NFκB论文（精选8篇）
NFκB论文 篇1
核转录因子(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一个具有多向性转录调节作用的序列特异性DNA结合蛋白家族。细胞内外的许多刺激信号都能够激活NF-κB,从而启动多种活性物质(如细胞因子、黏附分子、炎性因子、免疫相关受体等)的基因表达,参与许多病理过程的发生与发展。
1 NF-κB蛋白与NF-κB信号通路
NF-κB蛋白家族广泛存在于真核细胞中,分为两类共5个亚单位,分别为Rel(cRel)、p 6 5(RelA,NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。所有的NF-κB蛋白在N末端共享一个Rel同源域,负责与DNA的结合、形成二聚体以与相应蛋白的交互作用。Rel类蛋白在C末端有一个反式激活结构域[1],可直接作用于转录设备而激活基因转录。因此,缺少该反式激活机构域的p50(NF-κB1)和p52(NF-κB2)就无法激活基因转录,只能作为一种抑制性分子存在于细胞内。p50和p52蛋白拥有大型前体,被称为p105和p100,它们在C末端通过蛋白酶体途径和退化的锚蛋白重复转化为成熟的NF-κB蛋白p50和p52[2]。通过五个不同亚单位的活动,NF-κB以不同的二聚体形式对不同的基因表达进行相应调节[3]。
NF-κB信号通路包括NF-κB二聚体、IκB蛋白因子、IκB激酶、受体及其近端信号衔接蛋白。在正常细胞中,大部分的NF-κB二聚体通过与细胞质中的3个IκB因子(IκBα、IκBβ、IκBε)中的某一个结合并以无活性的状态存在[4],这种失活状态使其不能发挥调节作用[5]。当细胞受到外界刺激后,IκB激酶被激活,IκB因子发生磷酸化、泛素化,进而从NF-κB二聚体上解离使NF-κB二聚体得到释放,通过各种修饰作用后NF-κB被激活并进入细胞核中,与DNA链上的特异部位结合,启动基因转录,从而发挥生物效应。根据激活NF-κB信号通路的二聚体不同,可以将其激活途径分为经典和非经典通路[6]。经典通路即前述IκB蛋白降解激活p65/p50NF-κB二聚体通路,非经典通路则是通过前体P100到P52的加工处理从而激活信号通路,如CD 40配体、B细胞活化因子能够通过激活NF-κB激酶和IKKα激活非经典通路[7]。此外,某些其他机制也可激活NF-κB通路,如紫外线光可通过激活丝裂原活化蛋白激酶P38、酪蛋白激酶Ⅱ等通路激活P65[8]。
2 动脉粥样硬化炎症机制
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)以病灶内有大量脂质和坏死细胞形成的“粥样”成分为特征,其发病机制复杂,迄今为止已有血栓形成、脂质浸润、损伤反应、氧化应激等多种学说,但仍不能全面揭示该病发病机制[9]。1999年Ross首次提出动脉粥样硬化是一种炎性疾病[10]。该学说由损伤反应学说发展而来并得到广泛认同。目前认为,动脉粥样硬化是一个大量炎症细胞和炎症介质参与其中的慢性炎症过程。
研究表明:动脉粥样硬化与多种炎症细胞相关。包括巨噬细胞、淋巴细胞等。在动脉粥样硬化过程中,巨噬细胞可通过分化而表达多种受体,最经典的为清道夫受体(SRs)。活化的巨噬细胞可通过清道夫受体吸收氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),造成以胆固醇为主的脂类物质聚集,同时吸收的ox-LDL又可阻止巨噬细胞内的胆固醇外流,胆固醇在巨噬细胞内的聚集使巨噬细胞转变为泡沫细胞[11]。此外,大量研究证实:淋巴细胞在AS的发展过程中起到重要作用[12]。斑块中含有大量T细胞,以CD4+T细胞为主,其余包括T细胞1型(Th1)、2型(Th2)等辅助细胞。两类辅助细胞可分泌大量细胞因子,两者之间相互作用相互抑制,共同参与AS过程[13]。近年研究表明:T细胞亚型Th17以及调节性T细胞Treg等都对动脉粥样硬化疾病发展具有重要作用。
除炎症细胞外,大量研究证实了细胞因子、黏附分子、趋化因子等炎症介质参与了AS。如C反应蛋白(CRP)可通过活化单核细胞源性树突细胞并诱导T细胞活化从而在AS发展过程中发挥作用[14]。血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、选择素等可介导炎症细胞与血管内皮细胞的黏附,进而损伤内皮细胞[15]。此外,白细胞介素、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等多种细胞因子间的相互作用可促进黏附分子的表达、炎症细胞的聚集,从而增加了AS的发病风险。
3 NF-κB与动脉粥样硬化炎症机制
3.1 NF-κB与炎症反应
中性粒细胞聚集是炎症产生的重要介质,在这一过程中NF-κB发挥了重要作用。NF-κB负责多种炎症细胞因子和趋化因子的基因转录,如TNF-α,产生的TNF-α作用于血管内皮细胞,促使白细胞聚集;同时也可反向激活NF-κB。又如通过NF-κB通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,激活IKKβ、P38和c-Jun氨基末端激酶,单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和巨噬细胞炎性蛋白B(MIP-1B)在CD+14单核细胞上得以表达,从而导致滑囊炎的发生与发展[16]。此外,NF-κB调节黏附分子的表达,从而促使循环中黏附分子向白细胞相应感染部位外渗[17]。
NF-κB介导的炎症反应过程通常分为4个阶段:潜伏阶段、诱导阶段、应答阶段和消退阶段。在潜伏阶段,NF-κB活化引起相应细胞因子如白介素、黏附分子的基因进行低量的表达。在诱导阶段,各类促炎因子、整合素、TNF-α等诱导物刺激NF-κB的活化,与NF-κB的各个亚单位形成复杂混合物,从而完成各类蛋白的表达,即应答阶段。所表达的蛋白同样能活化NF-κB,最终形成恶性循环。消除这种恶性循环的首要方法就是使炎症消退,使促炎因子浓度降低,减少NF-κB的活化,使其表达逐渐减退,才能防止炎症反应产生不利后果[18]。
NF-κB同样可参与抗炎过程。例如NF-κB可促进产生内在抑制因子肝细胞生长因子(HGF),该因子具有抗炎作用[19]。实验研究表明:HGF可有效抑制NF-κB信号通路的阻断,同时抑制NF-κB介导的黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达从而抑制白细胞聚集[20]。
3.2 NF-κB与动脉粥样硬化
NF-κB在动脉粥样硬化的发生、发展过程中起重要作用。有研究表明动脉粥样硬化病变斑块部位可见激活的NF-κB[21]。内皮细胞的活化和促炎因子的表达均需要NF-κB信号通路的调节作用[22]。
NF-κB可通过调控细胞因子的表达参与调节动脉粥样硬化斑块形成,包括组织因子(TF)、基质金属蛋白酶(MMPs)和炎性细胞因子等[22]。内皮细胞上NF-κB的表达诱导炎症反应,产生的白细胞介素-1(IL-1)、TNF-α、CD40、氧化型低密度脂蛋白等因子促使血管炎症负担长期放大,从而促进动脉粥样硬化的形成。如内皮细胞上的NF-κB通过JNK-ATF2通路刺激炎症反应,干扰动脉血液流动[23]。此外NF-κB的表达可影响到血管黏附分子VCAM-1、选择素P、选择素E,造成内皮细胞的损伤;损伤的内皮细胞释放单核细胞趋化蛋白-1,这一过程同样受到NF-κB的调控,进而启动了MCP-1mRNA的转录和表达[24]。MCP-1与单核细胞表面的趋化因子CCR2结合,促使单核细胞趋化黏附,进而形成泡沫细胞。
炎症介质可反向刺激NF-κB。如高浓度的氧化低密度脂蛋白可抑制NF-κB激活炎症反应从而具有免疫抑制作用[25]。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可与AT1受体结合后,激活血管内皮细胞膜上的NADP/NADPH氧化酶,产生超氧阴离子,诱发血管平滑肌发生慢性炎症反应,使NF-κB活化,从而影响动脉粥样硬化[26]。此外,有研究发现NF-κB可被C反应蛋白激活,进而引起纤溶酶原激活抑制因子-1的表达明显增加[27]。
4 结语
NF-κB通路是动脉粥样硬化发病机制中的一个关键转导通路,NF-κB通过调节炎性因子的基因表达参与AS过程中的炎症反应。作为重要的免疫调节因子,NF-κB在动脉粥样硬化炎症机制中的作用为临床治疗提供了新的思路。已有相当一部分NF-κB通路抑制剂被应用于临床试验。如低浓度的番茄红素可有效降低动脉中层厚度,因此一定量的番茄红素摄入可减少心血管疾病和癌症的发生[28]。另有研究证实在内皮细胞中,强心苷、洋地黄毒苷可通过tak-1/IKK通路阻断NF-κB从而产生抗炎和血管保护作用[29]。由此可见,作为一个新型的抗炎靶点,NF-κB将成为未来治疗动脉粥样硬化的研究热点。尽管可作为新型治疗靶向,NF-κB通路可与其他通路进行整合,对机体进行整体调节,因此不能完全对该通路进行抑制。在动脉粥样硬化的发生、发展过程中,NF-κB通路的每一过程都需更加深入的研究。
NFκB论文 篇2
【关键词】 关节炎，胶原诱导性；寒痹康汤；核转录因子-κB
Influence of Hanbikang Decoction on the Expression of NF-κB in Synovial Cells of Collagen-Induced Rats with Rheumatoid Arthritis
Pang Xue-feng，Wang Qian，Wu Yan-hong，Tang Li-ping，Huang Chan-juan，Peng Zhong-yi，Liu Huan，Long Chao-yang，Pan Yan，Li Yu-ling
【ABSTRACT】 Objective：To observe the effect of hanbikang decoction on the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis to probe the mechanism of it in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：Bovine collagen type II and freund's incomplete adjuvant were used to induce rat model with arthritis to observe the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis with methotrexate as the control group.Results：Hanbikang decoction could reduce the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis，with almost the same function as methotrexate.Conclusion：Hanbikang decoction could influence the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis，being one of the mechanisms in the treatment of rheumatoid arthritis.
