白藜芦醇

白藜芦醇（共11篇）

白藜芦醇 篇1

白藜芦醇是植物受到外界刺激而产生的一种植物抗毒素, 1940 年首次从毛叶藜芦根部分离得到。由于“法国怪圈”现象的发现, 白藜芦醇开始受到人们的广泛关注与研究, 我国对白藜芦醇生理功能方面的研究是由北京中医药大学于1998 年开展起来的, 现已经成为研究热点[1]。目前已在虎杖、葡萄、花生等至少72 种植物中发现白藜芦醇的存在, 并且研究表明白藜芦醇具有多种药理活性, 具有广泛的应用价值, 市场需求量大。

1 白藜芦醇的理化性质与来源

1.1 理化性质

白藜芦醇化学名为3, 4, 5-三羟基二苯乙烯, 分子式为C14H12O3, 属于单宁质多酚, 纯品为无色针状结晶, 熔点256~257 ℃, 升华点261 ℃, 难溶于水, 易溶于有机溶剂 (如丙酮、乙醚、甲醇、乙酸乙酯、氯仿等) , 对光不稳定。遇醋酸镁的甲醇溶液显粉红色, 遇氨水等碱性溶液显红色, 能和三氯化铁-铁氰化钾反应呈蓝色。在366 nm的紫外光激发下可产生紫色荧光;在紫外光210 nm处有强吸收, 次强吸收峰分别出现在305~330、280~295 nm处[1,2,3,4]。 白藜芦醇在自然界中有顺式、反式白藜芦醇和顺式、反式白藜芦醇苷4 种存在形式。植物中白藜芦醇主要以反式构象存在, 且反式白藜芦醇苷的含量远高于反式白藜芦醇的含量。在紫外光照射下, 反式构象能转化为顺式构象, 其中反式异构体的生理活性大于顺式异构体, 白藜芦醇活性大于白藜芦醇苷。顺式白藜芦醇在避光条件下只有在中性环境下较稳定。白藜芦醇在光下呈现不稳定性, 反式白藜芦醇在完全避光时, 可以在乙醇中稳定存在数月, 在高p H值 (≥10) 环境下稳定性较差[1,5]。

1.2 来源

白藜芦醇的来源主要有植物中提取、化学合成和生物技术生产。从自然界的植物中提取白藜芦醇的原材料主要是含白藜芦醇较多的虎杖和葡萄, 提取的天然白藜芦醇具有绿色安全的特点, 符合人们追求纯天然无污染的要求。但植物中白藜芦醇含量低, 受限于原料来源、季节、生产能力和地区等问题, 且提取纯化成本较高, 因而人们开始寻求其他获取白藜芦醇的途径, 主要有化学合成和利用生物技术生产。化学合成白藜芦醇的方法主要有5 类:Heck反应, 钯催化的烯烃芳基化和烯基化偶联反应;碳负离子与羰基化合物的缩合反应制备白藜芦醇。Wittig反应, 磷叶立德即Witting试剂与醛、酮的羰基发生亲核加成反应[1,2,3];Perkin反应, 芳香醛与酸酐在同酸酐相应的酸的羧酸钠盐、钾盐的存在下进行缩合反应;Wittig-Horner反应, 是对Wittig反应的一种改进, 用简单易得的磷酸酯代替磷叶立德试剂来形成双键[5];化学合成能快速大量生产白藜芦醇, 满足市场需求, 但这些化学合成方法都存在合成路线长、生产成本较高、环境污染严重等问题, 因而需要探寻生产成本低、绿色环保的化学合成方法。利用生物技术生产白藜芦醇的方法主要有组织培养[6]、细胞培养[7]、毛状根诱导培养[8]、生物转化[9]、转基因植物培养及工程菌发酵。生物技术生产白藜芦醇能保护环境资源、防止环境污染, 但这些方法真正工业化应用的较少, 大多还处于试验阶段。

2 白藜芦醇的药理活性

2.1 保护心血管

WHO的一项流行病学调查发现, 由于饮用适量的红葡萄酒, 即使在摄入较多脂肪的情况下, 法国人心血管疾病发病率和死亡率明显低于脂肪摄取量相似的欧美其他国家。而白藜芦醇是红葡萄酒中发挥心血管保护作用的主要物质。白藜芦醇对心血管系统的保护作用主要包括:抗血小板凝集、抗动脉粥样硬化、保护血管和减少心肌缺血-再灌注损伤作用。

2.2 抗癌

白黎芦醇被列为抑制和治疗癌症的最有前途的药物之一。白藜芦醇对肺癌、肝癌、胃癌、肠癌、乳腺癌等多种癌症均有抑制作用, 且对癌细胞的发生、增殖和发展均有对抗作用。白藜芦醇抗肿瘤作用的机制主要有:抑制DNA聚合酶的活性, 降低DNA合成效应, 达到抑制癌细胞增殖的作用[1,2];调节凋亡相关基因的表达来诱导肿瘤细胞的凋亡。

2.3 抗炎

白藜芦醇对急、慢性炎症均有良好的抗性作用, 其抗炎机制与抑制白细胞的游走[1,2,3], 减少渗出, 清除氧自由基, 抑制脂质过氧化, 干扰花生四烯酸代谢, 抑制COX-2 的作用, 减少PGE2 合成, 抑制NO生成有关。

2.4 抗氧化

白藜芦醇具有抗氧化、清除自由基的药理作用, 这一药理作用是白藜芦醇发挥保健功效的一个主要途径。白藜芦醇之所以具有抗氧化作用, 是因为其具有多酚结构, 能通过抑制二硫化谷胱甘肽和羟自由基的形成, 最终清除自由基。

2.5 其他药理作用

白藜芦醇还具有免疫调节作用、雌激素样作用、保护神经系统作用、抗衰老作用、抗菌抗病毒作用等药理作用, 因而受到人们的广泛关注。

3 提取与纯化

3.1 提取

在传统的有机溶剂浸提和加热回流提取的基础上, 近几年出现了超声提取、微波萃取、酶法提取、酸提碱沉、减压沸腾提取等提取方法。王辉等用超声波辅助乙醇提取虎杖中白藜芦醇, 确立了超声波辅助下的白藜芦醇的提取工艺方法为:80%乙醇, 料液比1∶20 g/m L, 超声波功率700 W, 提取时间70 min[1]。提取温度低至35 ℃, 适于热敏性成分的提取。卢燕等用微波萃取并用UPLC同时检测, 结果表明采用微波萃取法能将提取时间缩短到10 min, 大大提高了分析效率。尚天翠采用碱提酸沉法提取虎杖中的白藜芦醇, 结果表明白藜芦醇碱提酸沉的最佳提取条件为:以Na OH溶液 (p H值=10) 为提取溶剂, 在磁力搅拌器上加热至60 ℃恒速、均匀搅拌1 h, 滤液用1mol/L盐酸调p H值至3[1,2,3], 放置沉淀, 离心分离并真空干燥沉淀物。碱提酸沉法利用了白藜芦醇在碱性条件下成盐后溶解性增加而溶解, 在酸性条件下游离出来而沉淀的原理, 既提取了白藜芦醇又除去了大部分杂质, 利于后续的纯化工作。马然等研究了虎杖减压沸腾提取工艺, 以白藜芦醇为考察指标, 确定减压沸腾提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度70%、料液比1∶10、真空度0.02 MPa、温度为50 ℃、提取时间1 h。与常用提取方法相比较, 减压沸腾提取的提取效率高、操作简单且适合热敏性物质。

3.2 纯化

以往的研究表明, 从植物中提取的白藜芦醇粗提物中含有较多的杂质, 成分复杂, 因而要将其用于食品、药品、生物和化工等方面必须对粗提物进行纯化, 以便达到其纯度要求。大孔吸附树脂法具有树脂可再生、溶媒用量少、成本低、操作简便且收率高的优点。姜瑞清等用硅胶柱层析法对花生根中白藜芦醇的纯化工艺进行了研究, 结果表明以氯仿与甲醇之比为9∶1 作为洗脱剂, 硅胶吸附剂与样品量之比50∶1 的上样量, 经硅胶柱层析纯化后白藜芦醇含量由39% 提高到99% 以上。 硅胶柱层析法分离效率高, 且使用的硅胶具有机械性能好、不溶胀、价格便宜等优点, 但常用柱层析生产周期长、溶剂用量较大。刘树兴等用高速逆流色谱分离纯化了虎杖中的白藜芦醇, 试验结果表明, 上下相组成为氯仿∶甲醇∶水=4∶3∶2, 转速850 r/min, 流速2 m L/min, 紫外检测波长280 nm, 粗产品经高速逆流色谱纯化后, 再经高效液相色谱测定, 白藜芦醇纯度大于96%。高速逆流色谱法克服了其他色谱分离方法因固相载体带来的样品吸附、损失、污染等缺点[6,7,8,9], 且快速、高精确度、制备量大, 但成本较高。

4 检测方法

白藜芦醇的检测方法目前主要有薄层色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、近红外光谱法、定量核磁共振波谱法等。张煜等以微乳液作为展开剂, 用微乳薄层色谱法分离鉴别了虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的顺、反异构体, 分离效果比硅胶薄层明显提高, 且操作简便、快速、准确。郑湘娟等用紫外分光光度法测定虎杖中白藜芦醇的含量, 以305nm作为吸收波长, 并进行了重复性试验和回收率试验, 研究结果表明其加样回收率和重复性均较好, 且紫外分光光度法具有操作简单、快速、方便的优点。吴青等应用高效液相色谱法测定了虎杖提取物中白藜芦醇的含量, 以乙腈-水 (30∶70) 作为流动相, 306 nm作为检测波长, 试验结果表明该方法重现性好、灵敏度高且准确可靠。吴利敏等采用了近红外光谱法同时测定虎杖提取物中虎杖苷、白藜芦醇和大黄素含量。该方法首先利用高效液相色谱紫外检测法测定虎杖中活性成分的化学值[1,2,3], 然后采用傅里叶变换近红外光谱技术并结合偏最小二乘法 (PLS) 建立、优化模型, 并对校正模型进行评价。研究结果证明近红外光谱法的准确度较高, 且快速、无损、无污染, 能够实现对虎杖多组分同时测定的精度要求, 有望用于快速无损地鉴定虎杖的品质。首先将样品超声提取净化, 再用定量核磁共振波谱法测定白藜芦醇和虎杖苷的含量, 并进行了方法验证, 包括精密度、线性、回收率。研究结果表明, 定量核磁共振波谱法可以同时定量分析中药虎杖中白藜芦醇和虎杖苷, 并且精密度好、准确可靠[10,11,12]。

5 结论与展望

综上所述, 虎杖中白藜芦醇具有多种提取与检测方法。目前, 因为超声提取法不仅提取时间短、温度低, 而且提取效率高, 因而成为目前主要的提取方法。虽然利用组织培养和转基因等生物技术来生产白藜芦醇大多还处于试验阶段, 但是甘草、黄芪等中草药已经建立了毛状根培养技术体系, 说明利用生物技术生产植物次生代谢产物白藜芦醇具有可行性, 这些试验结果为将来的工业化生产奠定了一定的理论基础, 也将引发生物技术生产白藜芦醇的研究热潮。

