褪黑素(MT)

褪黑素(MT)（共4篇）

褪黑素(MT) 篇1

1 材料与方法

1.1 动物与分组

雄性昆明小鼠共144只,体重15～20 g,3～4月龄,由北京维通利华动物研究中心提供。合格证号0291049,许可证编号SCXK(京)2012-0001。

适应性饲养7天后,随机分为长光照组、正常组、长黑暗组三组,每组各48只。各组光照干预条件如下:

长光照组:给予24小时不间断光照;此造模法模拟现代人生活夜晚灯光照射时间长,甚至睡眠剥夺。

正常组:给予12小时光照,12小时黑暗的光照条件;利用倒班黑箱及自动定时开关于每日6:00～18:00给予日光灯照射,18:00～次日6:00给予黑暗条件。

长黑暗组:给予24小时全黑暗条件。

饲养条件:室温(控制在20～23℃之间)。每日投食一次,自由摄取水及饲料,饲料为普通鼠全价颗粒饲料(北京实验动物研究中心提供)。于实验第6周末开始试验取材。

1.2 主要仪器和试剂

4℃低温离心机(美国BECKMAN公司)。小鼠褪黑素酶联免疫检测试剂盒,均购自北京瑞格博科技发展有限公司。

1.3 取血

实验第6周末最后一天,分别于0:00、4:00、8:00、12:00、16:00、20:00共6个时间点分组取血。每个时间点每组随机取8只小鼠取材,即每个时间点取血样24个。

取血时的光照条件与饲养过程中某时刻的光照条件一致,分别为:长光照组6个时间点均在正常光源下取血;正常组0:00、4:00、16:00、20:00这4个时间点在红光灯下排除其他光线干扰取血,8:00、12:00这2个时间点在正常光源下取血;长黑暗组6个时间点均在红光灯下排除其他光线干扰取血。

取血方法:10%水合氯醛腹腔注射麻醉,摘眼球取血,血样静置30分钟后,4℃3000 r/min离心分离血清,取上清低温贮存备测相关指标。

1.4 检测指标与方法

小鼠血清褪黑素采用酶联免疫检测法检测,检测步骤按照试剂盒使用说明书严格操作。比较同组小鼠不同时间点血清褪黑素含量数据,以求验证昼夜节律的存在。比较同时间点各组小鼠血清褪黑素含量数据,以求探索光照对小鼠褪黑素节律的影响。

1.5 统计分析

结果用SPSS 17.0统计软件包分析。实验数据均以x±s来表示。同组小鼠不同时间点血清褪黑素含量数据比较和同时间点各组小鼠血清褪黑素含量数据比较应用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。用LSD方法进行数据的两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 同组小鼠不同时间点血清褪黑素含量比较

同组小鼠不同时间点血清褪黑素含量有统计学差异,进行方差分析,差异有显著性(P<0.05),见表1、图1。但其节律性随着光照不同呈现不同的特点。

正常组小鼠血清褪黑素含量4:00最高,次高点是0:00。这2个时间点分别与其他时间点比较,差异有统计学意义(P<0.05)。8:00、12:00、16:00、20:00这4个时间点含量较低,这4个时间点数据间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和图1。20:00点～4:00点是血清褪黑素含量升高的转折时段,(P<0.05);4:00点～8:00点是血清褪黑素含量降低的转折时段(P<0.05),见表2和图1。

长光照组小鼠血清褪黑素含量0:00、4:00、8:00这3个时间点较高,三者比较差异无统计学意义(P>0.05)。12:00、16:00、20:00这3个时间点含量较低,三者比较差异无统计学意义(P>0.05)。8:00点～12:00点是血清褪黑素含量明显降低的转折时段(P<0.05),20:00点～0:00点(24:00点)是血清褪黑素含量明显升高的转折时段(P<0.01),见表2。

长黑暗组小鼠血清褪黑素含量0:00、4:00两个时间点较高,两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。8:00、12:00、16:00、20:00这4个时间点含量较低,四者比较差异无统计学意义(P>0.05)。8:00点、12:00点、16:00点、20:00点褪黑素含量低于0:00点、4:00点褪黑素含量,差异有统计学意义(P<0.05),见表1和图1。在4:00～8:00点时间段是血清褪黑素含量明显下降的转折时段(P<0.05),在20:00点～0:00点时间段是血清褪黑素含量明显上升的转折时段(P<0.05),见表2。

2.2 同时间点各组小鼠血清褪黑素含量比较

三组小鼠血清褪黑素含量昼夜整体均值比较,长光照组褪黑素含量最高,经方差分析,P<0.05,差异有统计学意义。用LSD方法进行数据的两两比较,长光照组褪黑素含量均值与正常组的组间比较,小鼠血清褪黑素整体水平上升,P<0.05,差异有统计学意义。长黑暗组褪黑素含量与正常组的组间比较,小鼠血清褪黑素整体水平无明显变化,P>0.05,差异无统计学意义。见表1。