【Key words】 arthritis，collagen-induced；hanbikang decoction；NF-κB
类风湿关节炎（rheumatiod arthritis，RA）主要是机体对自身滑膜发生免疫反应的疾病，在RA的病理机制中，核转录因子-κB（NF-κB）的异常活化与滑膜组织炎性增生及其对关节局部组织的侵蚀密切相关。本研究采用牛Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）和弗氏不完全佐剂诱导大鼠关节炎模型（CIA），观察寒痹康汤对滑膜细胞NF-κB表达的影响，探讨寒痹康汤治疗RA的机理。
1 实验材料
1.1 实验动物 60只Wistar大鼠，雌性，体质量（100±10） g，购于广西中医药大学实验动物中心。
1.2 实验试剂 牛II型胶原蛋白、弗氏不完全佐剂购于Chondrex（美国）公司；NF-κBp65兔抗体、SP-9000/9001/9002 HistosainTM-Plus Kits免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒及ABC复合物试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 实验药品 寒痹康汤（组方：秦艽、防风、黄芪、附子、麻黄、当归、淫羊藿、狗脊、青风藤）由广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心制备提供。甲氨蝶呤由上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产（生产批号20070121）。
2 方 法
2.1 造模及分组 60只大鼠适应性喂养7 d后，从中随机取10只为正常对照组，其余大鼠参照文献资料[1]方法造模：在无菌条件下，用0.1 mol·L-1冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白，浓度为4 mg·L-1，
置4 ℃冰箱过夜后，再与等体积弗氏不完全佐剂
（1 mg·mL-1）混合、震荡至充分乳化，制成CII乳剂，置4 ℃冰箱保存备用。实验时分别在每只大鼠颈、背部进行多点皮内注射0.25 mLCII乳剂致炎，14 d后再次按上述方法和剂量进行免疫。免疫成功后（评分4分以上）随机分为模型组、甲氨蝶呤组、寒痹康汤高剂量组、寒痹康汤中剂量组、寒痹康汤低剂量组5组，每组10只。
2.2 给 药 正常对照组自由饮食，模型组以生理盐水2 mL·（100g）-1灌胃，每日1次；甲氨蝶呤组灌服甲氨蝶呤药液2.7 mg·kg-1（为70 kg成人临床用药3倍），每只灌服约0.405 mg，每周灌服1次；寒痹康汤高、中、低剂量组，分别以寒痹康汤（含生药16 g·kg-1、8 g·kg-1、4 g·kg-1）
2 mL·（100g）-1，每日分2次进行灌胃。
2.3 检测项目
2.3.1 关节肿胀指数 参照文献资料[2]采用0～4级关节评分法进行评分。0分：无关节炎；1分：小趾关节轻度肿胀；2分：小趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内全部关节肿胀。关节指数积分越高，关节症状越严重。评分4分以上为造模成功。
2.3.2 标本采集 正常对照组、模型组及各实验组大鼠灌胃治疗36 d后，腹腔内注射2%戊巴比妥钠注射液进行麻醉，逐层分离膝关节各层组织，采集滑膜组织，用甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度5 μm。
2.3.3 NF-κB的检测 石蜡切片常规脱蜡至水。PBS冲洗3次，每次3 min。滴加3% H2O2去离子水，37 ℃温箱孵育10 min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。滴加试剂A，37 ℃温箱孵育15 min，倾去，勿洗。滴加1∶200的NF-κB兔抗体，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次3 min，滴加试剂B，37 ℃温箱孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min，
滴加试剂C，37℃温箱孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min，DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，脱水、透明、中性树胶封片。用图像分析仪进行图像分析，测定其平均灰度值。
2.4 统计学方法 采用SPSS15.0软件进行统计分析，计量资料用表示，组间差异采用方差分析及t检验，以P < 0.05 为差异有统计学意义。
3 结 果
实验结果显示，模型组大鼠关节滑膜的NF-KBp65的阳性染色强度明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。经过甲氨蝶呤、寒痹康汤治疗36 d后，各治疗组的NF-κBp65的表达均下调，接近于正常水平，与正常对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。寒痹康汤组与甲氨蝶呤组比较，疗效相当，差异无统计学意义
（P > 0.05），见表1。
表1 各组大鼠滑膜NF-κBp65表达的平均吸光度值比较 组别动物数（只）NF-κBp65表达
正常对照组10 92±8
模型组10 163±11）
甲氨蝶呤组10 90±72）
寒痹康汤低剂量组10 89±72）3）
寒痹康汤中剂量组10 85±62）3）
寒痹康汤高剂量组10 83±52）3）
注 与正常对照组比较，1）P < 0.05，2）P > 0.05；3）与甲氨蝶呤组比较，P > 0.05
4 讨 论
RA主要是机体对自身滑膜发生免疫反应的疾病，其病理改变主要为滑膜组织的增生、炎性细胞浸润、血管翳形成以及骨和软骨进行性不可逆性破坏，其中血管翳的形成为一重要的中间环节。滑膜巨噬细胞、淋巴细胞凋亡受抑制是RA滑膜增生的重要因素，TNF-α的作用在此过程至为关键，它通过与TNFR结合使NF-κB信号通路过度活化而启动抗凋亡信号，导致了多种抗凋亡分子的转录，进而抵抗由死亡受体或线粒体依赖途径引发的凋亡。
NF-κB是普遍存在的真核细胞转录因子，在机体免疫反应和细胞增殖等方面发挥中心调节作用。近年来的研究证明，许多疾病的发生和发展均与NF-κB过度激活有关。Yoshida S[3]等的研究表明NF-κB可能对血管形成具有核心的调节作用，并发现血管生成因子中TGF-β、TNF-α、IL-1α、IL-8等含有NF-κB的特异性结合位点，其表达受NF-κB的调控。Han等[4]的研究显示，在II型胶原诱导的大鼠关节炎，NF-κB的活化于免疫后20 d明显增高，在临床症状出现前1～2周，滑膜胶原酶MMP-13及备解素MMP-3基因的表达至第35天才逐步升高。还有研究表明，在大鼠的胶原性关节炎及佐剂性关节炎中均证明NF-κB的表达先于临床症状出现[5]。Benito等[6]采用免疫组织化学及凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）对早期RA患者关节组织的配对研究显示，在软骨与血管翳交界部位（CPJ），NF-κB阳性细胞绝对值显著高于关节内其他非CPJ部位，提示NF-κB与血管翳生成、关节软骨侵蚀密切相关。因此，NF-κB已成为RA治疗颇有吸引力的靶点和研究热点。
