破壁灵芝孢子粉

破壁灵芝孢子粉（共3篇）

破壁灵芝孢子粉 篇1

摘要：目的 建立虫草破壁灵芝孢子粉中腺苷虫草素含量测定方法。方法 采用HPLC法测定虫草破壁灵芝孢子粉中腺苷、虫草素的含量, 色谱柱为LK PN C18柱, 流动相为甲醇-水 (12:88) 流速为1 ml/min, 检测波长为260 nm。结果 腺苷和虫草素进样量与峰面积在10μg/min80μg/min范围内均呈良好线性关系, 相关系数r分别为0.9988和0.9992;平均回收率分别为99.6%和99.9%。RSD分别为0.54%, 0.58% (n=6) 。结论 本方法操作简便、快速、结果准确, 可作为该制剂中腺苷和虫草素的质量控制监测。

关键词：虫草破壁灵芝孢子粉,虫草素,HPLC

虫草破壁灵芝孢子粉是北冬虫夏草 (又名蛹虫草) 与灵芝破壁孢子粉等名贵中药组成。北冬虫夏草和灵芝都属滋补品, 具有扶正祛邪、滋肺补肾的作用。方中灵芝孢子粉比灵芝子实体功效更高, 作用更强, 但灵芝孢子粉破壁后更容易被人体吸收利用, 北冬虫夏草中含有腺苷、虫草素等成分[1], 其活性成分具有调节机体免疫力、抗肿瘤等多种药理活性, 根据其腺苷、虫草素的性质, 采用了适宜的提取分离方法, 用高效液相色谱法对虫草破壁灵芝孢子粉中虫草素、腺苷进行了含量测定, 获得了满意的结果。

目前虫草破壁灵芝孢子粉中的虫草素、腺苷含量测定暂无统一标准, 为确保质量得到有效控制, 本实验采用HPLC方法对虫草破壁灵芝孢子粉中的腺苷、虫草素含量进行测定研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

德国Agilent 1260 lnfinity液相色谱仪 (泵G1311C、紫外检测器G1314B、7725进样器) ;美国OHAUS DV215CD电子天平;TGL-10B离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;KQ-50B型超声波 (昆山市超声仪器有限公司) 。

1.2 试药

腺苷对照品 (批号:110879-200202) , 虫草素对照品: (批号:858-200202) 均由中国食品药品检定研究院提供;甲醇 (色谱纯, 美国Merck公司) , 水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:LK PN C18:330124-03色谱柱 (4.6×250 mm, 5μm) ;流动相:甲醇-水 (12:88) ; (流速:1 ml/min) ;检测波长260 nm; (柱温:30℃;分析时间:20 min;理论塔板数均不应低于2000) 进样量10μl。

2.2对照品贮备溶液的制备

分别精密称取腺苷和虫草素对照品约10 mg (准确到0.00001 g) 于50 ml容量瓶, 用90%甲醇溶解稀释至刻度, 摇匀, 以此分别作为腺苷、虫草素对照品溶液贮备液。精密吸取上述贮备液一定体积用90%甲醇稀释制成浓度分别约为10.0μg/ml。 (腺苷、虫草素对照品溶液)

2.3 供试品溶液的制备

精密称取供试品 (过三号筛) 约1.0g, 置50 ml容量瓶中, 加入90%甲醇40 ml, 超声处理 (功率250W, 频率20 k Hz) 30 min, 放冷, 用90%甲醇稀释至刻度, 摇匀, 离心 (4000 r/min, 15 min) , 取上清液, 用0.45μm微孔滤膜过滤, 滤液供HPLC分析。

2.4 阴性对照溶液的制备

依照虫草破壁灵芝孢子粉的制备工艺和供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液, 依法测定。结果阴性对照在腺苷虫草素相应的保留时间无干扰。

结果:供试品溶液中呈现与腺苷对照品、虫草素对照品保留时间相同的色谱峰;空白溶液无色谱峰。

2.5标准曲线及线性范围

分别吸取2.2项下对照品溶液0.1ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml置5个2 ml容量瓶中, 加90%甲醇稀释至刻度, 摇匀, 制成分别约含10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的溶液。分别取上述标准液各取10μl进样。以腺苷和虫草素的浓度 (X) 为横坐标, 以对应峰面积 (Y) 为纵坐标绘制腺苷和虫草素的标准曲线。腺苷和虫草素均在10μg/ml~80μg/ml之间浓度的范围内, 峰面积与浓度呈良好的线性关系。其线性回归方程及相关系数见表1。

