绞股蓝皂苷（精选4篇）
绞股蓝皂苷 篇1
0 引言
自由基与人体疾病和衰老有着直接的联系,它们具有较强的氧化能力。绞股蓝具有抗衰老、抗癌、提高免疫力等多种药理作用,绞股蓝皂苷是绞股蓝中的主要活性成分,因此对绞股蓝皂苷的抗氧化作用的研究十分必要。目前的研究大多集中在对绞股蓝皂苷及其他有效成分的分离提取的工艺上,对纯化后的绞股蓝皂苷的抗氧化作用鲜有报道。纯化条件不同可以得到不同种类和成分的皂苷样品。本文对不同纯化条件下所得到的皂苷样品进行了抗氧化作用的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
绞股蓝干叶:购于广州市医药公司,产地福建同安;人参皂苷Rb1、Rb3、Re、Rg1、Rg2标准品:成都曼斯特生物科技有限公司。
1.1.2 试剂
DPPH:Sigma公司;抗坏血酸:北京市金诺欣成化工有限公司;硫酸亚铁、水杨酸、三氯化铁:广州化学试剂厂;过氧化氢:深圳市祥瑞源化建商行;三氯乙酸:青岛市正大化工贸易有限公司;卵磷脂:郑州明欣化工产品有限公司;硫代巴比妥酸(TBA):上海沪宇生物有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.1.3 仪器
UV-1600紫外、可见分光光度计:上海美谱达仪器有限公司;DT5-2台式离心机:北京时代北利离心机有限公司;HH-4数显电子恒温水浴锅:江苏金坛宏华仪器厂;超声波清洗器:天津奥特塞恩斯仪器有限公司;Waters e2695高效液相色谱仪、Waters 2414蒸发光检测器:Waters公司;Agilent ZOR-BAX XDB C18(250×4.6mm,0.5μm)色谱柱:Agilent公司。
1.2 方法
1.2.1 绞股蓝皂苷样品的制备
绞股蓝皂苷粗提物的制备:取绞股蓝干叶粉末浸于75%乙醇中,80℃水浴120 min,将提取液抽滤后旋转蒸发得生药。
D101大孔树脂一次纯化:把生药配成6 mg/m L的初始液,以2.0 m L/min的流速上柱,再以体积分数为30%、50%乙醇梯度洗脱。在此,分别将30%、50%的乙醇洗脱出来的绞股蓝皂苷称为总皂苷A、B。
硅胶柱层析二次纯化:将用乙酸乙酯调匀的硅胶填入层析柱。总皂苷A粉末与硅胶混合后用流动相调和均匀,沿层析柱内壁倾入柱中,用流动相行常压洗脱,收集洗脱液,真空浓缩烘干。这里,将总皂苷A经硅胶柱层析后的得到的总皂苷简称为总皂苷A’。
用高效液相色谱-蒸发光检测法对绞股蓝皂苷中的人参皂苷类型和纯度进行检测[1]。
1.2.2 清除DPPH自由基能力测定[2]
吸取3 m L的DPPH 95%乙醇溶液于中,加入1 m L样品溶液,使其充分混匀,静置15 min,在波长517 nm处测定其吸光值,记为样品吸光值A1,空白对照吸光值为A0。每个样品设8组浓度梯度,每组3个平行。以Vc为阳性对照组。
自由基的清除率计算公式:
1.2.3 清除·OH能力的测定
采用Fenton反应法测定[3]:取6 mmol/L硫酸亚铁溶液2m L加入样品溶液2 mL、6 mmol/L的双氧水2 mL,静置10 min后加入6 mmol/L的水杨酸溶液2 mL,摇匀静置30 min,在510nm波长处测定吸光度。每个样品设9组不同的浓度,每个浓度3个平行。以Vc为阳性对照组。
1.2.4 抑制脂质过氧化实验
采用Fe诱导卵磷脂脂质体过氧化-TBA法[4]:将1 mL卵磷脂溶液、1 mL 400μmol/L三氯化铁溶液和l mL样品溶液混匀。避光于37℃水浴60 min,再加入2 mL TCA-TBA-HCl混合液,95℃水浴15 min后迅速冷却,以4 000 r/min转速离心10 min,取上清液在535 nm测吸光值。每个样品设8组浓度梯度,每组3个平行。以Vc为阳性对照组。
1.2.5 还原力的测定[5]