寒痹康汤是笔者治疗活动期RA的经验方，具有补益肝肾、益气温经、祛风除湿止痛之功效。应用秦艽汤及寒痹康冲剂治疗不同证型的RA患者，能明显改善患者症状，并可明显下调RA患者升高的TNF-α及IL-1β的水平[7-8]。动物实验亦表明，寒痹康汤能改善大鼠关节肿胀指数，诱导实验性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡[9]。
本研究表明，寒痹康汤能下调胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞NF-κB的表达，作用与甲氨蝶呤相当，进一步阐明了寒痹康汤治疗RA的作用机理。
5 参考文献
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NFκB论文 篇3
1 NF-κB系统概况
1.1 NF-κB家族及组成
NF-κB是Sen等1986年首次在成熟B细胞、浆细胞中发现的核蛋白[3]。随后的研究发现,NF-κB在组织细胞中广泛存在,成分并非单一,而是一个大家族。在哺乳动物细胞里,NF-κB家族是由五种相关转录因子构成的,它们是:p50(由p105裂解而来),p52(由p100裂解而来),p65(即RelA),c-Rel和RelB,该家族成员的N端均含有一段保守的300个氨基酸的DNA结合区,称为Rel同源结构域RHD,该区的9-10个碱基的配对,可形成同聚物和异聚物,继而调控基因表达。RelA(p65),c-Rel和RelB包含C端转录激活区(TADs),而p50(p105)和p52(p100)不包含C端TADs,所以p50和p52的同聚物抑制基因表达[4]。
该家族成员以一定的组合两两结合,形成不同的NF-κB转录因子。不同的二聚体与DNA结合的特异性位点不同,有的可以引起基因转录,有的抑制基因转录。典型诱导型的NF-κB异聚体是由p65和p50蛋白亚基组成的,一般意义上的NF-κB也常常指该异聚体。不同二聚体包含相互作用的DNA结合位点,在10个配对序列中会有轻微不不同,一般的序列结构为5′-GGGGYNNCCY-3′[5]。
1.2 IκB(NF-κB抑制物)家族及组成
IκB是具有多组锚蛋白重复结构的序列,通过该结构,IκB蛋白可以遮蔽NF-κB的核定位信号,使得复合物在细胞质中保持非活性状态。IκB家族相关蛋白具有N端调节结构域,与蛋白降解有关;其后6个以上的锚蛋白重复结构;C端附近有一个PEST结构,参与NF-κB在胞浆的定位[6]。在细胞激活过程中,IκB的32和36位残基被磷酸化,继而引发了泛素化作用和通过蛋白酶体的继发性的IκB的降解。IκB的降解又引起NF-κB的释放和一系列的基因转录[7]。
IκB家族有7个成员-IκBα,IκBβ,BCL-3,IκBε,IκBγ,和p100和p105。与p65/p50或p65/c-Rel聚合物结合的IκBα和IκBβ的结晶结构表明IκB蛋白仅遮蔽p65上的核定位信号NLS,而p50上的NLS仍然是可以进行作用的。p50上的NLS加上IκBα和p65上的NES(核输出信号)引起IκBα/NF-κB复合物在核内和胞质见来回运动。IκBα在该平衡中起到重要作用,是该家族的主要成员[8]。
1.3 IKK(IκB激酶)家族及组成
IKK是由三个亚基组成的异聚物,包括IKK-α和IKK-β亚基和一个调节亚基IKK-γ(也称作NEMO,是NF-κB活性必需分子)[9~11],而IKK-α和IKK-β亚基对于IκB的磷酸化非常重要,IKK-γ形成四聚体支架,使得两酶聚合物易于形成自磷酸化[12,13]。虽然IKK-γ对于酶的活性是必需的,但是其本身不是一种酶,而是调节主要的相关蛋白之间的相互作用。可能与酶上游酶复合物的激活有关。激活能力也可通过细胞核内IKK-β和其他酶对p65和p50的磷酸化进行调节[14,15]。
IKK-α和IKK-β有相似的结构与较高的同源性。IKK-α含745个氨基酸,IKK-β含756个氨基酸。IKK-α和IKK-β同源性为52%,N端的同源性高达64%,C端为44%[16]。
2 NF-κB信号转导过程
在大多数细胞中,静息状态下的NF-κB二聚体通常是以与其抑制物(Inhibitor of kappaB,IκB)家族成员结合,以无活性的形式存在于细胞质中。激活物通过介导IκB激酶(IKK)对IκB的磷酸化,继而发生泛素化变化和蛋白水解。NF-κB然后转移到细胞核上,通过与启动子中的NF-κB靶序列结合激活靶基因的转录[17]。
主要有以下两条途径:经典途径和非经典途径,也称可选择性途径。经典途径适用于大部分的NF-κB,包括p65,、c-Rel、RelB和p50。特别是p65/p50二聚物,多由肿瘤坏死因子TNF-α,白介素IL-1,脂多糖(LPS)和CD40L引发,较少由淋巴毒素和B细胞激活因子所引发。IKK-β对于IκBα在Ser32和Ser36和IκBβ的Ser19和Ser23的磷酸化是非常必要的。而IKK-α在该途径中的作用尚未明确[18]。通路的激活取决于IKK,IKK磷酸化IκB,使得它们的泛素化作用降低,并降解,最终引起NF-κB转移至细胞核,一些特异性的靶基因开始转录。该途径主要在内在免疫和炎症反应中发挥作用;而非经典途径涉及p100的加工和RelB/p52二聚物的核转位。p100通过IKK-α介导的C端的特异性的丝氨酸残基的磷酸化的NF-κB激酶(NIK)途径转变为成熟的p52。仅有部分的刺激因子可以通过该途径激活NF-κB,包括B细胞和B细胞激活因子,并且依赖于IKK-α同聚物。该途径对于次级淋巴器官的发展,B细胞的成熟和适应性的体液免疫是非常重要的[19~21]。
除以上途径外还有其他途径,如氧化应激等也能激活NF-κB通路,但只在少数敏感性细胞中存在该途径。
NF-κB在体内的激活也受到正,反精细的调控,其中反调控是主要的调控方式。一方面细胞外的TNF-α和IL-1β等基因的转录诱导NF-κB的活化,且NF-κB的活化再次增强TNF-α和IL-1β基因的转录,使TNF-α和IL-1β的产生和释放增多,进而基因再次激活NF-κB;另一方面,细胞内NF-κB和IκB互相激活对方,NF-κB活化后上调IκB的基因表达,抑制蛋白亚基的增加有助于将NF-κB限制在胞质中,下调核中NF-κB的活性,此为细胞内负调控的主要机制。正负反馈调节同时进行,共同参与人类的生理与病理过程。
3 NF-κB与疾病
NF-κB作用广泛,其过度激活与失活均会引起人类疾病。NF-κB的调节障碍可引起炎症性细胞因子增加,肿瘤的发生,凋亡异常等。与其相关的疾病主要分为炎症免疫系统疾病和肿瘤。
3.1 NF-κB与炎症、免疫系统疾病
许多与炎症和免疫反应关系密切的趋化因子、黏附因子、环氧合酶、金属蛋白酶和诱生型一氧化氮合酶等重要因子均含有κB位点,活化的NF-κB能与特定的κB位点结合,启动调节参与机体的炎症和免疫有关的基因转录,在机体的人炎症、免疫方面发挥重要作用。
NF-κB在心血管及许多炎症相关的疾病,如溃疡性结肠炎(UC),克罗恩氏病(Crohn’s disease),风湿性关节炎,系统性红斑狼疮,牛皮癣关节炎,巨细胞关节炎,Ⅰ型糖尿病,多发性硬化,乳糜泻,特发性血小板减少性紫癜和帕金森病等中发挥重要作用[22]。目前,也已针对相应病症取得一些进展[23]。
3.2 NF-κB与肿瘤
NF-κB具有抗凋亡、促细胞增殖和转移等作用。但其在最近的报道中表现出复杂性:在一些疾病中,NF-κB可以促进肿瘤的发生;而在另外一些疾病中表现为抑制癌症发生。但其非常详细的机制还有待后续研究。一些数据表明,敏感的肿瘤如口腔鳞状细胞癌,结直肠癌,肝癌,乳腺癌,骨髓瘤和淋巴癌等的发生具有NF-κB信号通路有很大关系[24]。
