛋白与D-葡萄糖孵育12周后形成较黏稠、澄清的棕色产物, 在370 nm波长的激发光、440 nm波长的发射光下产生的荧光值为48.93 U/mg, RSA产生的荧光值为5.47 U/mg, 两者相差约为9倍。细菌内毒素含量的检测结果见表1、表2、表3。

注:λc为灵敏度测定值, NC为阴性对照;“++++”表示4支试管均凝集, “----”表示4支试管均不凝集, “--”表示有2支试管不凝集。

注:Es为无内毒素水溶液反应终点浓度的几何平均值;Et为用供试品制成的内毒素标准品反应终点浓度的几何平均值;“++++”表示4支试管均凝集, “----”表示4支试管均不凝集, “++”表示有2支试管凝集, “--”表示有2支试管不凝集。

注:“++”表示有2支试管凝集, “--”表示有2支试管不凝集。

由表3可知, 样品内毒素含量的检测合格。

2.2 胸腺组织结构的观察结果

2.2.1 光镜观察结果见230页彩图1。

青年对照组大鼠皮质厚, 淋巴细胞排列紧密, 髓质呈现散在的斑块状, 皮质和髓质界限清楚, 见230页彩图1A。单纯血清组和AGEs+ALT-711组大鼠表现为皮质较厚, 淋巴细胞排列紧密, 髓质呈现散在的斑块状, 皮质和髓质界限清楚, 见230页彩图1B、C。AGEs组大鼠组织切片呈衰老样变, 皮质厚度较青年鼠变薄, 淋巴细胞密度降低, 髓质区域变大, 呈现相互融合的趋势, 见230页彩图1D。老龄对照组大鼠胸腺明显萎缩, 皮质厚度明显变薄, 淋巴细胞密度降低, 皮质和髓质界限模糊, 髓质由斑块状逐渐连成一体, 见230页彩图1E。

2.2.2 电镜观察结果见图2。

青年对照组大鼠胸腺细胞核较大且呈圆形, 细胞核中有较多的异染色质且呈团块状分布, 细胞质内线粒体结构正常, 线粒体嵴结构清晰, 核仁明显, 胞质内可见丰富、结构正常的线粒体, 见图2A。单纯血清组和AGEs+ALT-711组大鼠胸腺细胞结构正常, 呈圆形或椭圆形, 核较大, 核内异染色质呈块状分布, 线粒体嵴结构清晰, 见图2B、C。AGEs组大鼠胸腺细胞核固缩, 核形态不规则, 染色质边集, 表现为早期凋亡, 线粒体嵴断裂, 呈空泡化, 见图2D。老年对照组大鼠胸腺内淋巴细胞核固缩, 核形态不规则, 染色质边集, 线粒体嵴断裂, 并出现肿胀和空泡化, 粗面内质网增宽, 见图2E。

3 讨论

胸腺作为中枢免疫器官, 对免疫系统功能的发挥起关键作用。很多研究表明, 伴随衰老进程胸腺的退化性改变非常明显, 包括重量减轻、组织结构改变, 如胸腺萎缩、皮质和髓质界限模糊不清、淋巴细胞数量减少、细胞完整性被破坏、线粒体肿胀、线粒体嵴断裂、脂褐等[2]。

本研究用大鼠血清蛋白与D-葡萄糖体外孵育AGEs, 鉴定结果显示, 成功制备出外源性AGEs, 并且符合注射液标准。胸腺组织结构观察结果显示:青年对照组、单纯血清组、AGEs+ALT-711组大鼠的胸腺组织结构差异不明显;AGEs组大鼠的胸腺组织结构则呈现与老龄对照组大鼠相似的退行性改变。ALT-711是AGEs交联蛋白裂解剂, 可有效降解已形成的AGEs, 减轻其对组织、器官的毒害。综上所述, 外源性AGEs可诱导大鼠胸腺组织结构的衰老样变, 进而必将对免疫系统的功能产生影响。

参考文献

[1]BROWNLEE M.Advanced protein glycosylation in diabetes and aging[J].Annu Rev Med, 1995, 46:223-234.

O-糖基化 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

2013年1月~2014年10月,年龄≥60岁,随机选择在中心医院择期行非心脑血管全麻手术患者137例,包括非POCD组(106例)和POCD组(31例)。麻醉分级(ASA分级):Ⅰ~Ⅲ级。排除标准:合并神经精神系统疾病、老年性痴呆、心理疾病、帕金森病或其他严重脏器疾病,近期服用影响精神系统功能药物,酗酒,依照受教育程度[2]。经医院医学伦理委员会批准,并与患者签署知情同意书。两组老年患者年龄、性别、体质量指数(BMI)、手术时间、失血量、受教育程度、手术类型等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。见表1。