3 讨论

生物昼夜节律的形成是在生物长期进化过程中与生存环境互动的结果,它有一定的内源稳定性,以内源性自律系统的控制为基础,再加上外界环境周期性变化作为授时因子被生物感知,使得生命活动的节律与环境的周期变化同步,其中同步作用最强的是昼夜光照条件的周期性明暗变化。众多实验研究表明,光照强度、光照时间长短以及光谱的组成对机体的昼夜节律都有不同程度的影响。

松果体分泌的褪黑素是传递外界环境光周期变化的信号激素。在人体及动物血中褪黑素的浓度呈脉冲性分泌,表现出昼低夜高的分泌规律,啮齿类动物褪黑素在白天维持在一个很低的水平,入夜后逐渐上升,到3:00～4:00分泌高峰出现,然后逐渐降低,形成一个分泌周期,实验所观察到的正常光照组变化趋势基本与之相符。

持续黑暗组小鼠血清褪黑素分泌表现出不受光照引导的自由节律,与正常光照条件下相比,褪黑素含量升高的时相点前移。在持续光照条件下,小鼠血清褪黑素含量在高水平与低水平之间变化的时相点发生了变化,下降的时相点后移,而上升的时相点前移。尤其在0:00点、8:00点时刻:正常光照条件下8:00点时血清褪黑素为低水平含量,持续光照条件下8点时刻褪黑素水平仍维持在与4点时无显著差异的高水平含量;正常光照条件下0:00点血清褪黑素含量较低,0:00点～4:00点逐渐上升,到4:00点方达到高峰,在持续光照条件下0:00点血清褪黑素含量即达到较高水平。因此在长期持续光照条件下小鼠血清褪黑素的分泌节律出现了紊乱,而作为机体内部感知外界环境昼夜光周期变化的信号激素,这有可能是现代光污染导致睡眠—觉醒节律障碍,进而引起一系列生理节律紊乱的基础。

现代研究普遍认为,光照对于褪黑素的分泌具有抑制作用。但众多实验由于光照条件及实验对象的不同,实验结果也不尽相同,并且大多数研究的焦点集中在光照波长和光照强度的影响作用上,对光照持续时间的影响至今仍未发现普遍一致的规律。

有早期实验发现不管是对于人还是动物,在夜间突然给予1分钟以上的强光照可快速降低血液内及其他组织内的褪黑素含量[2]。有实验对大鼠采用24小时持续光照30天后,测得2:00血清褪黑素含量与正常光照组相比有所降低(正常组褪黑素含量为27.4534±2.6061 ng/ml,持续光照组为24.9920±2.3152 ng/ml),14:00血清褪黑素含量在持续光照下有降低趋势,但无显著差异(P>0.05)[3]。另外有实验在夜间无自然光照下对小鼠采用人工光照持续照射45天,于饲养结束后分别于一个昼夜周期的6个时间点取血,用放射免疫法测定血清褪黑素含量,发现一天内小鼠褪黑素含量整体均值持续光照组大于正常光照组,但对此结果未作分析[4]。在本实验结果中发现,长期持续光照条件下,小鼠一个昼夜周期的褪黑素整体均值含量较正常光照组有显著升高,另外,在前期预实验中,亦发现经过6周持续光照后,小鼠一天内褪黑素含量整体均值较正常组有升高趋势。所以,结合实验结果推测,光照对褪黑素分泌的抑制作用主要表现在,暗期动物突然暴露于光照条件下时褪黑素含量急剧降低,以及短期持续光照条件下褪黑素含量降低。但当动物长期处于持续的光照条件下时(比如在实验中持续时间在6周以上),机体对于长期持续的光照环境作出适应性的调整,通过某种代偿机制使得褪黑素整体水平上升,这种代偿机制可能与松果体的自身调节相关,也可能与其他组织细胞代偿性分泌褪黑素相关[5]。

中医天人相应理论认为,随着光照的变化,自然界阳气存在着生长化收藏的变化过程,在此基础上形成了昼夜的阴阳消长变化,机体阳气与自然界昼夜阴阳消长变化相应对各种生理病理变化有重要影响。本实验研究证实,通过昼夜不同光制改变,可以影响小鼠褪黑素的昼夜节律,导致其昼夜相位或整体含量的改变,这可能是现代光照条件下节律紊乱性疾病发生的重要因素之一,其机制有待于进一步深入探讨。在实验中,褪黑素指标表现出昼夜节律的变动,同时在不同光制的影响下,其昼夜节律发生了改变,该结果说明了中医关于昼夜阴阳消长对人体生理病理的影响具有客观物质基础,初步证明了中医天人相应理论具有科学内涵。