摘要：白藜芦醇是一种具有多方面利于人类健康的生物活性的天然产物。本文介绍白藜芦醇的理化性质、来源、药理作用、提取、纯化和检测方法, 以期为白藜芦醇的进一步研究和开发利用提供参考。

关键词：白藜芦醇,药理作用,提取,纯化,检测

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白藜芦醇 篇2

作 者：赖宜天 张喜全 郭键 李宝林 LAI Yi-tian ZHANG Xi-quan GUO jian LI Bao-lin 作者单位：赖宜天,郭键,李宝林,LAI Yi-tian,GUO jian,LI Bao-lin(陕西师范大学,化学与材料科学学院,陕西,西安,710062)

张喜全,ZHANG Xi-quan(江苏正大天晴药业股份有限公司,江苏,南京,210018)

白藜芦醇 篇3

关键词：桑树;白藜芦醇合酶基因;RT-PCR;RACE技术;序列分析

中图分类号： Q943.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0017-04

收稿日期：2014-07-09

基金项目：山东省自然科学基金（编号：ZR2010CL022）;山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室（潍坊学院）开放课题（编号：2012SWKF02）。

作者簡介：夏海武（1958—），男，山东潍坊人，博士，教授，从事植物生物技术研究。E-mail：xiahaiwu206@163.com。

桑葚为桑科落叶乔木桑树（Morus alba Linn.）的果实，聚花果，每年4—6月份成熟，不同生长环境、不同品种的果实之间存在差异。中国地大物博，桑葚资源丰富，全国各省份均有桑树的分布[1-2]。桑葚含有丰富的营养物质，具有食用及中药材之用，早在2 000多年前，它就成为皇帝的御用药品之一。1993年，国家卫生部把桑葚列为“既是食品又是药品”的农产品之一[3]。现已证明桑葚具有6种防病保健功能，包括防癌抗诱变、增强免疫力、保肾护肝、驻颜抗衰老、促进造血细胞生长、降低血糖血脂等[4]，这些保健功能主要依赖于桑葚中含有的一种叫白黎芦醇的芪类物质，它具有抗氧化及消除自由基功效，有防癌、抗炎、预防心血管疾病、抗衰老等功能[5-6]。白藜芦醇和其他芪类化合物均属于次生代谢物，其生物合成途径是苯丙氨酸-丙二酸，在白藜芦醇合成全过程中，白藜芦醇合酶（RS）是代谢途径中最后一个起作用的关键酶[7]，也是合成途径中唯一必需的合成酶，它催化1分子4-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A反应合成白藜芦醇[8]。白藜芦醇合成的底物在植物体内广泛存在，白藜芦醇的合成及含量控制主要依赖于白藜芦醇合酶基因的表达状况[9]，但大多数植物不含白藜芦醇合酶或含量很低。目前，虽然发现含有白藜芦醇的植物已有70多种，但要从天然植物中提取到高丰度的白藜芦醇比较困难，并且提取成本较高。利用基因工程技术使更多的植物产生白藜芦醇或提高植物体内白藜芦醇的含量，满足人们医疗保健需求具有重要的现实意义。 目前，已从松树、花生、葡萄、爬山虎、大黄等植物中分离到白藜芦醇合酶基因，但还没有从桑葚中克隆白藜芦醇合酶基因全长序列的报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料 桑树接近成熟的果实，采自山东省潍坊市农业科学院。采后洗净，每2 g为1份，装于5 mL离心管中，液氮速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱中待用。

1.1.2 试剂盒、酶和试剂 DNA片段快速纯化/回收试剂盒，购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司;cDNA第一链合成试剂盒，购于Fermenta公司;RACE试剂盒，ClonTech公司产品;pMD 18-T Vector Kit、Marker （DL2000）、T4-DNA连接酶、5.0 U/μL Taq DNA polymerase，购于TaKaRa生物工程 （大连）有限公司;其他试剂，分析纯，均为国产或进口。

1.1.3 试验用具与耗材的预处理 用于RNA提取的研钵、药匙、镊子、50 mL离心管、试剂瓶等器具，用0.1% 焦炭酸二乙酯处理过夜;无RNA酶的专用枪头、PCR管、1.5 mL离心管等耗材，经1.1 MPa、121 ℃高压灭菌30 min或在干燥箱中60 ℃烘干，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 桑葚总RNA的提取与检测

1.2.1.1 桑葚总RNA的提取 迅速从-80 ℃冰箱中取出桑葚2 g，置于用液氮预冷的研钵中，加入PVPP 0.2 g，研磨成细粉末，在研磨时不断加入液氮以不让组织解冻;在50 mL离心管中，加入经65 ℃预热的CTAB提取缓冲液20 mL和β-巯基乙醇400 μL，倒入研磨好的桑葚细粉末，充分振摇混匀，65 ℃水浴30 min;取出，冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比49 ∶ 1），混匀，于4 ℃、20 000 g离心20 min;将上层水相移至另1支离心管中，加入1/4体积10 mol/L氯化锂，混匀，4 ℃冰箱沉淀过夜;4 ℃、20 000 g离心20 min，弃上清，用2 mol/L氯化锂洗涤沉淀1次，4 ℃、20 000 g离心 10 min，取沉淀;用2 mL无RNase的ddH2O溶解沉淀，转入4个1.5 mL离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇（体积比49 ∶ 1）颠倒混匀，于4 ℃、20 000 g 离心20 min;将上层水相移至新的离心管中，加入1/10体积3 mol/L、pH值为5.2的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，置于-20 ℃冰箱1 h以沉淀RNA;4 ℃、20 000 g离心 15 min，弃上清，沉淀用75%乙醇漂洗2次，真空抽干5 min;加入100 μL无RNase的ddH2O充分溶解，放-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 电泳检测 将电泳槽、制胶板、梳子等用DNA-RNA Away处理，晾干，用1×TAE电泳缓冲液配制1.0%琼脂糖凝胶;待凝固，点入3 μL提取的RNA样品，在预冷的1×TAE电泳缓冲液中，100 V电压条件下电泳20 min左右;观察凝胶成像仪上RNA条带的清晰度和完整性，拍照。

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1.2.2 桑葚芪合酶保守区cDNA的克隆

1.2.2.1 引物设计 根据GenBank中葡萄和花生白藜芦醇合酶基因的核苷酸序列，分别设计桑葚白藜芦醇合酶基因保守区的上、下游引物。上游引物（BP1）为：5′-GGCCAGCCAATGTCTAAGATCAC-3′，下游引物（BP2）为：5′-CTGCGGAGGACAACAGTTTCAAC-3′，由上海生工生物技术有限服务公司合成。

1.2.2.2 桑葚白藜芦醇合酶保守区cDNA的RT-PCR扩增 按照试剂盒说明书进行，50 μL反应体系为：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 5.0 μL，cDNA 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取10 μL产物在1.0%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液、90 V电压条件下电泳30 min，其余产物用于回收。

1.2.2.3 目的片段的回收 从琼脂糖凝胶上切下目的片段条带称重，装入1.5 mL离心管中，按照北京鼎国昌盛生物技术有限公司的DNA片段快速纯化/回收试剂盒说明书进行操作，得到纯化的PCR产物。

1.2.2.4 目的片段与载体的连接与转化 按TaKaRa公司的pMD 18-T Vector Kit说明书，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α。大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化采用CaCl2法。

1.2.2.5 重组质粒的PCR检测与测序 挑取白色菌斑置于加抗生素的LB培养基中，对菌液进行PCR检测，20 μL反应体系为：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，菌液2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.3 μL，加无菌ddH2O 至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 15 min，30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取10 μL产物在1.0%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液、90 V电压条件下电泳30 min，在凝胶成像仪上观察并拍照，并将扩增出目的条带的样品菌液送上海生工生物工程技术有限服务公司进行测序。

1.2.3 桑葚芪合酶cDNA全长的克隆

1.2.3.1 引物设计及合成 根据保守区cDNA的测序结果和ClonTech公司BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书要求，设计3′RACE上游引物（SP2）为：5′-CTATCTTAACAAGAGTGTTCCCG-3′和5′RACE下游引物（SP1）为：5′-GCGGTATTCTCAGAGCAAACAATGAG-3′，引物序列委托上海生工生物工程技术有限服务公司合成。

1.2.3.2 第一链cDNA的合成 按照试剂盒操作说明书进行，5′RACE CDS 引物序列为：5′-（T）25VN-3′，（N=A、C、G或T;V=A、G或C）;3′RACE CDS 引物序列為：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC（T）30VN-3′;BD SmartⅡ A oligo序列：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′。

1.2.3.3 cDNA末端的快速扩增 3′RACE PCR扩增体系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×BD Advantage 2 PCR buffer 5.0 μL，3′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL ，10 μmol/L SP2 1.0 μL，10 μmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×BD Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL。5′RACE PCR扩增体系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×BD Advantage 2 PCR buffer 5.0 μL，5′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL，10 μmol/L SP1 1.0 μL，10 μmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×BD Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL。其中，UPM是通用引物混合物，其长序列为：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，短序列为：5′-CTAATACGACTCACTATAGGG C-3′。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。取10 μL产物在1.0%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液、90 V电压条件下电泳30 min，其余产物用于回收。回收的PCR产物，进行电泳、回收、连接、转化和蓝白斑筛选。

1.2.3.4 重组质粒的PCR检测 将白斑挑起，液体培养过夜，进行菌液PCR检测。20 μL反应体系为：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 2.0 μL，菌液2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL，10 μmol/L SP（5′ RACE加SP1，3′RACE加SP2） 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL，加无菌ddH2O 至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环;72 ℃延伸 10 min;4 ℃保存。取10 μL产物在1.0%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液、90 V电压条件下电泳30 min，将含重组质粒的阳性菌液送上海生工生物工程技术有限服务公司测序。

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2 结果与分析

2.1 桑葚总RNA的提取结果

由图1可见，提取的桑葚总RNA样品可以看到3条带，分别为28S、18S和5S，其中28S、18S条带整齐清楚，且28S条带比18S条带更亮，5S条带非常暗淡，这说明桑葚的总RNA完整性较好，没有出现降解。RT-PCR扩增和RACE试验结果进一步证实，提取的桑葚总RNA质量较高、完整性好，能满足多数分子生物学试验要求。

2.2 桑葚白藜芦醇合酶保守区cDNA的PCR扩增与序列分析

将桑葚总RNA进行逆转录合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，以BP1和BP2为上、下游引物进行PCR扩增，得到1条800 bp左右的特异条带（图2）。

将该产物进行克隆、菌液PCR检测，将检测结果阳性的相应菌液送样测序，结果表明，该PCR产物的大小为806 bp。由此推导出的氨基酸序列编码268个氨基酸，其中包含植物芪合酶的活性中心和家族特征信号区，该PCR产物是桑葚白藜芦醇合酶保守区cDNA片段。