注:两组比较,P>0.05

1.2 麻醉方法

所有观察对象均采用全麻,诱导均用咪唑安定0.05 mg/kg,芬太尼4μg/kg,异丙酚1.5~2.5 mg/kg,维库溴铵0.1 mg/kg,气管插管后行机械通气,采用持续吸入七氟醚并间断予以维库溴铵、芬太尼,维持术中患者血压(BP)、心率(HR)波动在基础值的±30%以内及PETCO2在35~45 mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)。术毕拔管后送入恢复室。

1.3 观察指标

分别于术前1 d、术后0.5 h以及术后1 d采用EDTA抗凝管收集静脉血5 ml,标本静置20 min后,使用离心机以3000 r/s离心15 min,取上清液-20℃保存。

1.4 统计学方法采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验;计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

两组老年患者在手术前1 d、术后0.5 h内血清s RAGE水平表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。术后1 d血清s RAGE水平表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后1 d两组s RAGE水平表达与术前1 d比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注:与非POCD组比较,aP<0.05;与术前1 d比较,bP<0.05

3 讨论

临床研究发现,血浆中s RAGE浓度越低,炎症反应及氧化应激相关疾病的风险越大。轻微认知受损的患者或确诊老年性痴呆患者体内s RAGE低于正常水平,且s RAGE与认知能力呈正相关[3]。神经元及少突胶质细胞细胞膜上的RAGE与Aβ结合后,可启动NF-κB系统,从而引起持久的炎症反应、神经元毒性并致细胞死亡。

老年患者POCD的发生可能是在大脑退行性改变的基础上,围术期由于持续应激刺激和药物的作用,导致中枢神经递质稳态失调或神经退行性改变以及神经胶质细胞及神经元损伤。引起POCD的危险因素很多,包括年龄、麻醉方式、手术类型等。从本研究可以看出,除了以上因素以外,老年患者术后s RAGE含量水平的明显降低,也是导致患者认知功能改变,出现POCD的一个重要危险因素。虽然具体机制尚待进一步研究,但是血清s RAGE含量降低与POCD的这种关系,有助于POCD的诊断,并为POCD的治疗提供思路。

摘要：目的 探讨老年手术患者术后认知功能障碍(POCD)的发生与血清可溶性晚期糖基化产物受体水平变化的关系。方法 选择137例接受择期手术的全身麻醉(全麻)老年(≥60岁)患者,分为非POCD组(106例)和POCD组(31例),分别于术前1 d和术后3 d应用简易精神状态量表(MMSE)对患者的认知功能进行评定。检测术前1 d、术后0.5 h及术后1 d外周血血清可溶性晚期糖基化终产物受体(s RAGE)水平。结果 两组老年患者在手术前1 d、术后0.5 h血清s RAGE水平表达差异无统计学意义(P>0.05)。术后1 d血清s RAGE水平表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论 POCD的发生可能与其术后血清s RAGE水平的降低有关系。

关键词：认知功能障碍,老年,术后,可溶性晚期糖基化产物受体

参考文献

[1]张明园.精神科评定量表手册.长沙:湖南科技出版社,1999:184-188.

[2]冯丽,田玉科,王鹏.老年病人术后认知功能障碍的研究进展.实用医学杂志,2006,22(13):1589-1591.

O-糖基化 篇4

1 对象及方法

1.1 研究对象

根据K-DOQI指南, 选取2011年10月至2012年6月入住我院肾内科病房的慢性肾脏病患者99例, 其中男50例、女49例, 年龄 (52.48±10.13) 岁。肾小球滤过率的评估采用全国eGFR课题协作组开发的适合中国人群的改良MDRD公式计算估计肾小球滤过率[3], 据肾小球滤过率 (GRF) 将研究对象分为:A、B、C三组, 分别对应CKD3、4、5期;A组37例;B组33例;C组29例。其中慢性肾小球肾炎67例, 高血压肾病18例, 慢性间质性肾炎5例, 梗阻性肾病2例, 高尿酸血症2例, 多囊肾5例, 未选择糖尿病肾病患者。正常对照组28例, 系健康查体者, 正常对照组肝、肾功能, 血糖, 心电图, 超声心动图均正常, 无高血压病史及冠心病阳性表现。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集与检测

留取入院后空腹静脉血, 测定血清AGEs水平, 采用ELISA法测定 (试剂盒由上海船夫生物科技有限公司提供, 按说明书操作) 。甘油三酯 (TG) 、总胆固醇 (CH) 、C反应蛋白 (CRP) 、高密度脂蛋白 (HDL-C) 、血肌酐 (Scr) 、血尿素氮 (BUN) 均由潍坊市人民医院检验科使用美国Beckman全自动生化仪测定。血清肌酐采用碱性苦味酸Jaffe法, 血清CRP采用免疫散射比浊法测定。

1.2.2 颈动脉内膜中层厚度 (IMT) 的测定

采用美国Ge公司logiqs6型彩色多普勒诊断仪探测所有研究对象颈总动脉内膜中层厚度。探头10.0MHZ, 轴分辨率为0.1mm。病人仰卧位, 头偏向检查对侧, 检查部位包括双侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉及其分叉处的内中膜厚度, 连续测量3个心动周期, 左、右颈动脉分叉处共六点, 取其平均值作为IMT值。由潍坊市人民医院B超室资深医师专人操作。