4 NF-κB与疾病的治疗
对NF-κB研究的不断深入为治疗这些疾病提供了新的思路。NF-κB是调控细胞反应的重要信号转录分子,因此参与NF-κB信号转导途径的各种蛋白质是治疗相关疾病的重要靶点。目前也已研制出一些药物用以干预NF-κB及其上下游信号通路,发挥治疗效果。
4.1 针对NF-κB的调控
Mackenzie等证明原矢车菊素B2在何杰金淋巴瘤中可以与对NF-κB蛋白相互作用,而抑制对NF-κB与DNA的相互结合,并该抑制作用呈现剂量依赖性[25]。另有实验表明,一些中药成分,如芍药苷等可以抑制NF-κB的表达,从而减轻由慢性脑血流灌注不足引起的大鼠大脑损伤[26]。
4.2 通过IκB抑制NF-κB
动脉壁的慢性炎症与动脉硬化的发展密切相关。Guo等从燕麦中分离得到的燕麦属苏氨酰胺和多酚类物质通过抑制IκB和IKK的磷酸化,降低相关蛋白酶体的活性,抑制NF-κB信号通路的激活,适当减轻动脉硬化的发展[27]。
4.3 通过抑制IKK而抑制NF-κB
Newton等发现PS-1145和ML120B可以作为IKK抑制物,作用于肺上皮细胞,发挥抗炎效应,可与传统的类皮质甾酮疗法疗法相互补充[29]。Folmer等发现两种萘并吡喃酮类化合物可以通过抑制IKK-β的活性,而完全抑制TNF-α引发的NF-κB的激活[30]。另外,Ziegelbauer等设计了一中小分子量的ATP抑制剂,该抑制剂通过抑制IKK-β的活性,进而抑制NF-κB的活性[28]。
4.4 其他抑制NF-κB的方法
通过抑制蛋白没小体也可达到抑制NF-κB的目的。蛋白酶抑制剂MG-132可以抑制NF-κB,选择性增强前列腺癌细胞对肿瘤放射的敏感性[31]。蛋白酶小体抑制药二肽硼酸类药物对多种细胞的生长有明显的抑制作用,并增强化疗药物的抗肿瘤作用[32]。另外抗氧化剂N-乙酰多巴胺二聚体可以抑制NF-κB的活性,但抑制机制尚不清楚[33]。
NFκB论文 篇4
2.1不同浓度TNFα诱导NF-κB核转位
高内涵数据分析如图1所示, 在静息状态下NF-κBnuc/cyt荧光强度比值<1, 显示此时NF-κB荧光信号主要分布在胞浆, 即NF-κB信号通路处于灭活状态;在TNFα因子刺激20min后, NF-κBnuc/cyt荧光强度比值增大, 表明NF-κB荧光信号在胞核分布增强;即TNFα诱导NF-κB发生核转位, NF-κB信号通路处于激活状态。同时, 随着TNFα浓度的增加, NF-κB nuc/cyt荧光强度比值也随之增加, 说明NF-κB核转位具有剂量依赖性, 这与已有文献报道一致[6]。
2.1对照干涉序列 (siIKKγ) 抑制TNFα诱导的NF-κB核转位
为实现高内涵技术应用于NF-κB相关信号通路的RNAi高通量筛选, 首先选择了TNFα信号通路的对照干涉序列siIKKγ进行体系验证。IKKγ是IKK复合体调节亚基, 为NF-κB 信号通路激活所必须[7]。高内涵成像结果显示在无TNFα刺激时, siControl与siIKKγ组的NF-κB蛋白质主要分布于胞浆 (图 2) ;在TNFα刺激20 min时, siControl组细胞NF-κB荧光信号在胞核出现强分布, 说明此时已发生NF-κB核转位, 但siIKKγ组只有少部分细胞在胞核出现强NF-κB荧光信号, 大部分为弱荧光信号, 甚至一小部分细胞与因子刺激前同为胞浆定位 (图 3) 。高内涵对nuc/cyt荧光强度分析的数据支持上述图像结果 (图 4) :在静息状态下, siControl与siIKKγ组的NF-κB nuc/cyt荧光强度比值均<1, 且差别无统计学意义;在TNFα刺激20 min时, siControl与siIKKγ组的NF-κB nuc/cyt荧光强度比值均增加, 但siIKKγ组增加的幅度明显低于siControl组, 在TNFα不同浓度下两组差别均有统计学意义。因此说明, siIKKγ抑制NF-κB入核, 即抑制TNFα信号通路。综上提示使用高内涵技术进行NF-κB相关信号通路的RNAi高通量筛选具有可行性。
3讨论
高通量筛选平台具有操作系统自动化、检测系统高灵敏性、数据处理高效性等特点, 因此在创新药物开发、功能基因研究等领域的应用日益突显, 推动了生物医学研究的发展。本实验应用高内涵筛选平台对TNFα刺激前后的NF-κB荧光信号进行量化, 通过nuc/cyt荧光强度比值表示NF-κB的细胞定位;并通过对照siRNA序列 (siIKKγ) 证明了使用高内涵技术进行NF-κB相关信号通路RNAi筛选的可行性。由于高内涵筛选是在因子刺激的早期检测NF-κB入核, 因此其优势在于可能更容易筛选得到信号通路直接的调控因子, 通过报告基因检测NF-κB转录活性则是一个长时间累积的效应。但是NF-κB核转位模型在应用于大规模RNAi筛选之前仍然需要更细致的模型评价, 比如Z’因子[8]以及更多的对照siRNA的评价等。
参考文献
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NFκB论文 篇5
1 血浆NF-κB水平及NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性概述
1.1 血浆NF-κB水平
NF-κB是1986年由Sen和Baltimore研究发现的, 其能与B细胞免疫球蛋白Κ轻链的ΚB序列进行特异性结合[6]。通常研究中所指的NF-κB是P65/P50异源二聚体, 一般情况下, NF-κB与抑制蛋白lΚB家族成员结合, 主要存在于胞质中, 呈现稳定状态而不参与转录的调控[7]。机体出现炎症、应激反应以及受到感染时, 机体内释放出的细胞因子会活化血浆NF-κB, 活化的血浆NF-κB可参与细胞生长、发育、增殖、凋亡以及炎症、肿瘤、免疫反应的发生以及发展, 同时对多种炎性因子进行调控及表达[8]。
1.2 NFκB1-94insel ATTG位点基因多态性
NFκB1基因存在于人4号染色体长臂24区 (4q24) , 其编码Rel蛋白家族的p50/p105, NFκB1基因包括启动子序列、24个外显子以及内含子序列[9], 基因共有6个突变位点, 其中位于启动子两个关键调控序列之间的-94位点是具有一定意义的突变位点, 主要因其插入或缺失4个碱基 (ATTG) 而形成基因多态性[10]。袁辉等[11]研究表明, NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性与NFKB1结合DNA的活性具有相关性, 同时NFκB1-94insdel ATTG位点多态性可影响炎性疾病的临床表现。另有国外学者对基因启动序列进行研究表明, NFKB1-94insdel ATTG多态性与自身免疫性疾病具有相关性[12]。
2 血浆NF-κB水平与NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性在动脉粥样硬化中的作用
