灵芝多糖（精选6篇）
灵芝多糖 篇1
灵芝 (Ganoderma Lucidum) , 隶属多孔菌科灵芝属, 在中国古称瑞草, 也叫长生草、灵草。《本草纲目》中称灵芝“甘温无毒, 主治耳聋, 利关节, 保神, 益精气, 坚筋骨, 好颜色, 疗虚劳, 治痔”。现代临床和药理研究表明, 灵芝具有多种生理活性与药理作用, 特别是灵芝多糖提取物具有免疫调节功能和明显抗癌和抗衰老功能 [1]。灵芝的各种药理活性大多和灵芝多糖有关。灵芝多糖的提取方法有煎煮法、水蒸馏法、溶剂浸提法等, 其提取时间长, 影响提取率。随着现代科学的发展, 超临界萃取、超声波、微波、超滤、凝胶电泳分离、新型吸附层析分离、真空冷冻干燥提取分离等新技术, 已经应用到中药和天然植物研究生产领域中[2]。作者曾对灵芝中超声波提取灵芝多糖的各种因素进行了实验室研究, 确定了提取灵芝多糖的最佳工艺条件。在此基础上进行放大试验, 利用自制的提取辅剂, 灵芝多糖的提取率达到85%以上, 灵芝多糖的得率达到60%以上。试验表明, 利用超声波产生的强烈振动、空化效应等作用[3], 能破坏灵芝坚实细胞壁, 从而加速灵芝多糖的溶出, 实现提高灵芝多糖提取率的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
原料:灵芝 (人工栽培) , 福建出产;纯水, 自制;取辅剂, 自制。
主要设备:切片机;200L超声波提罐;100型外循环真空浓缩机组;ZLPG-10喷雾干燥机组;岛津紫外分析仪。
1.2 工艺流程和方法
1.2.1 工艺流程
1.2.2 方法
1.2.2.1 灵芝多糖的提取
称取切片灵芝 (厚度1～2mm) 10.0kg, 加到200L超声波提取罐, 加纯水180kg (料液比为18倍) , 加入70g提取辅剂, 在70℃下预浸1h, 开启超声波发生器, 提取2h, 提取三次, 合并提取液, 提取液经过粗滤后, 开启隔膜泵, 再经过双联过滤器和板式过滤器, 提取液进入真空浓缩罐浓缩, 浓缩到相对密度为1.2～1.3, 制得灵芝多糖流浸膏。
1.2.2.2 样品的测定
以苯酚—硫酸法[4]测定多糖的含量, 以葡萄糖为标准。样品用95%乙醇处理至裴林试剂检测单糖呈阴性。检测波长490nm。
1.2.2.3 灵芝多糖的提取率和得率计算
灵芝多糖的提取率公式:
提取率=提取液含量/原料量 ×100%
灵芝多糖得率公式:
得率=提取物多糖含量/原料量 ×100%
2 工艺操作要点
2.1 超声波提取
首先对灵芝进行切片处理, 厚度应控制在1～2mm之间;其次, 本超声波频率为20kHz, 控制电流2～3A, 由于灵芝细胞壁坚实, 适当延长提取时间;最后, 在提取过程中要进行强化搅拌。
2.2 提取液过滤
提取液先经过超声波提取罐自带的粗滤装置粗滤后, 经隔膜泵通过双联过滤器和板式过滤器进行精滤, 得到不含悬浮颗粒的提取液。以避免或减少浓缩操作结焦、粘壁等。
2.3 真空浓缩
由于灵芝多糖的物性原因, 应控制好真空度, 本试验控制在-0.090～-0.075MPa, 温度在45℃～65℃。
2.4 喷雾干燥
喷雾干燥操作条件为:热风温度:200℃, 出口温度:75℃。
3 结果和分析
3.1 原料多糖含量
原料灵芝中多糖含量:23.02mg/g。
3.2 提取液多糖含量
提取液经过滤后, 分批次取样测定, 计算平均值, 其测定结果见表1。
表1结果表明:采取的超声波提取工艺比较稳定和可行的。
3.3 浓缩浸膏多糖含量
提取液经真空浓缩后, 分批次取样测定, 计算平均值, 其测定结果见表2。
表2结果表明:超声波提取工艺条件和真空浓缩条件选定是合理的。为今后工业化大规模生产提供了试验依据。
3.4 灵芝多糖含量
灵芝浸膏经喷雾干燥, 得到棕褐色提取物, 分批次取样, 测定, 其测定结果见表3。
以上结果表明, 利用超声波提取灵芝, 原料灵芝中多糖提取率均在80%以上。
3.5 分析与讨论
由上述结果表明, 超声提取技术是利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等, 主要破坏了灵芝坚实细胞壁, 加快了多糖类可溶物的溶出效应, 从而提高了灵芝多糖的提取率。超声提取方法比常规提取方法具有更大优势, 提取时间大大缩短, 提取过程温度也较低, 避免了高温对灵芝多糖分子结构的分解。
灵芝多糖也是一种极性很大的物质, 易溶于水, 而不溶于醇等有机溶剂。目前, 常见的灵芝多糖主要可分为水溶及碱溶两种方法提取。虽然以稀碱提 取灵芝多糖, 可以明显地提高了灵芝多糖的提取率, 但其杂质也多, 给多糖纯化带来很大障碍, 而且在碱性条件下很多糖肽结构都会遭到破坏, 肽链断裂。因此, 灵芝多糖的提取应避免在强酸、碱溶液中进行, 否则会造成灵芝多糖糖酸解和键断裂, 发生构象变化。
本试验提取灵芝多糖, 考虑灵芝生物特性, 以水为提取介质, 为加大多糖提取效果, 对原料进行切片处理, 进行预浸处理, 在温度较低的条件下采用超声提取技术, 从而为这一技术工业化提取灵芝多糖进行了试验研究, 为大规模生产提供依据。
4 结 论
(1) 利用超声波对灵芝的提取中间试验表明, 超声波应用于灵芝多糖的工业化生产是可行的, 并且提高了多糖产量。
(2) 根据工艺流程和放大试验结果, 工业化生产选择以下设备:超声波提取罐、双联过滤器、板式过滤器、薄膜蒸发器、真空机组和喷雾干燥机组。
(3) 试验得到灵芝多糖提取物, 含量均在20%以上, 质量符合使用要求。
(4 ) 本试验与工业化生产会有不同之处, 但可以在实际生产过程中进行研究和调整。
参考文献
[1]陈国良, 陈晓清.灵芝有效成分研究综述[J].中国食用菌, 1995, 14 (4) :7-9.
[2]林颖, 吴敏刘, 吴雯, 等.天然产物中的糖含量测定方法正确性研究[J].天然产物研究与开发, 1996, 8 (3) :5.
[3]郭孝武.超声技术在中草药成分提取中的应用[J].中草药, 1993, 24 (10) :548.
[4]翁文棣.闵产灵芝多糖含量测定研究[J].福建分析测试, 2003, 12 (2) :1749-1751.
