H9c2

H9c2（共4篇）

H9c2 篇1

心肌纤维化是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变,常伴随风湿性心脏病、高血压、心肌梗死及心力衰竭等疾病。它可引起心肌结构紊乱、组织异质性增高,是发生心律失常的结构基础,也是猝死和慢性心功能不全的潜在危险因索[1,2,3]。研究发现,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)在心肌纤维化及重塑过程中起重要作用。通过干预RAAS可明显改善心肌重塑,对心力衰竭等起积极防治功效[4,5]。而其中醛固酮的作用已日益受到关注。近年来的研究显示,心血管局部能够合成和分泌醛固酮,其受体广泛分布于心肌细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞,引起心肌细胞及血管平滑肌细胞增殖,成纤维细胞增生,胶原产生增多,导致心血管重构,诱发心律失常,加重心肌缺血[6]。虽然醛固酮促进心肌纤维化的作用已被公认,但有关的信号转导机制研究甚少。本研究以培养的大鼠H9C2细胞为模型,观察100 nM醛固酮刺激0、1、3、6、12、24及48 h后盐皮质激素受体(Mineral cortical receptor,MR)、转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGFβ)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CT-GF)、Ⅰ型和Ⅲ型胶原(Collagen,COL)的表达情况,探讨醛固酮促进心肌纤维化的发生机制,为临床上应用醛固酮受体拮抗剂预防和治疗心肌重构提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

H9C2细胞由中国科学院上海生科院细胞资源中心提供;DMEM、胎牛血清等均购自美国Gibco公司;醛固酮购自sigma公司;RNA提取试剂盒,c DNA合成试剂盒购自宝日医生物技术有限公司;Real-time PCR反应试剂盒由Applied Biosystems公司提供;总蛋白提取试剂盒和蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;MR多克隆抗体购自Santa Cruz公司,Western blot显色试剂盒购自GE Healthcare公司。

1.2 实验方法

1.2.1 H9C2培养与细胞分组

取同批培养的H9C2细胞,分为醛固酮刺激0、1、3、6、12、24和48 h组。H9C2细胞培养12 h后,更换无血清培养基的培养液同化培养6 h后进行醛固酮刺激实验。

1.2.2 细胞内总R NA提取和R eal-time PCR反应

各刺激时间结束后,细胞用冷PBS洗3遍,按照试剂盒要求提取总RNA。各标本总RNA以三蒸水为空白对照,在紫外分光光度计上测该样本的A260和A280值,测定其浓度和纯度,每一样品的纯度均较理想。按照试剂盒要求将RNA反转录成c DNA,设计相应的引物(引物序列见附表),应用SYBR Green PCR master mix,在ABI Prism 7900T序列检测系统检测分析,反应条件为20μL反应体系,按94℃30 s,然后94℃5 s,55℃5 s,72℃15 s扩增40个循环,分析溶解曲线,计算各个样本的相对浓度。

1.2.3 细胞内总蛋白提取和Western blot检测

各样本总蛋白用蛋白提取试剂盒提取并检测其蛋白含量,用细胞裂解液校正为同一浓度后行Western blot检测。等量的蛋白(50μg)进行SDS-PAGE,转移到硝酸纤维素膜上MR一抗孵育,4℃过夜,二抗孵育1 h后显色系统显色。膜用抗体清除液脱抗体后再用β-actin抗体孵育。Western blot条带用NIH Image software分析灰度。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 11.0软件包进行分析,计量资料以均数±标准差表示,各组间数据比较采用单因素方差分析,检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 醛固酮刺激后MR受体的表达结果

见图1。

与空白对照组相比,Western blot检测可见醛固酮刺激H9C2细胞后3 h开始,MR受体表达增高,6h达高峰,此后逐渐降低。

注:覮与对照组相比,P<0.05

2.2 醛固酮刺激后TGFβ和CTGF的表达情况

见图2。

注:覮与对照组相比,P<0.05

Real-time PCR检测结果显示,醛固酮刺激后TGFβ和CTGF的表达在6 h开始增高,12 h达高峰,以后逐渐降低。与空白对照组相比差异有显著性(P<0.05)。