动脉粥样硬化的实质是血管内皮细胞对损伤性因子的一系列炎性与增生反应, 可导致斑块表面纤维变薄, 同时导致斑块破裂及血栓形成, 引起急性冠状动脉事件[13]。血浆NF-κB水平的研究主要集中于反映动脉粥样硬化的标准物种, 对ACS患者血浆NF-κB水平变化研究较少。范亚欣等[14]对辽宁汉族人群NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性进行研究发现, 血浆NF-κB水平与动脉粥样斑块易损性密切相关, 可能是促进动脉粥样硬化的机制之一。动物实验表明, 血浆NF-κB水平与局部血流动力学有关, 通过研究小鼠动脉内皮细胞在层流、振荡流以及静止条件下的活性发现, 静止及振荡流中血浆NF-κB活性有增加趋势[15]。另有学者研究ATTG相关序列表明, 编码P50蛋白的NFκB1基因多态性与多种免疫炎性反应性疾病有一定关联性, 其中NFκB1-94insdel ATTG位点位于启动序列两个关键调控的序列之间, 是一类有意义的位点, NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性可通过直接或者间接作用达到调控细胞活性的目的, 从而影响疾病的生理病理过程[16,17]。
3 血浆NF-κB水平、NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性与ACS的相关性
近年来研究发现, 血浆NF-κB水平及NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性可作为ACS的诊断指标[18], NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性可影响NFκB1基因启动子结合蛋白的能力, 而等位基因不显示结合核蛋白的能力, 等位基因可以降低NFκB1基因转录活性, 从而抑制NFκB1基因编码P50, P50自身可以形成同源二聚体, 二聚体缺乏转录活性区域, P50/P50可以抑制TNF基因表达, 使P50表达减少, 对有效基因的表达起到抑制作用。Karban等学者研究发现, NFκB1-94insdel ATTG基因多态性对炎性因子具有调节作用[19]。目前研究表明, 血浆NF-κB水平及NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性可反映冠心病、ACS的发生及发展[20,21], 但仍需通过临床研究进一步证实。
4 血浆NF-κB水平、NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性与ACS危险因素的关系
冠心病、高脂血症、糖尿病及吸烟是影响冠心病的主要危险因素, 苏剑东等[22]通过研究NF-κB与细胞凋亡的关系发现, 大量吸烟 (>20支/d) 会引发冠心病, 血清胆固醇水平>250mg及吸烟与冠心病的关系最为密切。吸烟者血浆NF-κB水平明显高于不吸烟者, 提示吸烟可加重血管壁炎症。此外, 血浆NF-κB水平还可影响机体糖代谢及脂代谢, 可能与ACS患者动脉粥样斑块破裂有相关性, 血浆NF-κB水平可能成为诊断原发性高血压合并无症状性心肌缺血的有效检测指标之一[23]。高血压、高脂血症、糖尿病及吸烟可损害动脉血管, 易导致血管壁炎症, 而NFκB1-94insdel ATTG位点基因多态性与ACS危险因素间有无因果联系还有待进一步研究证明。
5 小结
NF-κB信号传导途径参与免疫细胞活化、增殖、分化、凋亡以及肿瘤形成等多种基因转录的调控, 已被证实在多种急慢性炎性疾病、肿瘤及变态反应性疾病的发生、发展过程中具有重要作用[24]。对NFκB1基因启动子、编码外显子以及内含子区域进行测序表明, 在6个检测出来的核苷酸变异位点之中, 只有启动子-94insdel ATTG具有潜在的功能性, 4个碱基的缺失可以导致启动子活性降低。此外, 与肿瘤疾病易患性的研究目前已经受到广泛关注, Karin等[25]对NF-κB位点基因多态性进行研究发现, 该位点基因多态性与膀胱癌、前列腺癌以及宫颈癌易患性均具有相关性。
NFκB论文 篇6
Stephens等[4]使用TNF刺激胰岛β细胞,观察到抑制NF-κB的活性可以保护胰岛β细胞免除TNF诱导的细胞死亡。因此,抑制NF-κB活性可能抑制β细胞中免疫介导的几种不同的细胞死亡途径,这种机制在自身免疫性糖尿病中可能作为保护胰岛β细胞的有效策略。
更多的研究正逐步向人们揭示糖尿病、炎症和各种炎症因子之间存在必然的联系,糖尿病病因及机制十分复杂,而炎症是其中重要因素之一。针对炎性因子及其靶基因在人体内调控的关键环节NF-κB的研究开创了糖尿病防治的新领域[5]。能抑制NF-κB活性的药物,在糖尿病治疗及并发症的防治上具有明显的优势。基于此,本实验通过建立NF-κB活性检测方法,考察仙鹤草降糖活性部位的不同极性部位及化学成分代表性单体对NF-κB活性的影响。
1 材 料
1.1 试剂和药材
293细胞,上海中科院细胞库;Lipofectamin 2000,Invitrogen公司;DMEM,上海吉诺公司;胎牛血清,Hyclone公司;荧光素酶检测系统,Promega公司;pNF-κB-lue,BD Biosciences,CA,USA;受试单体化合物乌苏酸,胡萝卜甙,山柰酚,槲皮素,没食子酸,鞣花酸,均为本课题组自制,经MS,NMR鉴定,HPLC检测纯度符合要求。
1.2 仪器
Sirrius Luminometer Berthold Detection Systems (Berthold Detection Systems GmbH),German;Corning 96孔细胞培养板,Costar。
2 方 法
NF-κB活性检测:利用NF-κB转录活性荧光素酶报告基因检测系统进行。pNF-κB-luc质粒上有4个NF-κB结合位点融合在荧光素酶基因的编码序列上。pNF-κB-luc质粒和PcDNA3.1质粒共转入293细胞中,通过0.6 mg/mL的G418筛选出pNF-κB-luc-293克隆细胞。pNF-κB-luc-293克隆细胞经培养后以1×105/孔铺于96孔板中,同时给予药物(10 μg/mL)处理15 min后再用TNF-a(10 ng/mL)孵育6 h。裂解细胞,荧光素酶的表达水平分析通过荧光素酶检测系统进行检测。荧光检测仪器为Berthold Detection Systems,蒸馏水替化合物做空白对照,罗格列酮替做阳性对照。
抑制率
3 结果与讨论
3.1 结果
阳性对照物罗格列酮 10 μg/mL,对TNF-a诱导的293细胞的NF-κB活性的抑制率为50.56%。
由图1可得知,仙鹤草中乌苏酸通过抑制NF-κB激活系统作用达到降糖作用,山柰酚、槲皮素、没食子酸有一定的抑制NF-κB激活系统的作用,胡萝卜甙,鞣花酸没有明显活性。
3.2 结论
仙鹤草中通过抑制NF-κB激活系统作用达到降糖作用的化学成分有乌苏酸,仙鹤草降糖提取物的降糖活性比提取物乌苏酸的降糖活性要强,事实证明山柰酚、槲皮素、没食子酸虽然抑制NF-κB激活系统作用而起降糖作用的能力不及乌苏酸,但山柰酚、槲皮素、没食子酸等可以通过抑制α葡萄糖甙酶及α-淀粉酶活性起到良好的降糖效果。由此可以提出结论,仙鹤草是多种降糖活性成分通过各自的降糖机理一起达到良好的降糖效果。
摘要：通过建立NF-κB活性检测方法,考察了仙鹤草降糖活性部位中分离得到的单体对NF-κB活性的影响,并探讨了仙鹤草降糖成分的降糖机理。结果显示:乌苏酸具有较强活性;没食子酸、山柰酚、槲皮素有活性;胡萝卜甙、鞣花酸无明显活性。证明仙鹤草中部分化合物能抑制NF-κB激活系统。
关键词：仙鹤草,降糖机理,NF-κB激活系统
参考文献
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[4]Stephens LA,Thomas HE,Kay TWH.Protection of N II-1 pancreaticβ-cell from immune attack by inhibition of NF-ΚB[J].J Autoimmunity,1997,10(3):293-298.