灵芝多糖的工艺纯化研究 篇2
灵芝多糖是多孔菌科灵芝属真菌菌丝体的次生代谢产物, 存在于灵芝属真菌的菌丝体和子实体中。它是具有生理活性的单糖聚合体, 由L-岩藻糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖和α-B葡聚糖等组成[1]。研究表明, 灵芝多糖具有提高机体免疫力、抑制机体内氧自由基 (防衰老) 、提高肝脏解毒功能同时还具有抗肿瘤作用[2]。灵芝多糖特有的生理活性和药理作用, 促使人们对其结构、功能、提取、应用等进行了研究。
2 灵芝多糖的提取纯化
灵芝子实体所产生的担孢子破壁后经提取、除脂、脱色、除蛋白、醇沉、柱分离等工艺操作后得到纯品灵芝多糖。纯化后的灵芝多糖可以提高疗效。2.1提取。称取一定重量灵芝孢子粉, 通过改变加水量和提取温度, 然后将所得灵芝多糖粗品减压浓缩、澄清后用蒽酮-硫酸法检定含量。最终确定按重量比首次加入15倍水, 二次加入10倍水, 提取时间一次提取2小时二次提取1小时, 温度90±5℃连续水煮两次收率最高。2.2除脂。1:1的乙醇乙醚混合溶液即能达到很好的除脂效果。 (植物多糖可以省略此部) 。2.3脱色。粗提灵芝多糖因为灵芝担孢子色素的影响, 多糖溶液颜色往往较深, 用浓NH3·H2O或Na OH调节p H8.0, 50℃加入药液体积的0.5%-5%的H2O2保温2小时。由于H2O2受热不稳定可以利用此性质将其除去。2.4除蛋白。灵芝多糖的粗提物中往往含有与蛋白结合的蛋白多糖以及游离的蛋白质和多肽, 不仅影响药品的纯度, 而且会增加药品的副作用, 因此除去多糖提取液中蛋白质杂质是一个很重要的步骤, 常用的方法有Sevag法 (氯仿:戊醇为5:1) 三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、后者效率较高, 操作简便, 植物来源的多糖常采用该法。具体操做法是:向一定体积的多糖溶液中加入浓度为3%~5%的三氯乙酸溶液, 产生白色沉淀, 静置片刻后过滤澄清, 继续加入三氯乙酸溶液, 静置、过滤, 直至不再产生沉淀为止。计算出体积比, 确定最终需要加入三氯乙酸的量。2.5醇沉。多糖在除蛋白过程中引入的三氯乙酸杂质可在下面醇沉法提纯时分离除去。灵芝多糖经过提取、除脂、脱色、除蛋白等操作后, 现组成成分基本是多糖、单糖、氨基酸、核苷酸、生物碱, 利用多糖不溶于醇的性质, 经过梯度试验最终确定使多糖溶液中醇的浓度达到70%时能将多糖完全沉淀而分离出来。再将沉淀加水复溶, 检出灵芝多糖溶的液含量, 再在当前状态下测出该溶液单位体积的固含量, 前者与后者的比值即为纯度。此时的多糖溶液纯度可以达到85%以上。2.6凝胶色谱柱分离。初步纯化后的多糖分子量大小还很不均一, 为了得到某单一组成的多糖, 可以利用分子筛原理, 采用柱层析办法进行分离。一般上样量为柱中填料体积的5%~8%能很好的分离。洗脱液和洗脱速度根据情况自定。根据所要达到的质量要求选择不同类型的凝胶及型号。可供选择的有葡聚糖凝胶SephadexG-25, SephadexG-100, 或琼脂糖凝胶CMSepharoseCL-6B, 按保留时间长短差异, 收集不同分子量大小的多糖, 便可以得到满意的产品。经过上述步骤纯化后的纯度可以达到90%~95%左右。图1为灵芝多糖溶液经水浴蒸干后压片所得红外鉴别见图谱。
3 结论
通过对灵芝多糖工艺的纯化研究, 基本解决了多糖的纯度难题。从而改提高了灵芝多糖的药理活性。
参考文献
[1]于淑娟, 高大维, 李国基.超声波酶法提取灵芝多糖的机理研究[J].华南理工大学学报 (自然科学版) , 1998, 26 (2) :123-127.
灵芝多糖 篇3
主要表现为代谢紊乱症状群, 即血糖升高后, 因渗透性利尿引起多尿, 继而口渴多饮;外周组织对葡萄糖利用障碍, 脂肪分解增强, 蛋白质代谢负平衡, 肌肉渐见消瘦, 疲乏无力、体重减轻, 儿童生长发育受阻;为了补偿损失的糖, 维持机体活动, 患者常易饥、多食。因此, DM的临床表现主要为“三多一少”, 即多饮、多食、多尿、体重下降。久之会引起各种并发症或伴发症 (如糖尿病酮症酸中毒、感染、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等) 。糖尿病的主要特征主要表现为以下几点:
1) 多饮与多尿。无论哪种类型的糖尿病, 胰岛素分泌均相对或绝对不足, 致使细胞膜上的葡萄糖转运蛋白不能正常发挥其转运葡萄糖的作用, 血糖不能有效地被利用而形成高血糖。若血糖升高超过肾糖阈, 肾脏形成的原尿中糖含量增高, 渗透压增加, 造成渗透性利尿, 肾小管回收水分减少而多尿, 机体失水。总体水量减缩1%～2%时, 即引起口渴感。体内失水增多, 导致细胞内脱水时, 即可引起烦渴多饮。在饮水量充足的情况下, 患者尿量与饮水量成正比。
2) 多食。脑调节能量代谢的部位多集中在下丘脑, 动物的摄食行为由摄食中枢控制。摄食中枢包括下丘脑外侧区的饥饿中枢和内侧区的饱食中枢。其中饥饿中枢的有效刺激是血糖的利用率。糖尿病时, 胰岛素的相对或绝对不足, 可使血糖的利用率降低, 从而刺激饥饿中枢, 抑制饱食中枢, 使大脑皮层产生饥饿感, 导致糖尿病患者多食。
3) 消瘦与体重减轻。糖尿病时, 患者的食欲虽然亢进, 表现为多食, 但由于胰岛素的绝对或相对不足, 严重影响糖, 脂肪和蛋白质代谢: (1) 葡萄糖利用率减少, 糖原合成降低; (2) 脂肪合成减少, 脂肪大量动员分解; (3) 肌肉及肝脏的蛋白合成不足而分解增多, 呈负氮平衡, 尿糖增多, 渗透性利尿, 使大量水分从尿中排出, 失水等诸多因素导致消瘦, 从而引起患者体重减轻。
目前糖尿病是常见病及多发病, 其患病率正随着人民生活水平的提高、人口老龄化、生活方式的改变而迅速增加, 呈逐年增长的趋势。据WHO估计, 全球目前有超过1.5亿的糖尿病患者, 到2025年, 这一数字将增加一倍;我国患病率呈逐年上升趋势, 估计我国现有糖尿病患者超过4000万, 居世界第二位[1]。糖尿病的研究与预防已成为目前科学家所面临的重要课题。因此, 如何更为有效地防治糖尿病及其并发症, 成为当今医患者讨论的热点。
1 运动防治糖尿病的作用及其生理机制
中国是世界上最早提出运动疗法治疗糖尿病的国家。我国传统医学早在隋朝 (公元610年) 太医博士巢元方的《诸病源侯论》一书中就有消渴病人应“先行一百二十步, 多者千步, 然后食之”的论述。唐代的《外台秘要》也记载了消渴病的体育运动疗法。此后, 历代医家皆有论述。到18世纪中叶, 外国医学家也开始主张糖尿病病人应当作适当的体力活动, 并将其列为治疗糖尿病的一大法宝。专家指出:长期进行有规律的体育运动, 保持体重在正常范围或者使肥胖的体重减轻, 是远离“甜蜜杀手”的重要措施。美国侨报报道:医学研究证明, 糖尿病的发生一个主要的原因就是缺乏运动。研究显示[4], 在最低体力活动和最高体力活动的个体间, 2型糖尿病患病率存在着2～4倍的差异。哥本哈根大学的研究者还发现, 体力活动可以提高胰岛素敏感性并改善糖代谢。科学合理的运动, 不但可以降低血糖、血脂和血液黏稠度, 有利于糖尿病的控制, 而且还能有效预防或延缓糖尿病的各种并发症, 降低糖尿病的致残率和致死率, 大大提高患者的生活质量。美国糖尿病协会 (ADA) 在1997年就提出, 在非糖尿病人群中, 运动可降低高血糖、IR、高血压, 改善脂代谢紊乱。Laaksonen[4]等2005年在芬兰进行了一项多中心的随机对照实验, 选取了487名糖耐量 (IGT) 患者, 通过对这些高危人群运动治疗的干预, T2DM的发病率与对照组相比较减低越63%～65%。李涛等人[9]对淮南市各医院45例符合1997年WHO修订的2型糖尿病诊断标准的住院患者采用内养功、医疗体操、步行、按摩等运动干预后发现:通过运动处方的实施, 使患者体脂代谢发生了明显的改善, 降低了体脂含量, 有效地促进了血糖浓度的下降, 使患者心血管功能发生了持续的恢复和改善, 血液生化指标得到了明显的改善, 有效控制了糖尿病的发展, 并促进了糖尿病人器官功能的恢复。