将0.25 mL样品溶液,0.25 mL pH 6.6的磷酸缓冲溶液和0.25 mL 1%的铁氰化钾混合,50℃水浴20 min后加入10%三氯乙酸溶液0.25 mL,500 r/min离心10 min。取上清液0.5 mL,加蒸馏水2.5 mL和0.2%三氯化铁溶液0.1 mL,混匀室温下静置10 min,于700 nm下检测吸光值。以Vc为阳性对照。
2 结果与分析
2.1 三种样品中人参皂苷的组成及含量的比较
将各样品的各组分含量总结于表1。由表1可知,三种纯化样品中,以总皂苷B的纯度最高,总皂苷A’次之,总皂苷A最低。三种样品的皂苷组分为人参皂苷Re、Rb1、Rb3,其中总皂苷B中的Rb1、Rb3含量较高,Re含量较低,而总皂苷A与总皂苷A’的Re含量较高,Rb1、Rb3含量较低。
2.2 不同绞股蓝皂苷样品的DPPH自由基清除率的比较
从图1中可知Vc在低浓度的条件下即可对DPPH表现出很强的清除能力,清除率能达到98%。3种绞股蓝提取物样品都具有一定的DPPH清除力。在相同浓度下,绞股蓝皂苷A的DPPH清除率高于总皂苷A’、B,浓度为0.20 mg/mL时清除率最高,达86.08%,当浓度超过0.20 mg/mL后清除率趋于平行,说明总皂苷A在浓度为0.20 mg/mL时已到达清除饱和。而总皂苷B在浓度0.80 mg/mL时才达到自由基清除的平衡,清除率最高为85.50%。总皂苷B为84.40%,总皂苷A’为77.50%
2.3 不同绞股蓝皂苷样品的·OH清除率的比较
由图2可知,Vc对羟自由基的清除率远远高于三种样品,几乎接近100%。总皂苷A在浓度达到2.0 mg/mL前,其羟自由基清除率与浓度成正相关,浓度为2.0 mg/mL时清除率最高,达到49.97%,而当浓度超过这个阈值以后清除率略微有些降低。而总皂苷A’浓度2.0 mg/mL时清除率为53.49%,在浓度超过2.0 mg/mL后,其羟自由基清除率未有明显的下降趋势,并且整体上清除率高于总皂苷A。对于总皂苷B,在相同浓度范围内,其羟自由基清除率均低于其余两种总皂苷。
2.4 不同绞股蓝皂苷样品脂质过氧化抑制率的比较
由图3可知,Vc具有较高的脂质过氧化抑制率,最高达79.55%。而总皂苷A、A’及B的抑制率均较低,在浓度0~4.0 mg/mL范围内,抑制脂质过氧化能力大小顺序为:总皂苷A>总皂苷A’,总皂苷A浓度为2.5 mg/mL时抑制率最高达到54.08%,而总皂苷B在浓度低于2.0 mg/mL时,抑制率高于总皂苷A,高于3.0 mg/mL时低于总皂苷A,但总皂苷B在整个浓度范围内抑制率波动不大,保持在40±5%。
2.5 不同绞股蓝皂苷样品还原力的比较
体系溶液颜色改变反映出体系中氧化还原状态的改变。吸光值越大,还原力越强,抗氧化效果越佳。从图2-4中知道,在相同浓度下,Vc的还原力最高,各样品的还原力大小顺序为:总皂苷A>总皂苷A’>总皂苷B。
从以上4个图中可以看出,不同样品在不同的浓度下,其抗氧化能力大小是不同的。总体来说,这3种样品的抗氧化能力的排序为:总皂苷A>总皂苷A’>总皂苷B。从表1中可知,总皂苷B中的皂苷含量最高,但其抗氧化能力并非最高,总皂苷A中的皂苷含量最低,反而抗氧化能力是最高的。
3 讨论
目前对绞股蓝活性成分抗氧化的研究集中在对粗提物的研究中,景永帅等发现绞股蓝粗提物具有很强的自由基清除作用和还原力[6]。而本研究的对象是纯化后的绞股蓝提取物,结果发现其皂苷含量越大反而抗氧化能力越弱。由于绞股蓝中的皂苷有80多种,并且绞股蓝中的黄酮类和多糖类均有抗氧化作用[7,8],所以皂苷样品中的其他未知成分可能具有较高的抗氧化能力,但究竟是哪种物质起主导作用还有待进一步研究。另有报道指出,粗提的绞股蓝总皂苷能通过提高超氧化物歧化酶SOD酶活性增强老龄大鼠机体的抗氧化能力[9],人参皂苷单体在动物模型中具有很好的抗氧化能力[10,11]。未能在体内研究纯化后绞股蓝皂苷的抗氧化能力是本研究的局限性。
4 结论