摘要：目的 从光照变化对小鼠褪黑素影响,探索昼夜阴阳消长与生物节律的关联性。方法雄性昆明小鼠144只,随机分为为正常组、长光照组、长黑暗组3组,每组各48只。适应性饲养7天,光照控制干预6周后开始试验取材,分别于0:00,4:00,8:00,12:00,16:00,20:00共6个时间点分组取血,检测血中褪黑素。对各组各时间点小鼠褪黑素数据进行方差分析确定昼夜节律的存在;并分析不同光照条件下小鼠褪黑素节律的不同。用LSD方法对各时间点数据进行两两比较分析,分析昼夜节律对小鼠褪黑素的影响。结果(1)同组小鼠不同时间点血清褪黑素含量有统计学差异(P<0.05),但其节律性随着光照不同呈现不同的特点。(2)正常组小鼠血清褪黑素含量4:00最高。20:004:00是血清褪黑素含量升高的转折时段,4:008:00是血清褪黑素含量降低的转折时段。(3)长光照组小鼠血清褪黑素含量0:00、4:00、8:00这3个时间点含量较高,三者比较差异无统计学意义。12:00、16:00、20:00这3个时间点含量较低,三者比较差异无统计学意义。8:0012:00是血清褪黑素含量明显降低的转折时段,20:000:00(24:00)是血清褪黑素含量明显升高的转折时段。(4)长黑暗组小鼠血清褪黑素含量0:00、4:00两个时间点较高,两者比较差异无统计学意义。8:00、12:00、16:00、20:00这4个时间点含量较低,四者比较差异无统计学意义。在4:008:00时间段是血清褪黑素含量明显下降的转折时段,在20:000:00点时间段是血清褪黑素含量明显上升的转折时段。(4)长光照组褪黑素含量均值与正常组进行组间比较,小鼠血清褪黑素整体水平上升,P<0.05,差异有统计学意义;长黑暗组褪黑素含量与正常组进行组间比较,小鼠血清褪黑素整体水平无明显变化,P>0.05,差异无统计学意义。结论(1)昼夜不同光照改变,可以影响小鼠褪黑素的昼夜节律,导致其昼夜相位或整体含量的改变,这可能是现代光照条件下节律紊乱性疾病发生的重要因素之一。(2)中医关于昼夜阴阳消长对人体生理病理影响的天人相应理论具有客观物质基础和科学内涵。

关键词：昼夜阴阳消长,天人相应,小鼠,褪黑素

参考文献

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褪黑素(MT) 篇2

1 材料和方法

1.1 动物

选用5周SD大鼠24只(广西桂林医学院动物实验室提供)质量为(117.8g±1.9g),随机分成三组:对照组在(每天22:00～06:00暗室常压常氧)(O2的体积分数为0.21)下饲养加灌服生理盐水(每天18:00～20:00按1mg/kg灌服)、实验组分为1组常压低氧(体积分数为8.5%的O2)箱内(每天22:00～06:00暗室间歇缺氧)饲养加灌服褪黑素购自美国Sigma公司(每天18:00～20:00按1mg/kg灌服)、2组在常压低氧(体积分数为8.5%的O2)箱内(每天22:00～06:00暗室间歇缺氧)饲养同时加灌服生理盐水(每天18:00～20:00按1mg/kg灌服)。

1.2 低氧舱构建及常压下间歇性缺氧动物模型的复制

采用常压间歇性低氧法复制由于夜间打鼾引起机体的慢性间歇缺氧大鼠模型,参照樊再雯[3]等人慢性间隙性缺氧箱并加以改进(本实验室):透明选用厚度为5mm有机玻璃箱(750mm×500 mm×500 mm)可容纳20只成年大鼠生活,箱子顶部有一个塑胶套、直径为300mm的窗口、两侧各有一个进气孔和出气各300mm,出气口与空气接触。箱内中线出有一隔板上有多个小孔约20mm方便气体循环,将箱内分成两个气室,前面各有一个放置孔约100mm,方便操作者拿取大鼠和打扫卫生等各项操作。实验者向缺氧箱内循环充入氮气,每次循环为8min,通过控氧仪监测间歇缺氧舱内的氧浓度来控制输入气体和排气量,使每1次循环间歇缺氧舱内最低氧浓度达到8.5%,然后随着排除低氧气体同时吸入空气(氧气浓度20.9%),使氧浓度逐渐恢复到21%,在气体分析仪(OX-100A浙江建德梅城电化分析仪器厂提供)动态监测下调整混合气氧体积分数(10±1.5)%,箱内CO2和水分分别用CO2吸收剂(Molecular Products Cimited代理商上海景年医疗器械有限公司提供)和无水氯化钙(汕头市西陇化工厂有限公司提供)吸收,每2天更换低氧箱内的和CO2吸收剂和无水氯化钙及垫料(桂林医学院动物实验中心提供)。