2.3 桑葚白藜芦醇合酶cDNA的RACE与序列分析

在桑葚白藜芦醇合酶保守区cDNA内，各设计1条正向引物SP2和反向引物SP1，采用BD SMARTTM RACE 技术，分别进行3′端和5′端的PCR扩增，电泳检测结果表明，3′RACE和5′RACE特异条带的大小均在500～750 bp之间（图3、图4）。将这2个特异片段进行克隆、菌液PCR检测，结果表明，3′RACE和5′RACE样品电泳都有预计大小的特异条带。测序结果表明，3′RACE产物的大小为635 bp，该序列与保守区有361 bp的重叠区，在第481～485 bp处存在加尾信号序列AATAA，在序列的末端含有19个A的poly（A）尾巴;5′RACE产物的大小为585 bp，该序列与保守区有232 bp的重叠区。由此推断，这2个片段分别是桑葚白藜芦醇合酶cDNA的3′端和5′端。

2.4 桑葚白藜芦醇合酶cDNA全长的获得与序列分析

由图5可见，桑葚白藜芦醇合酶cDNA编码区长度为 1 170 bp，编码389个氨基酸，该氨基酸序列含有芪合酶的活性中心序列GCFAGGTVLR和家族特征信号区GVLFGFGPGLT;在起始密码子ATG上游有11 bp的5′端非编码区，在终止密码子TAA下游有259 bp的3′端非编码区序列，其中，在第1286～1290 bp为加尾信号AATAA。

将桑葚与其他植物白藜芦醇合酶基因编码区核苷酸序列与氨基酸序列进行比较，结果（表1）表明，桑葚白藜芦醇合酶与花生的同源性较高，核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高分别达到82.82%和87.15%，与葡萄的同源性在60%左右。这说明桑葚白藜芦醇合酶基因与以往克隆的白藜芦醇合酶基因有一定的进化距离。

3 结论

近年来，人们发现至少21科31属72种植物中存在白藜芦醇，日常生活中人们喜闻乐见的食物如葡萄、桑葚、花生、凤梨等含有白藜芦醇，许多常见的药用植物中也含有白藜芦醇，如决明、藜芦、何首乌、虎杖等。已有资料表明，不同类群植物中白藜芦醇的含量差异很大，且多数植物中白藜芦醇含量都很低。笔者用高效液相色谱法测得桑葚中白藜芦醇的鲜质量

含量为26.88 μg/g[10]，这说明桑葚中具有较高活性的白藜芦醇合酶基因。本试验采用RACE方法成功克隆出桑葚的白藜芦醇合酶基因全长，为白藜芦醇合酶的基因工程奠定了良好的基础。

表1 桑葚与花生、葡萄白藜芦醇合酶基因编码区核苷酸

和氨基酸序列同源性比较

植物名称 基因登录号 核苷酸序列

同源性（%） 氨基酸序列

同源性（%）

桑葚 100 100

花生 AB027606 80.68 85.60

花生 AF227963 81.37 85.09

花生 AY170347 81.20 84.83

花生 AY826726 80.94 86.38

花生 DQ124938 80.85 85.60

花生 L00952 82.82 87.15

葡萄 AB046373 60.77 66.07

葡萄 AB046374 60.69 66.33

葡萄 AB046375 60.45 65.82

葡萄 AF128861 60.22 66.84

葡萄 AF274281 64.55 65.05

葡萄 DQ366301 63.16 66.58

葡萄 DQ366302 64.29 65.56

參考文献：

[1]李冬香，陈清西. 桑葚功能成分及其开发利用研究进展[J]. 中国农学通报，2009，25（24）：293-297.

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白藜芦醇的研究进展 篇4

关键词：白藜芦醇,制备方法,分析检测

法国人与西方其他发达国家居民一样以“高蛋白、高脂肪、高热量”的三高食品为主食, 但法国人冠心病、高血脂等心血管疾病的发病率远低于其他饮食习惯类似的国家, 这主要是因为法国人嗜好葡萄酒, 其人均葡萄酒饮用量居世界首位。据研究, 葡萄酒中含有许多天然多羟基类化合物, 这些化合物中除了类黄酮外, 还含有丰富的对人体健康有益的白藜芦醇。

白藜芦醇 (Resveratrol) 化学名为3, 4’, 5-三羟基-1, 2-二苯乙烯, 是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物, 分子式为C14H12O3 , 相对分子质量为228.25, 为无色针状结晶, 难溶于水, 易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二甲亚砜等, 有顺、反两种构型, 其中反式结构稳定, 生物活性更加广泛。白藜芦醇常与葡萄糖结合以苷的形式存在, 少量以游离态的形式广泛存在于葡萄、虎杖、藜芦、决明子和花生等天然植物或果实中, 到目前为止至少已在21科、31属的72种植物中发现了白藜芦醇[1], 它是许多植物受到真菌感染、紫外照射或病理状况下产生的一种植物抗毒素。

我国目前生产的白藜芦醇主要从虎杖中提取, 由于工艺技术水平的限制, 产品纯度较差, 多以粗产品使用或出口, 产品附加值较低, 因此开发生产高纯度白藜芦醇的工艺路线, 降低纯化的成本, 具有重要的经济意义。另外, 进一步挖掘富含白藜芦醇的植物品种, 例如葡萄、花生等, 通过人工栽培和育种手段获得高质量白藜芦醇的植物品种, 也是有效的途径之一。化学合成和生物合成法具有较好的前景,

但目前尚处于实验室研究阶段。

1 白藜芦醇的药理作用

白藜芦醇的结构式见图1。

白藜芦醇保健功能引起了欧美科学家们的普遍兴趣, 特别受到了生物学、医药学界的重视。近几年来, 对其药理作用进行了有价值的研究, 证实了它具有广泛的生理药理学作用[2]。

1.1 抗癌作用

1993年, Jayafilake等[3]研究表明反式白藜芦醇和顺式白藜芦醇都具有抗癌活性, 其原因是它们可以抑制蛋白质—酪氨酸激酶的活性。Jang等[1,4]研究小组进一步指出, 白藜芦醇在癌症发生的3个阶段即起始、增进和发展过程中, 都有较大的防癌活性, 且对癌症发生3个阶段都有抑制乃至逆转作用: ①抑制起始作用。减少自由基形成, 诱导Ⅱ期药代酶增多, 拮抗二噁英作用;②抑制增进作用。抑制环氧合酶 (COX) , 抑制过氧化氢酶;③抑制发展作用。抑制癌细胞增殖, 诱导癌细胞分化, 诱导癌细胞凋亡。

1.2 心血管保护作用

在民间, 早已用富含白藜芦醇的中药如虎杖、首乌治疗和预防高血脂、动脉硬化。研究表明, 白藜芦醇主要从以下几个方面发挥抗动脉粥样硬化、防治冠心病从而对心血管起到保护作用[5]:①调节血脂;②抑制血小板凝集, 促进纤维蛋白溶解, 抗血栓形成作用;③保护血管内皮, 抑制内皮细胞增殖; ④保护血管平滑机细胞, 抑制其增殖;⑤抗白细胞作用;⑥拮抗内皮素-1 (endothelinl , ET-1) 作用;⑦抗低密度脂蛋白氧化的功能。白藜芦醇及其衍生物是近年来研究较多的一类植物抗毒素, 其心血管保护作用渐渐地成为研究热点, 可望在预防和治疗心血管疾病的药物开发方面有所作为, 但是其作用机制远未明确, 有待进一步深入研究。

1.3 抗氧化、抗自由基作用

白藜芦醇是存在于植物中的天然抗氧化剂, 主要通过清除或抑制自由基生成, 抑制脂质过氧化、调节抗氧化相关酶活性等机制发挥抗氧化作用。

多羟基芪类物质大都具有抗氧化、抗自由基作用[6,7]。当白藜芦醇在1.3 μg/mL时, 能明显抑制大鼠红细胞的自氧化溶血和由H2O2引起的氧化溶血, 对小鼠心、肝、脑、肾的体内外过氧化脂质的产生有明显的抑制作用。白藜芦醇的抗氧化、诱除自由基和影响花生四烯酸代谢的药理功能引起了人们的广泛兴趣, 因为这些生理代谢涉及到与人体健康密切相关的许多生理疾病, 例如动脉粥样硬化、老年痴呆症、病毒性肝炎、胃溃疡、炎症与过敏反应等。

1.4 其他作用

除了上述3个重要的药理作用方面外, 白藜芦醇还具有雌激素调节[8]、抗突变[9]、抗菌消炎[10]、转基因[11]、辐射防护[12]等多方面的药理作用。此外, 新近的研究表明, 白藜芦醇还具有神经保护、治疗休克、美容、减肥等作用;例如, 可以被用作添加剂加到药品、酒类或化妆品中, 作为一种新型美容保健品以延缓人的衰老, 保持肌肤水分, 祛除疮类、黄褐斑, 防紫外线辐射等[13]。

2 白藜芦醇的制备方法

目前制备白藜芦醇主要有:植物提取法、生物发酵法或转基因法、化学合成法。

2.1 植物提取法

白藜芦醇是植物体中产生的一种次生代谢产物——二苯乙烯类多酚物质, 在植物体中的含量普遍很低。目前主要以含量相对较高的葡萄皮和虎杖为原料, 以有机溶剂 (甲醇、乙醇、丙酮等) 提取白藜芦醇。随着现代提取技术的应用, 发现微波及超声波辅助提取法可以提高白藜芦醇的提取率, 超临界CO2萃取法作为白藜芦醇的提取工艺也切实可行。此外, 逆流色谱、中压柱层析法、双水相萃取体系、H103大孔树脂都可用于富集、分离、纯化白藜芦醇。高速逆流层析分离效果好, 产品纯度高, 经HPLC检测, 反式白藜芦醇纯度可达99%, 但其提取成本相对较高, 白藜芦醇产率为2.18%[14]。可见, 越来越多的高新技术已被用于白藜芦醇的提纯研究, 其中不难发现, 学者们在兼顾高提取率的同时, 也考虑到了简化提取工艺、降低成本保护环境, 使提取方法向绿色化方向发展。

2.2 生物发酵法或转基因法

白藜芦醇是一种抗逆物质植物抗毒素 (Phytoalexin) , 在植物体内由芪合酶催化香豆烯和丙二酸单酰合成。谭琳等[15]从葡萄中分离克隆芪合酶基因, 构建植物表达载体, 导入番茄, 得到含有白藜芦醇的转基因植株。也有采用生物发酵技术对虎杖进行预处理, 以降低白藜芦醇的氧化损失和提高萃取产率。

2.3 化学合成法

通过研究人员不断摸索、改进, 发展到现在, 已报道的白藜芦醇化学合成方法[16]主要有Wittig、Heck、Perkin 及金属锂有机化合物制备、钯催化一锅法合成法等。

2.3.1 基于Wittig反应的合成路线

经若干步反应制得重要中间体磷叶立德, 再与醛缩合成烯, 若有顺反异构体, 需把顺式转为反式, 最后脱保护得白藜芦醇。此反应条件简单温和、原料易得、得率较高, 但路线长、消耗大、成本高。