注:*与对照组比较, P<0.05, #与A组比, P<0.05, △与B组比, P<0.05

1.3 统计学方法

所有数据用SPSS17.0统计软件包进行处理。计量资料数据先进行正态性检验和方差齐性检验。符合正态分布的计量资料数据以均数加减标准差 (χ—±s) 表示。方差齐的计量资料采用t检验或单因素方差分析;方差不齐的计量资料采用Dnnett’s C检验。相关性分析在双变量呈正态分布时采用Pearson检验, 非正态分布时用Spearman检验。以P<0.05认为差异有统计学意义。分析比较各组间的差异以及晚期糖基化终末产物与各项指标的相关性。

2 结果

2.1 血清AGEs均值:

与对照组比较, A组无统计学差异, B、C组高于对照组, 且有统计学差异 (P<0.05) 。见表1。

2.2 颈动脉内中膜厚度 (IMT) :

与对照组比较, A组无统计学差异, B、C组均高于对照组, 且两两比较有统计学差异 (P<0.05) 。见表1。

2.3 脂质代谢指标:

与对照组比较, A、B、C组各项脂质代谢指标均有统计学差异 (P<0.05) 。见表1。

2.4 各指标相关性分析:

AGEs与Scr、IMT、CRP均具有正相关性 (P<0.01) ;AGEs与Ccr具有负相关性 (P<0.05) , Ccr与IMT具有负相关性 (P<0.01) 。B、C组AGEs、CRP、Scr、Ccr等指标相关性分析见表2。

3 讨论

AGEs是体内多种蛋白质的氨基组、脂蛋白、脂质等与还原糖的醛基间发生非酶糖基化和氧化反应的终产物。已知在糖尿病肾病引起的CKD患者血中及组织中AGEs含量显著升高, 本研究结果证实在非糖尿病肾病引起的CKD4、5期患者中AGEs血清浓度亦有明显升高, 考虑与以下因素有关: (1) 组织中单核/巨噬细胞含有AGES受体, 正常人体内AGEs产生后, 通过受体 (RAGE) 介导的内吞噬方式清除AGEs修饰过的组织或细胞, 被降解的AGEs主要经肾脏排泄, CKD患者进入4、5期后肾小球率过滤明显下降时, 其降解产物清除率下降, 在血清中浓度升高, 当其再次释放入循环中能够再次修饰组织或细胞形成新的AGEs, 发挥致病作用, 从而形成恶性循环[4]。本研究的结果亦表明在CKD4-5期患者中血清AGEs与CCr呈线性负相关, 与肾功能密切相关。 (2) CKD4、5期患者体内多存在羰基应激反应, 另外饮食的限制、补充铁剂、肾脏合成抗氧化酶障碍等导致中性粒细胞和补体激活等因素共同作用, 使CKD患者体内普遍存在着氧化应激状态[5], 氧化应激可以促进羰基化合物及AGEs的形成, AGEs反过来促进了氧化应激。这种互相促进的应激状态使一些正常情况下不能生成AGEs的前体物质发生氧化而生成AGEs, 导致AGEs水平增高。 (3) 对部分已存在血管内皮受损的心血管病患者, 血管壁通透性增高, 致使AGEs特异性受体暴露增多, AGEs与AGEs特异性受体结合增多, AGEs清除减少。

V lassara等证明表明AGEs是促进动脉粥样硬化形成的重要因素, 体内AGEs慢性蓄积与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关[6]。有动物实验和人的大血管免疫组织化学证实在非糖尿病的动脉粥样斑块有AGEs沉积[7,8], 本研究亦证实在CKD患者4、5期患者的IMT与AGEs的升高密切相关, 另外AGEs与CRP明显相关, CRP为公认的炎性标志, 证实了在CKD患者体内普遍存在着微炎症反应状态, AGEs参与了微炎症状态的形成, 与心血管疾病密切相关。相关作用机制可能为: (1) AGES直接捕获蛋白质或引起蛋白质交联, 从而破坏血管的结构和功能。AGEs可能通过与受体 (RAGE) 的结合激活细胞内信号传导通路, 激活转录因子NF-κB表达, 诱导多种细胞表达的多种功能蛋白, 增加内皮细胞通透性, 促进炎性细胞黏附, 引起血管内皮炎症反应, 导致内皮细胞功能失调以及血管损伤, 刺激心脏平滑肌细胞增殖迁移。 (2) AGEs可通过多种途径减少内皮细胞合成NO, 导致凝血和纤溶系统失衡, 从而促使血小板激活。并可通过氧化应激反应促进血小板聚集, 增加血小板的聚集和黏附。 (3) 可通过损伤血管内皮间接激活血小板最终导致动脉粥样硬化及斑块形成。 (4) 影响RAAS系统。