2.3 醛固酮刺激后Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达情况见图3。

COLⅠ和Ⅲ的表达在6 h开始增高,24 h达高峰。与空白对照组相比差异有显著性(P<0.05)。

注:覮与对照组相比,P<0.05

3 讨论

醛固酮是肾上腺盐皮质激素的重要成分,传统观念认为,醛固酮仅在肾上腺皮质合成,基本上只作用于肾脏,调节水盐代谢。近年越来越多的证据表明其他组织,尤其是心脏、脑和血管也可以独立合成醛固酮[7]。醛固酮作为心肌胶原网络重塑的重要细胞因子,参与左心室肥厚与心肌纤维化,诱导左心室重构,使心室的僵硬度增加,顺应性下降[8]。细胞培养可以发现醛固酮促进成纤维细胞产生胶原,增强胶原酶活性,使胶原含量和Ⅰ、Ⅲ型胶原容积分数升高[9]。心肌细胞周围的纤维化也影响氧的弥散和养分的输送以及心肌细胞间的化学信号、电信号的传递,最终导致心肌细胞坏死、凋亡及心律失常的产生[10]。大鼠在体实验也发现,给予高盐饮食和醛固酮,可以诱导心室的纤维化,采用醛固酮受体拮抗剂螺内酯可以有效预防纤维化的发生,但却不能改变高血压和心肌肥厚的进程,从而确认了醛固酮的致纤维化作用是独立的[11]。醛固酮诱发心肌纤维化的具体机制不甚明了。小鼠实验表明,局部阻断MR并不能阻止小鼠心力衰竭并发心肌纤维化的过程,因而醛固酮诱导的心肌纤维化可能与MR和糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)间的平衡有关,GR等受体可能也参与了调节作用[11]。另外,醛固酮可直接或间接作用于心肌细胞与成纤维细胞,使COX2、PGE2、IL-6增加。慢性醛固酮增多还可增加NADPH的表达,促进超氧阴离子的产生和炎症反应,表明醛固酮对心脏的促炎作用也与心肌重构有关[12]。另外有研究显示,脑脊液低剂量注射螺内酯可以取得与口服大剂量螺内酯相似甚至更好的结果,表明醛固酮可能通过中枢神经系统途径影响包括心肌重构在内的外周反应[13]。

心脏中存在着Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ型胶原,其中以Ⅰ、Ⅲ型为主。越来越多的资料表明醛固酮可以促进胶原合成,是心脏纤维化的独立危险因素。局部胶原沉积,包绕心肌纤维,从而对心脏的舒张和收缩功能产生不利影响。DELCAYRE等[14]发现,血浆醛固酮可作用于血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)受体,使AngⅡ效应增强,激活三磷酸肌醇途径,使c-fos、c-jun基因表达,胶原生成增多,导致心肌纤维化。同时,在心肌纤维化过程中,醛固酮与肾素-血管紧张素起协同作用[15]。

H9C2细胞株是从BD1X大鼠胚胎心脏组织克隆得到的。它具有与原代培养乳鼠心肌细胞相似的功能特性,易于分离培养,并可传代,广泛应用于心肌细胞信号转导通路的研究。本研究发现,醛固酮刺激H9C2细胞后3 h开始,MR受体表达增高,6 h达高峰。TGFβ和CTGF的表达在6 h开始增高,12 h达高峰。COLⅠ和Ⅲ的表达在6 h开始增高,24 h达高峰。说明醛固酮刺激H9C2细胞后,通过与MR受体结合后促进TGFβ和CTGF的表达进而促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达。

综上所述,醛固酮是介导心肌重构的主要因素,它可促成心肌纤维化、心室肥大等改变,进一步加重心力衰竭等疾病[16]。对醛固酮的进一步研究将给其拮抗剂的广泛应用提供重要的理论依据,从而使其在心血管疾病治疗中发挥更加重要的作用。

H9c2 篇2

参芪苈心方是由黄芪、人参、附子、丹参等组成的纯中药复方制剂, 大量临床与实验研究已经证明该方对慢性心力衰竭疗效确切[4], 本研究以曲美他嗪为对照, 观察参芪苈心方对去甲肾上腺素诱导的H9C2大鼠心肌细胞能量代谢的影响, 探讨参芪苈心方在慢性心力衰竭治疗中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系