2.3.2 基于Heck反应的合成路线

一般是芳卤或芳酰卤在钯盐催化下, 芳烯取代卤原子成芪, 脱保护得白藜芦醇。

2.3.3 基于Perkin 反应的合成路线

以3 , 5-二甲氧基苯甲醛和对甲氧基苯乙酸钠缩合成烯, 得顺反构型混合物, 脱羧, 再置于甲醇和浓盐酸的混合液中48 h , 得反式产物, 脱保护得白藜芦醇;或用3 , 5-二异丙氧基苯甲醛和对异丙氧基苯乙酸钠在三乙胺和乙酸作用下缩合成烯得单一顺式产物, 在喹啉和催化剂作用下脱羧, 再把顺式产物转化成反式, 最后脱去异丙氧基得到白藜芦醇。

2.3.4 其他合成路线

用3, 5-二甲氧基苯甲醇与三甲基氯硅烷反应, 再与对甲氧基苯甲醛缩合成醇, 脱水得烯, 最后脱保护得白藜芦醇。此路线收率尚可, 但原料3, 5-二甲氧基苯甲醇成本高, 且实验大部分要求无水条件。此外, 还可利用固相载体接上原料做反应底物, 最后脱去固相载体, 此法便于分离产物, 操作简便。

3 白藜芦醇的分析检测方法

目前, 白藜芦醇的检测方法主要有高效液相色谱 (HPLC) 、毛细管电泳 (CE) 、薄层扫描 (TLC) 和气相色谱-质谱联用 (GC-MS) 等。

3.1 高效液相色谱法

高效液相色谱是在定性的基础上定量, 以纯物质作为标准物, 由已知量的被测物标样推算混合物中被测物的量[17]。它是中药制剂质量评价中常用的分析方法, 也是目前企业及科研单位精确定量白藜芦醇的主要方法。王华[18]等人采用直接进样法将处理好的酒样通过C18柱, 乙腈-水流动相 (体积比=1∶9～9∶1) 进行梯度洗脱, 在紫外检测器306 nm下, 外标法定性、定量地测出不同葡萄酒中的白藜芦醇的含量。张予林[19]等人采用HPLC法测定葡萄酒中的白藜芦醇, 将酒样经超滤脱气后直接进样, 色谱条件:固定相为shim-park VP-ODS C18柱, 流动相为乙腈-水 (体积比40∶60) 进行等压洗脱;流速:1.0 mL/min, 检测波长为306 nm, 进样量10 μL 。结果表明, 白藜芦醇含量在0.25～40 mg/L的范围内呈良好的线性关系。高年法等人[20]采用SCR-101H 柱, 流动相为φ (乙腈) =40%的水溶液, 流速为0.6 mL/min , 柱温为25℃, 检测波长为306 nm , 进样量20 μL , 测出了葡萄酒中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量。

高效液相色谱法具有简便快捷、选择性好、准确度高的特点, 但因白藜芦醇的异构化会导致测定损失, 样品需要量大, 待测组分损失较为严重。

3.2 毛细管电泳法

毛细管电泳是利用不同离子所带电荷及性质的不同, 迁移速率不同以达到分离目的, 其高效、高速、微量和低消耗等优点在分析领域中具重要的应用和发展前景。刘芳华[21]等人以毛细管电泳结合电化学检测 (ED) 测定了葡萄和葡萄酒中的白藜芦醇含量。在优化条件下, 以300 μm直径的碳圆盘电极为工作电极, 工作电位为+0.85V (vs.SCE) , 在100 mmol/L硼酸盐 (pH=9.2) 的运行缓冲液中, 被测物浓度与峰电流在3个数量级范围内呈良好线性, 检出限为1×10-7 g/mL。曹佳[22]等人在80 mmol/L硼酸盐 (pH=8.93) 的运行缓冲液中, 采用电动进样, 进样电压为12 kV, 进样时间10 s、分离电压15 kV的条件下, 测定葡萄皮中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量, 检出限为1.25×10-4 g/L, 线性动态范围分别是4.88×10-4～0.31 g/L 和5.37×10-4～0.34 g/L 。

用毛细管电泳法测定白藜芦醇, 所需设备和程序较简单, 测定的定量分析结果与高效液相色谱和气-质联用一致[23], 准确度高。

3.3 薄层扫描法

薄层扫描利用薄层色谱斑点 (组分) 发出的荧光强度或利用荧光薄层板上暗斑的荧光淬灭程度进行定量分析;在对二苯乙烯类化合物的含量测定研究中, TLC 法是较早应用的分析方法。陈敏[24]等人以薄层扫描法同时测定葡萄酒中顺反白藜芦醇及其糖苷异构体的方法, 样品用C18固相柱提取, 以聚酰胺薄膜为固定相, 苯-甲醇-甲酸 (体积比为10∶5∶1) 为展开剂进行分离, 荧光扫描法定量, 4种组分的线性关系良好, 相关系数为0.9972～0.9996, 平均回收率为97.1%～98.5%, RSD为2.0%～3.2%。

薄层荧光扫描法的检测灵敏度较低, 与高效液相色谱相比, 适用范围较窄。

3.4 气-质联用法

气-质联用法就是利用气相色谱对混合物的高效分离能力和质谱对纯物质的准确鉴定能力而开发的分析仪器法。气相色谱是质谱的样品处理器, 质谱是气相色谱的检测器。李攻科[25] 等人在SPE-GC-MS 法测定葡萄酒中顺反式白藜芦醇中确定了GC2MS 操作条件:色谱条件, 进样口温度280℃, 柱温采用程序升温, 初温100℃, 保持2 min后, 以10℃/min速度升至300℃, 恒温10 min, 载气为纯氦气, 流速为110 mL/min;质谱条件, 接口温度280℃, EI离子源, 电子能量70 eV, 离子源温度230℃, 四极杆温度106℃, 电子倍增器电压1400 V, 质量扫描范围30～550。

气-质联用法耗时少、样品用量少、待测组分损失少;但如果不衍生化而直接进样, 色谱峰拖尾严重, 且处理后的样品容易带水;样品衍生化后测定其含量, 会更为简便、快速、损失小, 适于大批量样品的测定。

4 白藜芦醇的应用前景

白藜芦醇的抗氧化作用是其具有多重生物学效应的重要机理之一。对人类多种常见病的防治具有重要意义, Hung 等[26]研究证实白藜芦醇的抗氧化作用强于维生素E 及维生素C, 并能清除自由基, 尤其是羟自由基, 使DNA免受损伤, 还可通过抑制二硫化谷胱甘肽的形成, 使谷胱甘肽处于还原状态, 从而抑制自由基的形成, 故将其开发成具有抗氧化作用的保健食品有较大的空间和市场潜力。白藜芦醇是存在于多种常用中药, 如虎杖、藜芦、决明子中, 也是食物如葡萄、花生等天然植物中的功效成分, 对人体有良好的抗自由基作用, 可用于化妆品中, 对皮肤起到防衰老、防紫外线辐射的保护作用, 故将其作为化妆品开发也具有较高的价值。白藜芦醇是具有雌激素活性的新型植物雌激素, 能通过促进骨形成和抑制骨吸收两者机制来抑制雌激素缺乏所诱发的骨丢失, 对中老年妇女绝经后骨丢失所致的骨质疏松等具有潜在的预防作用, 针对这些作用可以将白藜芦醇开发成对妇女具有特殊保健作用的保健食品。白藜芦醇抑癌作用及机理研究日趋成熟和明确, 是继紫杉醇之后的又一新的绿色抗癌药物。近年来, 欧美各国已将其开发成保健食品上市, 剂型有片剂、胶囊、口服液等。

白藜芦醇 篇5

儿茶素、白藜芦醇在离子液体双水相体系中的萃取性能研究

建立了室温离子液体氯化1-丁基-3-甲基咪唑-磷酸氢二钾双水相萃取体系,并采用紫外光谱法研究了儿茶素和白藜芦醇在该双水相体系中的.萃取性能.考察了儿茶素和白藜芦醇在氯化1-丁基-3-甲基咪唑-磷酸氢二钾双水相萃取体系中的稳定性,溶液pH值、儿茶素及白藜芦醇含量对儿茶素和白藜芦醇萃取回收率的影响.结果表明,儿茶素和白藜芦醇在双水相体系中的紫外光谱与在乙醇中的相同并具有足够的稳定性.pH值为3时,儿茶素含量在16.7~66.8 mg・L-1范围内的萃取回收率令人满意,白藜芦醇含量在0.45~0.9 mg・L-1范围内可获得定量萃取.

作 者：黄建林 彭瑾 HUANG Jian-lin PENG Jin  作者单位：湖北大学化学化工学院,湖北,武汉,430062 刊 名：化学与生物工程  ISTIC英文刊名：CHEMISTRY & BIOENGINEERING 年，卷(期)：2009 26(11) 分类号：O642.54 关键词：氯化1-丁基-3-甲基咪唑-磷酸氢二钾双水相体系   萃取   儿茶素   白藜芦醇   紫外光谱法  

白藜芦醇 篇6

【摘要】目的：建立一种测定爬山虎茎中白藜芦醇含量的方法，并对不同产地的爬山虎进行测定。方法：使用Agilent TC-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-水（45∶55）；柱温：35℃；体积流速：1mL/min；检测波长：290nm；进样量均为10μL。结果：爬山虎中白藜芦醇的进样量在0.002168～0.03252mg/mL范围内呈良好的线性关系，平均回收率为101.2%，RSD值为0.84%，且精密度、稳定性、重复性均良好。结论：该方法可以精密、快速、稳定和高效的测定爬山虎中白藜芦醇的含量。

【关键词】爬山虎茎；白藜芦醇；含量测定；HPLC

【中图分类号】R284.2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）21-0017-03

Determination of Resveratrol in Different Areas of Boston Ivy Stem by HPLC

BAO HuiweiHOU XiaolinLIU FangxinZHANG ChenLIU Jia*

Changchun University of Chinese Medicine， Changchun 130117， China

Abstract： Objective To establish a method for the determination resveratrol in Boston ivy stem in different places. Methods The chromatographic column： Agilent TC-C18 （4.6mm×250mm， 5μm）； The mobile phase： methanol-water（45∶55）； The column temperature： 35℃； The volumetric flow rate： 1mL/min； The UV detector was set at 290nm； The sample size： 10μL. Results Resveratrol showed good liner relation when the content was during 0.002168mg/mL～0.03252mg/mL in the samples， the average recovery was 101.2%， RSD=0.84%， good stability， precision and repeatability； Conclusion This method can determine the contents of trans-resveratrol in Boston ivy stem， it is fast， accurate and stable.