另外, 在本研究中也可以看到CKD患者各项脂质代谢指标普遍存在异常。AGEs能促使脂质代谢紊乱可能尾因素之一, AGEs产生的反应性氧的产物, 使脂质发生氧化, 形成氧化型低密度脂蛋白 (oxLDL) 。ox-LDL难以通过一般的代谢途径清除, ox-LDL能被巨噬细胞表面的受体识别并摄取, 最后转化为泡沫细胞。其对颈动脉粥样硬化的发生、发展起到重要的作用。亦有研究证实AGEs可增加高脂血症动物动脉粥样斑块局部的炎症反应[9]。

本实验结果启示我们及早监测并清除AGEs可能是预防非糖尿病CKD患者动脉粥样硬化性疾病的一个有效途径。采用ELISA法监测血清AGEs的水平, 可用于临床中的大规模的检测, 为诊断及预防CKD引起的心血管疾病提供依据, 有助于早期采取措施延缓心血管事件的发生。

摘要：目的 检测慢性肾脏病 (CKD) 患者血清晚期糖基化终产物 (AGEs) , 以及与年龄、性别、血肌酐、血尿素氮、肌酐清除率、C反应蛋白、甘油三酯及胆固醇、高密度脂蛋白、颈动脉内膜中层厚度 (IMT) 等因素的关系, 分析CKD患者血清 (AGEs) 水平与肾功能及动脉粥样硬化的相关性, 探讨其在慢性肾衰竭患者动脉粥样硬化的发生及发展过程中的相互作用及可能机制, 为临床上早期诊断、预防和治疗提供一定的理论依据。方法 根据K-DOQI指南, 选择CKD3-5期患者99例。据肾小球滤过率 (GRF) 将研究对象分为:A、B、C三组, 分别对应CKD3、4、5期。以双抗体酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定所有研究对象的空腹血清 (AGEs) 浓度, 并检测血肌酐、尿素氮等一般生化指标, B超测定颈动脉内膜中层厚度 (IMT) 。分析比较各组间的差异以及血清AGEs与各项指标的相关性。结果 B、C组与正常组比较、C组与B组比较, CRP、AGEs、IMT均有明显差异 (P<0.05) ;AGEs与CRP、Scr、IMT之间具有正相关性 (P<0.05) ;AGEs与Ccr则存在负相关性 (P<0.05) 。结论 AGEs在CKD3期之后出现的潴留, 与肾功能损害对AGEs的清除减少有关;AGEs在CKD患者颈动脉粥样硬化的发生、发展中起着重要的作用, 为诊断及预防CKD引起的心血管疾病提供依据及有助于早期采取措施延缓心血管事件的发生, 从而降低终末期肾脏病心血管事件高发生率和病死率。

关键词：晚期糖基化终产物,慢性肾脏病,内中膜厚度 (IMT) ,动脉粥样硬化

参考文献

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O-糖基化 篇5

糖尿病心肌病是糖尿病慢性并发症之一,高血糖所致蛋白质非酶糖化及糖基化终产物(advanced glycosylation endoproducts,AGEs)的蓄积是引起糖尿病慢性并发症的关键因素[1,2]。过多的AGEs沉积会导致细胞内活性致氧体(ROS)增多介导细胞发生凋亡,加重糖尿病心肌病变的发展。槲皮素(Quercertin,Que)及其衍生物是一类黄酮类化合物,具有抑制蛋白质非酶糖化,清除氧自由基的作用。其可通过抑制AGEs在长寿组织蛋白器官中积聚,减轻糖尿病慢性并发症[3]。目前关于其对糖尿病心肌细胞凋亡的作用报道较少。本实验拟通过观察槲皮素对早期糖尿病大鼠心肌组织AGEs含量及细胞凋亡、凋亡相关基因Caspase-3表达的影响,进一步探讨其对糖尿病心肌的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠,24只,雄性,2月龄,体重200~250 g[辽宁医学院实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(辽)2003-0007];链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(Sigma公司)、槲皮素(Sigma公司);原位凋亡(TUNEL)试剂盒购自Sigma公司,包括TDT(美国Promega公司),Dig-d UTP(德国BM公司),生物素化抗地高辛抗体(美国Sigma公司),Caspase-3免疫组织化学试剂盒购自Santa Cruz公司;BX51光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 模型制备及实验分组

SD大鼠随机分为3组,每组8只。16只大鼠以60 mg/kg一次性左下腹腔注射1%STZ溶液,临用前用0.5 mmol/L的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(p H 4.5)配制。另8只作为正常对照组(NC)注入等量容积上述缓冲液。当天即让大鼠自由进食饮水。注射后72h测血糖及尿糖,将血糖浓度大于16.7 mmol/L,尿糖阳性者定为糖尿病大鼠模型。然后将糖尿病大鼠随机分为两组,糖尿病组(DM)和槲皮素治疗组(Que)。治疗组灌胃给予槲皮素100 mg/kg,每天1次。各组大鼠饲养8周。