目前, 在运动对DM影响机制方面已有大量研究, 如脂肪因子、抗氧化酶活性、Ins受体和骨骼肌葡萄糖转运蛋白等方面。下面就运动疗法防治DM的生理机制略做阐述。
1.1 增强胰岛素分泌能力
糖尿病的主要机制就是胰岛素绝对或相对分泌不足, 那么增强胰岛素的分泌能力, 自然就能有效干预糖尿病的发生与发展。大量的研究表明, 运动能增强胰岛素的分泌能力。冯光斌、吴毅等人[10]研究结果表明, 糖尿病大鼠进行6～7周游泳训练, 不仅有骨骼肌敏感性的短暂提高, 更重要的是胰岛素的分泌能力得到了明显改善。吴昊[11]等人也研究表明, 耐力训练干预后自由C肽和血清胰高血糖素同时升高, 胰岛素、胰高血糖素释放量增加, 但血清胰岛素浓度并未明显增高, 说明胰岛素在外周的降解或利用快, 这可能是糖尿病对耐力训练干预适应的机制之一。
1.2 增强组织对Ins的敏感性
IR贯穿于的整个发病过程, 临床随机发现, T2DM进行高强度的有氧运动每周3次, 持续2个月, 其Ins敏感性提高46%[12]。Gianluca Perseghin, M.D等人研究表明, 运动增加正常人和胰岛素抵抗的糖尿病病人的胰岛素敏感性, 使肌肉内胰岛素刺激的葡萄糖合成增加2倍[13]。近年来, 对运动增加Ins敏感性的机制研究进一步证明, T2DM的IR主要是骨骼肌肌细胞膜上的GLUT4以及决定其转运率的转运蛋白信息核糖核酸 (GLUT4 mRNA) 的减少, 而运动能使肌细胞内GLUT4 mRNA增多, 从而GLUT4蛋白含量增加[14]。
Ins 发挥作用必须与细胞膜上的受体结合, 二者结合后促使细胞内发生一系列代谢变化, 从而发挥Ins 的降血糖作用, 增强骨骼肌等细胞对葡萄糖的摄取。研究证实, IR引起的T2DM患者体内, Ins受体数目和功能有所下降。丛琳[15]等人发现, DM大鼠肝细胞膜和骨骼肌细胞膜的Ins受体结合率显著低于正常对照组。
运动能增强细胞膜Ins受体结合力。丛琳[15]在研究中发现, DM大鼠运动组运动后的肝细胞和骨骼肌细胞膜的Ins受体结合率显著高于运动前;王从容[16]的研究显示, 耐力训练可通过增加肝细胞、脂肪细胞和白肌细胞膜Ins受体结合力, 减轻IR。运动与Ins受体的影响与运动方式是相关的。急性运动可提高Ins结合力, 而对数目影响不大。Webster[17]发现, 急性运动增加Ins结合力, 是通过儿茶酚胺水平的提高, 而不是增加Ins受体数目。细胞膜上Ins受体数量是决定其受Ins调节程度的基本条件, 有规律的耐力运动可增加Ins受体数目。Soman[18]研究发现, 耐力运动后单核细胞Ins结合力增加, 主要是增加了Ins受体数目。Dohm[19]研究也证明, 耐力训练确实能改变骨骼肌细胞膜Ins受体数量, 并且还提出这些变化对运动后改善是非常重要的。
另有报道, 运动可通过增强Ins受体的磷酸化作用, 改善Ins信号传导系统, 增加骨骼肌对葡萄糖的利用。Kim[20]的研究首次证明, 耐力训练能够提高Ins受体和受体后的基因表达, 并且这种变化与运动后Ins的敏感性的改善密切相关。由此可推测, 运动对Ins受体的影响是运动治疗T2DM的机制之一。
1.3 调节糖代谢, 降低血糖
运动可以促进骨骼肌对葡萄糖的直接摄取, 使血糖降低, 运动持续时消耗肌糖原与肝糖原, 使高血糖状态缓解, 运动后血糖又转变成糖原储存起来, 使血糖持续下降。许多报道[21,22]都表明对T2DM患者进行中强度的运动干预之后, 血糖值及糖化血红蛋 (GHbA1) 值均有明显的下降, 且结果有统计学意义。Boule等[23]通过14项临床试验分析发现, 在体重不减轻的情况下, 50%～60%最大摄氧量的踏车练习使 T2DM患者的GHbA1水平下降0.66%。Kelley等[24]发现葡萄糖输注速率在运动后显著高于运动前休息状态, 提示运动能增加Ins诱导的葡萄糖利用率。
1.4 加速脂肪分解, 降低血脂, 调节脂代谢
运动可以使能量消耗增加, 体内多余脂肪减少;使高脂血症得到改善, 甘油三脂、胆固醇和低密度脂蛋白等有害成分降低, 同时又能使具有保护功能的高密度脂蛋白升高。Sauin 等发[25]现II 型糖尿病病人经3个月锻炼后, 肌肉活检可见己糖激酶、琥珀酸脱氢酶活性增强, 脂肪利用改善, 血中低密度脂蛋白、甘油三酯下降, 高密度脂蛋白增高。Weinsier等[26]的研究显示经过至少1年的中、高强度运动后, 患者体脂量有明显下降没有反弹。杨晓峰等对80例T2DM患者实施了3个月的运动干预后实验组的三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白水平和体脂量指数均有明显降低[27]。
研究显示有规律的运动能使糖尿病患者LPL和卵磷脂胆固醇酞基转移 (LCAT) 的活性增加。LPL分解血浆中CM、VLDL和LDL, 使得血浆中TG浓度下降, HDL浓度升高。LCAT可以促进胆固醇酷, 使其被肝脏消除, 并且还可以促进HDL的成熟。对于糖尿病机体, 运动不仅可以提高其骨骼肌中LPL表达和活性, 也可以用过提高胰岛素含量来刺激脂肪组织LPL表达, 及增加其活性, 二者的共同结果使得血浆中LPL的含量和活性增加。关于运动对HL活性的影响报道尚不一致[4]。
1.5 延缓并发症的发生及发展
运动能增加血管壁的弹性, 改善心肺功能, 对DM心肺并发症的发生起一定的预防作用。Maiorana[27]等对T2DM患者进行8周的50%～60%最大摄氧量耐力运动, 结果发现患者每搏量增加, 血压下降。Church[29]等的研究表明, 较高强度的有氧运动能显著降低糖尿病患者的心血管病及总体死亡率;李涛等人[9] 研究也表明:通过运动处方的实施, 使患者体脂代谢发生了明显的改善, 降低了体脂含量, 使患者心血管功能发生了持续的恢复和改善。
2 灵芝多糖概述
灵芝是一种非常名贵的药用菌, 自古以来就被认为是吉祥、富贵、美好、长寿的象征, 中华传统医学长期以来一直视其为滋补强壮、固本扶正的珍贵中草药。在我国数千年的历史长河中, 关于灵芝的种种神奇传说绵延不绝。灵芝俗称“仙草”, 上古时期称为“瑶草”, 秦始皇时代称为“还阳草”, 东汉张衡的《西京赋》称为“灵草”, 它们指的均是灵芝。“灵芝”这一家喻户晓的称谓, 在药学著作中始见于《神农本草经》, 尔后历代本草均有记载。灵芝为多孔菌科植物灵芝Ganoderma Lucidum (Leyss.ex.Fr.) Karst或紫芝G.sinense Zhao.Xu et Zhang[G.japnicm (Fr.) Lloyd]的干燥子实体[30]。灵芝品种多样, 分布广泛。我国大部分省份均有分布, 一般适宜300～600m海拔高度山地生长, 特别是热带、亚热带杂木林下均可找到它的踪迹。
2.1 灵芝多糖的药理作用