标本留取3组大鼠鼠分别在常压常氧和常压间歇性低氧下生活8周后:实验组在常压常氧下分别断髓处死称(AC5-3上海旭日衡器有限公司提供)其体重,立即取心肌与左肺冰生理盐水(桂林医学院附属医院实验室提供)中洗净血液。用滤纸吸干后心脏沿房室环剪去心房,再沿室间隔边缘剪下右心室,用滤纸吸干水份,参照徐小红[4]等人右心室肥大检测加以改进:用分析天平(LIBROR AEU-210Shimadzu)分别称其RH和LH+S。接着将右心室肌剪碎,用滤纸吸干称300mg湿组织加蒸馏水按10%(W/V)制成10%匀浆,4℃,3500 r/min,离心(Sigma 3-5)10min,吸取上清液,分装后于4℃倾出保存备用,肺组织同法处理。对照组同前。

1.3 指标测定

(1)记录3组大鼠最初及最终体质量;计算3组大鼠RH右心室和LH左心室+S室间隔重量。(2)取心肌和肺组织各300 1mg检测GSH-PX活力、SOD活性、T-AOC,3种试剂盒均由(南京建成生物工程研究所提供),采用紫外分光光度计(Biochrom Libra S32PC)测定。

1.4 统计学处理

数据以表示,采用SPSS13.0软件,计量资料方差分析,多个样本均数两两之间比较用SNK-q检验(P<0.05)有统计学意义。

2 结果

实验组1,2与对照组大鼠BW、RV/(LV+S)(g/g)、RV/BW(mg/g)的差异见表1。

3 讨论

近年来流行病学和临床研究表明人类的鼾症是OSAHS的主要原因,OSAHS是一种由多种病因引起的发病率高、危险性大的全身性疾病,表现为睡眠时打鼾和呼吸暂停,因其反复发生的低氧血症和高碳酸血症可导致严重的心脑血管并发症和多脏器功能损害如血压病的独立危险因素,冠状动脉病变在OSAHS患者中易于发生和加重已被流行病学调查所证实[5]。有实验证实[6]慢性间歇性缺氧可使心肌组织中活性氧产生和清除机制失衡,进一步促进氧化应激的发生发展,最终心肌组织受损。若能在慢性间歇性缺氧早期应用MT等外源性的抗氧化剂,切断氧化应激的恶性循环,恢复代谢的平衡状态,则有可能减轻心肌损伤,对慢性间歇性缺氧起到有益的预防和治疗作用。本实验通过模拟人类睡眠时由于打鼾引起的间歇性缺氧对心肺造成损害,很多国内外学者就MT对由缺氧引起的氧化应激为重要发病机制的疾病是否具有积极作用开展了大量的体内外动物实验和部分临床实验[7],而MT对于缺氧造成的心肺损害有一定保护作用。

注:n=24实验1,与对照组比较,*P>0.05;实验2与对照组比较,*P<0.05;实验2与实验1比较,△P<0.05

实验组1,2与对照组大鼠心肌和肺组织GSH-PX活力、SOD活性、T-AOC差异见表2,3。

注:n=24实验1,与对照组比较,#P>0.05;实验2与对照组比较,#P<0.05;实验2与实验1比较,#P<0.05

注:n=24实验1与对照组比较,△P>0.05;实验2与对照组比较,△P<0.05;实验2与实验1比较,△P><0.05洛指标的单位为每mg组织蛋白中的单位含量。

有研究发现在慢性缺氧状态下,促红细胞生成素的合成增加,红细胞增多,血液的氧容量和氧含量增加,组织的供氧量增加,这种代偿作用同文献报道一致[8,9],本实验中发现实验2组与对照组、实验1组比较心肌和肺组织的GSH-PX活力、SOD及T-AOC活性明显降低(P<0.05),表明慢性缺氧状态下大鼠心肌和肺组织抗氧化能力的减弱,而灌服MT的实验1组与对照组这些指标没有明显变化(P>0.05),由此说明MT阻止了缺氧对心肺的损伤的进展。对照组大鼠8周内体质量明显增加,符合正常生理变化过程,而实验2组与对照组大鼠BW却比其缺氧前减轻(P<0.05),提示慢性缺氧可对大鼠BW造成影响,而灌服MT的实验1组与对照组大鼠BW也明显增加(P>0.05);于此同时右心室心肌肥大指数RV/(1V+S)、RV/BW比值,发现实验2组与其它二组比较均明显高(P<0.05),而对照组和低氧1组这些指标没有明显变化(P>0.05),由此可以证明MT对于慢性间歇性缺氧心肺有一定保护作用。由于目前尚未有一种安全的方法和药物来干预,由鼾症导致机体损害的进程,本实验的可能对于预防和研发新药有重要意义。