Keywords：Boston Ivy Stem； Resveratrol；Content Determination； HPLC

爬山虎（Parthenocissus tricuspidata S. Z.）系葡萄科爬山虎属落叶多年生多分枝木质大藤本，又名地锦、爬墙虎[1-2]。爬山虎茎长10～30m，枝端卷须可发育成粘性吸盘有很强的吸附、攀援能力，可攀援光滑的墙壁和裸露的岩石[3]，具有良好的生态适应性，是装饰墙壁、 假山的园林植物。近年来，人们对其黏附、繁殖以及绿化方面的研究较多，其同样具有良好的药效作用，如在抑菌[4]、抗氧化[5]等方面。爬山虎中药用活性成分较多，包括多糖、红色素、多酚类、黄酮类成分等，其中白藜芦醇在抗血栓[6]、抗肿瘤[7]、改善和治疗心血管疾病中起着重要的作用[8-10]，其结构见图1，且白藜芦醇在自然界中更加稳定，药效较顺式更强，从爬山虎中分离白藜芦醇也成为其获得方法之一[11]。鉴于爬山虎较高的药用价值，却缺少质量控制方法，本研究利用HPLC法建立一种测定爬山虎中白藜芦醇的方法，以评价不同产地的爬山虎[12]。

1仪器与材料

1.1仪器安捷伦1260型液相色谱仪（美国安捷伦有限公司）；AVW20D型电子天平（日本岛津制作所）；RE 52-99旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-400KDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2材料反式白藜芦醇对照品（批号：111535-200502，中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯，美国FISHER公司），乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚（分析纯，北京化工厂），水（纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司）。样品经长春中医学院李波老师鉴定为葡萄科爬山虎属落叶多年生多分枝木质大藤本植物爬山虎茎（Parthenocissus tricuspidata S. Z.），来源及批号见表1。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适应性试验[7] 色谱柱：Agilent TC C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：甲醇-水（45∶55）；柱温：35℃；体积流速：1mL/min；检测波长为290nm；进样量均为10μL。理论塔板数按白藜芦醇计算均不低于1500。在此条件下，白藜芦醇与其他物质分离度均符合药典规定，白藜芦醇标准品和爬山虎茎供试品色谱图见图2、图3。

2.2对照品溶液的配制精密称取白藜芦醇对照品10.22mg，置1000mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成0.01022mg/mL的白藜芦醇对照品溶液。

2.3供试品溶液的配制将干燥的爬山虎茎粉碎，过60目筛，精密称定10.5g，加200mL的乙酸乙酯超声提取约20min，过滤，在药渣中加入200mL乙酸乙酯超声提取约20min，过滤，并用200mL乙酸乙酯洗涤药渣，合并乙酸乙酯提取液，旋蒸60℃蒸干，用色谱甲醇溶解并用定容于10mL容量瓶中。

2.4线性关系考察精密称取白藜芦醇对照品10.84mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别吸取0.2、0.6、1、1.5、2、3ml，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。即浓度为0.002168、0.006504、0.01084、0.01626、0.02168、0.03252mg/mL的线性关系对照品溶液。按照“2.1”方法，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积。以色谱峰面积（Y）对溶液浓度（X）作图，得到白藜芦醇的回归方程为Y=31552X+6.2003，r=0.9995（n=6），表明白藜芦醇在0.002168～0.03252mg范围内呈良好的线性关系。

2.5精密度试验按照“2.1”项下方法分别精密吸取对照品溶液和爬山虎供试品溶液（批号为20150801）各10μL，重复进入高效液相色谱仪6次，测得白藜芦醇对照品和供试品色谱峰面积的RSD值分别为1.79%和1.82%，结果表明此方法精密度良好。

2.6稳定性考察分别在0、2、4、6、8、10、12、24h时，按照“2.1”项下方法分别精密吸取对照品溶液和爬山虎茎供试品溶液（批号为：20150601）10μL，依次进样，测得白藜芦醇对照品和爬山虎供试品色谱峰面积的RSD值分别为1.65%和1.01%（n=8），结果表明供试品溶液中白藜芦醇和对照品在24h内稳定。

2.7重复性实验取爬山虎茎供试品（批号：20150601）6份，每份约10g，精密称定，按“2.3”项下制备供试品溶液，依法进行含量测定，测得白藜芦醇色谱峰面积，并计算出其含量的RSD值为1.95%，结果表明此方法重复性良好。

2.8加样回收率实验取白藜芦醇对照品6份，每份约10mg，定容至100mL容量瓶中，吸取0.5mL，分别加入6份约5g的爬山虎茎供试品（批号：20150601），按“2.3”项下制备供试品溶液，并进行含量测定，计算回收率。结果白藜芦醇的平均回收率为101.2%，RSD值为0.84%（n=6），表明此方法回收率良好。结果见表2。

2.9样品测定取不同产地爬山虎样品，按照“2.3”项下制备供试品溶液，分别精密吸取“2.2”项下对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪器中，依法进行含量测定，记录色谱峰面积，并按照外标法计算供试品中白藜芦醇的含量。结果见表3。

3讨论

3.1提取方法的考察分别考察超声提取法、回流提取法对爬山虎中白藜芦醇的提取，发现两种方法均有很好的提取效果。但是回流提取法需要提取时间较长，且其液相色谱图杂质峰较多，故选取超声提取法对爬山虎进行提取。通过对比甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚等试剂对爬山虎的提取结果，发现除石油醚外，提取效果均很好，但其中乙酸乙酯色谱图中干扰主峰的杂质最少，最利于白藜芦醇的分离和测定。

3.2流动相的考察选择甲醇-水和乙腈-水体系对白藜芦醇进行分离，不断的改变有机相和水相的比例，最终确定甲醇-水（45∶55）为最佳分离比例，可将白藜芦醇和其它物质很好的分离开，且分离时间较短，峰形良好。

3.3检测波长的考察因爬山虎茎中成分极其复杂，故通过二极管全波长阵列检测器对供试品在190～400nm波长下进行分析，发现在290nm下，白藜芦醇吸收较好，且在此波长下其与爬山虎中其它组分分离度良好。

爬山虎虽然是一种具有良好药效的药材，但人们往往对于其爬墙能力方面研究较多，对于其药用价值方面研究较少。通过对其成分的分离，发现其中含有较高含量的白藜芦醇。白藜芦醇具有良好的抗肿瘤活性和治疗心血管疾病等药效作用，来近些年来备受人们关注，市场的需求也日益增加。由于爬山虎价格低廉，且生长速度极其迅速，从爬山虎茎中提取、分离反式白藜芦醇也是一种可行的方法。白藜芦醇的含量直接影响其质量，故测定其中白藜芦醇的含量非常重要。本研究建立了一种精密、快速、稳定、高效的HPLC测定方法，测定不同产地爬山虎茎中白藜芦醇的含量，建立了一种可靠的质量评定方法，此方法为其质量控制奠定了研究基础。

参考文献

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白藜芦醇的制备方法研究进展 篇7

一、白藜芦醇的制备方法

1. 天然植物中白藜芦醇的提取。

白藜芦醇是一种多酚类化合物, 易溶于有机溶剂。目前主要以含量较高的虎杖、葡萄 (皮、籽) 等植物为原料, 先将原料经过粉碎处理, 再用溶剂渗滤或加热回流提取, 然后对提取物进行萃取分离。提取溶剂有甲醇、乙醇、乙酸乙酯等, 萃取分离剂有氯仿、石油醚、乙酸乙酯等。这些传统方法, 或因所需浸提时间长, 溶剂用量大, 生产成本高;或因回流所需温度高, 造成白藜芦醇活性成分分解、挥发损失, 提取效率低。随着对白藜芦醇研究的深入和高新提取技术的应用, 从植物中提取白藜芦醇的先进工艺不断涌现, 相对于传统的提取方法, 这些新的提取工艺不仅大大提高了白藜芦醇的提取率, 而且减少提取时间, 缩短生产周期。从植物中提取的天然白藜芦醇具有食用安全的特点, 符合人们追求纯天然无污染的时尚生活要求。

(1) 有机溶剂提取法。白藜芦醇的提取由于所用植物原料不同, 提取物的组分也有所不同, 除含白藜芦醇外, 大多还含有白藜芦醇苷、酒石酸、单宁等多种成分。因此, 为了提高白藜芦醇的纯度, 溶剂的选择是关键, 提取白藜芦醇常用的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等。

(2) 微波提取法。微波提取, 是指使用适合的溶剂在微波反应器中, 从天然药用植物中提取化学成分的技术和方法。可缩短实验时间和生产时间、降低能耗、减少溶剂用量以及废物的产生, 同时可提高收率和提取物的纯度。

(3) 超声波提取法。超声波是指高于20k Hz的声波, 上限可高至与电磁波的微波区重叠。超声波提取作为一种有效提取方法, 在植物的有效成分提取中得到了广泛应用, 应用超声技术来强化提取过程, 可有效提高提取效率, 缩短提取时间。与常规方法相比, 超声波提取方法有操作简单、提取时间短、得率高、无需加热等优点。林轶等对超声波法提取葡萄皮中白藜芦醇进行了研究, 正交试验结果表明:采用超声波提取方法, 在40%的乙醇溶液中按液料比为12 1, 超声功率为104W、室温的条件下处理30min, 白藜芦醇的提取得率最高, 为3.50mg/g。

(4) 超临界流体萃取法。超临界流体萃取是利用超临界状态下的流体为萃取剂, 萃取有效成分并进行分离的方法。超临界流体萃取技术, 萃取能力强、提取效率高、生产周期短, 极少损失易挥发组分或破坏生理活性物质, 无溶剂残留, 产品质量高。缺点是设备投资较大, 生产成本高。张青松等人对采用超临界二氧化碳从葡萄皮渣中萃取白藜芦醇进行了研究, 结果表明:萃取各因素效应从大到小的顺序为, 压力>温度>时间, 在38℃、13 MPa下萃取17min效果最好, 在此条件下白藜芦醇平均得率达0.087%。

2. 白藜芦醇的化学合成法。

白藜芦醇的天然提取成本高, 真正具有开发价值或已被利用的目前只有虎杖、葡萄、花生等少数白藜芦醇含量相对较高的植物。从天然植物中获取大量白藜芦醇面临着资源短缺的问题。寻找获取更多白藜芦醇的有效途径, 利用化学方法制备白藜芦醇也成为研究的热点之一。

化学合成获取白藜芦醇归纳起来主要是包括Wittig反应、Wittig-Horner反应、Perkin反应、Heck反应以及碳负离子与羰基化合物的缩合反应。国内研究较多的是Wittig和Wittig-Horner工艺, 但其反应步骤较多及收率较低的问题一直没有得到很好的解决。利用碳负离子与羰基化合物的缩合反应合成白藜芦醇的路线也存在此类问题。Perkin反应合成白藜芦醇路线, 其中的脱羧步骤条件的优化, 特别是缩合脱羧一步同时进行如何得以实现, 是很好的发展方向。Heck反应合成白藜芦醇路线以其反应条件温和、立体选择性高、去保护容易、反应步骤少等优势, 最近几年来深受关注。都建立等提出了一条白藜芦醇合成的新方法, 在合成过程中, 羟基无需保护和去保护, 无需昂贵的脱甲基试剂, 且脱羧和异构化一步完成, 仅三步反应就成功合成了白藜芦醇。各中间体及产物结构经检验得到确证。反应中, 通过对3, 5-二甲氧基苯甲醛的脱甲基反应收率的影响因素综合考虑, 确定最佳条件为:在1, 2-二氯乙烷中, n (Al Cl3) :n (3, 5-二甲氧基苯甲醛) =4.5 1, 反应温度80℃, 反应时间12小时。该路线与国内外报道的方法比, 具有路线简捷、反应条件温和、操作简单、收率高、经济性好、脱甲基步骤成本低、脱羧—异构化一步完成、反应专一性等特点, 具有一定的工业应用价值。