灵芝是中医药学宝库中的珍品, 我国古代文献中, 有许多论及灵芝的著作。公元前11世纪周代《列子》一书中就有“朽壤之上有菌芝者”的记载, 其中认为:煮白沸气味清芳, 饮之目明、脑清、心静、肾坚, 其宝物也。东汉时期的《神农本草经》 (约见于公元前一世纪左右) 是我国最早的药学著作, 它将灵芝列为上品, 认为有“益心气”、“安惊魂”、“补肝益气”、“坚筋骨”、“好颇色”等功效, 久服可“不老延年”。 《神农本草经》根据中医阴阳五行学说, 按五色将灵芝分为青芝 (龙芝) 、赤芝 (丹芝) 、黄芝 (金芝) 、白芝 (玉芝) 、黑芝 (玄芝) 五类, 即称五芝。此外附紫芝 (木芝) 。还强调此六种灵芝均可“久食轻身不老, 延年神仙”。《神农本草经》中对灵芝的这些论述, 被其后的历代医药家尊为经典并引证, 沿用至今。东晋葛洪的《抱扑子·仙药》中, 把灵芝分为“五芝”, 并具体记载了“五芝”的生态习性、采集及其药用价值。其文曰“五芝者, 有石芝, 有木芝, 草芝, 有肉芝, 有菌芝, 各有百许种也”。 明朝李时珍在《本草纲目》中, 继承了前人的研究成果, 对灵芝的研究也更加深入。他在书中记载并列举了“青芝、赤芝、白芝、黄芝、黑芝、紫芝’, 六种灵芝的药用性能, 他的研究和总结为后人对灵芝的研究奠定了坚实的基础。
现代医学研究表明, 灵芝的作用, 是在激化人体的免疫功能。具有杀死肿瘤细胞功效的是灵芝多糖体, 使人体内细胞激素, 足以让肿瘤细胞生长受到抑制, 并达到阻断作用。
灵芝的多糖体, 对于调动人体的免疫功能, 具有激化作用, 所以直接可以让人体内的肿瘤细胞受到压抑, 而细胞的激素, 也会产生间接作用, 阻断肿瘤细胞的生长, 再让肿瘤细胞凋谢死亡, 达到抗癌的目的。多糖体是由单糖体 (葡萄糖等) 等多数结合而成, 所以灵芝中之多糖体是由数万到数百万分子的葡萄糖组合而成, 而在灵芝中可萃取约二百余种多糖体分子, 经研究其中约有十余种具有高分子量的多糖体。
2.2 灵芝多糖的主要功能
灵芝多糖中的有效成分多糖体, 有着许多重要的生理功能, 主要表现在:
(1) 促进人类免疫功能亦激发巨噬细胞及T淋巴细胞 (免疫细胞) 产生大量和抗肿瘤有关的细胞激素, 有助于消灭突变细胞, 降低转形成恶性肿瘤的机率[27]。
(2) 具放射线保护作用, 可改善药物成放射腺治疗引发的副作用, 对肿瘤防治具有重要意义[31]。
(3) 调整高、低血压作用。
(4) 改善高脂血症、降血糖作用[32]。
(5) 抗过敏反应作用。
3 灵芝多糖与糖尿病
糖尿病治疗上除注射胰岛素外, 主要口服磺脉类和双肌类降血糖药物, 但存在许多副作用, 人们正在积极探索既能治疗糖尿病, 又无毒副作用的保健品。灵芝作为药用真菌, 是人们最早认识的保健品, 它的有效成分非常丰富, 主要有:灵芝多糖、三花类化合物、灵芝酸、腺普, 其中灵芝多糖是最有效的活性成分之一, 灵芝的药理活性大多和灵芝多糖有关, 因此, 灵芝多糖特别受到医药科技工作者的重视, 研究报道也最多。
现知灵芝多糖有广泛的药理活性, 能提高机体免疫力, 提高机体耐缺氧能力, 消除自由基, 抑制肿瘤, 抗辐射, 提高机体合成DNA、RNA和蛋白质能力等。但对它的降血糖作用很少报道。陈伟强等[33]研究表明:灵芝多糖灌胃糖尿病大鼠, 其胰岛素水平显著升高, 中后期血糖显著下降, 血清TG、TC也显著降低。张慧娜等[34]研究结果显示预先给予灵芝多糖可降低MLD-STZ诱发的自身免疫性糖尿病小鼠的血糖水平和糖尿病的形成率, 并认为灵芝多糖对MLD-STZ诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用与其促进胰岛β细胞GLUT2蛋白表达, 改善胰岛β细胞胰岛素的分泌功能有关。
灵芝多糖 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
热带赤灵芝样品, 95%乙醇、苯酚、浓硫酸、葡萄糖均为分析纯。
1.2 实验步骤与方法
1.2.1 苯酚溶液的配制
精确称量分析纯苯酚晶体5g于250m L, 加入蒸馏水60m L, 放入50℃水浴中使其溶解, 再于100m L容量瓶中定容, 即得5%苯酚溶液。由于苯酚可以被空气氧化, 所以苯酚溶液现配现用。
1.2.2 样品多糖提取方法
取5g赤灵芝样品, 粉碎过80目筛。取所得灵芝粉末0.5g于500m L烧杯中, 加入15m L95%乙醇, 于60℃恒温水浴槽中加热30分钟, 过滤。重复以上操作两次, 以除去单糖、双糖以及低聚糖等干扰性成分[5]。经过滤后的样品于100℃沸水中提取一段时间, 过滤后取滤液加蒸馏水定容至500m L。
1.2.3 分光光度法测定多糖含量
(1) 标准曲线的绘制。精确称量充分干燥过的分析纯葡萄糖50mg, 加水定容至500m L容量瓶中, 得到0.1mg/m L葡萄糖标准溶液。取50m L洗净的容量瓶6只, 分别用移液管准确加入葡萄糖标准溶液5m L、10m L、15m L、20m L、25m L、30m L, 加入蒸馏水定容, 即得到浓度分别为0.01mg/m L、0.02mg/m L、0.03mg/m L、0.04mg/m L、0.05mg/m L、0.06mg/m L的葡萄糖标准溶液。测定时取1m L各浓度葡萄糖标准溶液加入到20m L具塞比色管中, 迅速加入5%苯酚溶液以及98%浓硫酸适量, 摇匀后放置于室温下显色20min。另取1m L蒸馏水, 同上加入苯酚溶液和浓硫酸, 做空白参比溶液。在指定波长处测定吸光度值, 绘制标准曲线, 计算标准曲线方程和相关系数R。
(2) 样品多糖含量测定。取1m L灵芝样品溶液加入到20m L具塞比色管中, 采用与标准液显色相同方法依次加入苯酚溶液和浓硫酸, 于特定波长处测定吸光度, 将吸光度带入标准曲线方程, 计算得出样品液浓度C。按下式计算出所取样品的多糖含量, 多糖含量 (%) =CV/m, C为样品液浓度, V为样品液体积, m为取样的质量[1]。
1.2.4 荧光法测定多糖含量
(1) 标准曲线的绘制。采用与分光光度法相同的方法配制浓度为0.01mg/m L、0.02mg/m L、0.03mg/m L、0.04mg/m L、0.05mg/m L、0.06mg/m L的葡萄糖标准溶液。测定时依次取各浓度葡萄糖标准溶液1m L加入到20m L具塞比色管中, 再加入5%苯酚溶液0.2m L, 迅速滴加98%浓硫酸12m L, 加蒸馏水至刻度于并摇匀放置于室温下显色20分钟后测定其荧光强度。测定条件激发波长492nm, 发射波长521nm, 激发狭缝和发射狭缝均为5nm, 绘制标准曲线[2]。
(2) 样品多糖含量的测定。用吸量管准确吸取1m L灵芝样品液于20m L具塞比色管中, 依次加入苯酚0.2m L和浓硫酸12m L, 再加蒸馏水稀释至刻度线。在激发波长492nm、发射波长521nm处, 激发狭缝和发射狭缝均为5nm。测定吸光度值, 带入标准曲线方程, 即得到样品提取溶液浓度, 计算样品多糖含量。
2 实验结果与讨论
2.1 分光光度法测定条件的确定
2.1.1 最大吸收波长的确定
取1m L0.05mg/m L葡萄糖标准溶液, 加入苯酚溶液和浓硫酸后反应一段时间后, 在450~520nm波长区间进行光谱扫描, 确定其最大吸收波长, 发现在488nm波长处, 所得吸光度值最大, 无其他杂峰, 则最佳测定波长选用488nm。
2.1.2 苯酚溶液用量的确定
取相同浓度的葡萄糖标准液1m L于6支20m L具塞比色管中, 分别加入0.4m L、0.6m L、0.8m L、1.0m L、1.2m L、1.4m L的5%苯酚溶液, 再依次加入5m L 98%浓硫酸, 混合摇匀。放置于20℃温度下显色30分钟, 在488nm波长处测定吸光度值。当加入苯酚溶液1.0m L时, 吸光度值最大, 加入苯酚溶液过多反而会引起吸光度降低, 所以实验中5%苯酚溶液的最佳加入量应当为1m L。
2.1.3 浓硫酸用量的确定