1.3 标本收集

饲养到期后取左心室心肌标本,立即置于4%多聚甲醛(p H7.4)中固定24 h,行常规石蜡包埋,制作切片。留做TUNEL检测心肌细胞凋亡及免疫组织化学检测。

1.4 血清FMN及心肌AGEs含量测定

血清FMN:颈动脉取血分离血清,匀浆上清液蛋白比色法检测。心肌AGEs:采用MONNIER等[4]方法,用荧光分光光度计在370/440 nm处测定胶原提取液荧光强度,其值用空白胶原酶校正。消化液中羟脯胺酸含量用氯胺T法测得。AGEs含量以每毫克羟脯胺酸所含的荧光强度为一个任意单位。

1.5 TUNEL检测心肌细胞凋亡及半定量分析

应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)原位标记心肌凋亡细胞核。心肌石蜡切片常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇水化后,经3%H202处理,蛋白酶K消化后,加入TDT和Dig-d UTP4℃过夜,封闭后加生物素化抗地高辛抗体,洗涤,加SABC、DAB显色,光镜观察。正常心肌细胞核呈蓝色,而凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。每只大鼠随机取5张左心室心肌切片,每张切片在10×40倍光镜下选择阳性表达区内5个无重叠视野,计数凋亡阳性细胞数占视野所有细胞数目的比例即为凋亡指数(AI),求其均值。

1.6 免疫组织化学法检测左室心肌Caspase-3蛋白表达

采用免疫组织化学ABC染色法,切片厚4μm,常规脱蜡水化,一抗为兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体(1︰50稀释),二抗为生物素化羊抗兔lg G(1︰100稀释),以PBS代替一抗作阴性对照,DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片。每张切片在阳性表达区域选择5个无重叠视野,采用图像分析系统计算每5个视野的阳性染色平均光密度值(OD)。

1.7 统计学分析

实验数据用表示,用SPSS11.0 for Windows软件对数据进行统计分析。采用one-way ANOVA和LSD-t检验进行两两比较。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 大鼠一般状态及血糖水平

大鼠注射STZ后血糖一直处于较高水平,糖尿病组大鼠呈明显多饮、多尿症状,并伴不同程度的精神萎靡,尿糖阳性。与NC组相比,病程8周时DM组大鼠血糖显著升高(P<0.01);Que组大鼠血糖水平与DM组相比差异无显著性(P>0.05)。见表1。

2.2 槲皮素对糖尿病大鼠血清FMN、心肌AGEs含量的影响

与NC组相比,DM组大鼠血清FMN、心肌AGEs含量明显升高;与DM组相比,Que组大鼠血清FMN含量无明显改变(P>0.05),但心肌AGEs含量明显降低(P<0.01)。提示槲皮素可抑制糖尿病大鼠心肌非酶糖基化,减少AGEs的形成。见表1。

注:1)与NC组比较,P<0.01,2)与DM组比较,P<0.05

2.3 槲皮素对糖尿病心肌细胞凋亡的影响

NC组大鼠心肌偶见凋亡细胞,DM组和Que组大鼠均可见凋亡细胞,其细胞核呈黄色或棕黄色。与NC组相比,DM组凋亡细胞明显增多(P<0.01);与DM组相比,Que组凋亡细胞数目减少(P<0.05)。提示糖尿病病程8周时存在心肌细胞凋亡,槲皮素可减少糖尿病心肌细胞凋亡的发生。见图1、2。

2.4 槲皮素对Caspase-3蛋白表达的影响

免疫组织化学染色后,Caspase-3蛋白表达阳性细胞胞浆呈黄色或棕黄色。NC组大鼠心肌Caspase-3阳性细胞数量较少,蛋白表达较弱(图3A);与NC组相比,DM组大鼠心肌Caspase-3阳性细胞数量明显增多(P<0.01),蛋白表达增强(图3B);与DM组相比,Que组大鼠心肌Caspase-3阳性细胞数量及强度明显减弱(P<0.01)(图3C)。见图3、4。

3 讨论

目前研究认为非酶糖化及糖基化终产物AGEs的沉积是导致糖尿病慢性并发症的主要原因之一[2]。研究显示[5],STZ诱导的糖尿病大鼠心脏功能改变发生在糖尿病病程6~14周,心肌超微结构的改变发生在糖尿病病程8~12周。本实验以8周为观察点,结果显示糖尿病组大鼠病程8周时心肌AGEs含量明显增高,此与CANDIDO等[6]观察结果一致,证实AGEs参与了糖尿病心肌病变的发生。实验中同时发现,糖尿病组及槲皮素治疗组大鼠血糖均处于较高水平,经槲皮素治疗后,大鼠血糖、血清果糖胺含量均无明显改变,但心肌AGEs含量明显降低。表明槲皮素并不降低血糖,对早期糖化产物果糖胺也无抑制作用,但对糖尿病大鼠心肌组织AGEs的形成具有明显的抑制作用。