NFκB论文 篇7
关键词：耳蜗,NF-κ B,豚鼠,丹参,庆大霉素
近年来的研究表明,NF-κB参与了哺乳类耳蜗生理学及病理生理学的重要过程[1~4]。顺铂的应用[1]以及耳蜗缺血[2]等均能诱导耳蜗中自由基的大量形成,自由基通过使NF-κB活化,进而造成对耳蜗的损伤[3]。此外,迷路炎症的消长和听力的波动亦与NF-κB的表达有关[4]。NF-κB引起的内耳炎症导致了听力的下降,而NF-κB表达降至正常后,内耳炎症消失,听力恢复。另有文献报道,NF-κB是调节中枢神经系统内细胞存活的重要信号通路,其可与钙调神经磷酸酶一起发挥对Ⅱ型螺旋神经节细胞的保护作用[5]。由此说明,在生理及病理状态下,耳蜗功能的维持有赖于NF-κB的表达与调控。已知SM为常用的活血化淤中药,能有效防护GM的耳毒性,但其发挥防护作用是否与NF-κB有关,迄今为止尚不清楚。因此,本研究采用免疫组织化学SP法和显微图像分析技术,结合电生理指标ABR测试,观察SM对GM耳中毒豚鼠耳蜗NF-κB活性的影响,以探讨SM对GM耳毒性损伤的防护作用及其分子机制。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
ABR诱发记录系统:Danac-7型声刺激器和VC-10型示波器由日本Danac株式会社生产;LZ3-204型记录仪由上海大华仪表厂生产。Zeiss-A1显微镜由德国Zeiss公司生产。CIAS-1000型细胞图像分析系统由北京大恒图像视觉有限公司生产。丹参注射液购自上海中西制药有限公司,硫酸庆大霉素购自天津药业集团新郑股份有限公司,鼠抗NF-κB P65单克隆抗体和兔抗NF-κB P50单克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供,免疫组织化学试剂盒SP-9001、SP-9002和DAB显色剂由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 耳中毒模型的制备
健康白色红目豚鼠40只,耳廓反射正常,体重250~300 g,雌雄不限,由中国医科大学第二临床学院动物室提供。将动物随机分成下列4组(n=10):正常对照组、GM组、GM+SM组和SM组。以上4组中,GM组每日腹腔注射硫酸庆大霉素100 mg/kg,SM组每日腹腔注射丹参注射液6 g/kg,GM+SM组每日腹腔注射丹参注射液6 g/kg,同时在对侧腹腔注射硫酸庆大霉素100mg/kg,正常对照组则每日腹腔注射等量生理盐水。4组皆连续用药10 d。用药期间每天监测体重以调整药量。
1.2.2 ABR测试
各组动物于用药前及停药第2天分别测试ABR。操作在隔音屏蔽室内进行。豚鼠用1%戊巴比妥钠40 mg/kg经腹腔麻醉后,将电极的正极置于动物颅顶正中皮下,负极置于给声侧耳廓后下,接地电极置于对侧耳廓后下,屏蔽耳机距测试豚鼠外耳道口0.5 cm。用ABR诱发记录系统给予交替短声(click)刺激,重复率20次/s,带通滤波50~3 000 Hz,叠加200次,扫描时程20 ms。声刺激强度从95 d B SPL开始,以5 d B逐次递减,听阈判定以刚出现ABR的Ⅲ波为准。
1.2.3 标本制备
停药第2天测试完ABR后,立即断头处死,速取听泡。充分暴露耳蜗后,在解剖显微镜下刺破圆窗及卵圆窗,蜗尖钻孔并缓慢灌流含4%多聚甲醛的PBS,再将标本浸入该溶液4℃下固定过夜。经PBS冲洗后放入10%EDTA溶液中,4℃下脱钙2周。标本经梯度酒精脱水、二甲苯透明,常规石蜡包埋后,沿蜗轴正中行5μm连续切片。
1.2.4 免疫组织化学染色(SP法)
严格按照试剂盒说明书进行。阴性对照染色切片用0.01 mol/L PBS(p H7.4)代替一抗,其他染色程序不变。
1.2.5 显微图像分析技术
用CIAS-1000型细胞图像分析系统,每组随机抽取10张切片,将载玻片置于显微镜下呈现图像后,用数码照相机拍照,并将图像输入计算机,在同等条件下测量螺旋韧带和血管纹NF-κB阳性反应产物的平均灰度值。平均灰度值越小,表示阳性反应越强烈。
1.2.6 数据处理
应用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计学分析,数据以均值±标准差(x±s)表示,每组用药前后的比较采用Student-t检验,用药后各组之间ABR阈值及平均灰度值的比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有显著性,以P<0.01为差异有极显著性,P>0.05为差异无显著性。另对各组NF-κB免疫反应的平均灰度值与ABR阈值的关系做直线相关检验。
2 结果
2.1 S M对GM耳中毒豚鼠耳蜗ABR阈值的影响
GM组连续用药10 d后,其ABR阈值比用药前明显提高,并且与正常对照组比较,差异显著(P<0.01);GM+SM组虽然在用药后ABR阈值也比正常对照组高,但较GM组明显降低(P<0.01);正常对照组和SM组在整个用药期间ABR阈值无明显变化,见表1。
注:1)与给药前比较,P<0.01;2)与正常对照组比较,P<0.01;3)与GM组比较,P<0.01
2.2 S M对GM耳中毒豚鼠耳蜗NF-κB活性的影响
2.2.1 耳蜗中的N F-κB P65及N F-κB P50的表达正常对照组NF-κB P65阳性免疫反应仅见于耳蜗螺旋韧带,而其他部位均呈阴性(图1A)。GM组、GM+SM组及SM组NF-κB P65的阳性免疫反应的分布和正常对照组相同,也仅见于耳蜗螺旋韧带,见图2。在阴性对照切片上未见NF-κB P65阳性染色。
正常对照组NF-κB P50阳性免疫反应见于耳蜗螺旋神经节(图1B)、螺旋韧带、血管纹、骨螺旋板缘及螺旋器(图1C)、神经纤维(图1D)。GM组、GM+SM组及SM组NF-κB P50的阳性免疫反应的分布与正常对照组大致相同,但GM组NF-κB P50在耳蜗螺旋韧带和血管纹的染色较正常对照组明显加深;而同时给予SM的豚鼠,NF-κB P50阳性染色较GM组则明显减弱,见图3。
正常对照组和SM组耳蜗外毛细胞胞浆可见P50阳性染色,胞核则未见染色。给予GM后,耳蜗外毛细胞胞核可见P50阳性染色,而联合应用SM后,外毛细胞核染色消失,见图4。
2.2.2 显微图像分析
统计学分析表明,各组豚鼠耳蜗螺旋韧带NF-κB P65阳性反应的平均灰度值无显著性差异(P>0.05),见表2。
给予GM后,豚鼠耳蜗螺旋韧带和血管纹NF-κB P50阳性反应的平均灰度值较正常对照组明显减小(P<0.01),即GM组耳蜗螺旋韧带和血管纹NF-κB P50活性明显增强;而同时给予SM的动物,其耳蜗螺旋韧带和血管纹NF-κB P50阳性反应的平均灰度值较GM组则明显增大,即NF-κB P50活性较GM组显著减弱(P<0.01),见表3。
注:1)与正常对照组比较,P<0.01;2)与GM组比较,P<0.01
2.2.3 豚鼠耳蜗螺旋韧带和血管纹N F-κB P50的平均灰度值与ABR阈值的关系
连续给药10天后,各组豚鼠耳蜗螺旋韧带和血管纹NF-κB P50免疫反应的平均灰度值发生变化,同时伴有ABR阈值的改变,提示二者之间关系密切,通过直线相关检验证明二者呈负相关,见表4。
注:1)表示0.05水平相关,2)表示0.01水平相关
3 讨论
作为一种关键的转录因子,NF-κB几乎存在于机体各种组织细胞中,对炎性和免疫反应、细胞凋亡及肿瘤发生等多种生物进程具有重要的调节作用。目前,国内外对NF-κB与内耳关系的研究尚不多见。
3.1 耳蜗中NF-κB的表达
ADAMS[6]和王朝永等[7]应用免疫组织化学方法,观察到在正常豚鼠耳蜗石蜡切片上,NF-κB P65阳性染色主要见于螺旋韧带的Ⅰ型纤维细胞和根细胞的胞浆内,而血管纹和螺旋韧带的Ⅱ型纤维细胞均未见表达。本研究结果也表明,NF-κB P65免疫活性反应主要见于螺旋韧带,而在血管纹无表达,这与ADAMS[6]和王朝永等[7]的报道相同。然而,我们和王朝永等[7]都发现,螺旋器的毛细胞和支持细胞并无NF-κB P65表达,这与ADAMS[6]的报道不同。可能与所用抗体、实验条件以及结果判定等因素的差异有关。