3. 生物工程技术法。

(1) 植物细胞培养法。把本来应在天然环境中成长的植物, 在不改变其天然属性的前提下, 置于完全人工控制的反应环境中, 并利用优化的细胞繁殖条件促使植物细胞高速繁殖, 把每一个植物细胞都变成能够自然合成的有用化合物, 然后从细胞中提取对人类有用的天然活性成分物质。郭斌等通过He-Ne激光辐照, 用农杆菌株感染过的葡萄皮脱分化组织, 进行诱变处理, 通过继代培养得到的高产Res细胞系遗传性状稳定、生长迅速、生长周期短。

(2) 转基因法。白藜芦醇是一种抗逆物质植物抗毒素, 在植物体内由芪合酶催化香豆烯和丙二酸单酰合成。谭琳等从葡萄中分离克隆芪合酶基因, 构建植物表达载体, 导入番茄, 得到含有白藜芦醇的转基因植株。也有人采用生物发酵技术对虎杖进行预处理, 以降低白藜芦醇的氧化损失和提高萃取产率。

二、展望

白藜芦醇的生理功能及其应用前景 篇8

1 白藜芦醇的生理功能

1.1 对心血管疾病的防治作用

Res对心血管的作用主要是通过抑制血小板聚集和调节血脂水平两种机制发挥作用。(1)过量或不适当的血小板聚集,可导致血栓形成,进而导致缺血性疾病的发生。如心肌梗死、缺血性脑血管病变、缺血性视神经病变等。Res能抑制血栓素B2(TXB2)的形成,抑制二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、凝血酶和胶原引起的血小板聚集[2]。(2)Res可增加血液中高密度脂蛋白(HDL)的浓度,调节低密度脂蛋白(LDL)的比例,显著降低血清胆固醇、甘油三酯含量,具有降血脂、防止动脉粥样硬化的作用[3]。(3)Res有抗氧化和清除自由基功能。姜淑芳等[4]实验观察Res对冠状动脉结扎诱发的大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。结果显示:Res能舒张血管,降低大鼠心肌冠脉结扎后抬高的ST段,降低LDH和MDA水平,升高SOD、GSH-PX水平,抑制bax而增强bc1-2的表达,减少心肌细胞凋亡。表明Res对心肌缺血再灌注损伤的保护作用与其具有抗氧化、清除自由基及增加一氧化氮(NO)合成等有关。Res有明显的舒张血管作用,生理浓度(0.1μmol/L)的Res能够使血管舒张,因而能降低血压和降低心血管病的风险[5]。最近的研究表明Res是一种有效和有前途的预防心脏功能紊乱的分子[6]。

1.2 肝脏保护作用

欧阳昌汉等[7]试验表明大剂量给予雌性小鼠致肝损伤药物CC14和D-半乳糖胺(D-Ga N)诱导,引起严重的肝细胞损害,Res对这两种药物引起的肝损害有明显的保护作用,表现为AST和ALT活性降低,甘油三酯(TG)含量下降。高低剂量组Res均可明显降低肝组织MDA和NO含量,增加机体内源性抗氧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,表明Res的保肝机制与其清除自由基、抗脂质过损伤及抑制NO的产生密切相关。刘永刚等[8]发现Res具有抗纤维化作用。肝纤维化发生的最终共同途径是肝星状细胞(HSC)的激活,转化为成纤维细胞。实验结果表明Res明显改善CC14损伤后肝细胞存活率,抑制CC14引起的ALT、MDA活性升高,并明显抑制HSC氧应激后MDA活性升高和SOD活性降低,抑制增殖和Ⅰ型胶原的生成,具有抗纤维化的作用。孙水平等[9]也发现Res能明显降低谷丙转氨酶(GPT)的活性,促进肝功能恢复,改善肝脏显微结构,对成年大鼠肝脏缺血再灌注损伤有良好的保护作用。孙中杰等[10],实验研究表明Res对肝癌H22细胞的增殖具有抑制作用,能引起H22细胞S期阻滞。杜强等[11]实验结果表明Res除了通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡来抑制肝肿瘤生长外,还存在另外的抗肿瘤机制,即通过抑制肿瘤细胞的黏附力及降解基质能力两个环节来抑制肿瘤细胞侵袭,并存在一定的细胞选择性。

1.3 抗肿瘤作用

Res在肿瘤起始、增殖及发展的3个阶段均有抑制甚至逆转作用、即通过抗氧化、抗突变、诱导2期药代酶的作用,发挥抗起始活性;通过抗炎、抑制环加氧酶和氢过氧化物的活性,在肿瘤的增殖阶段起抑制作用;诱导人早幼粒白血病细胞的分化而抑制肿瘤的发展。

1.3.1 抗氧化、抗自由基作用

体内氧化水平异常升高与癌症发生密切相关,尤其是活性氧自由基的过表达,除可引起机体DNA氧化损伤而导致原癌基因活化和抑癌基因失活以外,还可以干扰细胞内细胞因子、代谢酶等正常表达和活性,而这些均有一定促癌作用。Res具有较强的抗氧化活性,清除自由基及影响花生四烯酸代谢的药理作用[12]体外。实验发现[13]Res能抑制黑色素瘤细胞氧自由基的合成并抑制其增殖。

1.3.2 抑制部分酶类

抑制细胞色素酶:Res是细胞色素P450的抑制剂,能通过抑制AHR介导的CYR基因反式激活以及通过抑制自由基的产生控制肿瘤始发突变。在体内外的很多器官中,肿瘤细胞内的CYP1B1能通过催化Res生成羟基化产物而抑制肿瘤生长。Res呈浓度依赖性的降低CYP1B1m RNA的表达下调CYP1B1基因表达,发挥抑瘤作用。Res还可通过干预二恶英受体与CYP1A1酶活性发挥抑瘤作用。

抑制环氧化物酶:环氧化物酶(cyc10 Oxygenase,cox)是在花生四烯酸转变成前列腺素过程中的限速酶,它由2个同分异构体,Cox-1和Cox-2。Cox-2的表达可导致前列腺素水平增高,其中前列腺素E2最重要,可通过多种机制影响肿瘤的发生、发展,其中包括肿瘤细胞的增殖、抑制正常的免疫监视作用。Res对Cox-1和Cox-2均有直接抑制作用,并能通过抑制蛋白激酶C信号转导通过抑制Cox-2的基因表达[14]。在食管癌动物模型研究中发现,Res可使肿瘤组织中的Cox-1 m RNA和Cox-2 m RNA的表达降低,前列腺水平明显减少,从而干预该模型食管癌的形成。相关的研究在乳腺癌和肠癌中亦有报道[15]。

1.3.3 抑制DN A合成,阻滞细胞周期与诱导肿瘤细胞分化

细胞周期调控机制的破坏,导致细胞失控性生长。大多数抗癌物质可以使细胞周期停滞在G1、S、M期的某一阶段,造成细胞周期的阻滞。Res阻滞细胞周期其机制可能为Res通过诱导半胱氨酸蛋白酶caspase-3的激活。从而分解DNA修复酶,通过清除RNA还原酶的酪氨酞基来抑制RNA还原酶活性,降低DNA合成能力,达到抑制细胞增殖作用[16]。Res对细胞周期所发挥的作用主要是减少处在G0到G1期的细胞和阻滞S期的细胞,即G1~S和S~G2期,从而抑制癌细胞的增殖[17]。STERVBO等[17]通过对人白血病HL~60细胞的分化系统的模型研究,发现Res能引起粒细胞和巨噬细胞减少,表明Res能诱导人早幼粒细胞白血病细胞的分化,从而证明对肿瘤发展阶段有明显抑制作用。

1.3.4 干预细胞增殖相关的信号传导通路

Res可以通过抑制NF-k B,D13K/Akt,MAPK等信号转导途径发挥抗肿瘤活性,抑制细胞增殖。

1.3.5 抑制端粒酶

端粒(telomere)是染色体末端由DNA与调节蛋白组成的特殊复合体,有维持细胞稳定的作用。85%的肿瘤细胞具有端粒酶的活性,从而导致肿瘤细胞永生化。目前研究表明Res可以使肿瘤细胞的端粒酶活性明显下降,并随Res浓度的增加而加强,使肿瘤细胞退出周期而死亡。

1.3.6 诱导肿瘤细胞凋亡

通过P53基因触发凋亡:P53作为一种抑癌因子,正常情况下具有修复错误基因,使突变细胞停滞于G1期,诱导细胞分化和凋亡的功能。野生型P53蛋白在调亡诱导中发挥重要作用,很多实验结果表明P53可能是Res诱导细胞凋亡的重要机制。DONG[19]在实验中发现Res可以通过激活P53依赖性途径而诱导小鼠上皮细胞癌JB6细胞凋亡。

通过Bcl-2家族诱导肿瘤细胞凋亡:Bax的过表达可促进细胞死亡,Bc1-2可抑制Bax的功能。在Res对食管癌细胞株、胃癌细胞株的研究中均发现了Bcl-2表达的减少及Bax表达的增加,由此可见,Bc1-2/Bax下降的途径是Res诱导肿瘤细胞发生凋亡的重要途径。

通过线粒体介导肿瘤细胞凋亡:Res作用于淋巴细胞性白血病,线粒体膜损伤,从而激活caspase3导致凋亡。

1.3.7 抑制肿瘤血管形成

血管对肿瘤细胞起到营养转运的作用,新生血管的形成与肿瘤发生、发展、转移、复发密切相关。TSENG等[20]发现Res能抑制小鼠Lewis肺癌的增殖和转移并发现该作用能抑制血管内皮生长因子的表达,从而抑制肿瘤血管生成。在人乳腺癌裸鼠移植瘤实验中Res可通过下调血管内皮生长因子的表达而抑制肿瘤血管的生成[21]。由此可见Res具有抑制新生血管形成的作用。可望在预防和治疗病理性血管生成药物开发方面发挥作用。

1.4 免疫调节作用

唐明增等[22]研究发现,Res对小鼠免疫功能有较好的调节作用。姚煜等[23]发现Res具有抗衰老免疫机制,可以抵抗自由基及其代谢产物引起的脂质过氧化导致的老化,能减缓肌体胸腺萎缩,从而使T细胞数量增加,功能增强,提高机体免疫功能,延缓机体的损伤过程,具有一定的抗衰老作用。安利峰等[24]研究说明Res能提高免疫,抑制小鼠的细胞、体液免疫应答水平、调节细胞因子分泌,从多方面有效增强免疫功能。