糖尿病心肌病变早期主要以心室重构及心脏舒张功能障碍为主,最终可出现收缩功能不全,心肌细胞凋亡参与了上述病变过程[7]。FIORDALISO等[8]研究显示,STZ诱导的糖尿病大鼠早期(3 d)即存在细胞凋亡,提出糖尿病心肌细胞出现代偿性肥大,并导致心肌肥厚及心力衰竭可能与细胞凋亡有关。TIAN等[9]在糖尿病心肌病大鼠中观察到DNA片段化及TUNEL阳性凋亡细胞增多。本研究中病程8周时糖尿病大鼠心肌细胞凋亡数显著增加,表明细胞凋亡参与了糖尿病心肌病变的发生。细胞凋亡是由多基因调控的死亡过程,本实验结果显示,病程8周时,糖尿病大鼠心肌Caspase-3蛋白表达增强。Caspase-3是线粒体依赖的凋亡途径的主要执行者,它可作为凋亡级联反应中公共下游的凋亡效应因子,完成致命性DNA断裂的作用机制,诱导细胞凋亡[10]。因此,提示Caspase-3介导了糖尿病心肌细胞凋亡的调控。

引发糖尿病心肌细胞凋亡的机制非常复杂,蛋白质非酶糖化过程中可产生大量的氧自由基,活性氧物质的积聚及增加的氧化应激在心肌细胞凋亡中起重要作用[11]。本研究病程8周时糖尿病大鼠心肌AGEs含量明显增高,同时凋亡的心肌细胞数目增多,提示糖尿病心肌细胞凋亡可能与AGEs的沉积有关。槲皮素是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物,药理作用广泛,具有抑制蛋白质非酶糖化,清除氧自由基等多方面作用。有研究发现,槲皮素可通过抑制非酶糖化及氧化反应减轻糖尿病肾病肾小球肥大程度,减轻蛋白尿[12]。本实验中应用槲皮素治疗后,大鼠心肌AGEs含量明显降低,心肌Caspase-3表达明显减弱,细胞凋亡数目明显减少。表明槲皮素可能部分通过抑制AGEs的形成,下调Caspase-3表达来减少心肌细胞凋亡,从而发挥对糖尿病心肌的保护作用。

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O-糖基化 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

实验主要试剂如下：HUVECs株CRL-1730购自ATCC公司，RPMI-1640细胞培养基、胰蛋白酶和Trizol试剂购于Gibco公司，胎牛血清购于Hyclone公司，无内毒素人血清白蛋白(HSA)、D-葡萄糖、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、二甲基亚砜(DMSO)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G和anti-βactin(小鼠来源)抗体购于Sigma公司，anti-phospho-αAMPK(兔来源)抗体和anti-αAMPK(兔来源)抗体购于Cell Signaling公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠Ig G来源于Santa Cruz公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于BD公司，d NTP(脱氧核苷三磷酸)购于北方生物技术研究所。参照文献设计脂联素及内参照β-actin引物，委托沈阳联星生物技术有限公司合成。Trizol Reagent and Systems总RNA抽提试剂盒购于Ta Ka Ra公司，Taq DNA多聚酶、RNA酶和逆转录试剂盒购于Rromega公司。

1.2 方法

1.2.1 体外晚期糖基化终产物的制备

参照文献[2]略有改动：0.5 g人血清白蛋白(HSA)、3.0 g D-葡萄糖、1 000μg青霉素和500μg庆大霉素溶于0.5mol/L PBS(p H7.4)10 m L中，过滤除菌，恒温37℃避光孵育。90 d后以无菌的p H7.4的PBS透析。以同样条件，不含D-葡萄糖的孵育液培养的HSA作为对照。制备的AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-HSA)经荧光分光光度法鉴定：待测蛋白以10 mg/L浓度，激发波长360 nm，发射波长430 nm测试荧光值。AGE含量为78.2 ku/g，对照样本AGE含量不超过0.9 ku/g。

1.2.2 HUVECs的体外培养

细胞用RPMI-1640细胞培养基培养于37℃、5%二氧化碳、100%湿度的孵箱中，每天换液1次，3、4 d以0.25%的胰蛋白酶消化传代1次。细胞贴壁后24 h，用无酚红、无血清、RPMI-1640细胞培养基预处理，即37℃、5%二氧化碳中培养24 h，使其处于同步化状态。不同浓度(100、200和400 mg/L)AGEs作用24 h或48 h，其中一组预先用3 mg/L g Ad处理24 h。分别以相应条件的未修饰HSA作为对照组。