大鼠H9C2心肌细胞株:购于中国科学院上海细胞库。

1.2 实验动物

健康SD大鼠30只, 清洁级, 雌雄各半, 体重200~240 g, 由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。

1.3 实验药品和试剂

参芪苈心方:人参15g、黄芪30g、制附子10g、桂枝10g、丹参15g、赤芍15g、葶苈子15g、五加皮15g、麦冬15g、五味子5g, 水煎浓缩成2.6g/ml;盐酸曲美他嗪:施维雅制药有限公司, 批号:2004288。去甲肾上腺素:天津金耀公司;ATP检测试剂盒:上海碧云天公司。

1.4 主要实验仪器

123C酶标仪:Clini Bio;LC-10avp高效液相色谱仪:岛津;LS6500液闪计数仪:Beckm;720日立全自动生化分析仪:日本;Olympus光学显微镜。

1.5 含药血清的制备

30只Wistar大鼠, 随机分为空白组、参芪苈心方组、盐酸曲美他嗪组, 每组10只。空白组每日灌服等体积生理盐水, 其余组每日灌服中药煎剂26g/kg和盐酸曲美他嗪混悬液5mg/kg, 每日1次, 连续给药7天。于末次灌胃1~2小时无菌条件下腹主动脉取血, 3000 r/min离心15分钟, 分离血清, 0.22μm微孔滤膜过滤, 56℃30分钟灭活, 分装标示后-20℃保存备用。

1.6 H9C2心肌细胞培养及分组处理

H9C2细胞置于10%新生牛血清的低糖DMEM培养基中, 于37℃、5%CO2条件下传代培养。取对数生长期、生长良好的细胞进行实验, 传代方法1:2~1:6传代;2~3天换液1次。H9C2心肌细胞培养72小时达融合状态后, 去除原培养液, 随机分为4组:正常对照组、模型组、曲美他嗪组、参芪苈心方组。正常对照组:心肌细胞中加入正常大鼠血清100μl;模型组、曲美他嗪组、参芪苈心组分别加入正常大鼠血清10μl、盐酸曲美他嗪含药血清10μl、参芪苈心方含药血清10μl, 均加入NE (最终浓度均为2μmol/L) , 加空白培养液补至100μl后, 每组设8个复孔, 在加药后24、48小时进行指标检测。

1.7 观察指标及测定

1.7.1 细胞形态观察

于48小时应用倒置显微镜观察各组细胞形态。

1.7.2 细胞存活率测定

MTT法。实验结束前4小时加入20μl的MTT, 继续培养4小时, 终止培养, 弃培养液, 每孔加入100μl的DMSO, 振荡10分钟, 酶标仪于波长490 nm处测吸光度OD值

1.7.3 H9C2心肌细胞内ATP含量的测定

高效液相色谱法测定。

1.7.4 H9C2心肌细胞葡萄糖氧化率、脂肪酸氧化率测定

于48小时后吸取心肌细胞培养基, 应用LS6500多功能液闪计数仪检测心肌细胞葡萄糖氧化率[5]、脂肪酸氧化率[6], Lowery法测定蛋白的含量.

1.8 统计学分析

应用SPSS 11.5统计软件, 计量资料以 (±s) 表示, 用方差分析和多重比较t检验进行统计分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞形态变化

正常对照组心肌细胞形态规则, 成梭形紧密排列。参芪苈心方组心肌细胞皱缩及少量球形凋亡细胞。曲美他嗪组心肌细胞进一步皱缩变圆, 并可见细胞脱落, 细胞间隙变大。模型组, 可见大量皱缩变圆的凋亡细胞, 细胞之间连接明显受到破坏, 大量细胞脱落后可见明显间隙形成。

2.2 各组H9C2细胞增殖活性的比较

见表1。

与正常组比较△P<0.01, △△P<0.01;与模型组比较*P<0.05) , **P<0.01;与曲美他嗪组比较#P<0.05, ##P<0.01 (下同)