取相同浓度的葡萄糖标准溶液1m L加入到五支编号的具塞比色管中, 各加入5%苯酚溶液1m L, 依次滴加浓硫酸4.0m L、4.5m L、5.0m L、5.5m L、6.0m L。于488nm波长处测定其吸光度, 发现硫酸加入量为5m L时所测得的吸光度值达到最大, 加入硫酸过少则反应不够完全, 加入硫酸过多可能导致其他副反应, 导致测定结果降低, 所以最佳硫酸加入量为5m L。
2.1.4 显色温度的确定
分别取一定浓度葡萄糖标准液1m L加入到五支编号的具塞比色管中, 各向其中加入5%苯酚溶液1m L, 迅速滴加98%浓硫酸5m L, 分别放置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃温度下显色30分钟, 在489nm波长处测定其吸光度。在各温度下, 测得的吸光度基本不变, 所以温度对反应吸光度基本无影响, 在室温下就能够完全反应[3]。
2.1.5 显色时间的确定
分别取一定浓度葡萄糖标准液1m L加入到五支编号的具塞比色管中, 各向其中加入5%苯酚溶液1m L, 迅速滴加98%浓硫酸5m L, 分别于室温下显色10min、20min、30min、40min、50min, 在488nm波长处测定其吸光度。发现, 反应10分钟吸光度值较小, 显色时间从20到50分钟, 样品溶液的吸光度基本不变, 所以反应时间控制在20分钟以上就基本能够反应完全。所以反应时间控制在20分钟以上就能达到最佳效果。
综合以上测定结果, 得出苯酚硫酸法最佳测定条件参数:1m L样品液, 5%苯酚溶液加入量为1.0m L, 98%浓硫酸加入量为5m L, 显色温度室温即可, 显色时间为20分钟以上, 最大吸收波长为488nm。
2.1.6 标准曲线的绘制
精确称量充分干燥过的分析纯葡萄糖50mg, 加水定容至500m L容量瓶中, 得到0.1mg/m L葡萄糖标准溶液。取50m L洗净的容量瓶6只, 分别用移液管准确加入葡萄糖标准溶液5m L、10m L、15m L、20m L、25m L、30m L, 加入蒸馏水定容, 即得到浓度分别为0.01mg/m L、0.02mg/m L、0.03mg/m L、0.04mg/m L、0.05mg/m L、0.06mg/m L的葡萄糖标准溶液。测定时取1m L各浓度葡萄糖标准溶液加入到20m L具塞比色管中, 迅速加入5%苯酚溶液以及98%浓硫酸适量, 摇匀后放置于室温下显色20min。另取1m L蒸馏水, 同上加入苯酚溶液和浓硫酸, 做空白参比溶液。在指定波长处测定吸光度值, 绘制标准曲线, 计算标准曲线方程和相关系数R。准确称量葡萄糖0.0520g。标准曲线方程为y=9.080 3x-0.038 5, 相关系数R值为0.998 4, 线性较好, 线性范围10.5~63.0μg/m L。
2.1.7 多糖提取条件的确定
取5g赤灵芝样品, 粉碎过80目筛。取所得灵芝粉末0.5g于500m L烧杯中, 加入15m L95%乙醇, 分别于沸水浴中加热0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h, 过滤, 取滤液定容至500m L。再取定容后溶液1m L, 用分光光度法测定吸光度, 计算多糖含量。精确称量灵芝0.502 2g,
发现, 沸水浴中提取1h, 样品溶液吸光度值达到最大, 说明沸水中加热1h已经基本将样品中的多糖全部提取出来了。加热时间过短, 可能导致提取不完全, 提取时间过长吸光度值偏低, 加热时间过长可能引起多糖结构变化, 导致多糖不能全部与显色剂发生显色反应, 使得实际测得多糖含量偏低。
2.1.8 重复性试验
采用苯酚硫酸法平行取样品溶液测定五次, 得到数据如表1所示。
RSD=1.18%, 说明精密度较高, 能满足定量分析的要求, 平均吸光度值为0.244。带入标准曲线方程, 计算得样品液浓度为0.031mg/m L。500m L灵芝样品液所含多糖总量为15.5mg, 称量灵芝精确量为0.502 2g, 多糖百分含量为3.08%。
2.1.9 加标回收率
准确移取灵芝样品溶液0.5m L于20m L具塞比色管中, 分别准确移取0.005mg/m L、0.010mg/m L、0.015mg/m L的标准溶液0.5m L加入样液中, 测定多糖含量计算平均回收率。样液浓度0.031mg/m L, 样品称量0.502 2g, 0.5m L样液多糖含量经运算为15.5μg, 测定结果如表2所示。
由表2知平均回收率为97.64%, 回收率较高, 说明此法结果准确率较高。
2.2 荧光分光光度法
2.2.1 激发波长的确定
设定发射波长489nm, 设定激发波长范围300~600nm, 进行光谱扫描。发现激发光谱曲线在521nm波长处出现峰值, 则采用荧光法测定灵芝多糖应采用激发波长521nm。
2.2.2 发射波长的确定
采用激发波长520nm, 设定发射波长范围450~550nm进行光谱扫描, 发现激发光谱曲线在492nm波长处出现峰值, 则采用荧光法测定灵芝多糖应采用发射波长492nm。
2.2.3 标注曲线的绘制
采用与分光光度法相同的方法配制浓度为0.01mg/m L、0.02mg/m L、0.03mg/m L、0.04mg/m L、0.05mg/m L、0.06mg/m L的葡萄糖标准溶液, 测定时依次取各浓度葡萄糖标准溶液1m L加入到20m L具塞比色管中。再加入5%苯酚溶液0.2m L, 迅速滴加98%浓硫酸12m L, 加蒸馏水至刻度于并摇匀放置于室温下显色20分钟后测定其荧光强度。测定条件激发波长492nm, 发射波长521nm, 激发狭缝和发射狭缝均为5nm, 绘制标准曲线[4]。准确称量葡萄糖0.0543g, 定容至500m L, 浓度为0.1086mg/m L。工作曲线回归方程为y=1 504.5x+3.273 3, 相关系数R=0.998 1。线性较好, 线性范围10.9~65.2μg/m L。
2.2.4 多糖含量的测定
取样品标准溶液1m L加入到20m L具塞比色管中, 依次加入5%苯酚溶液0.2m L, 迅速滴加98%浓硫酸12m L, 加入蒸馏水定容至刻度线, 于室温下放置20分钟测定其荧光强度。测定条件激发波长492nm, 发射波长521nm, 激发狭缝和发射狭缝均为5nm。平行测定六次, 结果如表3所示。
将表3中所得平均值带入标准曲线得浓度, 计算得0.028mg/m L, 500m L样品液所含多糖总量为14mg。精确称量灵芝样品0.5022g, 得多糖百分含量为2.79%。
3 结论
通过本论文研究, 得出采用分光光度法测定灵芝多糖, 最佳条件为5%苯酚水溶液1m L, 98%浓硫酸5m L, 于室温下放置反应20min, 最大吸收波长488nm, 线性范围10.5~63.0μg/m L。测定热带赤灵芝中多糖含量为3.08%, 荧光法测定灵芝多糖线性范围10.9~65.2μg/m L, 测定热带赤灵芝中多糖含量为2.79%, 比分光光度法所测得结果低0.29%。
摘要：该研究以热带赤灵芝为样品, 苯酚-硫酸显色, 采用分光光度法和荧光法两种方法测定样品多糖含量。系统地研究了分光光度法测定灵芝多糖含量时的多糖提取条件以及测定条件, 最终结果显示, 最佳条件为5%苯酚溶液加入量1.0mL, 98%浓硫酸加入量为5mL, 室温下放置时间为20分钟, 最大吸收波长为488nm, 以此法测定热带赤灵芝中多糖含量为3.08%, 略高于荧光法所得含量2.79%。
关键词：灵芝,多糖,分光光度,荧光
参考文献
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[3]生东明, 马莺.灵芝多糖研究综述[J].粮食与油脂, 2004, (7) :44-46.