以30%的乙醇为洗脱剂的皂苷纯化样品(总皂苷A),其体外抗氧化能力比以50%的乙醇为洗脱剂的皂苷样品(总皂苷B)及以30%乙醇为洗脱剂并经过硅胶柱二次纯化的皂苷样品(总皂苷A’)的体外抗氧化能力要强。
参考文献
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绞股蓝皂苷 篇2
目前绞股蓝皂苷的提取工艺已有很多,例如常规水浴法、醇提[5]、超声波[5,6]、微波[7]、酶法提取[8]等方法,但是多数试验主要集中在对某种试验方法的单因素或多因素的正交优选方面,而对这些提取方法之间的协同作用的研究所见不多。鉴于此,作者综合酶法和超声波法提取绞股蓝总皂苷的优势,首次采用超声波协同酶法提取绞股蓝皂苷,以若干个试验参数作为考察因素,对提取的工艺进行优化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
绞股蓝干叶购自广州市医药公司,产地福建南靖(2009年8月采收),试验时先行粉碎至40～60目。
1.1.2 试剂:
人参皂苷Rb1标准品购自成都曼斯特生物科技有限公司;纤维素酶购自广州齐云生物技术有限公司;甲醇为色谱纯,高氯酸、冰醋酸为分析纯,香草醛为化学纯,均为国产。
1.1.3 仪器:
FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);UH-950B超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司);电热鼓风干燥箱(重庆市永生仪器有限公司);UV-1600紫外、可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);HH-4恒温水浴锅(江苏省金坛市宏华仪器厂);DT5-2台式离心机(北京时代北利离心机有限公司);BS 224S型电子天平(Sartorius);accumet AB15型pH计(美国Fisher Scientific)。
1.2 方法
1.2.1 标准曲线法[9,10]:
通过测定人参皂苷Rb1的紫外吸光值,以吸收值Y与皂苷浓度C (mg/mL)做回归处理,得标准曲线,求出回归方程为: Y =3.8433C-0.0270(浓度为0.020mg/mL～0.100mg/mL,R2=0.9997)
1.2.2 皂苷含量的测定:
取100μL样品上清液置于10mL试管中,测其吸光值A,代入回归方程可得皂苷的含量C,计算皂苷提取率η:
η=CV/1000M
式中:η-皂苷提取率,%;C-皂苷含量,mg/mL;V-提取液总体积,mL;M-绞股蓝干叶质量,g。
1.2.3 常规水浴提取:
经单因素试验和正交试验后,选用水为提取溶剂,做3次平行试验(以下方法均作3次平行处理),以料液比1:25于80℃加热浸提120min,离心取上清液,测定吸光值,计算皂苷提取率。
1.2.4 单一酶法提取的单因素试验:
称取1.000g绞股蓝干叶粉末若干份,分别以不同的酶用量、溶剂pH、酶解温度、酶解反应时间等进行酶法提取的单因素试验。固定条件为溶剂pH 5.0,料液比1∶25,酶解温度50℃,酶解反应120min,酶用量0.6%(m/m),单一变化其中一个条件进行单因素试验。
1.2.5 酶法提取的正交试验:
在单因素试验基础上,以酶用量、溶剂pH、酶解温度、酶解反应时间四个因素,各选出3个水平,进行正交试验,见表1。
1.2.6 单一超声波提取:
将样品置于冰水混合物中,保持低温环境,再分别以功率190W和285W的超声波细胞破碎仪处理不同时间后,测其吸光值并计算总皂苷提取率。
1.2.7 超声波协同酶法提取:
①超声波后酶解处理:按照1.2.6所得超声波法的最优条件处理后,再进行1.2.5所得酶法的最优条件进行处理,测其吸光值并计算总皂苷提取率。②酶解后超声波处理:按照1.2.5所述酶法的最优条件处理后,再进行1.2.6所述超声波法的最优条件进行处理,测其吸光值并计算总皂苷提取率。