1.5 抗菌、抗病毒作用

1.5.1 抗菌作用

Res在较低的浓度下对葡萄球菌和皮肤癣菌即有很好的抑菌效果,对皮肤癣菌抑菌作用尤为显著。Res干扰葡萄球菌细胞壁的合成,同时损伤细胞膜,影响菌体正常的细胞周期,抑制胞内物质复制。皮肤癣军的抑制作用可能是破坏细胞壁,并进入细胞内部,使细胞内离子平衡失调,导致p H值渗透压改变,损伤基质。或是两种机制同时协同作用的结果[25]。

1.5.2 抗病毒活性

(1)抗流感活性:Res通过阻碍病毒复制过程中所必须蛋白质(如红细胞凝集素)的生成而发挥作用的,并且限制病毒RNA蛋白从细胞核到细胞质的运输,阻碍病毒增殖[26]。(2)杨子峰等[27]实验发现Res具有一定的体内抗小鼠艾滋病毒作用。近年来美国天然药物研究所(CNN)发现Res具有抗艾滋病作用。(3)有预防急性传染性非典型肺炎(非典)等药用价值[28]。

1.6 雌激素样作用和对骨代谢的影响

美国GEHM·B博士等发现,Res的化学结构与一种雌激素-二乙基乙烯雌酚很相像。可以竟争其受体的结合空间。对受体进行活化,起雌激素的信号转导作用[29]。因此把Res视为一种植物雌激素。雌激素在骨代谢中发挥重要作用,试验证明当体内雌激素缺乏时(妇女绝经期)Res具有良好的防治骨质疏松作用。

1.7 对代谢及生命周期的影响

RODGERS等[30]研究表明SIRTI(sirtuin typel)能通过转录其激活因子PGC-1α调节许多物种的衰老和控制肝糖原异生/糖酵解途径。HEILBRONN等[31]研究表明CR(caloric restriction)能够调节葡萄糖的利用率和胰岛素的敏感性,并提高人体的代谢速率。Res可通过SIRTI的介导来行使以上功能。Res还可提高胰岛素敏感性,对防治Ⅱ型糖尿病有一定作用,这一过程也是通过SIRTI在染色质水平下调PTPIB基因的转录来实现的[32]。

1.8 抗辐射损伤作用

Res具有明显的抗辐射防护作用,其作用机制与抑制辐射敏感细胞的细胞凋亡有关。清除辐射诱导产生的自由基和抑制脂质过氧化可能是Res抗辐射的原因[33]。

2 白藜芦醇的应用及发展前景

白藜芦醇存在于多种植物中,而且具有多方面有益与人类健康的生理作用和药理活性,被广泛应用于医药、保健品和食品添加剂等领域,目前国内已将含有白藜芦醇的植物提取物制成有降脂、美容、减肥、抗癌胶囊;还将其添加到各种酒中,配制出对心血管疾病有良好防治作用的保健佐餐酒。在美国、日本、加拿大等国,Res保健食品已被消费者广泛接受。被美国《抗衰老圣典》列为“100种最有效的抗衰老药物之一”,已将其做成膳食补充剂,成人每日推荐剂量为4 mg。日本将其作为食品添加剂。白藜芦醇作为一种天然的有多种生物学功能的植物化合物,具有降脂、抗氧化、抗癌、保护心脑血管、保肝、抗衰老、免疫调节及雌激素样作用等,随着研究的不断深入有望开发成为可防治多种疾病的新型药物,具有广泛的应用前景。

摘要：白藜芦醇是广泛存在于葡萄、花生、虎杖、藜芦、决明等植物中的活性物质,具有抗肿瘤、抗炎、保肝、调节血脂、抗动脉粥样硬化及植物雌激素等多种生物作用,本文简要论述了白藜芦醇的生理功能和应用前景。

白藜芦醇 篇9

1 白藜芦醇的化学结构及理化性质

白藜芦醇是蒽醌萜类(非黄酮类)的多酚化合物,具有酚和芪的特性,分子式为C14H12O3,相对分子量为228.25;无味、白色针状结晶,难溶于水,易溶于乙醚,氯仿、甲醇、乙醇、丙酮等有机极性溶剂。其溶解性大致为:丙酮>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>乙醚>氯仿;在366 nm的紫外光照射下产生紫色荧光,遇氨水等碱性溶液显红色,遇镁的甲醇溶液显粉红色,并能和三氯化铁-氰化钾起显色反应;在低温、避光条件下较为稳定,碱性环境中不稳定。在自然条件下,以自由态和糖苷两种形式存在。白藜芦醇还具有顺、反式两种结构。

2 桑叶中白藜芦醇的提取及测定

2.1 实验仪器及药品

旋转蒸发仪、回流提取仪、高效液相色谱仪、水浴锅、微波炉;桑叶(桑叶来源于涪陵李渡工业园区)、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、甲醇(HPLC级)、白藜芦醇标准品(Sigma 99%)。

2.2 桑叶中白藜芦醇的提取

2..2.1 提取

2.2.1.1 不同溶剂对提取白藜芦醇的影响

称取桑叶粉末10.0 g 4份,分别放入1～4号圆底烧瓶,分别加入150 mL乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮回流提取,乙醇、甲醇、丙酮浓度为80%,提取次数为1次,水浴温度为60 ℃,提取时间分别为90 min。提取液过滤除渣后,用旋转蒸发仪进行减压浓缩,用10 mL的甲醇溶液溶解浓缩物,再用离心机离心,取上层清夜,放入10 mL的试管中进行保存。再用高效液相色谱法测定白藜芦醇的含量,如表1。

由表1可以看出,不同溶剂对桑叶中的白藜芦醇提取效果不同白藜芦醇提取效果不同,考虑到丙酮与甲醇的毒性及挥发性均较乙醇强。因此,选择安全、无毒、易回收的乙醇为提取剂。

2.2.1.2 乙醇浓度对白藜芦醇的影响

称取桑叶粉末10.0 g 5份,放入1～5号圆底烧瓶,提取时间90 min,提取温度60 ℃,提取次数为1次,乙醇浓度分别为:50%、60%、70%、80%、90%,提取液过滤除渣后减压浓缩,用甲醇溶解至10 mL,再离心分离,以后操作与上面相同,如表2。

由表2可知,随着乙醇体积分数的增大,白藜芦醇的提取率增加。当乙醇的体积分数大于80% 后,提取效果增加不明显。

2.2.1.3 料液比对提取白藜芦醇的影响

称取桑叶粉末10.0 g 5份,放入1～5号圆底烧瓶,提取时间90 min,提取温度60 ℃,乙醇浓度为80%,提取次数为1次,乙醇用量为:90 mL、110 mL、130 mL、150 mL、170 mL,提取液过滤除渣后减压浓缩,用甲醇溶解至10 mL,再离心分离,以后操作与上面相同,如表3。

由表3可知,随着料液比的增加,白藜芦醇的提取率增加,但增加的效果不明显,所以选择1:13较为合适。

2.2.1.4 温度对提取白藜芦醇的影响

称取桑叶粉末10.0 g 5份,放入1～5号圆底烧瓶,分别加入150 mL乙醇回流提取,乙醇浓度为80%,提取时间90 min,提取温度分别为:40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃。提取液过滤除渣后减压浓缩,用甲醇溶解至10 mL,再离心分离,以后操作与上面相同,如表4。

由表4可知,随着温度的增大,藜芦醇的提取率增加,当温度大于70 ℃ ,增加的效果不明显,所以选择60 ℃较为合适。

2. 2.1.5 时间对提取白藜芦醇的影响

称取桑叶粉末10.0 g 5份,放入1～5号圆底烧瓶,提取时间分别为:30 min、45 min、60 min、75 min、90 min,提取温度为60 ℃,乙醇用量为150 mL,提取液过滤除渣后减压浓缩,用甲醇溶解至10 mL,再离心分离,以后操作与上面相同,如表5。

由表5可知,随着提取时间的增加,白藜芦醇的提取率增加。当提取时间大于 90 min后,提取效果增加不明显,所以选择90 min比较合适。

2.2.2 最佳提取方法

将采集的桑叶晾干粉碎,以料液比为1:13加入80%的乙醇,在60 ℃条件下微波加热回流提取90 min,过滤得提取液,将此提取液减压浓缩,乙醇回收循环使用,剩余物加入碱液并搅拌溶解,过滤除去不溶性杂质,所得滤液再用酸调节pH=5.0左右,过滤收集沉淀物,最后将沉淀物用乙醇-水重结晶即得白藜芦醇。

2.2.3 方案流程图

3 HPLC法测定白藜芦醇的条件

3.1 实验仪器及药品

色谱柱:HypersilODS柱(250 mm×416 mm,5 μm);流动相:乙腈:水(35:65);检测波长:303 nm;柱温:室温;流速:1 mL/min。在测定白藜芦醇标准样品的相同条件下依次将各提取液进样10 μL。

3.2 白藜芦醇的HPLC法测定

3.2.1 白藜芦醇标准曲线

如图1所示,峰面积和浓度呈良好的线性关系。白藜芦醇的出峰时间为3.958 min,其图谱如图2。

3.2.2 样品中的白藜芦醇含量测定

从图3可见,在3.898 min处有一白藜芦醇吸收峰,其峰值很高,峰型完整。其峰面积为1420,利用面积外标法得到白藜芦醇的含量为15.025 mg/L,最后求得其百分含量为0.0015%。

根据待测样品中的总体积可得出白藜芦醇的总含量和待测的原始质量可得:样品白藜芦醇质量比=(HPLC实测值×提取体积)/样品质量×106。

4 结果与讨论

白藜芦醇的抗氧化抗疲劳作用研究 篇10

法国人与英国人和美国人的饮食结构基本相同, 显著区别是法国人喜欢喝葡萄酒。1970年, 法国人均葡萄酒的消费量为108升, 相当于每人平均每天要喝300毫升。显然, 差别和起作用的都是葡萄酒。研究人员仔细分析后认为原因是葡萄酒中白藜芦醇的含量高。

白藜芦醇是植物界分布较广的羟基二苯乙烯类化合物, 1940年首次从毛叶藜芦的根部分离获得, 近几十年来, 发现白藜芦醇存在于21个科, 31个属的72种种子植物中, 其中新鲜葡萄皮中含量最高。

白藜芦醇在我国大都称为葡萄皮提取物, 其化学名为芪三酚, 分子式, 分子量228.25, 有游离态 (顺式-、反式) 和糖苷结合态 (顺式-、反式) 两种活性形式。它在很多食物中存在, 如葡萄、桑葚、花生等, 尤其是葡萄皮中白藜芦醇含量很高。葡萄酒中都含有白藜芦醇, 但红酒似乎含量更高。1992年在商业葡萄酒中首次发现白藜芦醇。同一年科学界也确认了葡萄酒中存在着白藜芦醇。1995年, 日本山犁大学科研人员进一步研究了葡萄酒中的白藜芦醇, 确认该成分多存在于葡萄果皮上。

