脂多糖类

脂多糖类（精选7篇）

脂多糖类 篇1

急性肺损伤 (ALI) 是指由心源性因素以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭, 以肺部容积减少、肺顺应性降低、通气/血流比例失调为病理特征, 肺部影像学表现为非均一性渗出性病变, 主要临床症状为进行性低氧血症和呼吸窘迫[1]。ALI发展至严重阶段被称为急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 。近年来, ALI/ARDS的发病率逐年升高, 且死亡率高达30%~40%[2]。内毒素是G-细菌细胞壁的重要成分, 又名脂多糖。当细菌死亡溶解或被人工破坏时, 其可被释放到细胞外, 对宿主产生毒性效应[3]。大量炎症细胞参与了机体炎症反应, 其中中性粒细胞 (PMN) 是导致细胞损害和肺组织损伤的主要效应细胞, 也是造成过度性、失控性炎症反应的主要因素。炎症介质是参与和介导炎症反应的化学因子, 其中超敏C反应蛋白 (hs-CRP) 、肿瘤坏死因子α (TNF-α) 、白细胞介素1β (IL-1β) 等是重要的细胞炎症介质, 是研究表征炎症是否存在以及严重程度的重要指标, 已成为临床测试是否有炎症存在及其严重程度的通用指标[4,5,6]。

1 材料与试剂

1.1 动物

健康昆明小鼠, 体重 (18.0±2.0) g, 雄性, 由广西医科大学实验动物中心提供 (合格证号:SCXK桂2009-0002) 。

1.2 试剂

大肠杆菌脂多糖 (批号:1010A032, 美国Sigma公司) ;无菌生理盐水 (批号:A12061505, 广西裕源药业有限公司) ;多聚甲醛 (批号:20100626, 天津市博迪化工有限公司) ;小鼠hs-CRP ELISA试剂盒 (批号:201010, 美国R&D公司) ;小鼠TNF-αELISA试剂盒 (批号:201010, 美国R&D公司) ;小鼠IL-1βELISA试剂盒 (批号:201010, 美国R&D公司) 。其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器

电热恒温培养箱 (型号:HHBII, 上海跃进医疗器械厂) ;电热恒温鼓风干燥箱 (型号:101-1-BS, 上海跃进医疗器械厂) ;高压自动灭菌器 (型号:MLS-3750, 日本三洋公司) ;低温高速离心机 (型号:ST16R, 美国热电公司) ;冰箱 (型号:BCD-192DC, 青岛海尔公司) ;全波长酶标仪 (型号:Epoch, 美国伯腾仪器有限公司) 。

2 方法

2.1 脂多糖溶液配制

将适量LPS溶于生理盐水中配制成500μg/mL的溶液, 临用现配, 剩余溶液暂放4℃冰箱内储存, 储存时间不超过24h。

2.2 4%多聚甲醛溶液配制

精确称取40g多聚甲醛, 加入pH7.4PBS溶液800mL, 磁力搅拌器搅拌加热至60℃, 滴加NaOH溶液, 完全溶解后, 冷却定容至1L, 4℃储藏备用。

2.3 小鼠尾静脉注射脂多糖剂量确定

2.3.1 动物分组与处理

选择健康昆明种小鼠50只, 按照LPS剂量 (1、2、3、4及5mg/kg) 分为5组, 各组小鼠尾静脉注射相应剂量的脂多糖, 另选择10只小鼠作为对照组, 采用等体积无菌生理盐水以同样方法尾静脉注射。摘取小鼠眼球取血, 室温下血液自然凝固30min后, 于4℃下3 000r·min-1离心20min, 分离血清, 分装冻存于-20℃。采用ELISA法检测血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-α含量。随后摘取小鼠左肺上叶, 以4%多聚甲醛溶液固定, 常规石蜡切片, HE染色后进行病理组织镜检。

2.3.2 血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α检测

分别采用hsCRP、IL-1β、TNF-α的ELISA检测试剂盒, 按照说明书操作。

2.4 尾静脉注射脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的时间效应

2.4.1动物分组与处理

取雄性小鼠40只, 随机分为空白对照组 (空白组) , 不同给药时间组 (2、6、12h) ALI组, 每组10只。根据小鼠体重尾静脉注射LPS 4mg/kg, 并于给药2、6、12h后取样, 空白组小鼠尾静脉注射等体积无菌生理盐水, 于2、6、12h后取样。

2.4.2 动物标本采集

ALI各组小鼠注射LPS后, 于2、6、12h末摘取小鼠眼球取血, 室温下血液自然凝固30min后, 于4℃下3 000r·min-1离心20min, 血清分离后分装, -20℃冻存。采用ELISA法检测血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-α含量。摘取小鼠左肺上叶, 置于4%中性甲醛溶液中固定24h, 常规脱水石蜡包埋, 制作切片, 厚度为5μm, 伊红染色 (HE染色) 。

2.4.3 血清hs-CRP、L-1β、TNF-α检测

操作同“2.3.2”。

2.5 观察指标

在实验期间, 即从开始进行尾静脉注射至实验结束为止, 观察各组小鼠的一般状态和大体标本。

2.6 检测方法

取处理好的动物标本, 于光镜下观察病理组织的形态变化。肺损伤评价指标为肺泡和间隙水肿程度、中性粒细胞浸润程度以及出血程度。设置的评估标准[22]为 (视野里) :无损伤=0;25%损伤=1;50%损伤=2;75%损伤=3;全都损伤=4。

2.7 统计学方法

采用SPSS17.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料采用均数加减标准差 (±s) 表示, 方差齐性数据采用单因素方差分析LSD检验。▲P<0.05为差异具有统计学意义, ▲▲P<0.01为差异具有极显著统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠一般状态和大体标本观察