JIANG等[9]应用冰冻切片,发现NF-κB P50弱染色见于正常小鼠耳蜗所有类型细胞的胞浆中,并且在内毛细胞和支持细胞的一些胞核中也有表达。而MASATSUGU[8]等采用石蜡切片,观察到在正常小鼠耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞的胞浆中均有NF-κB P50的表达,但胞核未见。本研究结果显示的NF-κB P50在正常豚鼠耳蜗的分布与JIANG等[9]的报道略有不同。可能与应用石蜡切片的方法有关,因为在石蜡切片制作过程中,温度升高可能导致蛋白质变性失活。此外,本组用的动物的种属也不同,确切原因尚有待进一步证实。实验中同时也观察到正常豚鼠耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞的胞浆中有P50的表达,而胞浆未见,与MASATSUGU[8]的相同。
3.2 GM通过激活NF-κB对耳蜗造成损伤
王朝永等[7]报道,经鼓室注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)后6 h和48 h,耳蜗中NF-κB P65被激活,随后引起的内耳炎症导致听力下降。耳蜗缺血[2]能诱导耳蜗中自由基的大量形成,自由基使NF-κB活化,进而造成耳蜗的损伤。这些都提示了激活的NF-κB对耳蜗造成了损伤。本实验中应用GM后,耳蜗螺旋韧带和血管纹NF-κB P50阳性染色明显增强,外毛细胞胞浆中的NF-κB易位到核内而被活化,直线相关检验证明GM所致ABR阈值升高与NF-κB P50活性增强相关。由此提示,GM通过诱导激活NF-κB,从而引起耳蜗损害。
耳蜗侧壁包括螺旋韧带和血管纹,血管纹中血运丰富,代谢率高,易受GM的毒性作用。文献报道,GM能引起血管纹内毛细血管缺血、瘀血,血管周围水肿、渗出,边缘细胞穿孔、融合等变化[10]。由于螺旋韧带和血管纹在K+循环中发挥非常重要的作用,K+循环的障碍可影响耳蜗内电位,最终造成小鼠的全聋[11],而细胞因子通过改变离子通道的功能进而影响K+循环[12]。本实验观察到,GM组NF-κB P50在螺旋韧带和血管纹的活性明显增强。由此推测,应用GM后,作为细胞因子的NF-κB被活化,从而导致内环境紊乱和离子失衡,最后造成听觉损害。此外,螺旋韧带和血管纹共同组成的侧壁还具有活化转录因子[13]、激活NO和ROS[14~16]、产生抗氧化酶[17]、以及清除兴奋性氨基酸(excitatory amino acid,EAA)[18]等诸多作用。侧壁通过提高其代谢活性以维持这些功能,而其代谢活性的提高导致应用GM后ROS的生成增多。因为NF-κB是对氧化还原敏感的转录因子,侧壁氧化状态的改变就会导致NF-κB的活化,从而启动相关基因的转录调控,通过参与调控的炎性分子基因的表达而参与GM耳毒性损伤的发生过程。
3.3 S M通过抑制NF-κB以拮抗GM的耳毒性
SM通过抑制NF-κB以拮抗GM的耳毒性:据报道,SM可扩张耳蜗血管,增加耳蜗外侧壁及蜗轴血流,改善内耳微循环。近年来的研究表明,SM还能有效抑制心、肺和脑组织中NF-κB的活化,进而发挥对多种疾病的防治作用。
本实验中给予GM后,耳蜗外毛细胞胞核可见P50阳性染色,而联合应用SM后,外毛细胞核染色消失,表明SM通过抑制NF-κB的核易位,进而抑制了外毛细胞中NF-κB的活性。此外,笔者还观察到,GM+SM组耳蜗螺旋韧带和血管纹中NF-κB P50阳性免疫产物的分布与GM组相同,但NF-κB P50活性较GM组则明显减弱,同时ABR阈值也显著降低,并且与NF-κB P50活性减弱显著相关,表明SM发挥拮抗GM耳毒性的作用是通过抑制GM所致NF-κB P50活性增强来实现的。
前已述及,GM能诱导ROS的过量生成,进而激活NF-κB,最终导致耳蜗损伤。以往的研究证明,SM能有效抑制GM引发的ROS生成和脂质过氧化[19],由此推测,SM可能通过清除过量的ROS,以减少ROS对NF-κB的激活作用,从而抑制了NF-κB的活性,使NF-κB不能发挥作用而减弱了听功能的损伤。
NFκB论文 篇8
1材料与方法
1.1材料
健康新西兰雄性大白兔40只,体重(2.5±0.5) kg,由遵义医学院珠海校区动物养殖中心提供。 ELISA试剂盒购自蓝基生物科技有限公司,逆转录M-MLV1试剂盒 (reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)购自TAKARA公司,荧光定量PCR仪购自Funglyn Biotech Incorporated公司。
1.2方法
1.2.1实验分组40只雄兔随机分为假手术组 (Sham组)8只、缺血再灌注组(I/R组)和缺血后处理组(IPO组)各16只,随机按供受体配对,Sham组不进行肺移植,开胸游离左肺门后维持60 min;I/R组在肺移植后直接恢复血流灌注和通气,而IPO组在移植后开放肺静脉和支气管,肺动脉给予3个周期1 min再灌 /1 min再阻断,然后全面恢复再灌注。
1.2.2兔左肺同种异体移植模型的建立过程1麻醉、气管插管:实验前,所有大白兔禁食12 h,自由饮水。供体兔以20%乌拉坦(5 ml/kg)经腹腔麻醉后, 仰卧位固定。调节呼吸机参数:Fi O221%(空气),潮气量15 ml/kg,呼吸频率40/min,吸呼比为1∶2;颈部备皮、消毒,正中切口,行气管插管并接呼吸机;2供肺切取:经正中开胸,静脉注射肝素10 mg/kg,游离出上、下腔静脉及主动脉,分别结扎;剪开心包,距肺动脉起始部远端约1.0~1.5 cm套线,用尖刀切开肺动脉约2.0 mm切口,将内径2.0 mm冲灌洗插管 (自制锁骨下静脉穿刺管灌洗器) 插入肺动脉内,套线打结固定;切开左心耳,然后经灌注管向肺动脉主干内以4℃低钾右旋糖苷肺保护液(LPDG液)行双肺灌注,(灌注60 ml/kg,压力控制在40 cm H2O以下)灌注至肺变白为止;此期间持续予呼吸机维持呼吸;灌注完毕后,使肺在2/3膨胀状态下,将心肺整块取出,置入4℃ LPDG液中保存4 h;3供肺修整: 将供肺右肺门结扎后切除右肺;沿房室沟切除心脏, 修剪左房,留约1.0 cm左右的左房袖,插入肺静脉套管4号线结扎;保留全长左肺动脉,插入肺动脉软套管1号线结扎;切断左主支气管,插入气管套管4号线结扎;4受体肺移植:受体兔麻醉,备皮、消毒, 气管插管接呼吸机调节参数如前,取右侧卧位,正中开胸,充分暴露左侧肺门;先分离左肺动脉,再分离左肺静脉上下两支,分别将其结扎;将潮气量减少1/3,结扎左主支气管,切除左肺,经静脉注射肝素10 mg/kg,全身肝素化;左主支气管与供体气管套管插入连接、固定,呼吸机潮气量调回原值;供肺左房套管插入受体肺的左心耳结扎固定;最后供体左肺动脉套管插入受体左肺动脉结扎固定,松止血夹,恢复灌注。
1.2.3标本收集各组大白兔再灌注60 min后,取小块左上肺组织作肺湿干重量比测量;切取小块左肺下叶组织块,4%甲醛固定,备用。每组取8例。余肺组织置 -80℃冰箱保存备用。
1.2.4肺组织NF-κB、TNF-α 和IKKβ m RNA的检测ELISA法检测肺组织中NF-κB和TNF-α 的含量,实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法检测肺组织IKKβ m RNA表达含量。
1.2.5肺湿 / 干重比(W/D)的测量取小块肺组织,称得的质量为湿重,随即置入干燥箱内以80℃ 干燥12 h后称取的质量为干重,其比值为肺湿 / 干重比。
1.2.6肺病理学观察切取左肺下叶小块组织,以4%甲醛固定,行病理学检查。