1.2.3 MTT比色法测定细胞活性

取对数生长期细胞制成3×105个/m L的细胞悬液，接种于96孔培养板内，每孔200μL，设5个复孔。4 h细胞贴壁后实验处理分组，每组设5个复孔，调零孔加100μL培养液，继续培养。培养结束前4 h每孔吸去上清液，加20μL浓度5 g/L MTT培养4 h，调零孔不加MTT，吸去全部上清液，然后每孔加150μL DMSO，震荡摇匀10 min，使结晶充分溶解。酶联免疫检测仪测每孔吸光度(检测波长490 nm)。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡

用4℃预冷的PBS洗细胞1次，用稀释好的结合缓冲液重悬细胞，调整其浓度为1×106个/m L。取100μL细胞悬液于5 m L流式管底，加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI(10 mg/L)，轻轻混匀。室温避光孵育15 min。在反应管中加入400μL稀释好的结合缓冲液，1 h内上机检测早期凋亡细胞数。用CELL Quest软件对结果散点图进行分析。

1.2.5 Western blot检测蛋白

将收集的细胞，加入细胞膜裂解液，冰浴中将细胞超声粉碎，4℃12000×g离心后弃沉淀，Bradford法测定蛋白浓度。蛋白样品经过热变性、SDS-PAGE电泳、转膜，分别加入兔抗人anti-αAMPK(1︰400)、anti-phospho-αAMPK(1︰200)杂交后，再加入HRP标记羊抗兔Ig G(1︰1 000)孵育，经增强发光剂显色(ECL显色试剂盒)。

1.2.6 RT-PCR检测内皮细胞AdipoR1 m RNA的表达

分别收集不同时间的各组细胞，加入Trizol反复吹打，再加入氯仿，剧烈震荡后放置，4℃12 000r/min离心15 min。加入异丙醇混匀后室温放置，4℃12 000 r/min离心10 min。弃上清，加75%冷DE-PC-乙醇1 m L，涡旋漂洗1次，4℃7 500 r/min离心5 min。弃上清，敞口风干室温放置于空气中干燥5 min，重悬于无RNA酶焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水中，置56℃水浴中孵育10 min。取2μL RNA，应用紫外分光光度仪测定RNA纯度，提取到各组细胞总的m RNA。采用两步法，第一步逆转录反应：65℃15 min,37℃1.5 h,94℃8 min;第二步RT-PCR反应：94℃2 min,55℃1 min,72℃2 min 1个循环，94℃45 s,55℃40 s,72℃1 min 30个循环，72℃10 min。Adipo R1 m RNA基因序列(NM015999)，扩增产物长度100 bp,Forward Primer:5'-TCCTAAG-CACCGGCAGACAAG-3';Reverse Primer:5'-CTTGA CAAAGCCCTCAGCGATAGTA-3'。Homo-GAPDH引物基因序号(NM002046),Forward Primer:5'-GCAC CGTCAAGGCTGAAC-3';Reverse Primer:5'-TGGTG AAGACGCCAGTGGA-3'，扩增产物长度138 bp。琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭液覆盖凝胶，染色5 min，自动凝胶成像分析仪下观察拍照。结果以脂联素条带吸光度值与β-actin条带吸光度值的比值表示。

1.3 统计学处理

采用SPSS 11.5软件分析。组间比较采用单因素方差分析，SNK检验两两比较。以均数±标准差表示，P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 MTT比色法测定细胞活性

不同浓度AGEs作用HUVECs 24 h，其中一组预先用3 mg/L g Ad处理24 h。测定HUVECs活性，结果如图1所示。

不同浓度(100、200和400 mg/L)AGEs作用内皮细胞24 h，与对照组比较，随着浓度的增加，细胞活性显著下降(P<0.01)。与200 mg/L AGEs组比较，预先用g Ad处理后的200 mg/L AGEs组细胞活性显著增加(P<0.01)。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

Annexin V-FITC/PI双染标记法检测细胞凋亡，如图2所示。

其中一组预先用3 mg/L g Ad处理24 h。右下象限AnnexinⅤ(+)/PI(-)为凋亡细胞。所得结果见图3。

与对照组比较，随着浓度的增加，细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。与200 mg/L AGEs组比较，预先用g Ad处理后的200 mg/L AGEs组细胞凋亡率显著下降(P<0.01)。

2.3 Western blot检测p-αAMPK（磷酸化的αAMPK）和αAMPK蛋白

不同浓度AGEs作用HUVECs 48 h，其中一组预先用3 mg/L g Ad处理24 h。免疫印迹法检测p-αAMPK和αAMPK蛋白表达量，见图4。

β-actin作内参对照。与对照组比较，不同浓度(100、200和400 mg/L)AGEs作用内皮细胞48 h,p-αAMPK/αAMPK的比值，差异无显著性(P>0.05)。与200 mg/L AGEs组比较，预先用g Ad处理后的200 mg/L AGEs组细胞p-αAMPK/αAMPK的比值显著增加(P<0.01)。用p-αAMPK/αAMPK灰度值比值即各组细胞AMPK磷酸化水平表示AMPK激活程度。