对照组小鼠呼吸平稳, 进食正常, 对外界刺激反应无异常, 无死亡;肺叶外观无异常, 质软, 弹性好, 呈粉红色。脂多糖各剂量组小鼠精神萎靡, 活动减少、食欲下降、呼吸急促, 四肢、口唇发绀。脂多糖剂量达到4mg/kg后, 小鼠肺脏可见明显淤血点、出血点和水肿, 尤以6h组最为明显。

3.2 各剂量组小鼠血清L-1β、TNF-α及hs-CRP水平比较

尾静脉注射LPS后, 小鼠血清中炎症细胞因子hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平均明显升高, LPS1组、LPS2组、LPS3组小鼠血清hs-CRP、TNF-α水平与空白对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05) ;LPS4组、LPS5组小鼠血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平显著高于空白组, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。见表1。

3.3 时间效应的血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平比较

尾静脉注射LPS后, ALI组小鼠血清炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平均明显增加且显著高于空白组, 与空白组比较差异均有统计学意义 (2h组vs空白组、6h组vs空白组、12h组vs空白组P均<0.01) 。随着时间的延长, 小鼠血清hs-CRP水平呈逐渐上升趋势;血清TNF-α水平经LPS处理2h后达到高峰, 6h时有所降低;血清IL-1β水平2h时达到高峰, 6h时IL-1β水平有所降低, 但仍高于空白组。结果见表2与图1。

3.4 水平剂量的肺组织病理学评分比较

染色HE结果显示, 空白组小鼠无明显炎症反应。对照组小鼠尾静脉注射LPS后, LPS3、LPS4、LPS5剂量均可引起小鼠肺组织充血、水肿及炎症细胞浸润, 与空白组比较差异具有统计学意义 (P<0.01) 。LPS3组小鼠肺脏HE染色镜检中仅见轻度炎症细胞浸润, 炎症反应轻微;LPS4组小鼠肺脏可见炎症细胞轻到中度浸润, 伴有组织淤血水肿, 水肿程度不等, 炎症反应较明显;LPS5组小鼠可见大量炎症细胞浸润, 并伴有淤血。LPS1组、LPS2组小鼠肺组织病理学表现与空白组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表3。

(±s)

(±s, n=10)

(±s, n=8, 10)

3.5 时间效应的肺组织病理学评分比较

染色HE结果显示, 空白组小鼠无明显炎症反应。对照组小鼠肺组织在光镜下发生病理学改变, 可见肺泡间隔增宽, 部分肺泡塌陷, 内浸润有较多数量的中性粒细胞, 明显充血, 中性粒细胞浸润程度与出血程度均显著高于空白组, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 以6h最为显著, 12h次之, 2h最弱。见表4。

(±s, n=10)

4 讨论

本研究设置了不同剂量的LPS (1、2、3、4、5mg/kg) , 旨在确定复制小鼠ALI模型的最佳条件, 通过测定血清中炎症细胞因子的水平和病理变化, 综合评价ALI模型是否成功建立。从实验结果可知, 不同剂量的脂多糖可引起不同程度的ALI:当LPS≥4mg/kg时, 小鼠出现明显的呼吸困难、四肢、口唇发绀等症状, 血清中TNF-α、IL-1β、hs-CRP水平均显著升高, 出现炎症细胞浸润与组织瘀血水肿等病理学变化。该变化与ALI病程发展过程相似, 说明当LPS≥4mg/kg时, 可显著引发小鼠释放抗炎因子。当LPS剂量为5mg/kg时, 可导致小鼠死亡现象, 因此4mg/kg LPS为建立小鼠急性肺损伤模型的安全剂量。

本实验采用小鼠制备急性肺损伤模型, 尾静脉注射LPS 4mg/kg后, 对3个时间点的小鼠血清促炎因子hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平以及肺损伤程度进行检测, 初步探讨肺损伤过程中炎性介质的相互关系及其变化规律。病理结果显示, 空白组小鼠肺组织形态结构变化不明显, 小鼠在注射LPS 2h后出现肺损伤, 损伤程度随时间变化, 6h时损伤最明显, 表现为肺泡间隔明显增厚, 部分肺泡塌陷, 大量中性粒细胞浸润, 明显充血;但至12h时, 病理变化又趋向减轻。实验结果表明, LPS注射6h时小鼠出现明显的肺组织结构损伤, 证实ALI模型复制成功。

综上所述, 从开始进行尾静脉注射至观察终点为止, 各组小鼠全部存活, 表明4mg/kg剂量的LPS安全性较高, 用于静脉注射建模安全性良好, 且病理学改变以6h时最为显著。

摘要：目的:建立脂多糖诱导的急性肺损伤模型。方法:随机将60只昆明种小鼠分为5组, 分别向小鼠尾静脉注射生理盐水和不同剂量的脂多糖, 12h后检查并评估各组小鼠的急性肺损伤情况, 以确定合适的建模脂多糖剂量。确定合适的脂多糖剂量后, 采用ELISA法分别于2、6、12h末摘取小鼠眼球取血并分离血清, 测定血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平;采用HE染色观察小鼠肺脏病理形态变化。结果:脂多糖剂量为4mg/kg时, 小鼠血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α可持续保持较高水平。HE染色后, AIL组小鼠光镜下可见以肺泡正常结构消失、肺泡间隔明显增厚、肺泡腔内出血、大量炎性细胞浸润为主要表现的组织病理变化, 肺损伤6h最为明显。结论:向小鼠尾静脉注射脂多糖4mg/kg可成功复制AIL小鼠动物模型。

关键词：脂多糖,急性肺损伤,动物模型

参考文献

[1]钱桂生.急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征研究现状与展望[J].解放军医学杂志, 2003, 28 (2) :97-101.