2.3 各组H9C2细胞内ATP含量的变化

结果见表2。

2.4 各组H9C2细胞葡萄糖氧化代谢率和脂肪酸氧化代谢率的变化

见表3。

3 讨论

因为心衰本身发病机制的复杂性, 多数治疗方法只能延缓其病情进展, 而且现有药物作用模式比较单一, 既使多组药物联合应用仍然无法取得满意疗效。调节心肌能量代谢方法的提出无疑为心衰的治疗提供了新的治疗途径[7], 即通过调节异常的心肌能量代谢, 改善衰竭心肌的功能, 以糖代谢为主代替脂肪酸代谢, 从而减少心肌氧耗, 减轻代谢产物的心肌毒性, 减缓泵衰竭的进程。研究表明三个过程在心肌能量代谢中起着至关重要的作用———底物利用[8]、氧化磷酸化[9]、高能磷酸化合物利用率[10], 如何通过以上途径调节能量代谢, 进而治疗心力衰竭成为当今心血管领域研究的重点。

盐酸曲美他嗪通过抑制脂肪酸氧化, 促进葡萄糖氧化, 提高ATP生成效率, 从而改善心脏功能[11]。大量临床研究以证实该药物对于心力衰竭具确切疗效[12,13]。但该药物仍然存在作用单一, 临床应用较局限等缺点, 如对于血液动力学的改善、抗氧化、抗凋亡、抗自由基损伤等方面未见明显作用。

参芪苈心方是基于多年的临床实践, 以“益气温阳、活血利水”为主法, 针对心衰中医特点研制而成, 临床应用已证实该方药对于治疗充血性心力衰竭疗效确切[14], 同时在改善血液动力学、增强心肌收缩力、降低周围血管阻力、清除氧自由基、抑制心肌细胞凋亡等方面发挥显著作用。

H9c2 篇3

1 材料与方法

1. 1 材料

1.1.1细胞培养及传代

胎牛血清( 四季青,优级胎牛血清,100 m L,140628) ,双抗生素( 青霉素+ 链霉素) ,谷氨酰胺,DMEM,胰酶,PBS磷酸盐缓冲液。96孔板( Cos TAR,3599) ,25 cm2培养瓶,激光共聚焦小皿。

1.1.2药品

甘草酸( 普菲德,批号: 131201,HPLC≥98% ) ,甘草次酸( 普菲德,批号: 130611,HPLC ≥98% ) 。DMSO( SIGMA,D2650,100 m L) ,MTT( Sigma,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,M5655-500MG ) 。乙酰乙酸双氯荧光素( Invitrogen molecular probes,D99,1072945,DCFH-DA ) ,夹竹桃素( Santa cruz,sc-203321,APO) ,血管紧张素Ⅱ( Sigma,A9525-10mg,SLBJ0358V,AngⅡ) 。

1.1.3仪器

仪器培养箱( Thermo,3111,Forma Series Water Jacket) 37℃ 5% CO2。震荡器( Qilinbeier,TS-100) 。酶标仪( KHB,ST-360) 。激光共聚焦显微镜( OLYMPUS,FV1000) 。倒置显微镜( OLYMPUS,CKX41SF) 。

1.2 H9c2鼠心肌细胞培养

本研究所用H9c2鼠心肌细胞从北京协和医院购买,采用含10%胎牛血清的DMEM培养。

1.3 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法

采用此方法探索甘草酸和甘草次酸的毒性与其对细胞生长的影响,用以协助确定甘草酸、甘草次酸干预ROS的最佳药物浓度。甘草酸和甘草次酸用DMSO溶解,制成0. 1 mg / μL的储液。实验分组: 空白组,DMSO溶剂对照组( DMSO终浓度为0. 1% ,等同于本实验所设计的最高药物浓度组的DMSO终浓度) 以及不同浓度梯度的药物组。H9c2 鼠心肌细胞培养至80% 融合,以0. 05% 胰酶消化,用含有10% 胎牛血清的DMEM培养基重悬,以5 000 个细胞/孔的密度种于96 孔板上,细胞贴壁24 h之后更换为无血清DMEM培养液继续培养24 h。之后吸出培养液,加入含有不同浓度梯度的甘草酸和甘草次酸的无血清DMEM( 储液倍比稀释所得) ,使得DMEM内药物终浓度为10-6μg /μL ~ 10-1μg /μL。48 h之后,吸出液体,加入100μL含有MTT的无血清DMEM。在37℃ 下孵育4 h。小心的吸出液体,加入150 μL DMSO。振荡器上震荡15 min之后,在酶标仪上检测OD值。