2 结果与分析
2.1 常规水浴提取
按照1.2.3所述方法,称取1.000g绞股蓝干叶粉末3份,做3次平行试验,分别显色后测定吸光值,计算得绞股蓝皂苷平均提取率为4.180%。
2.2 单一酶法提取的单因素试验
2.2.1 酶用量对皂苷提取率的影响
图1可知,酶用量从0.2%至0.4%,皂苷得率显著提高,后趋于平缓,说明0.4%的酶用量已能将样品最大程度酶解。考虑到工业上生产成本问题,选用0.4%的酶用量较适宜。
2.2.2 溶剂pH对皂苷提取率的影响
由图2可见,在其余条件相同的情况下,当溶剂pH为5.0时,皂苷提取率达到最高,说明pH5.0为所用纤维素酶的最适pH。
2.2.3 酶解温度对皂苷提取率的影响
由图3可知,在其他条件相同的情况下,50℃酶解的皂苷提取率高于其他温度,说明50℃为所用纤维素酶的最适温度。
2.2.4 酶解反应时间对皂苷提取率的影响
由图4可见,当酶解时间达到120min时,分解趋于完全,皂苷大部分已溶出,随着反应时间的延续,其皂苷的提取率增加幅度不明显,因此酶解时间选择120min较合适。
2.3 酶法提取的正交试验
由表2可知,单一酶法中各因素对皂苷提取率的影响程度为:溶剂pH>酶解温度>酶解反应时间>酶用量,再结合各因素的K值,得出最佳组合为A2B2C2D3,即酶用量0.6%(m/m),酶解温度50℃,溶剂pH 5.0,酶解反应时间140min。以此最佳条件进行3次重复试验,得绞股蓝总皂苷提取率为5.577%。
2.4 单一超声波法提取
按1.2.6所述方法,在固定料液比1∶25的条件下,分别用功率为190W、285W的超声波处理不同时间,测得皂苷提取率,结果见图5。
由图5可知,用功率为190W的超声波进行处理时,随着反应时间的延长其皂苷提取率逐渐提高,当反应时间超过20min以后,提高的幅度趋于平缓;而用285W超声波进行处理时,随着时间的延长,得率下降,这可能是由于超声波强度过大会导致溶出的杂质增多,产生干扰,或者是高强度超声波对绞股蓝皂苷结构有一定的破坏作用,这与林硕等[6]的研究结果相符。有鉴于此,又考虑到超声时间长耗能增加,因此选择功率190W的超声波处理20min为最佳方案。
2.5 超声波协同酶法提取
2.5.1 超声波后酶解处理:
按照2.4中超声波法的最佳提取条件,即功率190W的超声波处理20min后,再按照2.3中酶法正交试验的最佳提取条件处理,即酶用量0.6%(m/m),酶解温度50℃,溶剂pH 5.0,酶解反应时间140min,测定吸光值,计算出绞股蓝总皂苷提取率为6.566%。
2.5.2 酶解后超声波处理:
先按照2.3中酶法正交试验的最佳提取条件处理后,再按照2.4中超声波法的最佳提取条件处理后,测定吸光值,得出皂苷提取率为7.494%。
2.6 几种提取方法的比较
表3表明,超声波和纤维素酶对总皂苷的提取都有明显的促进作用,而采用超声波协同酶法促进效果更为明显,其中酶解后超声波处理比先超声波后酶解的处理方法的绞股蓝总皂苷提取率更高,达到7.494%,分别比常规水浴法、单一酶法、单一超声波法提高了79.28%、34.37%、43.04%。
3 讨论
先酶解再用超声波处理,其提取率高于先超声波再酶解的处理方法,这是因为在纤维素酶的作用后,细胞壁上的纤维素被部分降解,有的细胞壁已经破裂,再用超声波处理时,更加有利于细胞内皂苷的溶出[11]。
本研究首次采用纤维素酶与超声波协同的方法提取绞股蓝总皂苷,其提取率明显高于常规水浴法,也高于单一酶法和单一超声波法,这与王万能[11]等运用超声波协同酶法提取豆粕异黄酮的结论一致。其中,以料液比1:25,酶用量0.6 %(m/m),溶液pH 5.0,50℃酶解140 min,灭酶15 min后,用超声波(190W,处理3s,间歇3s)于冰水混合物中处理20min为最佳的工艺条件,其皂苷得率为7.494%。
绞股蓝皂苷 篇3