[2]缪李丽, 骆玲, 王导新.Ang-2在大鼠内毒素性急性肺损伤中的作用[J].细胞与分子免疫学杂志, 2009, 25 (11) :1005.

[3]张霞, 剡根强, 王静梅.细菌内毒素的研究概况[J].上海畜牧兽医通讯, 2006 (4) :4-5.

[4]KANEHARA#space2;#M, YOKOYAMA#space2;#A, TOMODA#space2;#Y, et#space2;#al.Antiinflammatory#space2;#effects#space2;#and#space2;#clinical#space2;#efficacy#space2;#of#space2;#theophylline#space2;#and#space2;#tulobuterol#space2;#in#space2;#mild-to-moderate#space2;#chronic#space2;#obstructive#space2;#pulmonary#space2;#disease[J].Pulmonary#space2;#pharmacology&therapeutics, 2008, 21 (6) :874-878.

[5]WITONSKI#space2;#D, WAGROWSKA-DANILEWICZ#space2;#M, KESKA#space2;#R, et#space2;#al.Increased#space2;#interleukin#space2;#6and#space2;#tumour#space2;#necrosis#space2;#factor#space2;#alpha#space2;#expression#space2;#in#space2;#the#space2;#infrapatellar#space2;#fat#space2;#pad#space2;#of#space2;#the#space2;#knee#space2;#joint#space2;#with#space2;#the#space2;#anterior#space2;#knee#space2;#pain#space2;#syndrome:apreliminary#space2;#report[J].Polish#space2;#Journal#space2;#of#space2;#Pathology, 2010, 61 (4) :213-218.

[6]SUHWM, PARK#space2;#SB, LEE#space2;#S, et#space2;#al.Suppression#space2;#of#space2;#mastcell-mediated#space2;#allergic#space2;#inflammation#space2;#by#space2;#Lindera#space2;#obtusiloba[J].Experimental#space2;#biology#space2;#and#space2;#medicine, 2011, 236 (2) :240-246.

脂多糖类 篇2

1仪器与试剂

1.1仪器YD-20硬度仪 (天大天发科技有限公司) , ZB-1E智能崩解仪 (天大天发科技有限公司) 。

1.2试剂黄芪多糖由实验室自制, 200目筛分乳糖购于美剂乐公司, 可溶性淀与甘露醇由安徽山河药用辅料股份有限公司提供, CMC-Na、PEG6000、粉硬脂酸富马酸钠、蔗糖、木糖醇、甘露醇、葡萄糖、三氯蔗糖、赤藓糖醇、柠檬酸、碳酸氢钠均购于国药集团化学试剂有限公司, 咖啡香精、草莓香精、甜橙香精购于依伦 (上海) 香精香料有限公司。

2方法

由课题组前期研究基础可知, 黄芪多糖单日服用量为100 mg时即可达到良好的降糖降脂效果。考虑到泡腾片处方中需添加大量酸源、碱源, 且具有较高的制备难度, 因此将片剂规格定为1000 mg, 载药量为10%, 辅料空间为90%。

2.1柠檬酸、碳酸氢钠含量限度研究泡腾片是运用柠檬酸或酒石酸与碳酸氢钠在水中反应后放出大量二氧化碳的原理产生剧烈泡腾效果的一种固体制剂, 从而使药物均匀分散在水溶液中。因此跟其他普通片剂相比, 其处方中除含有药效成分及其他赋形剂外还需要加入大量酸源和碱源, 以保证有足够二氧化碳释放出来。以10%的主药黄芪多糖, 4%的崩解剂CMC-Na (内加3%、外加1%) , 1%的润滑剂PEG6000作为基本处方。添加不同剂量的柠檬酸、碳酸氢钠 (酸碱比例为1:1) , 剩余部分用充填剂乳糖补充至100%。酸碱分开制粒后混合压片, 片剂的硬度控制在80~100 N, 通过片剂的泡腾效果及崩解时限来筛选酸碱的用量限度。

2.2矫味剂筛选泡腾片的服用方法一般为冲服, 因此对口味有较高要求。处方中的酸源柠檬酸具有较强酸味, 碳酸氢钠在与柠檬酸反应后产生一定量的钠离子, 具有较强的咸味。因此在处方研究过程中, 应着重考察各类香精和甜味剂的种类与剂量, 以中和酸味和咸味, 带来良好的口味和口感。

酸味剂剂量筛选柠檬酸具有令人愉悦的柠檬酸味, 然而在发生泡腾反应后, 由于酸碱中和导致酸味完全消失, 因此考虑在保证20%碳酸氢钠含量不变的前提下增加柠檬酸剂量, 从而增加泡腾片溶液的酸味口感。按单片1000 mg的剂量, 在250 ml水中加入200 mg碳酸氢钠, 并按照柠檬酸含量和酸度加入对应的柠檬酸的量。随着柠檬酸的加入, 泡腾片溶液的酸味逐渐增强, 当加入量达到50%时, 酸味能够在一定程度上抑制碳酸氢钠的咸味, 口味最佳, 因此柠檬酸含量定为50%。尽管柠檬酸能够部分抑制碳酸氢钠的咸味, 但泡腾片溶液口感仍旧不佳, 因此考虑适当加入部分甜味剂以进一步改善口味。

甜味剂种类筛选口服泡腾片常用甜味剂有蔗糖、木糖醇、甘露醇、葡萄糖、三氯蔗糖、赤藓糖醇、AK糖、糖精钠, 其中前6种甜度较低, 后2种甜度较高。本文研究选用蔗糖, 木糖醇, 甘露醇, 葡萄糖, 三氯蔗糖、赤藓糖醇单独或配比进行甜味剂的筛选。为保证片剂成形性, 处方中需要为充填剂留出足够空间, 因此规定甜味剂的最高含量为处方量的10%。按照单片1000 mg的剂量, 在250 ml水中分别加入200 mg碳酸氢钠和500 mg柠檬酸的情况下, 根据种类分别加入相应的甜味剂剂量的甜度的甜味剂。