1. 4 乙酰乙酸双氯荧光素( DCFH-DA) 法

1.4.1血管紧张素Ⅱ诱导ROS升高模型

用本方法探索不同浓度的Ang Ⅱ对细胞内ROS水平的影响,用于筛选和建立Ang Ⅱ诱导ROS升高的细胞模型。实验分组为: 空白组、10-7~ 10-5mol / L Ang Ⅱ模型组。选取对数生长期的H9c2 心肌细胞,用含10% 胎牛血清的DMEM悬浮,密度为50 000 个/m L。接种1 m L于直径20 mm的激光共聚焦小皿中。培养24 h之后,更换为无血清DMEM。再培养24 h之后,于模型组内加入( 10-7~ 10-5) mol/L Ang Ⅱ。培养24 h之后,用乙酰乙酸双氯荧光素( DCFH-DA) 法测定H9c2 心肌细胞内活性氧水平: 1 m L PBS冲洗2 遍H9c2 心肌细胞,加入DCFH-DA 10 μmol / L,每皿加100 μL,37 ℃ 孵育30min,再用PBS冲洗2 遍。 在激光共聚焦显微镜下随机选取5 个不重复区域进行摄片,用Image J1. 48 软件分析5 个视野绿色荧光强度的平均值,再对每组的样本进行统计学分析。

1.4.2药物对血管紧张素Ⅱ模型的影响

用本方法探索甘草酸和甘草次酸对Ang Ⅱ建立的ROS模型的影响。实验分组: 空白组、Ang Ⅱ模型组、甘草酸组( 血管紧张素Ⅱ+甘草酸) 、甘草次酸组( 血管紧张素Ⅱ+甘草次酸) 、阳性对照组( 血管紧张素Ⅱ+夹竹桃素) 。培养24 h之后,更换为无血清DMEM。再培养24 h之后,阳性对照组加入夹竹桃素100 μmol/L,培养箱内孵育30 min。之后,所有样品用PBS冲洗2 遍。模型组加入含Ang Ⅱ的无血清DMEM,药物组加入含AngⅡ和甘草酸或甘草次酸的无血清DMEM( 药物浓度参考MTT法的结果确定) ,空白组加入无血清DMEM。培养24 h之后,用乙酰乙酸双氯荧光素( DCFH-DA)法测定H9c2 心肌细胞内活性氧水平。

1.5统计学处理

采用SPSS 16. 0 对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差(  ±s ) 表示,两组间比较采用t检验; 多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P <0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 甘草酸、甘草次酸的细胞毒性和促增殖作用

2.1.1甘草酸的细胞毒性

对比空白对照组和溶剂对照组的数据,可以发现0. 1% 浓度的DMSO,无明显的细胞毒性( P >0. 05) ; 甘草酸在本实验的最高浓度( 0. 1μg / μL) 及其他稀释浓度,均未发现有明显的毒性。

2.1.2甘草酸对细胞的促增殖作用

甘草酸在10-6~10-1μg /μL的浓度,有明显促增殖作用( P <0. 01) ,不同浓度间无统计学意义( P >0. 05) 。10-9~ 10-7μg /μL甘草酸组OD值与对照组无统计学意义( P >0. 05) 。详见图1。

与空白对照组比较,1)P<0.01。

2.1.3甘草次酸的细胞毒性

对比空白对照组和溶剂对照组数据,可以发现1‰浓度DMSO,无明显细胞毒性( P >0. 05) 。0. 1 μg /μL甘草次酸组OD值显著低于空白及溶剂对照组( P <0. 01) ,表明该浓度具细胞毒性,其余稀释浓度未见到有明显的毒性。

2.1.4甘草次酸的促增殖作用

在10-5μg/μL~10-2μg / μL的浓度区间,OD值均显著高于空白对照组( P <0. 01) ,10-6μg /μL甘草次酸OD值显著高于空白对照组( P <0. 05) ,提示甘草次酸在10-6~ 10-2μg /μL的浓度范围内具有一定的促增殖作用,而且各浓度组间无统计学意义( P >0. 05) 。10-9~ 10-7μg /μL甘草次酸组OD值与空白对照组比无统计学意义( P >0. 05) 。详见图2。