摘要：目的:探讨褪黑素(MT)对常压下慢性间歇缺氧损伤SD大鼠心肺的保护作用。方法:将24只雄性,5周SD大鼠随机分成三组并模拟人类睡眠时间:对照组在常压常氧下饲养加灌服生理盐水,实验组分为实验1组常压低氧箱内饲养加灌服褪黑素、实验2组在常压低氧箱内饲养同时加灌服生理盐水,8周后检测体重(BW)、右心室/左心室加室间隔比值RV/(LV+S),右心室/体质量(RV/BW)比值以及心肌和肺组织谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果:实验2组与实验1组比较大BW明显降低(P<0.05),而RV/(LV+S)及RV/BW明显增加(P<0.05),心肌及肺组织GSH-PX活力、SOD活性、T-AOC均明显降低(P<0.05);实验1组与对照组比较BW无明显差异(P>0.05),而RV/(LV+S)及RV/BW无明显差异(P>0.05),心肌及肺组织GSH-PX活力、SOD活性、T-AOC均无明显差异(P>0.05);实验2组与对照组比较BW明显降低(P<0.05),而RV/(LV+S)及RV/BW却增加(P<0.05),心肌及肺组织GSHPX活力、SOD活性、T-AOC均明显差异(P<0.05)。结论:褪黑素可防止慢性间歇缺氧对心肺的损伤作用。

关键词：褪黑素,慢性缺氧,心肺,保护作用

参考文献

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褪黑素(MT) 篇3

目前, 褪黑素对于脑组织损伤保护作用的研究, 国内外已经做了相当程度的工作, 但是褪黑素对脊髓损伤保护作用的研究还寥寥无几。笔者的实验在已有研究的基础之上, 进一步阐述褪黑素对大鼠急性脊髓损伤保护作用的机制, 为临床治疗提供相应的理论基础。通过测定SCI后胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 及诱导型一氧化氮合酶-1 (i NOS-1) 的表达变化情况来验证褪黑素对脊髓损伤以后的保护作用, 并在不同时间点将褪黑素与甲强龙的疗效进行对比。

1 资料与方法

1.1 动物模型

健康成年雄性Wistar大鼠72只, 体质量230~280 g, 随机分为褪黑素组、甲强龙组、打击对照组和无水乙醇组 (每组分别分2、24和72 h 3个时间段, 每个时间段6只鼠) , 10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉, 背部剪毛, 然后将大鼠俯卧位固定于手术台上, 消毒、铺巾, 行背中段正中切口, 以T9为中心显露T8~10棘突椎板, 暴露脊髓硬膜, 采用改良Allen’s脊髓打击技术, 打击装置整合于立体定位仪上, 用5 g重锤自距硬膜10 cm的高度垂直落下, 造成大鼠急性脊髓损伤。以打击后鼠尾出现无规则的痉挛性摆动为打击成功的标志。随后止血, 盐水冲洗后以0号线逐层缝合。术毕在创口撒少许青霉素粉, 防止感染。褪黑素组大鼠腹腔内注射褪黑素 (100 mg/kg, 瑞士Alexis公司生产) , 按照褪黑素说明书要求, 用无水乙醇进行稀释;甲强龙组腹腔内注射甲强龙 (30 mg/kg, 法玛西亚——普强公司比利时分厂) ;打击对照组腹腔内注射与褪黑素组等量的生理盐水;无水乙醇组注射与褪黑素组等量的无水乙醇。各组大鼠均于损伤后每天上午8时、下午2时及下午8时3次人工膀胱排尿, 直到相应时间点取材。

1.2 取材及切片制备

3组脊髓损伤大鼠分别于术后2、24和72 h按BBB分级法评价大鼠双后肢神经功能恢复情况, 然后各组动物分别在相应时间点麻醉剖胸, 经左心室-主动脉插管灌流固定, 先用生理盐水约200 m L冲洗至流出澄清液, 再用4%多聚甲醛约200 m L灌流固定, 解剖椎管, 完整取出损伤段脊髓组织。迅速用4%甲醛液进行固定, 24 h后石蜡包埋固定, 以备苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色。

1.3 免疫组织化学

GFAP:所取材各标本脊髓组织均按严格要求做成厚度5μm的连续切片, 脱蜡浸水, 1%H2O2-甲醇30 min, 0.1%胰酶37℃20 min, 马血清封闭37℃30 min, 1∶500 GFAP单抗 (Sigma) 4℃24 h, 1∶200生物素酰化二抗37℃45 min, SABC显色, Mayor苏木素复染, 晾干封片。染色过程中除正常血清外, 均需0.01 mol/L浓度的PBS洗3次。

i NOS-1:脱蜡水化后, 用3%过氧化氢室温孵育10 min, 以灭活内源性过氧化物酶;正常山羊血清室温封闭20 min;加入1∶80稀释兔抗大鼠i NOS多克隆抗体 (Sigma) 后4℃过夜;随后滴加生物素化羊抗兔Ig G 37℃20 min;滴加试剂SABC 37℃孵育20 min;最后DAB显色, 苏木素复染, 封片。