实验表明10%的蔗糖、木糖醇、甘露醇、葡萄糖均无法产生甜味, 三氯蔗糖与赤藓糖醇混合物甜度较高, 与柠檬酸配合可产生较为愉悦的酸甜口味, 且以7:1比例的混合物具有较为适中的甜味, 拟进一步考察该甜味剂剂量, 使泡腾片达到最佳口感。

2.2.3甜味剂剂量筛选按单片1000 mg的剂量, 在250 ml水中分别加入200 mg碳酸氢钠和500 mg柠檬酸的情况下, 甜味剂三氯蔗糖和赤藓糖醇 (7:1) 混合甜味剂, 筛选混合甜味剂在总处方的用量。当三氯蔗糖和赤藓糖醇混合甜味剂占总处方量的7%时, 泡腾片甜度适中, 达到最佳口感。甜味剂剂量筛选。见表1。

3结果

黄芪多糖泡腾片的最佳处方为:柠檬酸50%, 碳酸氢钠20%, 黄芪多糖10%, 三氯蔗糖+赤藓糖醇7%, 甜橙香精100μl, 乳糖8%, PEG6000 1%, CMC-Na 4%, 该处方在压片过程中未出现黏冲现象, 所制备的片剂具有较好的外观、口感及泡腾效果。

4小结

本研究针对多糖类中药制剂原料易吸潮、黏性强等不良物理属性开发了以乳糖为充填剂、以PEG6000为润滑剂的泡腾片基本处方, 有效降低了制剂原料的黏性, 防止黏冲确保压片工艺的顺利进行。

黄芪多糖降压降脂泡腾片的处方筛选研究开发了以三氯蔗糖、赤藓糖醇组合为主要甜味剂的矫味配方, 与处方中柠檬酸共同构成了令人愉悦的酸甜口味, 提高了患者的依从性为同类产品提供了可参考的甜味剂基本配方。

摘要：目的 筛选最佳的黄芪多糖泡腾片处方。方法 分别以口味、口感、成型性、泡腾状态和崩解时间等为考察指标, 筛选黄芪多糖泡腾片处方的甜味剂、充填剂、崩解剂的种类及用量, 获得最佳处方配比。结果 最佳处方为柠檬酸50%, 碳酸氢钠20%, 黄芪多糖10%, 三氯蔗糖+赤藓糖醇7%, 甜橙香精100μl/片, 乳糖8%, 聚乙二醇6000 (PEG6000) 用量为1%, 羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 为4%, 该处方条件下, 黄芪多糖泡腾片具有较好的外观、口感及崩解性能。结论 黄芪多糖降压降脂泡腾片的处方筛选研究解决了多糖类泡腾片制备过程中黏性高、难以泡腾的瓶颈问题, 同时针对泡腾片的口味开发了最优的甜味剂组合, 提高了患者的依从性, 为该类泡腾片的处方开发提供了参考依据。

关键词：黄芪多糖,泡腾片,降糖,降脂,处方筛选

参考文献

[1]刘力生.《中国高血压防治指南》2010年修订版要点解读.临床荟萃, 2011 (23) :8.

脂多糖类 篇3

1 LPS的结构特点及生物学作用

在正常情况下LPS主要通过胃肠道进入机体内, 之后就作为一种免疫增强剂激活单核细胞、巨噬细胞等, 引起细胞因子的合成和释放, 导致多种病理和生理损害;而微量细菌脂多糖可以活化单核巨噬细胞系统, 促进大量内源性细胞因子释放[1]。

而目前建立猪免疫应激模型普遍采用的方法就是从腹腔或者静脉注射一定剂量的LPS[2]。以此建立猪的免疫应激模型。LPS是目前所知的十分有效的免疫应激源, 具有致热作用、抗肿瘤作用、强化网状内皮系统的功能、增强抗感染力, 以及其它多种生物学功能, 如刺激白细胞、巨噬细胞, 诱生干扰素、肿瘤坏死因子及白细胞介素等细胞因子, 直接或间接激活T淋巴细胞、B淋巴细胞, 增强机体的特异性及非特异性免疫反应。LPS刺激巨噬细胞和其它细胞分泌的细胞因子, 具有广泛的代谢调节作用, 介导病理条件下的代谢改变以满足抗感染的需要。

2 LPS在模拟断奶仔猪上的应用

在LPS通过腹腔注射至动物机体之后, 会引起动物日常行为的变化, 而不同品种的仔猪对脂多糖的免疫应激反应不同, 刘玉兰 (2003) 报道[3]:给DLY仔猪注射200μg/ (kg Bw) 的LPS建立断奶仔猪免疫应激模型, 仔猪出现呼吸加快、气喘、发抖、行走不稳、体温升高、厌食、卧地不起等系列异常反应, 但却未出现死亡。而黎文彬 (2009) 报道[4]说:与DLY猪相比较, 梅山仔猪更容易发生免疫应激, 按照100μg (kg BW) 的LPS注射剂量就能够引起梅山仔猪的半数致死, 尸体解剖发现死亡的原因可能主要是由于LPS引起其肺部大面积充血, 使其呼吸衰竭, 这个试验就能够说明梅山仔猪对免疫应激更加敏感, 但是却没有指出死亡的具体原因。LPS还可在某些条件下如肠上皮损伤时进入血液循环, 强烈地刺激巨噬细胞产生IL-1、IL-6和TNF-α, 产生炎性反应, 导致机体发热、采食量下降和生产性能的降低。炎性细胞因子可直接作用于外周组织, 使得机体的新陈代谢发生改变, 组织合成代谢减弱, 分解代谢增强。