2.6 精密度试验

取2.1项浓度为10.0μg/ml的对照品溶液, 连续进6针, 每针进10μl。腺苷和虫草素的峰面积积分值的RSD分别为0.47%、0.55% (n=6) 。

2.7 稳定性实验

取批号为120615供试液在8 h内每隔2h进样测定, 5次测定腺苷和虫草素RSD为0.42%、0.64%, 表明供试品在8 h内基本稳定。

2.8 重复性实验

精密称取6份批号为120914虫草破壁灵芝孢子粉, 按照样品供试液制备方法进行处理, 测定, 样品的腺苷和虫草素平均含量为0.105%、0.211%, RSD分别为0.54%、0.58%。

2.9 加样回收实验

取已知虫草素腺苷含量批号为120914虫草破壁灵芝孢子粉约0.25 g, 精密称定, 共9份, 分成3组, 每组分别精密2.2项加腺苷、虫草素对照品溶液 (浓度分别约为10.0μg/ml) 2 ml、3 ml、4 ml, 依照供试品溶液制备方法制成供试品溶液, 测定, 计算其加样回收率。结果腺苷、虫草素回收率平均值分别为99.6%、99.9%, 相应的RSD分别为0.73%、0.87%。

2.1 0 样品含量测定

按2.3项下供试品溶液的制备法, 对批号为120215、120615、120914进行处理, 每批取量2份做平行处理, 测定, 结果见表2, 色谱图见图2。

3 讨论

虫草破壁灵芝孢子粉中含有腺苷、虫草素等成分通过对腺苷及虫草素对照品在190~800 nm波长范围内进行扫描, 结果表明腺苷和虫草素在195、260 nm处波长都有最大吸收, 考虑到在低波长195 nm左右干扰较多, 所以本法选用260nm为检测波长。这与甘宾宾等[2]的分析相同, 由于虫草破壁灵芝孢子粉含有大量低聚果糖等水溶性成分采用甲醇提取可以更多地除去杂质, 避免损伤液相柱。流动相经多次摸索, 选用乙腈为流动相, 乙腈毒性较大、价格较贵等, 最佳比例为甲醇:水=12:88, 此时腺苷虫草素与杂质峰已能完全分离。

本文建立了HPLC法测定虫草破壁灵芝孢子粉中腺苷及虫草素含量, 并进行了方法学考察, 结果可以看出, 本方法稳定性好、准确度高, 操作可行, 可以作为虫草破壁灵芝孢子粉腺苷虫草素质量控制方法。

参考文献

[1]郭澄, 朱杰.高效液相色谱法测定人工虫草菌丝中腺苷和虫草素的含量.中国中药杂志, 1998, 23 (4) :236.

[2]甘宾宾, 潘艳坤.HPLC法测定保健食品中虫草素和腺苷含量.中国卫生检验杂志, 2006, 16 (11) :1310-1311.

破壁灵芝孢子粉 篇2

B、还有灵芝在以下情况是不建议使用的：病人手术前、后一周内，或正在大出血的病人。

C、服用灵芝无效之原因。正常的情况服用1-2周后即有改善的表现，继续服用则可让身体恢复健康。但是也会碰到没有效果的，其原因可能如下：

没有定时、定量食用(想到才吃)。分量不够。有瞑眩(排毒)反应时，因害怕而未再继续食用。饮食、运动、生活没有好好配合。病得太久，而所服用药物太多，体内毒素无法短时间内彻底排除，或先前用药不当，反而积毒、积患成疾。病情时好时坏，过于心急、缺乏耐性而失去信心，没有继续食用。心理因素，因接受别人消极的建议，不再食用。

D、灵芝对其它各种慢性病，均有相当的功效，最好亦要与维他命C一起长期服用。

E、老人、小孩、孕妇服用也安全?原则上，任何人都可以服用灵芝。小孩与老人的身体抵抗力(免疫力与肝脏之解毒力)比成人弱，因而容易患各种疾病。服用灵芝，抵抗力就会大为增强，因而不易感冒，因此，小孩与老人更要率先服用灵芝。小学生以下的小孩，适量为成人的2/3，体重轻而虚弱型的老人，适量为成人的2/3。孕妇如果是怀孕3个月之内，请勿开始服用，因为当今全是添加物的加工食品，空气污染药害厉害、污染自来水……，畸形儿的发生大为增加。而刚开始服用，若在如此不幸状况下时，实际上也难否定其因果关系。因此，还是请不要开始服用为宜。不过怀孕四个月以上，胎儿五体已经完成，所以服用无妨。事实上，服用者之中，也有相当多的报告指出，对妊娠性肾盂肾炎有着效，孕吐得以减轻。