1.3统计学方法
实验数据均以均数±标准差(±s)表示。采用SPSS19.0进行单因素方差分析,以P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1兔左肺同种异体移植模型的建立
本实验采用肺静脉套管 (7号头皮针套自制)、 肺动脉软套管(7号头皮针管自制)和气管套管(7号头皮针套自制)三套管分别结扎改良肺移植手术,见图1A。在动脉和静脉的连接过程中,注意排气,防止气栓。松开左肺动脉血管夹,移植肺色泽可由白变为粉红色,随呼吸频率而呼吸。检查移植肺血管充盈饱满、连接口无漏血、气管无漏气,表示肺移植手术操作成功,见图1B。
2.2各组肺组织NF-κB、TNF-α和IKKβmRNA的含量与W/D测定的比较
肺移植再灌注60 min后,I/R组肺组织NF-κB、 TNF-α 和IKKβm RNA表达量明显高于Sham组, 而IPO组肺组织NF-κB和TNF-αm RNA明显低于I/R组,3组间比较差异有统计学意义(P <0.05), 见附表。
2.3各组肺组织病理学变化
各组在再灌注60 min后病理学变化:Sham组肺组织无明显的炎症反应(见图2A);I/R组大量炎性细胞浸润、红细胞渗出、肺间质增厚明显,肺间质增宽并有水肿,损伤较明显(见图2B);IPO组肺间质轻度增宽水肿,少量炎性细胞浸润,损伤较轻(见图2C)。
注:1)与 Sham 组比较,P <0.05;2)与 I/R 组比较,P <0.05
3讨论
本研究应用改良“三套管”方法建立兔左肺同种异体移植模型,结果表明I/R组和IPO组NF-κB活性、IKKβ m RNA表达量和TNF-α 浓度较Sham组明显增高,结合病理学结果,提示模型制备成功。
NF-κB通常以由NF-κB/Rel家族组成的同源或异源复合物存在,其中最见的为p65/p50异二聚体,也是其活性的主要形式。在静息细胞中, NF-κB二聚体通过非共价键的形式与其抑制蛋白结合形成三聚体而分隔在细胞浆内,在多种活化信号的刺激下,激活NF-κB诱导激酶(NF-κB-inducing kinase,NIK)或活化途径中的其他激酶,使抑制因子 κB(inhibition κB,IκB)磷酸化、泛素化并降解,从而暴露NF-κB的核定位信号,激活后的NF-κB进入细胞核,与DNA模块上的特异基因启动子结合,诱导相关特异m RNA的产生,最后转录、 产生和释放各种细胞因子,在各种细胞外刺激介导的细胞信号转导调控中起核心作用。许多研究证实, 肺缺血再灌注能够诱发NF-κB活化[6],并且NF-κB活化及其诱发的炎症级联反应可促进肺损伤的发生。NF-κB在氧自由基刺激几分钟就可被激活,结合到许多细胞因子的增强子序列中,启动TNF-α、 IL-1β 和IL-6的转录[7]。LSHII等[8]在离体大鼠肺缺血再灌注模型中发现NF-κB的DNA结合活性在缺血期呈现基础水平,且在恢复血供30 min后表达增强,这说明NF-κB在再灌注早期就能导致损伤。 NF-κB不仅是炎症反应的一个标志,同时也是炎症发展的决定性因素[9];炎症反应的强弱与编码炎症介质的基因表达有关,NF-κB是这些促炎因子高表达所必须的转录因子,参与多种基因的表达和调控,是细胞激活的标志,而通过抑制NF-κB活化可以减轻肺再灌注损伤,则明显减轻PGD[10]。
在NF-κB二聚体活化过程中,IκB激酶(IKK) 通过对抑制性蛋白 κB的磷酸化而扮演关键的角色。IKK复合物在胞浆内有多种存在形式,其中, IKKα 和IKKβ 同源性,常为催化亚单位。IKKα 和IKKβ 由于对IκB作用位点的差异IKKβ/NF-κB途径被称为经典途径,而IKKα/NF-κB途径为旁路途径。在器官再灌注损伤中经典途径是缺血再灌注过程中NF-κB激活的主要方式[11],IKKβ 刺激诱导NF-κB的激活的主要激酶而且IKKβ 的激活是必需的[9]。虽然胞外刺激所产生的胞内早期信号途径各不相同,但一般认为,大多数此类胞外刺激起始的信号传递反应将最终激活IKK复合物,引起IKK的活化 ,通过级联反应,使IκB磷酸化而 与NF-κB解离,致使NF-κB活化进入细胞核内介导炎症反应,引起肺损伤。而IKKβ 缺陷的细胞对TNF-α 和白细胞介素 -1 (IL-1) 等刺激不会引起NF-κB的活化 , 因此 ,IKK-NF-κB通路是NF-κB活化通路的枢纽,并且通过检测IKKβ 蛋白表达量及核内NF-κB p65亚基量,可基本反应肺缺血再灌注过程中NF-κB/IκB/IKK信号转导通路的激活程度。WU等[12]研究发现人为制造呼吸性酸中毒可抑制IKK-NF-κB通路激活从而减轻大鼠肺缺血再灌注损伤,表明通过抑制IKKβ 或IKK-NF-κB可以减轻 肺缺血再 灌注损伤 ,而IKKβ 的适度活化是避免因局部缺血或充血引起严重炎症反应而导致多组织功能丧失所必需的 。 HUANG等研究[13]亦表明,特异性IKKβ 抑制剂适度抑制IKKβ 具有减轻肺缺血再灌注的很高效能, 完全抑制IKKβ 则不具备保护作用。从本实验结果可以看出,肺移植组 (I/R和IPO组) 肺组织中IKKβm RNA与NF-κB含量较Sham组明显增多并成正相关(P <0.05),表明肺移植后肺缺血再灌注能够诱发IKKβ/NF-κB经典通路的激活。而IPO组IKKβm RNA与NF-κB含量较I/R明显减少并成正相关(P <0.05),表明后处理可以抑制肺缺血再灌注中的NF-κB的活化和IKKβm RNA的表达来减少损伤,ZHANG等[14]也有类似发现。
TNF-α 是一类重要的具有多种生物学效应和可在多种组织表达的的促炎症细胞因子。在缺血早期TNF-α 分泌或合成的增加是肺损伤的主要原因[7],它具有增加血管内皮细胞的通透性,诱导细胞黏附因子表达等作用。TNF-α 在肺缺血后诱发的白细胞浸润和组织损伤中起重要作用,可引起多核白细胞聚集和激活并释放炎症介质 (如IL-6和IL-8),从而起到协同作用,而相应的抑制TNF-α 的表达可以有效的减轻肺的缺血再灌注损伤。
TNF-α 是受NF-κB调控的重要炎症介质,在TNF-α 的启动子中存在着NF-κB的结合位点,该位点与活化的NF-κB结合后促进TNF-α 的表达[15]。ESSANI等[16]发现,随着NF-κB活化,血浆中TNF-α 表达明显增加,而用药物抑制NF-κB活化后,TNF-α 表达下降了86%,以上实验可以说明TNF-α 的表达受NF-κB的调节。但也有实验应用腺苷后处理[17]可以降低TNF-α 和IL-10等炎症因子来减少NF-κB转录。SUN等[18]研究显示七氟烷可减少TNF-α 并提高以此介导的IκB的表达来抑制NF-κB核转录来减轻肺缺血再灌注损伤。这表明TNF-α 是不仅是受NF-κB调控,并且作为NF-κB的刺激剂,可进一步活化NF-κB,放大炎症反应。这从本实验结果也可以看出,肺移植组(I/R和IPO组) 肺组织中TNF-α、IKKβm RNA和NF-κB含量较Sham组明显增多并成正相关(P <0.05),并与肺组织损害程度增高相关。而TNF-α 与IKKβ m RNA的表达量和NF-κB的活性成正相关 (P <0.05)。 这表明缺 血再灌注 早期诱发IKKβ/NF-κB经典通路的激活并刺激TNF-α 等炎症细胞因子的表达,但同时这些细胞因子又是NF-κB的刺激剂,可进一步活化NF-κB,提高IKKβm RNA的表达,造成持续或放大的炎症反应, 形成正反馈圈,导致肺组织损伤。另外,结果中显示, IPO组肺组织中TNF-α、IKKβm RNA与NF-κB含量较I/R组明显减少并成正相关(P <0.05),表明缺血后处理可以抑制IKKβ/NF-κB经典通路激活,减少TNF-α 释放、阻断炎症反应正反馈圈,减少肺组织损伤。
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