2.1 LPS对仔猪体内血液生化指标的影响

LPS能够显著降低断奶仔猪白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和噬中性粒细胞数量, 同时使得断奶仔猪血浆葡萄糖、总蛋白和白蛋白含量显著降低, 碱性磷酸酶和谷草转氨酶活性显著升高, 谷丙转氨酶活性显著降低, 谷草转氨酶/谷丙转氨酶升高, 但是是对血液中尿素氮的含量无显著差异[5]。

2.2 LPS对仔猪体内物质代谢的影响

2.2.1 LPS诱导的免疫应激对断奶仔猪肠道结构的影响:

范伟等 (2010) [6]探究了LPS对肠道结构的影响, 试验选取12头 (28±3) 日龄断奶仔猪, 随机分为对照组和LPS组, LPS组按体重注射100μg/kg LPS, 而对照组注射等量生理盐水。注射3 h后, 屠宰仔猪后取小肠样品, 观察肠道形态, 测定小肠黏膜细胞增殖率。其结果表明: (1) LPS刺激加深了仔猪十二指肠、空肠的隐窝深度 (P<0.05) , 降低了十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度与隐窝深度比值 (P<0.05) ; (2) LPS组十二指肠、空肠和回肠小肠黏膜细胞增殖率显著降低 (P<0.05) 。这也就说明LPS刺激可导致仔猪肠道结构发生损伤。

2.2.2 LPS诱导的免疫应激对断奶仔猪蛋白质利用及周转的影响:

chen等 (2008) 探讨[7]试验选用 (10.15±0.39) kg的断奶仔猪, 分成3组, 试验组注射1m L 200μg/kg的LPS建立免疫应激模型, 自由采食;对照组注射1 m L生理盐水, 自由采食;另设置了配对-饲喂组, 注射1 m L生理盐水, 饲喂断奶仔猪与试验组等量的试验日粮。结果表明:LPS刺激极显著的提高了淋巴细胞胚细胞样的转化, 并且降低了断奶仔猪ADG、ADFI以及饲料转化率 (P<0.01) 。同时, 相比对照组, LPS刺激极显著的降低了氮沉积和氮的利用效率 (P<0.01) ;而相比配对-饲喂组, LPS刺激增加量粪氮沉积 (P<0.05) 。整体氮流量以及氮沉积随着采食量的降低而减少, 但试验组与饲喂-配对组无显著差异。LPS刺激显著增加了蛋白质降解 (P<0.05) 。

2.2.3 LPS诱导的免疫应激对仔猪肠黏膜免疫屏障的影响:

朱惠玲等 (2009) 研究[8]结果表明:LPS刺激极显著降低十二指肠、回肠上皮间淋巴细胞数 (P<0.01) , 极显著增加小肠各段肥大细胞数 (p<0.01) ;LPS刺激显著显著增加回肠集合淋巴结凋亡细胞数 (P<0.05) , 但对增殖细胞数没有影响 (P>0.05) ;LPS刺激可增加仔猪小肠杯状细胞数, 但两处理组间差异不显著 (P>0.05) 。这些结果显示, LPS应激可导致肠黏膜免疫屏障功能改变, 进而加重机体出现急性感染症状。

2.2.4 LPS诱导的免疫应激对断奶仔猪免疫和神经内分泌激素的影响:

刘玉兰等 (2004) 研究[9]结果表明: (1) 注射LPS激活了应激轴:与注射生理盐水的对照组相比, LPS提高了注射后1 h (P<0.10) 、2 h (P<0.01) 和3 h (P<0.01) 的IL-1β水平, 提高了注射后1 h (P<0.05) 和3h (P<0.01) 的皮质醇和PGE2 (前列腺素2) 水平; (2) 注射LPS抑制了生长轴:LPS降低了注射后3 h的生长激素 (GH) 水平 (P<0.10) , 降低了注射后2 h (P<0.05) 和3 h (P<0.01) 的IGF-I (类胰岛素生长因子) 水平。这些结果显示:免疫应激激活了仔猪应激轴, 而抑制了生长轴, 在一定程度上揭示了免疫应激抑制生长的机制。

2.2.5 LPS诱导的免疫应激对仔猪肠道发育及胰高血糖素样肽-2分泌的影响:

车炼强等 (2009) 研究[10]结果指出:注射LPS后的仔猪24 h内几乎所有仔猪均不采食, 24 h后才开始部分采食, 并表现出呕吐、躺卧不起、嗜睡、颤抖等症状, 随着注射次数增加, 仔猪的反应略有减轻。注射LPS后2 h, 仔猪直肠温度显著高于生理盐水注射组 (P<0.05) 。而在淋巴细胞转化的影响方面, 注射LPS后仔猪淋巴细胞转化率显著上升 (P<0.05) , 相反未注射LPS处理组仔猪淋巴细胞转化率无显著变化, 在肠道黏膜形态及消化酶活性的影响上, 注射LPS组的仔猪空肠上段绒毛高度显著低于生理盐水组的仔猪 (P<0.05) 。而两个处理间隐窝深度差异不显著, 但注射LPS的仔猪的空肠上段绒毛高度/隐窝深度比显著降低 (P<0.05) 。