1.4 图像采集分析

以细胞中呈含有明显的黄棕色颗粒者为阳性。利用图像分析系统 (Olympus光学显微镜图像采集系统及显微图像分析系统, 型号:Meta Morph/DP10/BX41, 生产厂:UIC/Olympus, US/JPA) 进行图像采集及吸光度 (Α) 测定。

1.5 统计学分析

所有数据资料均采用SPSS 12.0统计软件进行处理。各组标本吸光度的表达数值用均数±标准差表示, 用单因素方差分析进行统计学检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色

损伤区2 h脊髓组织即有广泛出血。24 h中央灰质和白质毛细血管、小动脉和小静脉周围出现大片出血;灰质结构破坏, 灰质中仅存在少量神经元, 主要位于后角;白质中可见肿胀的轴突和大量空泡;细胞边界模糊不清, 并有大量巨噬细胞和多形白细胞浸润。72 h相应节段损伤加重, 灰白质中结构破坏明显, 部分细胞出现形态改变, 坏死区有胶质细胞和内皮细胞肥大、增生, 炎症反应进一步加剧, 灰质中有囊性变化, 白质中有脱髓鞘变化和微小空腔形成。

电镜所见:脊髓损伤后, 线粒体局部嵴缺损, 核糖体减少, 细胞轮廓不清, 局部有破损 (图1A) , 细胞核内异染色体凝集, 靠近核膜边集, 胞质细胞突起 (图1B) , 核膜皱缩, 异染色质凝集, 少量边集, 核膜破损, 细胞膜模糊, 粗面内质网扩张 (图1C) , 神经纤维局部脱髓鞘, 板层分离, 水肿 (图1D) 。

通过光镜和电镜观察, 褪黑素组、甲强龙组与生理盐水组、无水乙醇组比较, 相应时间段脊髓损伤均有不同程度的减轻。

2.2 免疫组织化学

GFAP:SCI后2 h GFAP阳性细胞即有表达, 24h阳性细胞数量明显增高, 72 h继续呈现增高趋势。褪黑素组、甲强龙组SCI后的阳性表达细胞数与打击对照组、无水乙醇组比较, 均有一定程度的减少 (见表1和图2~4) 。

注:1) 与打击对照组比较, P<0.05;2) 褪黑素组与甲强龙组比较, P>0.05;3) 与打击对照组比较, P>0.05

i NOS-1:SCI后2 h仅有少量阳性细胞表达, 24h与72 h阳性表达明显, 呈明显增加趋势。褪黑素组、甲强龙组的阳性表达细胞数与打击对照组、无水乙醇组比较, 均有不同程度的减少 (见图5~6和表2) 。

3 讨论

脊髓损伤是导致死亡和致残的最常见原因之一。脊髓的外伤性损伤可导致神经组织坏死、功能丧失、一些轴突直接被破坏, 称为直接损伤或原发性损伤。更多数量的轴突是由于病理化学和病理生理学的变化而坏死或丧失功能, 称为继发性损伤。继发性损伤是由直接损伤引起的, 并且更容易受到药理学的干扰。目前临床研究的重点是脊髓继发性损伤的治疗。脊髓继发性损伤有许多病理化学和病理生理学等方面的变化, 包括:氧自由基、神经递质、神经肽、酶活动的改变[1]。目前脊髓继发性损伤的机制尚未完全明确, 已知的相关因素有损伤后缺血、离子失衡、脂质过氧化、炎症介质等, 而氧自由基诱导的脂质过氧化是其中最重要的原因之一。脊髓损伤后, 局部组织缺血缺氧, 出血, 红细胞溶解, 大量的游离铁从铁蛋白和血红蛋白中释放, 导致损伤后脊髓组织形成高毒性的羟自由基, 引发脂质过氧化的链式反应。由于脊髓组织含有丰富的不饱和脂肪酸, 易发生脂质过氧化, 这样便触发脊髓组织广泛的脂质过氧化, 造成细胞坏死, 功能丧失。

激素类制剂在20世纪60年代开始应用于临床治疗脊髓损伤, 当时主要的理论基础是激素能减轻脊髓损伤后的继发水肿。近年来, 经过各国学者的深入研究, 认为甲强龙 (methylprednisolone, MP) 具有多方面的神经保护作用, 包括改善微循环、抑制脂质过氧化、减少细胞钙内流、维持神经元兴奋性等[2]。甲强龙作为治疗实验性脊髓损伤的一种药理学手段已经被广泛应用, 而且在临床当中, 甲强龙也被证实是治疗急性脊髓损伤的一种有效方法。众多研究表明, 氧自由基诱导的脂质过氧化是导致继发性脊髓损伤的一个极为重要的因素, 甲强龙则是由于它的有效的抗氧化作用而在脊髓损伤后发挥保护脊髓的功效的[3]。目前早期应用甲强龙治疗脊髓损伤已在国内外得到公认。但是, 作为一种皮质类固醇激素, 长期大量使用可以产生一系列并发症, 如感染、高血压、急性胃溃疡、股骨头坏死等。