破壁灵芝孢子粉 篇3

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为蝉白僵菌孢子粉。将保存于实验室的蝉白僵菌接种到优化后的液体培养基中, 恒温 (25℃) 振荡 (110~120 r/min) 培养48~72 h后转接到固体培养基中, 恒温培养7 d至产孢, 通过旋风分离装置分离收集分生孢子粉。试验试剂包括0.01%吐温-80、超纯水、液氮。仪器与设备:磁力搅拌器、高速离心机、烘箱、冰箱、电磁炉、光学显微镜、混匀器、电子天平。

1.2 试验设计

试验设不同温度与时间的4个组合处理, 分别为:置于液氮中30 min, 用沸水处理5 min (A) ;-20℃冰箱保存4 h, 用沸水处理5 min (B) ;置于液氮中30 min, 于135℃高温下处理1 min (C) ;置于-20℃冰箱中保存4 h, 于135℃高温下处理1 min (D) 。每个处理重复3次。

1.3 试验方法

1.3.1 孢子粉预处理与悬液制备。

为了去除杂质干扰, 孢子粉经过前处理 (水洗、烘干) 后制作孢子悬液。称取孢子粉0.5 g加入50 m L 0.01%的吐温-80中, 用磁力搅拌器搅拌2~3 h, 获得孢子悬液。采用血球计数法测定加入其中的孢子数。准备eppendorf管, 各装入混匀的孢子悬液1 m L, 备用。

1.3.2孢子破壁处理。

将装好孢子悬液的eppendorf管以12 000 r/min高速离心5 min后, 去除上清液, 只留沥干后的孢子粉, 放在37℃烘箱烘5 min, 然后按试验设计分别进行孢子破壁处理。

1.4 统计内容与方法

1.4.1 破壁后孢子的计数。

在4~15号管中重新加入1 m L0.01%的吐温-80, 在混匀器上充分混匀后, 仍然采用血球计数法在200倍光学显微镜下测定破壁之后的孢子数。如果孢子破壁与否不好辨别时, 也可用更高倍数的光学显微镜观察。

1.4.2 破壁率的计算。

在显微镜下, 通过对未经破壁处理的孢子粉 (N) 以及破壁处理后的孢子粉 (N1) 进行计数。然后按如下公式计算破壁率:

式 (1) 中:X为破壁孢子粉样品的破壁率 (%) ;N为未进行破壁处理前的孢子数目 (个) ;N1为破壁孢子粉样品中未破壁的孢子粉的数目 (个) 。

2 结果与分析

按照上述方法计算处理获得的孢子粉破壁率及其标准差见表1。由数据分析得, 液氮处理30 min显著优于-20℃冰箱中保存4 h处理 (p=0.007 8) ;而处理时间则差异不显著 (p=0.688 5) , 并且处理C和处理D差异显著。由表1可知, 置于液氮30 min, 经135℃高温1 min破壁处理后的孢子粉的数目明显少于其他处理方式的孢子数, 其破壁率高达91%, 远高于-20℃冰箱中保存4 h、135℃高温处理1 min的64%, 说明在破壁处理过程中, 液氮起到了主导作用。

3 结论与讨论

试验结果表明, 低温冷萃的前处理对孢子的破壁非常重要[5], 液氮处理30 min达到的效果明显高于-20℃冰箱中处理数小时的效果;后期的高温与沸水处理效果差异不明显。在使用血球计数板计数的过程中, 对能够影响到计数结果的操作尽量进行统一量化处理, 如涡旋混合前溶液的相对状态、涡旋混合的时间、制片时取样的位置、对压线孢子的计数、孢子破壁与否的标准等都进行了统一的规定, 当然这些也难以避免操作过程中人为因素的影响而造成的随机误差, 只能通过控制使之尽量降低[6]。

参考文献

[1]难波恒雄.和汉药百科图鉴 (Ⅱ) [M].北京:中国医药科技出版社, 2001:198.

[2]俞滢, 顾蕾, 陈启琪.蝉花的化学成分分析[J].杭州师范学院学报, 1997 (6) :61-63.

[3]王砚, 赵小京, 唐法娣.蝉花药理作用的初步探讨[J].浙江中医杂志, 2001, 36 (9) :219-220.

[4]尚晓东, 李明容, 王南, 等.应用血球计数板检测孢子粉破壁率的研究[J].食用菌学报, 2005, 12 (2) :37-40.

[5]倪伟锋, 邢增涛, 赵晓燕, 等.破壁灵芝孢子粉破壁率测定的研究[J].上海农业学报, 2008 (3) :51-55.