对人参皂苷和人参皂苷元抗肿瘤作用的构效关系研究发现,苷元的活性强于皂苷[3,4,5]。
有人报道已从绞股蓝皂苷酸水解产物中发现了人参二醇、2α-羟基人参二醇[6,7]和(20R,25S)-12β,25-环氧20,26-环达玛烷-2α,3β-二醇[8]。本课题组首次发现并报道[5]的具有显著抗肿瘤活性的原人参二醇型皂苷元衍生物20(R)-达玛烷-3,12,20,25-四醇。人参二醇虽然已经有报道,但没有确定C-20的构型,所以本实验发现的20(S)-人参二醇也是在该水解产物中首次发现。为了寻找新的具更强活性的成分,本研究采用了酸水解法进行水解,通过硅胶柱层析法分离和重结晶纯化及波谱数据的测定,鉴定5个化合物的化学结构分别为20(R)-原人参二醇(Ⅰ),20(S)-人参二醇(Ⅱ),拟人参皂苷-F11(Ⅲ),20(R)-达玛烷-3β,12β,20,25-四醇(Ⅳ)和20(R)-达玛烷-3β,6α,12β,20,25-五醇(Ⅴ)。化合物Ⅰ~Ⅴ均为首次在绞股蓝皂苷的水解产物中发现。化合物Ⅳ为本课题组从人参果皂苷中首次发现和报道的具有显著抗肿瘤活性的原人参二醇型皂苷元衍生物。
1 仪器与试药
旋转蒸发仪RE-52A(上海亚荣生化仪器厂),恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司),三用紫外灯UV-8(无锡科达仪器厂),Yanaco MP-S3显微熔点测定仪(温度计未校正,日本岛津公司),核磁共振波谱仪(Bruker-ARX-300,TMS作内标),硅胶G(200-300目,青岛海洋化工厂),硅胶H(中国医药上海化学试剂公司),所用液体试剂均为分析纯。
绞股蓝总皂苷购于湖南九汇现代中药有限公司(总皂苷含量>80%);核磁共振谱由沈阳药科大学测试中心代测。
2 酸解物的制备与分离
按参考文献[13]的水解方法制得绞股蓝总皂苷的水解产物。取水解样品进行硅胶(200-300目)柱层析,用石油醚-丙酮(10:1、4:1、2:1、1:1)进行梯度洗脱,每流份400mL,共收集130个流份。流分11经重结晶得化合物Ⅱ;流分23~25,进行硅胶(200~300目)柱层析,得流分A~G,流分B经重结晶得化合物Ⅰ,流分F经重结晶得化合物Ⅳ;流分52~60,进行硅胶(200~300目)柱层析,得流分H~N,流分H经重结晶纯化等方法得化合物Ⅲ,流分M经重结晶纯化得化合物Ⅴ。
3 化合物的结构鉴定
化合物Ⅰ:白色针晶(丙酮),mp261~263℃,Liebermann-Barchard反应呈阳性,Molish反应呈阴性。13C-NMR给出30个碳信号,无糖端基碳信号。2个烯碳信号可归属为C-24(126.1)和C-25(130.7);3个连氧碳信号分别归属为C-3(78.0),C-12(70.9) 和C-20 (73.0)。根据C-17,C-21,C-22的化学位移值(δ50.5,22.6,43.3),说明其C-20为R构型。13C-NMR(300MHz,C5D5N)δ39.0(C-1),28.3(C-2),40.0(C-4),56.4(C-5),18.8(C-6),35.3(C-7),37.4(C-8),50.5(C-9),40.1(C-10),31.5(C-11),49.3(C-13),51.8(C-14),32.3(C-15),26.7(C-16),16.5(C-18),16.4(C-19),22.8(C-23),25.8(C-26),17.7(C-27),28.7(C-28),15.8(C-29),17.4(C-30)。以上碳谱数据与文献[3]报道的20(R)-原人参二醇的碳谱数据对照,二者基本一致。与其已知对照品共薄层,二者Rf值相同。故确定化合物Ⅰ为20(R)-原人参二醇[20(R)-protopanaxadiol]。