褪黑素 (melatonin MT) 是一类主要由松果体细胞分泌的肽类激素, 具有高度的脂溶性和水溶性, 能透过核膜进入核内发挥作用, 因此不仅能保护膜脂质, 还能保护蛋白质、核酸及细胞其他成分[4]。近年, 随着对褪黑素研究的深入, 它的多种作用已初见端倪, 如抗衰老、天然的助眠剂、调整时差、治疗肿瘤或辅助治疗肿瘤、防治老年痴呆、治疗帕金森病、防治癫痫发作、预防老年人白内障、解除疼痛和紧张、预防前列腺肥大、防治阳萎、预防冠心病、保护心脏、抑制糖尿病的发病等。ERKAN研究表明[5], 对于脊髓损伤, 褪黑素与甲泼尼龙琥珀酸钠具有相同的抗氧化能力, 但对脊髓继发损伤, 褪黑素具有比甲泼尼龙琥珀酸钠更好的效果。且近年来研究发现褪黑素能直接清除自由基、抑制肿瘤坏死因子和过氧化物酶[6], 减轻中性粒细胞介导的毒性损害[7,8], 可以减轻细胞损伤和凋亡[9]。褪黑素是通过抑制自由基的产生、清除自由基、直接解除自由基的毒性等发挥抗氧化作用的, 而且已经被证明可以进入细胞和细胞核[10,11]。甲强龙则是直接通过膜反应来发挥它的神经保护作用的。在以前的研究中, 褪黑素被证实可以保护因致癌因素和离子辐射等所致的氧自由基导致的核酸破坏, 减轻中性粒细胞介导的毒性损害。除此之外, 褪黑素还是电子供体, 所以, 它不仅可以保护生物分子防止自由基的损害, 并有可能通过提供电子来修复乏电子生物分子。褪黑素对自由基的清除不需要受体, 而且能够进入绝大多数细胞及生物屏障, 这一特点使它可以进入绝大多数亚细胞结构发挥作用, 从而更好地发挥脊髓保护作用[12,13]。

GFAP作为星形胶质细胞 (astrocyte, AS) 的一种标志蛋白, 存在于正常星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞中, 其表达的高低可从侧面反映星形胶质细胞增殖、肥大、坏死等改变的程度, 从而反映脊髓损伤性改变的程度。NOS是一氧化氮生物合成的关键酶。一氧化氮可以与氧自由基反应生成过氧化硝基阴离了及烃自由基, 引起广泛的脂质过氧化及蛋白质酪氨酸硝基化反应, 一氧化氮还可以与细胞内许多酶的铁硫中心结合, 破坏线粒体电子传递体系和柠檬酸循环, 抑制靶细胞氧化呼吸, 干扰DNA双链的转录翻译等, 促使细胞死亡, 引起组织损害, 高浓度的一氧化氮对损伤组织的作用弊大于利[14]。因此, NOS表达水平可以从侧面反映一氧化氮的表达水平。所以, 在笔者的实验当中选择GFAP和i N-OS-1来作为反映脊髓损伤程度的两个指标。

笔者的研究也证实, 脊髓损伤后GFAP和i N-OS-1在损伤区域细胞内表达增加, 通过测定各组实验大鼠损伤段脊髓GFAP和i NOS-1阳性细胞的表达及损伤前后BBB评分的变化, 发现甲强龙与褪黑素治疗的实验组GFAP和i NOS-1表达明显减少, 损伤后BBB评分明显高于对照组, 从而推测褪黑素与甲强龙均可抑制脊髓损伤后细胞GFAP和i N-OS-1的表达, 具有减轻脊髓组织继发性损伤的明确作用。经过与甲强龙进行多个时间点的对比, 笔者发现褪黑素组GFAP和i NOS-1的表达与甲强龙组无明显差异。