与空白对照组比较,1)P<0.05,2)P<0.01。

2. 2 甘草酸、甘草次酸对血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2鼠心肌细胞活性氧的影响

2.2.1不同浓度的血管紧张素Ⅱ对H9c2鼠心肌细胞活性氧的影响

与空白对照组相比,10-5mol / L AngⅡ组可以显著的升高细胞内ROS水平( P <0. 01) ,而10-6mol / L、10-7mol / L Ang Ⅱ组对ROS无显著影响( P>0. 05) 。详见图3、图4。

与空白对照组比较,1)P<0.05。

2.2.2甘草酸、甘草次酸对血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2鼠心肌细胞活性氧的影响

与空白对照组相比,Ang Ⅱ可以显著升高细胞内ROS水平( P <0. 01 ) ; 与AngⅡ造模组相比,甘草酸、甘草次酸可以显著降低细胞内ROS水平( P <0. 01) ,作用与阳性对照夹竹桃素组相近( P >0. 05) 。表明甘草酸和甘草次酸均可以显著的降低Ang Ⅱ诱导的细胞内ROS水平。详见图5、图6。

与空白对照组比较,1)P<0.01;与模型组比较,2)P<0.01。

3 讨论

本研究以H9c2 细胞为研究载体,未发现甘草酸具有明显的毒性,同剂量的甘草次酸毒性却很明显。这与李锦[6]、曹珊[7]分别在基因毒性和小鼠口服所得的结论基本一致。甘草次酸为甘草酸类药物经过体内代谢的产物,是甘草酸类药物的真正药用成分。健康人长期大量服用甘草次酸能引起血压增高、水钠潴留和钾离子的排出,尿内钠/钾的比例稍有降低,这种作用与醛固酮相似[5]。正是由于甘草次酸在临床上的毒副反应限制了其在市场和临床上的广泛应用,在使用的过程中必须同时充分考虑其安全范围。

根据毒性试验的数据,发现甘草酸和甘草次酸在10-6μg /μL时具有促增殖作用的最低浓度,且与其他较高剂量组无统计学意义,可能是甘草酸、甘草次酸发挥心肌细胞保护作用的最低剂量,因此选择10-6μg /μL作为活性氧检测的给药浓度。

心脏是机体摄氧率最高的器官,抗氧化能力差,自由基容易损害心肌细胞。研究发现心力衰竭病人血浆和心包液中氧自由基增多,且氧自由基与心力衰竭的严重程度成正比[8]。ROS的功能可作为第二信使参与多种氧化还原信号通路的调节,在细胞生长分化、血管形成和血管紧张度的调控等方面起着重要作用,但是ROS的大量堆积可促发细胞氧化应激、钙超载、能量耗竭,并启动细胞凋亡和坏死[9],降低ROS水平被认为是干预心力衰竭的新策略,但以ROS清除为手段的抗氧化治疗方案,因在大规模临床试验中不能降低,甚或增加了损害而遭到严重质疑[10]。因此,特异性抑制ROS相关的氧化酶及其通路是目前的研究热点。

NADPH氧化酶活性增加是终末期心衰病人心脏氧化应激最重要的来源之一。Ang Ⅱ是一类强效的NADPH氧化酶激活剂,通过刺激AT1R作用于NADPH氧化酶使体内血管ROS升高。Ang Ⅱ可通过ROS诱导由Ca MKⅡ通路介导的心脏衰竭[11]。本实验表明,10-5mol / L的AngⅡ可以显著升高H9c2 心肌细胞ROS水平。同时,发现10-6μg /μL甘草酸和甘草次酸均可显著的降低,由Ang Ⅱ诱导的细胞内ROS水平的升高。抑制心肌细胞内过度的氧化应激可能是甘草干预心衰的主要效应环节之一,而甘草酸和甘草次酸均可能是甘草调控氧化应激的重要效应成分。