化合物Ⅲ:白色针晶(丙酮),mp263~265℃,Liebermann-Barchard反应呈阳性,Molish反应呈阴性。13C-NMR给出30个碳信号,无烯碳信号。两个连氧碳信号δ80.2(C-20)和85.1(C-24)是Octilo型人参皂苷元五元含氧环的特征信号。13C-NMR(300MHz,C5D5N)δ38.9(C-1),28.4(C-2),77.9(C-3),40.6(C-4),61.4(C-5),67.2(C-6),47.0(C-7),39.9(C-8),50.0(C-9),38.3(C-10),32.4(C-11),70.7(C-12),48.9(C-13),51.6(C-14),32.0(C-15),25.6(C-16),47.9(C-17),17.9(C-18),17.3(C-19),26.7(C-21),31.4(C-22),27.6(C-23),69.9(C-25),27.2(C-26),25.0(C-27),31.2(C-28),16.1(C-29),16.7(C-30)。以上碳谱数据与文献[10]报道拟人参皂苷元的碳谱对照,二者基本一致。与其已知对照品共薄层,二者Rf值相同。故确定化合物Ⅲ为拟人参皂苷元-F11[24(R)-Ocotillo1]。
化合物Ⅳ:白色针晶(甲醇),mp252~254℃,Liebermann-Barchard反应呈阳性,Molish反应呈阴性。13C-NMR给出30个碳信号,无不饱和碳信号。通过与 20(R)-PPD[20(R)-原人参二醇]的13C-NMR数据比较,可确定C-3,C-12和C-20的3个连羟基碳信号分别为δ78.0,δ70.9和δ73.4,由C-5(δ56.4)和C-6(δ18.8)以及其他非连氧碳信号,据此推测此化合物为原人参二醇型皂苷元。δ18.8,45.6,30.0和30.2可分别归属为C-23、C-24、C-26和C-27,因此确定另一含羟基的δ69.7为C-25;根据C-17,C-20和 C-21的化学位移分别为δ50.9,73.4和22.9,说明C20-OH为R构型。13C-NMR(300MHz,C5D5N)δ39.6(C-1),28.3(C-2),78.0(C-3),39.4(C-4),56.4(C-5),18.8(C-6),35.3(C-7),40.1(C-8),50.6(C-9),37.4(C-10),32.3(C-11),70.9(C-12),49.4(C-13),51.8(C-14),31.3(C-15),26.7(C-16),50.9(C-17),16.3(C-18),16.5(C-19),44.1(C-22),28.7(C-28),15.9(C-29),17.4(C-30)。进一步与文献碳谱数据[11]比较,基本一致,故鉴定该化合物为20(R)-达玛烷-3β,12β,20,25-四醇[20(R)- dammarane-3β,12β,20,25-tetrol]。
化合物Ⅴ:白色方晶(甲醇),mp246~248℃,Liebermann-Barchard反应呈阳性,Molish反应呈阴性。13C-NMR给出30个碳信号,无不饱和碳信号。4个连氧碳信号δ78.4(C-3),δ67.7(C-6),δ70.9(C-12),δ73.3(C-20)以及C-5位信号δ61.8,据此推测此化合物为原人参三醇型皂苷元。δ18.7,45.6,29.9和30.2可分别归属为C-23,C-24,C-26和C-27,因此确定另一羟基碳δ69.8归属为C-25;根据C-17,C-20和 C-21的化学位移分别为δ50.8、22.7和44.0,说明C20-OH为R构型。13C-NMR数据与文献[12]报道的20(R)-人参五醇的碳谱数据比较,二者基本一致,与已知对照品共薄层,二者Rf相同。故确定化合物Ⅴ为20(R)-达玛烷-3β,6α,12β,20,25-五醇[20(S)-dammarane-3β,6a,12β,20,25-pentol (25-OH-PPT)]。