褪黑素在抗运动性疲劳中的作用 篇4

1 褪黑素、运动与抗氧化

研究表明, 耐力训练可以提高红细胞中抗氧化酶的含量, 不同负荷训练对红细胞自由基代谢的影响不同;自行车运动员在完成定量负荷运动后红细胞中SOD活性显著升高, CAT活性下降, 而GPX活性没有显著变化[1], 而大鼠在定量负荷运动后各时段红细胞SOD活性显著地持续下降[2]。研究指出, 强度越大和 (或) 每天运动时间越长, 对提高骨骼肌SOD和GPX的活性作用越明显[3]。褪黑素能显著对抗CCl4或KCl所致小鼠肝脏或脑组织丙醛含量的增加, 可明显抑制环磷酰胺引起的小鼠骨髓细胞微核增多和清除自由基, 可显著对抗醋氨酚所致小鼠GSH的耗竭作用, 提高红细胞内SOD、CAT、全血GSH-Px活性[4]。褪黑素不但能有效清除化学反应中产生的羟自由基, 也可抑制H2O2引起的过氧化脂质含量的升高, 且褪黑素清除过氧化脂质的作用比维生素E、维生素C、谷胱甘肽均强, 并且褪黑素可增强组织谷胱甘肽过氧化物酶的活力。

2 褪黑素、运动与免疫

机体的免疫功能体现在对抗原性异物的识别和清除, 免疫系统通过一系列白细胞来去除抗原性异物, 或一系列细胞因子、淋巴因子调节免疫反应。运动对人体免疫能力有直接影响。有实验表明, 运动员在大运动量的强化训练期或竞技比赛中, 上呼吸道感染风险明显增加[5], 可能是过量运动引起的急性免疫反应, 此时机体免疫处于免疫功能减弱期, 人体免疫力下降。不同运动量急性运动后, 红细胞C3b受体 (RBC-C3b R) 活性与安静时相比显著性下降, 其下降程度与运动量大小呈正相关。运动量是影响乃至决定RBC-C3b R活性变化的主要因素。急性运动后小鼠脾脏淋巴细胞对分裂和抗原的增殖反应明显增强, 而辅助性T细胞比值上升, 脾淋巴细胞培养液中IL-2活性增强, 但腹腔巨噬细胞分泌IL-1水平无明显变化[6]。

褪黑素可增加免疫器官的重量, 提高外周血中淋巴细胞百分数, 促进抗体形成T、B淋巴细胞增殖反应, 刺激细胞因子产生, 参与神经内分泌免疫网络的调控, 且褪黑素在介导免疫功能昼夜节律方面发挥重要作用[7]。研究发现, 松果体切除的小鼠注射ML后, 小鼠恢复了胸腺以及外周的免疫功能, 对小鼠中断ML补充治疗后, 小鼠又回到免疫低下状态, 再给予小鼠ML治疗, 其免疫功能参数又均恢复[8]。褪黑素对正常小鼠能通过增加CD4+和CD8+T细胞的百分比, 增加细胞免疫功能, 保持CD4+/CD8+比值正常, 维持Th/T比例, 发挥免疫调节作用。褪黑素对免疫功能低下或缺陷者, 则是通过提高CD4+、CD8+和T细胞的百分含量, 改变CD4+/CD8+比值, 调整Th/T比例而发挥免疫增强作用[9]。

3 褪黑素、运动与细胞凋亡

细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程。研究表明, 引起细胞氧化的因素对细胞凋亡有着积极的作用, 消除自由基的各种因素能抑制氧化诱导的细胞凋亡, 自由基可诱导细胞凋亡。因此, 运动、自由基与细胞凋亡有很大关系。研究表明, 细胞凋亡与疲劳有关, 并且随疲劳程度加深, 细胞凋亡的比例越高, 运动诱导骨骼肌细胞发生凋亡时, 其肌细胞内钙含量显著升高, 并且运动后产生的自由基的浓度与肌细胞凋亡程度显著相关, 在细胞凋亡的时间上, 运动后即刻和运动后48 h小鼠肌肉肌细胞凋亡率显著高于非运动组[10], 而MT预处理能明显因减少氧中毒所致的细胞凋亡。研究表明, 细胞在发生凋亡早期, 其胞质内钙离子浓度呈持续性升高, 钙离子浓度的升高激活钙依赖性酶, 进而使DNA断裂和使胞质内蛋白质发生交联, 引起细胞凋亡。Biral等[11]也认为正常肌肉在离心运动中的过度牵拉会使一些肌细胞膜蛋白丢失, 也会导致骨骼肌细胞凋亡或坏死。因此, MT抑制细胞凋亡的原因可能是通过抑制线粒体释放细胞色素C和抑制线粒体跨膜电位的降低而减少自由基的生成, 从而降低缺血-再灌注诱导的小脑颗粒细胞的凋亡, 或者直接与糖皮质激素受体发生作用, 诱导IL-4的释放或直接调节凋亡抑制基因bcl-2的表达[12,13]。

摘要：褪黑素 (melatonin, MT) 为松果体分泌的一种高亲脂性神经内分泌激素化合物, 在人体内有着广泛的生理作用。本文从运动的角度阐明褪黑素与抗氧化系统、免疫以及细胞凋亡的关系, 指出褪黑素能消除自由基、提高机体抗氧化和免疫能力, 并能抑制细胞凋亡, 补充褪黑素对运动功能的恢复有着积极的作用。