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灵芝多糖 篇5
灵芝 (Ganoderma Lucidum) , 又名赤芝、红芝、丹芝、瑞草等, 是多孔菌科植物的子实体。灵芝在我国有上千年的药用历史, 富含灵芝多糖、三萜类化合物等多种活性成分, 具有多种生理功能, 极富药理价值。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分之一, 存在于灵芝属真菌的菌丝体和子实体中, 具有降血脂、降血糖、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗肿瘤、提高免疫力等作用。灵芝多糖结构复杂, 合成困难, 因此常常从灵芝中提取。本文主要论述从灵芝中分离提纯灵芝多糖, 并对其含量和结构进行分析的方法。
1 灵芝多糖的提取
1.1水提醇沉法
水提法即“煎煮法”, 是将药材加水煎煮取汁的方法, 也是一种最常用的简易浸出方法。但是, 用水煎煮得到的浸出成分比较复杂, 除有效成分外, 部分脂溶性物质及其他杂质也有较多浸出, 不利于精制。在实际提取灵芝多糖的操作中, 利用其易溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂的特性, 将灵芝多糖提取液浓缩, 加入乙醇反复数次沉降, 以达到初步纯化。
杨晓梅等[1]采用水提醇沉法提取西藏野生灵芝中的灵芝多糖, 通过正交试验确定其最佳工艺提取条件为:料液比1:50 (g/m L) , 提取温度90 ℃, 提取2次, 每次提取2 h, 90%乙醇醇析, 通过苯酚-硫酸法测定西藏野生灵芝子实体粗多糖的含量约为0.734%, 这一含量在全国灵芝品种中处于中等水平。
1.2回流提取法
回流提取法是用乙醇等易挥发的有机溶剂提取原料成分, 将浸出液加热蒸馏, 其中挥发性溶剂馏出后又被冷却, 重复流回浸出容器中浸提原料, 周而复始, 直至有效成分回流提取完全的方法。
王敏慧等[2]通过回流提取法提取硬孔灵芝多糖, 通过正交试验确立其最佳工艺条件, 即以水为溶剂, 控制恒温水浴回流温度70 ℃, 提取3次, 料液比1:40 (g/m L) , 提取时间l h, 验证性试验表明该工艺条件稳定合理, 适合灵芝多糖的提取。
1.3酸碱提取法
根据多糖的结构不同, 可利用乙酸、盐酸等酸性物质提取含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖。但是, 上述酸性物质往往会破坏糖苷键, 影响多糖的浸提率, 因此一般不常使用。提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖可利用稀碱溶液, 碱溶性多糖一般先用水浸提, 再用碱液对残渣进行提取, 之后经浓缩、醇析、除蛋白, 得到粗多糖, 然后经乙醇、丙酮、乙醚洗涤数次。
田光辉等[3]在实验中考察了酸碱盐介质对灵芝多糖提取的影响, 证实稀碱溶液浸提灵芝子实体有利于将其有效成分充分提取出来。
上述提取方法皆为传统的提取方法, 在长时间的实践中, 逐步暴露出耗时长、效率低、溶剂消耗大等缺点。近年来, 随着科学技术的发展, 一些新型的提取方法如超声波提取、微波提取、超临界流体萃取等得到迅猛发展。
1.4超声波提取法
超声波提取是利用超声波振动的方法进行提取的新工艺, 其原理:使溶剂快速地进入固体物质中, 使其所含的有机成分尽可能完全地溶于溶剂之中, 得到多成分混合提取液。超声波产生强烈的振动、较高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等, 能加速有效成分进入溶剂, 另外超声波的次级效应, 如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速有效成分的扩散释放。近年来, 人们采用超声波技术提取植物、真菌中的活性物质, 取得了很好的效果。
翟旭峰等[4]通过超声波提取灵芝多糖, 并采用响应曲面分析法对其进行优化, 得到优化的工艺参数为:超声功率320 W, 提取温度70 ℃, 提取时间34 min, 其多糖得率为2.78% , 氧自由基吸收能力 (ORAC值) 为1 956 μmol TE/g, 与理论预测值无显著性差异。
1.5微波提取
微波是一种超高速电磁波, 具有很强的穿透作用, 植物细胞吸收微波能, 细胞内部温度迅速上升, 细胞破裂, 有效成分从细胞中溶出。与常规提取方法相比, 微波提取法具有提取质量高、产量大、选择性好、省时、溶剂用量少等优点。近年来, 该方法在天然产物提取方面的应用日渐活跃。
胡灵等[5]利用微波法提取灵芝多糖, 并采用响应面分析法 (RSM) 优化工艺, 确定微波提取灵芝多糖的最佳工艺条件为:提取时间20 min, 功率400 W, 提取温度90 ℃, 料液比1:20 (g/m L) , 提取2次。在此条件下, 实际测得的灵芝多糖提取率为1.15%。
1.6酶法提取
酶法提取是利用酶的专一性分解构成细胞壁的纤维素、半纤维素及果胶质, 从而破坏细胞壁的结构, 产生局部的坍塌、溶解、疏松, 减少溶剂提取时来自细胞壁和细胞间质的阻力, 达到加快有效成分溶出细胞的速率、提高提取效率、缩短提取时间的目的。
吕兴平等[6]利用纤维素酶从灵芝子实体中提取灵芝多糖, 通过单因素实验研究酶量、酶解时间、料液比、酶解温度对灵芝多糖提取率的影响。结果表明:纤维素酶能够显著提高灵芝多糖的提取率, 最佳提取工艺条件为:酶量2.0%, 酶解时间90 min, 料液比1:30 (g/m L) , 温度50 ℃, 在该条件下灵芝多糖提取率可达6.30%, 与普通的水提法相比, 纤维素酶提取灵芝多糖的提取时间大幅减少, 提取率可提高5~6倍。
1.7超临界流体辅助提取
超临界流体萃取技术通过改变温度和压力使被提取物的溶解度发生变化, 达到分离提取的目的。该技术具有耗能低、无污染且效率高等优点, 适合于挥发性较强、热敏性物质和脂溶性成分的提取分离[7]。
袁雨婕等[8]研究了超临界CO2微乳对灵芝孢子多糖的萃取效果。结果表明超临界CO2微乳对灵芝孢子粉多糖成分具有明显的萃取效果, 多糖转移率较高。
在实际的多糖提取分离过程中, 通常会将上述提取方法联合运用, 以达到节约资源、提高效率的目的。
黄生权等[9]采用响应面法优化超声-微波协同萃取灵芝多糖工艺, 得到最佳的工艺条件为:原料用量100 g, 微波功率284 W, 提取时间12 min, 料液比1:11.6 (g/m L) 。与传统水浴浸提法相比, 超声-微波协同萃取法在较短的超声提取时间下, 灵芝多糖的提取率从1.517%提高到了3.27%。
郑静等[10]将超声波提取法和超声波辅助酶法的提取结果进行比较, 确定超声波酶法的最佳提取条件为:酶解温度50 ℃, p H值6.0, 酶量2.0%, 酶解时间20 min, 粗提取物中多糖含量达到57.62%, 约为单一超声波法的1.8倍。
熊先锋等[11]采用单因素实验和正交试验分别研究了不同酶解时, 时间、p H值、温度、加酶量对纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶反应的影响。结果表明, 超声波结合酶法处理可显著提高灵芝多糖的提取率。在不同种类酶各自的最优提取条件下灵芝多糖的含量分别为:纤维素酶5.790%, 果胶酶4.787%, 蜗牛酶4.529%, 明显比水提法的含量高, 且纤维素酶的提取效果最好。
2 灵芝多糖的分离纯化
2.1除蛋白质
2.1.1 Sevag法
Sevag法是目前应用最为普遍的除蛋白质的方法。Sevag法利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点, 将提取液与Sevag试剂 (氯仿:正丁醇=5:1 (V/V) ) 按一定比例混合, 加到样品中振摇, 使样品中的蛋白质变性成不溶状态, 用离心法除去。该方法的优点是条件温和, 不会引起多糖的变性。
杨德等[12]通过Sevag法去除灵芝多糖中的蛋白质成分, 蛋白去除率为82.41%, 多糖损失率为36.03%。与Sevag法原理相似的还有三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法。
2.1.2 冻融法
冻融法是指利用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度增高的原理, 使细胞破裂, 从而分离出蛋白质。这种方法比较简单方便。
梁忠岩等[13]采用冻融法并结合乙醇二次分级, 从松杉灵芝发酵菌丝体热水提取液中分离得到了脱蛋白多糖。
2.1.3 等电点沉淀法