化合物Ⅱ:白色针晶(丙酮),mp257~259℃,Liebermann-Barchard反应呈阳性,Molish反应呈阴性。13C-NMR给出30个碳信号,无烯碳信号。C-5 (δ56.4)和C-6(18.8)说明母核为原人参二醇型皂苷元。根据C-17,C-21,C-22的化学位移值(δ55.0,19.6,35.8),提示C-20的构型为S型。13C-NMR(300MHz,C5D5N)δ39.3(C-1),28.3(C-2),78.0(C-3),39.6(C-4),35.3(C-7),40.1(C-8),51.4(C-9),37.4(C-10),31.3(C-11),70.2(C-12),49.9(C-13),50.3(C-14),31.3(C-15),25.4(C-16),16.4(C-18),16.5(C-19),76.9(C-20),16.5(C-23),36.5(C-24),73.0(C-25),33.2(C-26),27.3(C-27),28.7(C-28),15.9(C-29),17.3(C-30)。与文献[9]报道的碳谱数据对照,二者基本一致。与已知对照品共薄层,二者Rf值相同。故确定化合物Ⅱ为20(S)-人参二醇[20(S)-panaxadio1]。
摘要：目的:研究绞股蓝总皂苷(Gynostemma pentaphfllum(Thunb)Makino.)水解产物的化学成分。方法:采用盐酸水解法制备水解产物,通过硅胶柱层析法进行分离、重结晶纯化,理化常数和波谱数据分析测定。结果:从绞股蓝水解产物中分离得5种化合物,分别鉴定为20(R)-原人参二醇(Ⅰ),20(S)-人参二醇(Ⅱ),拟人参皂苷元-F11(Ⅲ),20(R)-达玛烷-3β,12β,20,25-四醇(Ⅳ)和20(R)-达玛烷-3β,6α,12β,20,25-五醇(Ⅴ)。结论:化合物Ⅰ～Ⅴ均为首次在绞股蓝总皂苷水解产物中发现。化合物Ⅳ为本课题组从人参果皂苷中首次发现和报道的具有显著抗肿瘤活性的原人参二醇型皂苷元衍生物。
绞股蓝皂苷 篇4
1 实验方法[1,2,3]
1.1 仪器、材料
752型紫外可见分光光度计 (上海仪器厂) ;10万分之一电子天平 (上海仪器厂) ;恒温烘箱 (沈阳利港净化设备厂) 。平肝降脂胶囊 (解放军第102医院制剂中心, 批号070622、070702、070703) ;对照品人参皂苷Rb1 (中国药品生物制品检定所, 批号:110704-200217) ;大孔吸附树脂AB28 (天津南开大学化工厂) ;甲醇、乙醇、正丁醇、乙醚、高氯酸、香草醛等均为分析纯。
1.2 对照品试液的配制
精密称取人参皂苷Rb1对照品2.04 mg, 加甲醇制成每1 ml含人参皂苷Rb11.02 mg的溶液, 作为对照品溶液。
1.3 测定波长的确定
精密吸取供试液10 μl, 人参总皂苷对照品溶液50 μl (1.02 mg/ml) , 分别置具塞试管中, 在60℃水浴中蒸干, 加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 ml, 高氯酸0. 8 ml, 摇匀, 密塞, 于60℃水浴中加热15 min, 取出立即用冰水冷却, 加冰醋酸5 ml, 摇匀, 于400～800 nm波长处扫描测定吸收度, 结果均在550 nm处有最大吸收波长, 故选择550 nm为测定波长。
1.4 空白干扰试验
精密吸取甲醇液60 μl, 置具塞试管中, 在60℃水浴中蒸干, 加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 ml, 高氯酸0.8 ml, 摇匀, 密塞, 于60℃水浴中加热15 min, 取出立即用冰水冷却, 加冰醋酸5 ml, 摇匀, 用以上试剂为空白在550 nm波长处测定吸收度, 结果显示阴性无干扰, 图谱见附录。
1.5 标准曲线的绘制