2.2.6 LPS刺激可提高仔猪脾脏、胸腺和外周血白细胞PPAR-γ蛋白的表达:

鲁晶等 (2008) [11]研究:试验组注射100ug/kg BW的LPS建立免疫应激模型, 对照组注射生理盐水, 结果表明:LPS刺激仔猪导致血浆IL-6、TNF-α、皮质醇和前列腺素E含量显著升高 (P<0.05) , 胰岛素、IGF-1含量显著降低 (P<0.05) , 血浆葡萄糖、总蛋白、白蛋白和球蛋白含量显著降低 (P<0.05) , 脾脏、胸腺和白细胞PPAR-γ蛋白表达水平显著或极显著升高, 这表明PPAR-γ可能参加仔猪免疫应激的调控。

2.2.7 LPS诱导的免疫应激对断奶仔猪外周血免疫细胞和免疫器官中PPARγm RNA表达水平的影响:

石君霞 (2008) 研究[12]:试验组注射100μg/ (kg BW) 的LPS, 而对照组注射等量的生理盐水, 结果表明: (1) LPS刺激后1.5和3 h, 肿瘤坏死因子TNF-α和皮质醇含量均急剧上升 (P<0.01) ;LPS刺激后3h, 胰岛素含量显著下降 (P<0.01) , 胰高血糖素含量显著上升 (P<0.01) 。此外, LPS刺激也导致血液生化指标发生了显著变化。这表明LPS刺激导致机体处于急性免疫应激状态; (2) LPS刺激导致外周血白细胞 (P<0.01) 、胸腺 (P<0.05) 和肠道淋巴结 (P<0.05) 的PPAR m RNA表达量显著升高, 这表明免疫应激诱导了免疫细胞和免疫器官中PPAR7 m RNA的表达。

2.3 减缓LPS免疫应激的营养措施

向饲料中添加一定比例的下列物质能够减缓LPS对仔猪的免疫应激作用:

2.3.1 共轭亚油酸 (CLA) :

赖长华2005研究[13]结果表明:添加CLA缓解了因注射LPS引起的日增重降低 (P<0.05) , 并改善了试验全期的饲料转化效率 (P<0.05) 。两次LPS刺激后, CLA抑制 (P<0.05) 了由LPS诱导的血浆白细胞介素-6 (IL-6) 、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和α2乙酰糖蛋白 (AGP) 浓度的上升。在第14 d和21 d, LPS刺激提高 (P<0.05) 了血浆IL-1β和皮质醇含量, 而CLA则降低了IL-1β和皮质醇含量。这也就表明:CLA能缓解免疫应激引起的仔猪生长抑制, 其防止免疫应激诱导的生长抑制作用可能与CLA抑制炎性细胞因子的分泌有关。2.3.2α-酮戊二酸 (AKG) :李永塘 (2010) 报道[14]:免疫应激导致仔猪肝脏酪氨酸 (Tyr) 含量显著下降了81.82% (P<0.05) , 赖氨酸 (Lys) 的含量有下降的趋势 (P<0.1) , AKG组仔猪肝脏的Tyr、Lys含量与LPS组和对照组差异均不显著;丙氨酸 (Ala) 的含量较LPS组有升高的趋势 (P<0.1) , 谷氨酸 (Glu) 的含量较对照组和LPS组均有上升的趋势 (P<0.1) 。这结果表明:AKG能在一定程度上缓解免疫应激对仔猪氨基酸代谢的影响, 减轻LPS刺激对仔猪肝脏损伤。

2.3.3 酵母硒:

黎文彬 (2009) [4]报道:在饲料中添加酵母硒 (300 g/t) 比亚硒酸钠 (300 g/t) 更能有效缓解眉山仔猪因注射LPS而引起的生长抑制, 能够缓解由免疫应激而诱导的仔猪血清IL-1β和IL-6浓度的升高, 促进IGF-I、Ig G和Ig M的分泌, 其中起主要作用的是酵母硒中的有机硒。

2.3.4 p GRF基因质粒:

董海军 (2009) 报道[15]:p GRF基因质粒可以缓解因注射LPS导致的日增质量的降低 (P<0.05) , 饲料转化率有所改善 (P>0.05) ;能够抑制由LPS诱导的细胞因子 (IL-1、IL-6) 浓度的上升 (P<0.05或P<0.05) 和血清IGF-I浓度的降低 (P<0.05或P<0.05) , 同时显著提高血清Ig G的浓度 (P<0.05) 。结论:p GRF基因质粒缓解了断奶仔猪因注射脂多糖引起的生长抑制, 降低了血清IL-1和IL-6的水平, 提高了血清Ig G的浓度, 提高了仔猪的抗病力, 从而缓解了断奶仔猪的免疫应激;p GRF基因质粒缓解免疫应激的作用与其促进IGF-I的分泌密切相关。

2.3.5马来酸罗格列酮 (Ro S) :

刘玉兰等 (2010) 报道[5]:马来酸罗格列酮 (Ro S) 作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptorγ, PPARγ) 的激动剂在一定程度上缓解了LPS导致的血液生化指标的变化, 从而在一定程度上缓解了LPS应激导致的应激反应。

3 LPS应激存在的缺陷

脂多糖类 篇4

山药是中国国家食品药品监督管理局 (SFDA) 批准的既是食品又是药品的87种保健食品原料之一[1]。中医认为山药味甘性平, 入肺、脾、肾经, 具有益气养阴, 补脾、肺、肾, 固精止带, 降血糖等功效[2]。山药的保健功能活性与其中所含的活性多糖、粘液蛋白、薯蓣皂苷等密切相关[3]。本文通过山药多糖对2型糖尿病患者血糖和血脂影响的研究, 揭示其对2型糖尿病的治疗机制, 为山药多糖的临床应用提供理论依据。

1 实验材料

实验材料:

1.1. 山药多糖

焦作市县购买山药, 洗净、去皮、捣碎成泥。按山药与水1:5的比例加水, 煮沸3h (在煮沸过程中不停地搅拌, 以防粘锅) , 然后过滤, 滤液为可溶性山药多糖;将所得多糖蒸发浓缩再加胰蛋白酶去蛋白、脱色置冰箱内备用。