在等电点时, 蛋白质分子以两性离子形式存在, 其分子净电荷为零 (即正负电荷相等) , 此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥, 分子相互之间的作用力减弱, 其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀, 所以可利用此性质将蛋白质沉淀分离。
2.2除色素
2.2.1 活性炭吸附法
活性炭是一种很细小的炭粒, 有很大的表面积, 而且炭粒中还有更细小的孔———毛细管。这种毛细管具有很强的吸附能力, 由于炭粒的表面积很大, 所以能与色素分子充分接触, 使色素分子被毛细管吸附以达到脱色的作用。
臧晋等[14]通过不同纯化方法的对比试验, 确定经超滤去除小分子可溶性杂质、加活性炭抽滤脱色、Sevag法除蛋白质、再经醇析和真空干燥可制得纯净的灵芝多糖。
2.2.2 树脂脱色法
色素一般以一种有机酸的形式存在, 所以从交换方式方面来分, 脱色树脂一般分为两类:离子交换树脂和大孔吸附树脂。离子交换树脂是通过离子交换达到脱色效果, 大孔吸附树脂是通过比表面积和网孔孔容孔径吸附达到脱色效果。
曹鹏伟等[15]使用树脂对灵芝多糖进行脱色, 发现该方法不但能很好地吸附色素而且能吸附部分蛋白质。
2.2.3 氧化剂氧化法
植物体内的大部分色素的化学本质都是有机物, 很容易被氧化。氧化剂氧化法就是利用氧化剂破坏色素分子中的化学键使其分解, 以达到脱色的目的。
李平作等[16]在研究灵芝胞外多糖的分离纯化及生物活性时, 利用20%的H2O2溶液除去灵芝粗多糖中的色素, 再利用Sevag法去除蛋白质, 得到的多糖纯度高, 有利于进一步对其生物活性的研究。
2.3除小分子杂质
2.3.1 超滤法
超滤是一种加压膜分离技术, 即在一定的压力下, 使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜, 而灵芝多糖不能透过, 留在膜的一边, 从而使灵芝多糖得到部分的纯化。
杨祖金等[17]运用截留分子量6 000 D的超滤膜在45~50 ℃、压力0.16 MPa下, 超滤45 min, 制得的灵芝多糖纯度达到73.15%。
2.3.2 加酸中和法
由于碳酸钠在乙醇水溶液中溶解度很低, 因此含有碳酸钠盐的灵芝多糖浓缩液醇沉时, 溶液中的碳酸钠很容易析出, 使产品的纯度偏低。乙酸钠在醇水溶液中溶解度比碳酸钠大, 加入乙酸的目的就是将碳酸钠转化为乙酸钠, 将盐从沉淀中转入到溶液中, 以保证产品的纯度。
李艳等[18]考察了脱盐方法对提取灵芝多糖纯度和得率的影响, 确定了将灵芝多糖水提液浓缩, 然后加入1.2倍的乙酸除盐, 再用95%乙醇将溶液乙醇浓度调至75%, 得到的沉淀真空干燥, 所得灵芝多糖得率较高。
3 灵芝多糖的分析
3.1灵芝多糖的含量测定
3.1.1 苯酚-硫酸法
糖在浓硫酸的作用下, 脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物, 在10~100 mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比, 并且在485 nm波长下有最大吸收峰, 因此可用比色法在此波长下测定。该方法简单方便, 灵敏度高, 实验时基本不受蛋白质存在的影响, 并且颜色稳定在160 min以上。
张志军等[19]通过一系列实验确定了苯酚硫酸法测定灵芝多糖的最佳测定条件为:无水酒精50 m L、硫酸10 m L、离心速率3 000 r/min、离心时间15 min。
3.1.2 蒽酮-硫酸法
糖在浓硫酸的作用下, 可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛, 生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物, 在一定范围内, 颜色的深浅与糖的含量成正比。
郭晓蕾等[20]通过实验比较硫酸蒽酮法和硫酸苯酚法测得的灵芝多糖含量的差异, 发现硫酸蒽酮法测得的吸光度要高于硫酸苯酚法, 且线性范围较宽, 具有更好的重现性, 测得的误差小于硫酸苯酚法。
上述两种方法操作简单、快速、灵敏、重复性好, 对每一种糖仅制作一条标准曲线, 颜色持久, 但上述方法所测定的是提取液中总糖的含量, 如果提取液中还含有单糖, 往往得到的结果会偏高。
3.1.3 3, 5-二硝基水杨酸显色法 (DNS)
在氢氧化钠和丙三醇的存在下, 还原糖能将3, 5-二硝基水杨酸中的硝基还原成氨基, 生成氨基化合物, 此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色, 在一定波长下具有最大吸收, 吸光度与还原糖含量有线性关系。因此可利用吸光度的这个特性测定多糖的含量[21]。
3.1.4 碘量法
碘量法是一种应用比较广泛的滴定方法, 分为直接碘量法和间接碘量法。直接碘量法是基于碘离子的氧化性, 待测物与碘离子发生氧化还原反应, 生成碘单质, 以淀粉-KI溶液为指示剂。间接碘量法是基于碘离子的还原性, 待测物与其生成碘单质, 然后碘单质与硫代硫酸钠发生氧化还原反应, 且通常以二苯胺磺酸钠为指示剂。碘量法既能测定总糖含量, 又能测定还原糖含量, 方法简便、快速、滴定终点比较明显, 试样本身的颜色对测定基本无干扰[22]。
赵阳楠等[23]通过苯酚硫酸法和间接碘量法分别测定同一样品灵芝多糖的含量, 两种方法测得的总糖含量基本一致, 分别为2.04%和2.07%。其中, 间接碘量法测得样品中原有还原糖含量为0.80%, 灵芝多糖含量为1.27%。
上述两种方法操作简便, 稳定可行, 但由于苯酚硫酸法只能测得样品中总糖的含量, 因此比较而言, 间接碘量法更加科学合理。
3.1.5 斐林试剂滴定法
还原糖可以将斐林试剂中的二价铜离子还原为一价铜离子, 反应终点可以由次甲基兰指示 (蓝色消失形成砖红色) , 根据一定量的斐林试剂完全还原所需的还原糖量, 可计算加入样品中的还原糖的含量。
3.2灵芝多糖的结构分析
3.2.1 化学分析法
化学法在多糖结构分析中的应用已经较为成熟, 主要包括水解法、高碘酸氧化法、Smith降解法、甲基化反应和气质联用等。
其中, 水解法是分析多糖链组成的主要手段, 包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等;高碘酸法可用于判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度和支链多糖的分支数;Smith降解法根据降解的产物可推断糖苷键的位置;甲基化反应可确定单糖残基的连接位置[24]。
3.2.2 仪器测定法
多糖的一级结构分析常用红外光谱法 (IR) 、质谱法 (MS) 、气相色谱法 (GC) 、高效液相色谱法 (HPLC) 等。多糖的高级结构分析常用核磁共振法 (NMR) 、X射线衍射光谱、原子力光谱、旋光谱、圆二色谱等[24]。
钱夕惠[25]等曾利用薄层色谱法分析灵芝多糖中的单糖组成;何晋浙[26]等通过GC分析得出一种灵芝多糖的单糖组分中89%为葡萄糖。
4 结语
灵芝多糖作为天然产物多糖的一种, 具有极高的生理药理价值。近年来, 随着天然产物研究越来越引人注目, 灵芝多糖的提取、分离及分析方法也逐渐被人们所重视。但从目前研究现状来看, 传统的灵芝多糖提取、分离方法普遍存在提取效率不高、纯度低、溶剂用量大等缺点。新型提取分离技术如超声波提取、酶法提取、大孔树脂分离等虽然在一定程度上能够弥补传统方法的不足, 但由于上述方法的最优操作条件较为苛刻, 若要将其运用到实际生产中, 还需要进行大量的基础实验研究。如何将现有的技术改良, 同时和新型技术相结合, 将实验室的研究成果扩大到具体的工业生产中去, 还有待于进一步的研究和探索。
摘要：灵芝多糖是灵芝的有效成分之一, 具有多方面的药理活性, 已成为目前中药研究的一大热点。综述了目前在灵芝多糖的提取、分离、纯化以及分析方法方面的研究进展, 以期为灵芝多糖的研究提供一些参考。
灵芝多糖 篇6
水浴浸提法是提取多糖的常用方法, 但该方法得率较低、耗时长。近年来, 超声波协同酶法提取植物多糖和菌类多糖的研究较多, 该方法具有能耗低、耗时短、得率高及不破坏有效成分等特点。但是该方法在灵芝多糖的生产应用中还不成熟。因此研究一种高得率、操作简单和适合工业化大规模生产的提取方法将提高灵芝产业的经济效益, 进而带动农业经济的发展。本文探讨了超声波协同纤维素酶法提取灵芝多糖的最佳工艺条件, 并与传统的水浴浸提法进行比较, 为灵芝多糖的工业化生产提供一定参考。
1 试验材料与方法
1.1 原料与试剂
灵芝 (采购于长白山人工栽培灵芝基地) 挑选、清洗、烘干后粉碎备用、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖和纤维素酶等, 均为分析纯。