精密吸取人参皂苷Rb1对照品 (1.02 mg/ml) 50、100、200、300、400、500 μl置具塞试管中, 操作方法同“三”步骤, 于550 nm处测定各A值, 结果见表1。
以对照品含量为横坐标, A值为纵坐标绘制标准曲线, 曲线如下:
2 结果
人参皂苷Rb1对照品含量在51～510 μg间与吸光度成线性关系, 计算回归方程为:A=0.0025C-0.0016;r=0.9998。
2.1 精密度试验
取同一份对照品5份, 分别在550nm处测其吸光度, 结果RSD为1.12%, 仪器精密度良好, 数据见表2。
结论:仪器精密度良好。
3 工艺参数的考察和优化[1,2]
3.1 大孔吸附树脂的选择及前处理
参考相关文献[25]本实验选用AB28型大孔吸附树脂, 以乙醇湿法装柱, 继而用95%乙醇洗脱, 不时检测流出的乙醇, 当流出的乙醇与水 (1 ∶ 1) 混合不呈白色混浊即可, 然后用大量的蒸馏水洗至无醇味, 称取树脂时以树脂预处理后的质量 (g) 为单位备用。
3.2 上柱液的制备
取装量差异项下的本品内容物 (批号:070622) , 研细, 取约12.5 g, 精密称定, 加蒸馏水适量使溶解, 过滤, 定容至500 ml。
3.3 洗脱溶酶的确定
考察不同体积分数的乙醇洗脱对绞股蓝总皂苷提取效果的影响。将绞股蓝总皂苷提取液通过树脂柱 (2 cm×10 cm) 。洗脱时分别用4BV的20%、40%、60%、70%、80%、95%及无水乙醇洗脱皂苷类成分, 将洗脱液分别蒸干, 用甲醇溶解并定容, 分别测定洗脱液中绞股蓝总皂苷的含量。结果见图2。
由以上结果可知, 随着乙醇含量的提高, 皂苷的含量相应的提高。但是, 70%、80%、95%、无水乙醇的差别不是很大, 再从经济角度考虑, 选择70%醇作为洗脱溶剂。
3.4 70%乙醇洗脱量的确定
将绞股蓝提取液约15 ml通过树脂柱 (2 cm×10 cm) 。静置30 min后, 先用3BV蒸馏水洗至流出液Molish反应呈阴性, 再用4BV70%乙醇依次洗脱, 洗脱液流速1 ml/min, 以1BV为1份, 共收集4份, 按上述高氯酸-香草醛显色方法测定绞股蓝总皂苷的含量。结果见表3。
结果显示, 2BV洗脱溶媒绞股蓝总皂苷的累计百分含量达96%。基本洗尽, 故确定洗脱溶媒为20 ml。
3.5 最佳上柱量的确定
分别吸取绞股蓝总皂苷提取液5、8、12、15、20、25、30 ml上大孔吸附树脂柱 (2 cm×10 cm) , 过柱流出液重吸附3次, 且静置30 min, 依次用3BV蒸馏水、2BV70%乙醇溶液梯度洗脱, 收集70%乙醇洗脱液, 按上述高氯酸-香草醛显色方法测定绞股蓝总皂苷的含量。结果显示, 20 ml上柱量为饱和上柱量, 超过20 ml即超过了树脂的吸附容量, 因此, 20 ml为最佳上柱量。
3.6 最佳吸附时间的确定
分别吸取绞股蓝总皂苷提取液20 ml上大孔吸附树脂柱 (2 cm×10 cm) , 过柱流出液重吸附3次, 分别静置5、15、30、60 min, 依次用3BV蒸馏水、2BV70%乙醇溶液梯度洗脱, 收集70%乙醇洗脱液, 按上述高氯酸-香草醛显色方法测定绞股蓝总皂苷的含量。结果显示, 静置30 min后洗脱最佳。
4 实验结论
样品水溶液上AB28大孔吸附树脂, 上样量为20 ml 静置30 min, 以3BV水洗脱后, 再以2BV70%乙醇洗脱可以达到理想的结果。
按上述试验结论, 取装量差异项下的本品内容物, 研细, 三批各取约12.5 g, 精密称定, 加蒸馏水适量使溶解, 过滤, 分别定容至500 ml, 按上述结果进行柱分离, 收集洗脱液, 过滤, 蒸干, 用甲醇定容至10 ml, 即得三份供试液, 备用。
参考文献
[1]林霞, 郭伟.大孔吸附树脂在天然药物皂苷成分研究中的应用.卫生职业教育, 2006, 19 (3) :79-80.
[2]田其学, 唐正平.绞股蓝口服液中绞股蓝总皂苷的含量测定.湖南中医杂志, 17 (3) :52-53.