1.2. 实验对象

实验对象为我市159医院就诊的Ⅱ型糖尿病患者40名, 其中男性23例, 女性17例。将实验对象随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。见表1。

2 实验方法

2.1 治疗方案

查阅与本课题相关的文献并对相关医生和专家进行走访, 结合2型糖尿病的病理特征, 确定山药多糖的剂量。低剂量组200mg/次, 中剂量组400mg/次, 高剂量组800mg/每次, 每天3次, 8周为一个疗程。对照组不进行任何干预。

2.2 指标测试

实验前后血糖、血脂指标均在159医院进行测试。

2.3 数据处理

采用SPSS17.0统计软件包对数据进行处理, 以X±SD表示, 组间比较采用样本均数的t检验。

3 实验结果

3.1 各受试者实验后BMI和血糖指标比较

表2显示, 山药多糖低剂量组和中剂量组的BMI、2h PG和GSP指标均低于对照组, 具有显著性差异 (P<0.05) , FBG和Hb Alc与对照组比较差异性不显著;高剂量组的BMI、2h PG和GSP指标与对照组相比存在极显著性差异 (P<0.01) , FBG和Hb Alc存在显著性差异 (P<0.05) ;高剂量组与中剂量组和低剂量组比较血糖指标差异性显著 (P<0.05或P<0.01) ;说明山药多糖有明显降血糖作用, 且需要剂量大。

3.2 各受试者实验后血脂指标比较

表3显示, 山药多糖低剂量组与对照组比较血脂指标存在显著性差异 (P<0.05) , 中剂量组与对照组比较血脂指标变化显著 (P<0.05或P<0.01) ;高剂量组与对照组比较血脂指标存在极显著性差异 (P<0.01) ;表明山药多糖有降血脂的作用, 但高剂量效果更佳。

4 分析与讨论

糖尿病患者普遍存在不同程度的脂代谢紊乱, 而高脂血症又可引起胰岛素抵[4,5]。本实验结果说明山药多糖对调节血脂和胰岛素分泌作用明显, 推测山药多糖调血脂作用可能与提高胰岛素敏感性及促进胰岛素分泌有关。越来越多的证据表明氧化应激参与糖尿病并发症的发生和发展, 研究显示, 糖尿病人抗氧化能力下降[6]。在高糖环境下。机体清除氧自由基的酶的活性降低, 同时体内氧化应激作用增强, 造成体内大量活性氧自由基的积聚, 致使糖尿病一系列并发症的发生和发展[7]。

本实验结果表明, 山药多糖具有较好调节糖脂作用, 其调节血脂作用可能与改善胰岛素敏感性相关。其降血糖活性有随剂量增加而增强的趋势。同时, 山药多糖还可有效清除氧自由基, 可能对延缓糖尿病并发症发展起到一定作用。

摘要：目的:探讨山药多糖对糖尿病患者的降血糖和降血脂作用;方法:选用42名2型糖尿病患者, 随机分成4组, 对照组、低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组, 给药组连续服用8周, 比较各组血糖和血脂指标的差异。结果:与对照组比较, 低剂量组、中剂量组和高剂量组的糖脂指标差异显著;高剂量组的糖脂指标明显优于低剂量组和中剂量组, 有统计学意义 (P<0.01或P<0.05) 。结论:山药多糖具有明显的降血糖作用, 高剂量效果更佳。

关键词：山药多糖,2型糖尿病,血糖,血脂

参考文献

[1]凌关庭.保健食品原料手册[M].北京:化学工业出版社, 2002:97-98.

[2]许效群, 常霞, 刘志芳.山药汁对糖尿病大鼠血糖的影响[J].上山西农业大学学报 (自然科学版) , 2010, 30 (02) :143-145.

[3]何凤玲.山药中活性成分的提取及降糖活性研究[D].重庆:西南大学, 2011.

[4]孙设宗, 张红梅, 赵杰等.山药多糖对小鼠肝、肾、心肌和脑组织抗氧化作用的研究[J].现代预防医学, 2009, 36 (08) :1445-1447.

[5]Holland WL, Knotts TA, Chavez JA, et al.Lipid mediators of insulin re-sistance〔J〕.Nutr R ev, 2007;65:39-46.

[6]Suarez PW, R ajotte R V, Mosmann T R, et al.Both CD+4 and CD+8 Tcells in syngenic Lslet grafts in NOD mice produce interferon-gramma during beta-cell destruction[J].Diabetes, 2006;45:1350.

脂多糖类 篇5

关键词：生地注射液,肺部炎症,脂多糖

生地味苦性寒, 具有清热解毒、养阴生津的作用, 同时对心、肝、肾能起到良好的保护作用。采用单味生地研制的生地注射液在临床上能有效改善慢性阻塞性肺炎患者的临床症状[1]。该研究通过探讨生地注射液对脂多糖诱导下的大鼠肺炎的影响, 从而了解分析生地注射液对慢性阻塞性肺炎的作用机制。该研究对30只雄性大鼠进行实验研究, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

生地注射液由上海中医药生物公司提供 (国药准字号:050120) , 脂多糖由美国Sigma公司提供;O2- (氧阴离子) 试剂盒、MPO (过氧化酶) 等均有南京生物工程研究所提供;TNFa-试剂盒由美国生物药业公司提供;冷冻离心机由德国仪器设备公司提供, 酶标仪、纯水仪由美国医药设备公司提供。