2.4 RT-PCR检测内皮细胞脂联素受体AdipoR1mRNA的表达

应用所提取细胞总RNA通过逆转录获得c D-NA，然后根据所设计的引物对获得的c DNA产物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果(图5)。电泳结果显示扩增片段与设计的目的基因以及内参引物长度一致。

不同浓度(100、200和400 mg/L)AGEs作用48 h，其中一组预先用3 mg/L g Ad处理24 h。采用RT-PCR方法，测定内皮细胞Adipo R1 m RNA表达，结果见图6。

与对照组比较，随着AGEs浓度的增加，Adipo R1 m RNA表达显著下降(P<0.05)。与200 mg/L AGEs组比较，预先用g Ad处理后的200 mg/L AGEs组Adipo R1 m RNA表达量显著增加(P<0.01)。

3 讨论

动脉粥样硬化(AS)是糖尿病主要的血管并发症，而内皮细胞凋亡过度是造成血管壁局部血栓形成，加速AS发展的主要原因之一。

本研究发现AGEs诱导HUVECs的凋亡，其凋亡率随AGEs浓度升高而增加，具有明显的浓度依赖性。越来越多的证据表明AGEs与糖尿病慢性并发症有密切关系。AGEs水平与心血管疾病存在确切的相关性，已经证实血清AGEs水平是心力衰竭和心血管事件的预测子[3]。与非糖尿病患者比较，AGEs在糖尿病患者并发心血管疾病中，可能起更重要的作用[4]。AGEs的累积与糖尿病合并心血管疾病密切相关[5]。

本实验研究发现g Ad明显降低AGEs诱导的HUVECs的凋亡，具有抗内皮细胞凋亡的作用。AGEs诱导HUVECs凋亡并不激活AMPK蛋白，而g Ad可激活AMPK蛋白，提示g Ad抑制AGEs诱导HUVECs的凋亡，可能与AMPK通路有关。大量实验研究已经证实，脂联素在拮抗细胞凋亡中有AMPK参与。用g Ad处理成年雄性鼠野生型心肌细胞，可以显著减少模仿的缺血再灌注损伤，明显减少AMPK的α亚单位的表达，提示g Ad的抗凋亡作用部分依赖于AMPK[6]，在体内AMPK缺陷明显增加心肌缺血和心肌再灌注损伤[7]。脂联素水平不仅与发展缺血性心脏病的危险有关，而且与心肌缺血再灌注损伤严重程度有关。完全长度脂联素或球状脂联素呈剂量依赖方式减轻Adipoq-/-鼠的心肌缺血再灌注损伤[8]。体外研究已经证实，脂联素促进细胞存活，抑制细胞死亡，提示脂联素直接保护心肌细胞。来源于Adipoq-/-鼠新生心肌细胞培养中，通过AMPK支配的负性突变，脂联素的抗凋亡作用被彻底抑制，提示脂联素的心肌保护作用主要通过AMPK调节的信号通路[7]。

本实验中，随着AGEs浓度的增加，Adipo R1m RNA的相对表达量逐渐下降，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。这一结果说明，AGEs有抑制Adipo R1 m RNA表达的作用，并呈浓度依赖性。Adipo R1既是球状脂联素的高亲和力受体，又是完全长度脂联素的低亲和力受体。Adipo R1调节的脂肪酸氧化作用对球状脂联素高度敏感，但对完全长度脂联素有抵抗作用。Adipo R1激活细胞内第二信使AMPK，让它参与控制氧化应激和凋亡[9]。脂联素联合高糖培养的小鼠胰岛细胞中Adipo R1和Adipo R2均有表达，而以Adipo R1的表达为主。高血糖和高胰岛素血症都能减少L6鼠骨骼肌细胞Adipo R1大约50%的表达[10]。这一结果与本研究发现高AGEs抑制Adipo R1的表达相一致。Adipo R1调节球状脂联素抑制内皮素-1诱导培养的心肌细胞肥大。通过这些受体，AMPK参与信号转导。Adipo R1可能在心肌梗死后由内皮素-1相关的心肌细胞肥大发表机制中起作用[11]。SOCCIO[12]等从基因角度研究了Adipo R1与糖尿病心血管病的关系，发现Adipo R1基因的3'端顺序变化是决定2型糖尿病心血管病的重要原因。这种作用的出现是由于Adipo R1等位基因的表达差异造成的，可能影响脂联素作用于靶组织的抗动脉硬化的作用。这些结果肯定并且增强脂联素作为生理性动脉硬化的调节子，并指出Adipo R1基因的变化作为这种效应的关键调控子。

综上所述，AGEs诱导HUVECs的凋亡呈浓度依赖性，g Ad可能通过激活AMPK/Adipo R1通路抑制AGEs诱导HUVECs发生凋亡。提示g Ad、AMPK和Adipo R1可能在防止血管内皮损伤，减少糖尿病血管病发生方面有重要意义。

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