H9c2 篇4

关键词：心房钠尿肽,缺血再灌注,线粒体膜通透性转移孔,糖原合成酶激酶3β

心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)是由心房肌细胞合成和分泌的肽类激素。ANP对缺血再灌注损伤具有较好的保护作用。在大鼠离体心脏灌流模型中,ANP可以增加再灌注心脏的心输出量,减少缺血再灌注心脏的心梗面积,对急性心肌梗死患者静脉注射ANP能减轻缺血再灌注造成的心脏损伤[1],但ANP发挥心肌保护作用的具体机制尚未清楚。线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,m PTP)的开放是导致缺血再灌注损伤的关键因素[2],防止m PTP的开放是减轻再灌注损伤的有效手段,抑制m PTP的开放是一些心脏保护类药物,如腺苷,抗缺血再灌注损伤的共同作用机制。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase3β,GSK-3β)是真核生物中普遍存在的一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,静息时GSK-3β保持激活状态。GSK-3β的丝氨酸(Serine,Ser9)位点磷酸化使GSK-3β活性降低。研究发现,抑制GSK-3β的活性可以有效抑制m PTP的开放[3]。但是,ANP保护缺血再灌注损伤机制与GSK-3β活性和m PTP的开放是否有关,尚不清楚。本研究采用激光共聚焦显微成像技术和Western blot检测,观察ANP是否通过降低GSK-3β的活性而抑制m PTP的开放,起到抵制缺血再灌注损伤的作用,拟探讨ANP的心肌保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞株(美国ATCC菌种收藏中心),ANP、细胞培养所用的达尔伯克必需基本培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶等(美国Gibco公司),GSK-3β-S9A-HA(美国宾夕法尼亚大学医学院),四甲基罗丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethylester,TMRE)荧光染料(美国Invitrogen公司),Western blot检测凝胶试剂盒(北京索莱宝公司),抗磷酸化的GSK-3α/β(Phospho-GSK-3α/β,Ser21-GSK-3α/Ser9-GSK-3β)抗体以及α-actin抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

实验中主要仪器有FV-1000激光共聚焦显微镜(日本Olmpus公司),JY200C电泳系统(北京君意东方电泳设备有限公司),680型酶标仪(美国Bio-Red公司),Champ Gel 6000凝胶成像分析系统(北京赛智创业科技有限公司),5430R台式低温离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 线粒体膜电位的测定及实验分组

TMRE荧光探针是一种带正电荷、可透过细胞膜的无毒性荧光染料,其激发光波长为543 nm,发射波长为560 nm。在正常生理条件下,线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)保持内负外正的状态。由于该电压差使正电的TMRE可迅速地进入并聚集在线粒体内。m PTP的开放使得氢离子等进入细胞,造成MMP消失,MMP降低是m PTP开放的象征,从而导致TMRE从线粒体释放。所以线粒体内TMRE荧光强度变化能较为准确地显示MMP的高低和m PTP的开放。故利用激光共聚焦显微镜成像技术检测线粒体内TMRE荧光强度值的变化值,可推测线粒体膜电位的变化,从而可以测定线粒体m PTP的开放。本实验利用双氧水H2O2诱导H9c2的缺血再灌注损伤,TMRE荧光强度减少至<50%基础值则认为诱导缺血再灌注损伤成功。

H9c2分成7组,用H2O2(终浓度600μmol/L)在37℃孵育箱内孵育20 min,诱导H9c2氧化应激损伤。H9c2分成两组,对照组:H2O 20 min+H2O220 min;ANP组:ANP(终浓度0.001、0.010、0.100、1.000、10.000和100.000 nmol/L)20 min+H2O220 min。各组以每10 min间隔扫描图片,并用定量分析软件测定荧光强度值。

1.3 GSK-3β质粒DNA的转染及实验分组

GSK-3β质粒(GSK-3β-S9A-HA)采用Fugene 6转染试剂盒进行转染,所有实验在转染48 h内进行[5]。对照组:H2O 20 min+H2O2(终浓度600μmol/L)20 min;ANP组:ANP(终浓度1 nmol/L)20 min+H2O220 min;S9A组:转染激活型GSK-3β质粒的H9c2细胞+H2O 20 min+H2O2(终浓度600μmol/L)20 min;S9A/ANP组:转染激活型GSK-3β质粒的H9c2细胞+ANP(终浓度1 nmol/L)20 min+H2O220 min。各组以每10 min间隔扫描图片,并用定量分析软件测定荧光强度值。

1.4 Western blot检测GSK-3β磷酸化水平

采用终浓度为0.001、0.010、0.100、1.000、10.000和100.000 nmol/L ANP预处理H9c2细胞20 min,常规Western blot检测GSK-3βSer9位点的磷酸化,从而观察GSK-3β的活性。其最终数据表示为(目的蛋白/内参蛋白)/(对照组蛋白/对照组内参蛋白)×100%。