白藜芦醇是一种重要的植物抗毒素和抗氧化剂, 针对细胞NADPH、Fe-抗血酸酯及Fe-微粒体系统中发生的脂质过氧化反应和细胞内源生成的自由基可产生不同的抗氧化作用, 清除和淬灭细胞氧化应激中生成的活性氧介质, 白藜芦醇可以抵御活性氧介质对DNA的损伤并且防止细胞膜发生脂质过氧化反应, 可以抗炎、抗过敏和抗诱变, 同时白藜芦醇可以影响脂类及花生四烯酸代谢, 阻止低密度脂蛋白氧化, 抗血小板聚集, 因此使机体能够保持健康、年轻的状态, 精力充沛, 防止疲劳, 对延缓衰老, 预防及治疗衰老相关的肿瘤、神经退行性疾病、心脏病和动脉粥样硬化等具有积极意义。

2003年8月《自然》杂志发表美国哈佛大学辛克莱教授的研究报告认为, 白藜芦醇可能是研发抗衰老药物的关键。研究报告认为白藜芦醇可以像抗生素一样保护葡萄不受菌类侵害, 可以使保护癌细胞不被化疗等消灭的一种蛋白质失效。该研究将白藜芦醇用于癌症预防和治疗, 哈佛大学一些研究人员相信, 他们发现植物分子白藜芦醇可能掌握了研发抗癌药物的关键。研究的理论根据是:白藜芦醇负责管理对细胞存活非常重要的细胞蛋白质, 下达命令让细胞进入防御模式。哈佛大学研究人员猜测, 这种细胞蛋白质可能会修护受损的DNA, 或干扰细胞自然的死亡过程, 从而延长细胞的存活。几年前, 研究者们发现白藜芦醇能阻止细胞癌变和恶意扩散, 同时也能防止关节炎和其它疾病的细胞发炎。不过辛克莱教授认为, 人类要单靠喝红酒来达到延年益寿的效果, 恐怕还有些路要走, 因为换算成人类所需之剂量靠喝红酒还是太少;这就提示人类应该额外补充白藜芦醇。科学家Mc Nary和Baldwin试验了培养人及动物的肿瘤细胞对白藜芦醇的反应, 弄清了它能有效地关闭NF-kappa B癌症基因, 而未被处理的癌细胞则继续茁壮成长。有实验证实白藜芦醇通过神经酰胺信号转导通路抑制转移乳腺癌细胞的生长并且诱导细胞凋亡。

近期有关简单有机体寿命实验研究了白藜芦醇和限制热量摄入两者延长寿命的共同机制。在酵母出芽实验中发现, 停止养分循环能够激活一个需要酶参与的途径延长寿命, 而在正常养分循环时酶的过量产生可以延长酵母的寿命。酶能稳定动物体内的遗传物质, 从而起到延年益寿的作用。在进化上更为先进的新小杆线虫属蠕虫实验中观察到增多酶的表达可以延长寿命。Sirtuins通过转移特异性的靶蛋白上的乙酰基团发挥功能, 这种“乙酰基降解酶”的作用依赖于代谢过程中细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸分子 (NAD) 的浓度, 该分子有两种状态, 氧化型 (NAD) 和还原型 (NADH) , 正是氧化型 (NAD) 大大增强了的活性, 在酵母中限制热量可以精细调节NADH-NAD的转化率或改变NAD衍生物的浓度, 从而调节酶的活性, 延长寿命。Howitz et al.等在实验中对能直接作用于酶的小分子进行了筛选, 结果发现了两种相关化合物, 分别能够激活的活性。这两种化合物属于多酚分子家族, 是植物代谢产物, 有趣的是在所有植物多酚筛选实验中白藜芦醇是最强的酶激活因子, 研究人员观察到白藜芦醇通过激活酶表达能够将酵母的寿命延长大约70%, 而该酶缺陷型的酵母株在白藜芦醇的作用下也不能够延长寿命。酶属于进化上保守的sirtuins类分子家族, 在简单有机体如酵母和蠕虫中, 这类酶在广泛的领域中调控影响寿命的细胞活动包括调整细胞内致密DNA的包装, 在哺乳动物细胞中sirtuins作为细胞凋亡及分化的调控因子发挥作用。因此白藜芦醇通过对酶的激活作用在多层次、多途径影响着机体的健康。

限制热量摄入可以使机体提高热量利用率, 抵抗衰老, 因为这等于限制食物消化代谢在线粒体进行的氧化磷酸化, 减少ATP生成过程中自由基的产生, 降低内源自由基对细胞的损伤, 防止线粒体老化所导致的机体衰老。白藜芦醇作为抗氧化剂, 勿需限制热量摄入, 就能有效降低食物消化代谢在线粒体进行的氧化磷酸化, 可以有效清除此时线粒体能量代谢过程中的自由基, 减少细胞脂质过氧化反应, 保护线粒体, 使细胞保持在“年轻”状态。保持细胞健康是预防老年病的关键, 同时也是延长寿命的关键延缓衰老。

已有的研究和实验表明白藜芦醇作为最有前途的多功能抗氧化剂之一, 在机体保健和疾病治疗方面拥有积极的意义和无比乐观的前景。

参考文献

[1]白藜芦醇的提取分离及其对内皮素-1的拮抗作用[Z].

白藜芦醇 篇11

1 材料与仪器

干燥箱、高速万能粉碎机、电子天平 (LD-600, FA2204B) 、超声仪、可见紫外分光光度计 (UV-2550, 日本岛津) 、真空泵 (SHZDIII) 。白藜芦醇标准品 (中科院) 、乙醇、玉泉营3年与13年赤霞珠 (果皮、籽、梗、叶) 、玉泉营蛇龙珠 (果皮、籽、梗、叶) 、园林场贵人香 (果皮、籽、梗、叶) 、园林场赤霞珠 (果皮、籽、果梗、叶) 。

2 实验方法

2.1 药材处理方法

对玉泉营3年与13年赤霞珠 (果皮、籽、梗、叶) 、玉泉营蛇龙珠 (果皮、籽、梗、叶) 、园林场贵人香 (果皮、籽、梗、叶) 、园林场赤霞珠 (果皮、籽、果梗、叶) 进行分类处理, 分别将样品放入55℃干燥箱12~24h, 烘干后用高速万能粉碎机粉碎, 过20目筛, 装入自封袋内备用。

2.2 标准曲线建立

精确称取白藜芦醇标准品3.1mg于50mL容量瓶中, 超声混匀。从母液中分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL, 用60%乙醇定容至5mL容量瓶内, 测其吸光度值A。

分别精确称取各个样品5g于锥形瓶中, 加入50mL60%乙醇溶液, 混匀, 放入超声仪内超声40min, 超声2次, 取上清液进行真空抽滤, 将滤液用60% 乙醇溶液定容至100mL容量瓶内。从100mL提取液中吸取0.2mL, 用60%乙醇溶液定容至10mL容量瓶内。用60%乙醇溶液调零, 于λ=306nm[6]处测量各个样品的吸光度值, 平行测量3次。

3 结果

3.1 白藜芦醇标准曲线绘制

以吸光度 (A) 对浓度 (C) 进行线性回归, 得到线性回归方程y=0.182 4x+0.008 (R2=0.999 9) 。结果见图1。

3.2 宁夏葡萄副产品中不同组织中白藜芦醇含量比较

葡萄不同组织中白藜芦醇含量大小由高到低依次为葡萄叶>皮>梗>籽, 其中葡萄叶中白藜芦醇含量最高, 尤其是13年赤霞珠中白藜芦醇含量达4.76mg/g;其次, 玉泉营3年蛇龙珠葡萄皮中白藜芦醇含量达2.57mg/g;园林厂3年赤霞珠葡萄皮中白藜芦醇含量最低达0.52mg/g;说明不同葡萄副产品组织中葡萄叶白藜芦醇含量最高。同品种之间比较发现, 蛇龙珠葡萄皮中白藜芦醇含量较高, 达2.571mg/g。见表1。

3.3 不同宁夏葡萄品种中白藜芦醇含量比较

不同生长年代、不同地域、不同品种之间白藜芦醇含量也存在差异。经比较发现, 白藜芦醇含量由高到低依次为13年赤霞珠>玉泉营3年蛇龙珠>玉泉营3年赤霞珠>园林厂3年贵人香>园林厂3年赤霞珠, 说明13年赤霞珠中白藜芦醇含量最高。见表1。

4 讨论

白藜芦醇的检测方法主要包括色谱法、气相色谱、质谱法等[7]。但也有研究显示紫外分光光度法测定虎杖和葡萄中的白藜芦醇含量具有准确度高、速度快、操作简单等优点[8]。通过本研究发现, 葡萄叶和皮中的白藜芦醇含量极其丰富, 玉泉营13 年赤霞珠葡萄叶中白藜芦醇含量高达4.76mg/g, 可见提取葡萄中的白藜芦醇潜在价值非常大, 对于宁夏地区葡萄产业的经济发展具有重要意义。通过本研究发现宁夏地区葡萄皮、叶等废弃组织中所含的白藜芦醇含量极其丰富, 如果加以利用, 不仅可以变废为宝, 促进资源的充分合理利用, 还可以带动宁夏地区葡萄产业的发展, 提高经济效益。

但在实验中, 提取物上清液仅进行了真空抽滤, 未经任何除杂处理, 杂质含量过高, 干扰物质太多。此外, 紫外分光光度法测定的不是单体含量, 其他结构类似物也可能干扰结果, 需进一步进行分析研究。

摘要：目的:测定宁夏葡萄副产品中白藜芦醇的含量, 提高葡萄副产品的利用率。方法:采用紫外分光光度法测定白藜芦醇的含量, 检测波长为306nm。结果:宁夏葡萄副产品中白藜芦醇的含量由高到低依次为叶片>果皮>梗>种籽, 葡萄品种叶片中白藜芦醇含量最高, 其次为葡萄皮、梗、籽, 尤其是13年赤霞珠中各组织白藜芦醇含量最高;同品种之间比较发现, 蛇龙珠葡萄皮中白藜芦醇含量较高, 达2.57mg/g。结论:葡萄皮、叶等组织中白藜芦醇含量丰富, 加以利用可变废为宝, 有利于提高葡萄副产品的利用价值。

关键词：白藜芦醇,葡萄副产品,提取,紫外分光光度法

参考文献

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[3]LIU W, LIU CY, YANG CX, et al.Effect of grape genotype and tissue type on callus growth and production of resveratrols and their piceids after UV-C irradiation[J].Food Chem, 2010 (122) :475-481.

[4]KODE A, RAJENDRASOZHAN S, CAITO S, et al.Resveratrol induces glutathione synthesis by activation of Nrf2and protects against cigarette smoke-mediated oxidative stress in human lung epithelial cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2008, 294 (3) :478-488.

[5]JANG M, CAIL E, VDEANL G, Et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol a natural product derived from grapes[J].Science, 1997, 275 (10) :218-220.

[6]毕琮, 李臻, 刘倩, 等.紫外分光光度法测定转基因烟草叶片中白藜芦醇的含量[J].山东农业科学, 2011 (1) :93-96.

[7]叶秋雄, 黄苇.虎杖中白藜芦醇测定方法的比较研究[J].食品工业科技, 2010, 31 (5) :359-362.