1.2 仪器与设备
JA3003A电子天平, 上海精天电子仪器有限公司;KQ-250DB数控超声波清洗器, 昆山市超声仪器有限公司;CK-98-1#数显恒温水浴锅, 江苏金坛市金城国胜试验仪器厂;TDL-4A型离心机, 上海菲恰尔仪器有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计, 北京市普析通用仪器有限责任公司;中草药粉碎机, 天津市泰斯特仪器有限公司;PH070A干燥箱, 上海一恒科技仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法。
1.3.2 灵芝多糖得率W (mg/g) 的计算
式中:m为灵芝粉的质量, g;X为葡萄糖浓度, μg/mL;V为样品溶液的体积, mL;n为多糖溶液的稀释倍数;f为葡萄糖对灵芝多糖的换算因子, 1.7948。
1.3.3 灵芝多糖的提取工艺流程
(1) 超声波协同纤维素酶法:精确称取一定量灵芝粉→加一定量pH值的缓冲液和酶→超声波提取→灭酶→抽滤取虑液→浓缩→加无水乙醇沉淀静置过夜→离心取沉淀→沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤→干燥
(2) 水浴浸提法:精确称取一定量灵芝粉→水浴浸提→抽滤取虑液→浓缩→加无水乙醇沉淀静置过夜→离心取沉淀→沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤→干燥
2 结果与分析
2.1 超声波协同纤维素酶提取灵芝多糖的单因素试验优化结果
2.1.1 超声功率对灵芝多糖得率的影响
准确称取1g预处理后的灵芝粉, 在酶量0.02g、料液比1∶40、提取时间40min、pH值5和提取温度45℃的条件下, 分别在超声波功率150、175、200、225和250W条件下提取灵芝多糖, 490nm下测其吸光度值, 计算灵芝多糖得率。试验设3个重复, 结果如图1所示。
由图1可知:功率在150~200W之间时, 随着超声功率的不断增大, 产生的冲击波、剪切力迫使细胞壁破碎, 灵芝多糖得率不断增加。当超声功率大于200W时, 多糖得率开始下降。可能是功率大幅度的增加会引起部分多糖的水解;其次, 超声功率过高会导致反应器内局部温度瞬时升高, 使酶活力下降;再次, 超声波的剧烈刺激可能会对酶的结构产生影响, 使酶的作用减弱, 多糖得率降低。因此200W为最佳功率。
2.1.2 纤维素酶用量对灵芝多糖得率的影响
准确称取1g预处理后的灵芝粉, 在料液比1:40、提取时间40min、pH值5、超声波功率200W和提取温度45℃条件下, 分别在纤维素酶量0.010、0.015、0.020、0.025和0.030g条件下提取灵芝多糖, 490nm下测其吸光度值, 计算灵芝多糖得率。试验设3个重复, 结果如图2所示。
由图2可知:当纤维素酶量小于0.020g (即2%) 时, 多糖得率随着酶量的增加逐渐增大, 由于随着酶量的不断上升, 底物与酶接触机会不断增加, 使多糖分离出来的速度加大。当酶浓度达到一定程度时, 随着酶量的逐渐增多, 多糖得率趋于平缓, 原因在于酶和底物的结合已经饱和。考虑试验成本, 选择酶量为2%进行下一步试验。
2.1.3 提取温度对灵芝多糖得率的
准确称取1g预处理后的灵芝粉, 在酶量0.020g、料液比1∶40、提取时间40min、pH值5和超声波功率200W条件下, 分别在30、35、40、45和50℃提取灵芝多糖, 490nm下测其吸光度值, 计算灵芝多糖得率。试验设3个重复, 结果如图3所示。
由图3可知:在30~45℃温度范围内, 随着温度的升高, 纤维素酶的活力逐渐增强, 得率不断增加。在高于45℃时, 因为温度过高而使酶的活力下降, 导致多糖得率下降。因此, 45℃为最佳温度。
2.1.4 提取时间对灵芝多糖得率的影响
准确称取1g预处理后的灵芝粉, 在酶量0.020g、料液比1∶40、提取温度45℃、pH值5和超声波功率200W条件下, 分别在超声时间20、30、40、50和60min提取灵芝多糖, 490nm下测其吸光度值, 计算灵芝多糖得率。试验设3个重复, 结果如图4所示。
由图4可知:随着超声处理时间的延长, 多糖的得率逐渐增高, 当超声时间达到50min时, 达到最高值, 随后有小幅度的回落。原因可能是超声时间过长, 多糖的结构被破坏;其次, 超声时间过长使得灵芝粉表面对提取物的吸附力增强, 使得率下降。因此50min为最佳提取时间。
2.1.5 料液比对灵芝多糖得率的影响
准确称取1g预处理后的灵芝粉, 在酶量0.020g、料液比1∶40、超声时间500min、提取温度45℃、pH值5和超声波功率200W条件下, 分别在料液比1:20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60提取灵芝多糖, 490nm下测其吸光度值, 计算灵芝多糖得率。试验设3个重复, 结果如图5所示。
由图5可知:液料比在20~50之间多糖得率上升, 但液料比在50以后, 随着溶剂比例的增大得率减小。这是由于随着反应体系中水分的过分增多, 使酶和底物的接触面积减少, 也减弱了超声波能量的传递效果, 细胞壁没有得到充分的破碎, 多糖得率减小。因此液料比50为最佳。
2.1.6 pH值对灵芝多糖得率的影响
准确称取1g预处理后的灵芝粉, 在酶量0.020g、料液比1∶40、超声时间500min、提取温度45℃、料液比1∶50和超声波功率200W条件下, 分别在p H为3、4、5、6、7提取灵芝多糖, 490nm下测其吸光度值, 计算灵芝多糖得率。试验设3个重复, 结果如图6所示。
由图6可知:在pH值3~5之间, 随着pH增大, 得率逐渐增大。当pH值为5时, 多糖的得率达到最大值。pH值大于5以后, 随着pH值的继续增大, 得率开始下降。由于酶对pH值比较敏感, pH值的变化改变了酶空间构象而引起酶活性的降低。因此, pH值为5为最适p H值。
2.2 超声波协同纤维素酶提取灵芝多糖的正交试验优化结果
根据灵芝多糖提取的单因素优化试验结果, 考虑超声波功率、提取时间、提取温度和纤维素酶量对灵芝多糖得率的影响, 利用L9 (34) 正交表进行试验设计, 试验方案与结果见表1。
正交试验结果表明:影响超声波协同纤维素酶法提取灵芝多糖的因素的主次顺序:B (时间) >A (功率) >D (纤维素酶量) >C (温度) 。最佳组合为A3B3C3D2, 即超声波功率225W、超声时间60min、温度50℃和纤维素酶添加量为2%。
2.3 验证性试验
为证实优化组合的合理性, 在最优组合条件下进行试验, 得到灵芝多糖得率为19.9mg/g。灵芝多糖得率高于非最优组合条件下多糖得率, 这表明验证性试验最优方案可行, 工艺条件可靠。
为了考察超声波协同纤维素酶法与传统的水浴浸提法对灵芝多糖得率的影响, 选择这两种提取方法的最佳工艺条件 (其中传统水浴浸提法最佳提取条件是温度100℃、时间300min、料液比1∶20g/mL) 进行对比。试验结果表明:传统的水浴浸提法所得到的多糖得率最高仅7.4mg/g, 而超声波协同纤维素酶法最高得率为19.89mg/g, 在相对较短的时间内提高了1.7倍。
3 结论
本研究优化了超声波协同纤维素酶法提取灵芝多糖的最佳工艺条件, 在料液比1∶50、pH值为5、超声波功率225W、提取时间60min、提取温度50℃和纤维素酶量2%时灵芝多糖的得率最高。通过验证性试验可知此最优工艺条件可靠, 灵芝多糖得率较传统的水浴浸提法得率提高了1.7倍。超声波协同纤维素酶法, 作为一种操作简单、能耗低耗时短及适用于大规模工业化生产的有效提取方法, 将在灵芝多糖乃至其他有效成分的提取中扮演重要角色。
超声波作用是一种机械作用, 而酶解虽然温和, 但两者难免会对灵芝多糖有一定的分解、破坏作用, 进而影响灵芝多糖的结构, 生物活性等, 超声波协同纤维素酶法提取的灵芝多糖与传统的水提醇沉法所得到的灵芝多糖在组分、生物活性等方面是否存在差异、何种差异尚待进一步的研究。
摘要：本研究以灵芝子实体为原料, 采用超声波协同纤维素酶法提取灵芝多糖, 通过单因素试验和L9 (34) 正交试验研究了超声波功率、提取时间、提取温度、纤维素酶量、料液比和pH值等因素对多糖得率的影响, 并将其与传统的水浴浸提法进行比较。结果表明:在试验条件范围内各因素对灵芝多糖得率影响的主次顺序为:时间>功率>纤维素酶量>温度;最佳提取条件为:料液比1:50、pH值为5、提取时间为60min、超声功率为225W、提取温度为50℃和纤维素酶量为2%, 在此条件下, 灵芝多糖的得率较传统的水浴浸提法提高了1.7倍。