1.5 统计学方法

采用Prism 3.0统计软件进行数据处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间均数比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ANP对线粒体m PTP开放的影响

对照组利用600μmol/L H2O2处理H9c2细胞20 min后,TMRE荧光强度明显减少至基础值的(36.75±3.87)%,即H2O2可以明显诱导缺血再灌注损伤。不同浓度的ANP预处理H9c2心肌细胞20 min后发现,0.01、0.10、1.00和10.00 nmol/L ANP均抑制H2O2减少TMRE荧光强度的效应(P<0.05),而浓度0.001 nmol/L和最高浓度100.000 nmol/L ANP未能抵制H2O2对MMP的衰减作用。ANP防止m PTP开放的有效浓度范围为0.01~10.00 nmol/L。见表1和图1。

2.2 ANP对GSK-3β活性的影响

0.01~100.00 nmol/L ANP均明显增加GSK-3βSer9的磷酸化水平,即可以明显抑制GSK-3β的活性,其中1.0 nmol/L ANP效果最明显,只有最低浓度ANP(0.001 nmol/L)对GSK-3β磷酸化没有影响。该有效浓度范围与ANP对m PTP抑制作用的有效浓度范围基本一致。见图2和表2。

2.3 ANP对转染GSK-3β质粒的H9c2细胞m PTP开放的影响

对照组、ANP组、S9A组、S9A/ANP组经20 min H2O2处理后,各组TMRE荧光强度分别减少至基础值的(36.75±3.87)%、(78.47±11.00)%、(35.32±5.49)%和(39.95±4.51)%,差异有统计学意义(F=8.830,P=0.000),ANP组TMRE荧光强度高于对照组、S9A组及S9A/ANP组(t=3.576、3.520和3.247,P=0.003、0.003和0.006)。而S9AANP组的TMRE荧光强度与S9A对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

(n=6,±s)

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与对照组比较,P<0.01

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与对照组比较,P=0.000

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是治疗缺血性心脏病过程中面临的最棘手的医学问题[6]。虽然介入和搭桥手术等目前先进的医疗手段能够改善缺血带来的损伤,但由于冠状动脉再通后容易引起再灌注损伤,急性心肌梗死的治疗难度和死亡率依然很高。目前动物实验显示,再灌注期给予几种药物,如腺苷,可以改善缺血再灌注损伤,但临床试验结果均不理想[7],究其原因是还未完全了解保护再灌注损伤的作用机制[8]。研究认为,心肌缺血再灌注时,m PTP持续性开放是导致再灌注损伤的重要原因[2],因此抑制m PTP的开放是防止再灌注损伤的关键。有研究发现,预先反复短暂缺血(缺血预处理)可以提高心肌组织对随后持续缺血的耐受性,减少心肌梗死面积,减少心律失常发生,而缺血预处理保护心肌细胞的作用机制就是通过抑制m PTP的开放而减轻再灌注损伤[9]。

ANP最早发现的生物学作用是排钠利尿,而近年来的研究证实,ANP在许多缺血缺氧相关性疾病如急性心肌梗死、充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病中保持高分泌状态,并且在该类疾病中分泌的ANP可以发挥抵制心肌肥大[10]、氧化应激[11]、保护缺血再灌注损伤等作用[12]。在本研究中,0.01、0.10、1.00、10.00 nmol/L ANP可以明显抑制H2O2诱导的H9c2细胞m PTP开放,提示ANP可能通过抑制线粒体m PTP的开放,抵制氧化应激伤的损伤,进而保护缺血再灌注的心脏。本实验室长期对大鼠ANP浓度测定结果显示,大鼠心房灌流液的ANP浓度一般在50~300 pg/ml,而本实验所用的ANP浓度已经超出大鼠灌流液当中的ANP生理浓度。本实验室前期研究还显示,大鼠心房缺氧时ANP浓度明显升高,并且升高至常氧时的5~10倍。故根据本实验的结果推测,缺氧缺血时增高的ANP可能起到抵制缺氧缺血等的生理学作用,从而保护缺氧缺血的心脏。