1.2 动物

30只SD雄性大鼠, 平均重量为 (235±25) g, 清洁级, 由上海莱克实验动物有限公司提供 (许可证号:沪2003-0003) 。

2 方法

2.1 大鼠肺炎模型建立

大鼠称重后采用10%水合氯醛纯对其进行麻醉, 按照3.5 mL/kg的标准给大鼠进行腹腔注射用药。大鼠麻醉后立刻进行手术, 将气管暴露, 并采用微量注射器将脂多糖 (3 mg/kg) 行气管滴入, 术后6 h将大鼠处死, 收集BALF (气管肺泡灌洗液) , 同时收集肺部组织进行病理学分析。

2.2 给药及分组

随机将30只大鼠进行分组, 分别为对照组、模型组及药物组, 每组大鼠均采用静脉注射方式给药。模型组大鼠及药物组大鼠分别给予生理盐水及生地注射液。分2次给药, 第一次用药于气道滴入脂多糖5 min, 第二次用药于气道滴入脂多糖3 h后。脂多糖滴入6 h后, 采用股动脉放血的方式将大鼠处死, 将其肺胸及器官暴露, 气管插管, 将大鼠右侧肺部结扎。

2.4 BALF细胞计数及分类计数

将BALF充分摇匀, 同时将0.1 mL BALF悬匀液加入到0.2 mL的白细胞计数液中, 混匀后采用计数板对白细胞计算总数, 余下的BALF则采用离心机对其进行离心处理 (转速为2 000 r/min, 时间3 min) , 同时将上清液保存在-80℃的冰箱中。对沉淀物进行染色处理, 分别对淋巴单核细胞及中性粒细胞进行计数处理。将置于冰箱中的BALF解冻处理, 并将其置入转速为10 000 r/min的离心机中离心10 min, 并取上清液测定TNFa-、O2-、MPO[2]。

2.5 统计方法

所有数据采用SPSS17.0统计软件分析, 计量资料以 (x±s) 表示, 进行t检验。

3 结果

3.1 对炎症细胞聚集影响

模型组气管内滴入脂多糖6 h后, 白细胞数量、中粒细胞及淋巴细胞数目与对照组相比显著增加。生地注射液能有效抑制白细胞及中粒细胞数的分泌, 但对淋巴细胞数目影响, 见表1。

注:与模型组相比, 药物组小鼠白细胞数量及中粒细胞数量显著低于模型组, P<0.05。

3.2 三组大鼠T N Fa-、O2-、M PO水平比较

模型组大鼠于气管内滴入脂多糖后, 大鼠TNFa-、O2-、MPO水平显著高于对照组 (P<0.05) , 药物组大鼠能有效抑制TNFa-、O2-、MPO水平, 见表2。

注:药物组在TNFa-、O2-、MPO水平显著高于模型组 (P<0.05) 。

3.3病理学分析

模型组大鼠气管内滴入脂多糖后, 其中粒细胞浸润、肺组织损伤及气管粘膜水肿评分均显著高于对照组, 生地注射液能有效抑制脂多糖诱导下的肺炎大鼠中粒细胞浸润剂气管粘膜水肿。

4 讨论

目前认为COPD的发病机理与蛋白酶、肺内慢性炎症、粘液分泌亢进以及氧离子失衡有着密切关系。COPD临床特征表现为气道、肺血管及肺实质持续性炎症有关, COPD气道炎症特征是中性粒细胞的浸润[3]。当这些炎症细胞大量聚集时便会导致TNFa-、O2-、MPO的水平增加。

生地注射液临床上对COPD患者可起到有效的作用, 能有效改善患者肺通气功能以及肺部容量, 能显著提高患者NK细胞活性剂CD4细胞的数量, 提高患者细胞免疫功能, 同时能有效改善患者血栓现状。该研究通过观察生地注射液对脂多糖诱导大鼠肺炎的影响, 从而证实生地注射液能有效对抗脂多糖诱导下的大鼠肺炎现象, 具有抑制消炎、抗氧化等作用。

参考文献

[1]刘力, 唐岚, 徐德生, 等.生地注射液对脂多糖诱导大鼠肺部炎症的影响[J].中国中药杂志, 2007, 32 (6) :526.

[2]刘力, 唐岚, 徐德生, 等.生地对大鼠肺间质成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的作用[J].中成药, 2008, 30 (2) :175.

脂多糖类 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

雌性C57BL小鼠购自武汉大学实验动物中心,动物实验受武汉市中心医院、华中科技大学附属同济医学院医学伦理委员会批准。人肝癌细胞Hep G2及人永生化正常肝细胞Hepa RG购自中科院上海细胞库,以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基常规培养于5%二氧化碳CO2,37℃培养箱中。

胎牛血清、RPMI 1640培养基购自武汉启动子生物有限公司,转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司,BRG1、GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司,促炎因子白细胞介素1(Interleukin1,IL-1)、白细胞介素6(Interleukin 6,IL-6)及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor a,TNF-a)酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物有限公司,BRG1质粒购自山东维真生物有限公司,并经测序检测,BRG1特异性si RNA(序列为5'-GGACCUGAAUGA GGAGGAA-3')及LPS购自美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型及药物诱导

将8~9周龄的C57BL雌性小鼠饲养于华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系动物中心,遵循12 h/12 h昼夜节律,自由进食饲料及饮水。按照小鼠体重给以腹腔注射LPS(2.5 mg/kg)作为实验组,给以等量生理盐水(NS)腹腔注射作为对照组,每组8只,8 h后处死小鼠,分别取肝脏组织及血清样本行相关检测。该实验得到华中科技大学同济医学院及武汉市中心医院伦理委员会的批准。

1.2.2 细胞药物处理及转染

LPS以100 ng/ml的终浓度处理Hep G2及Hepa RG细胞,等量生理盐水作为对照组,8 h后收集细胞培养基上清及细胞行相关检测。BRG1过表达质粒及特异性si RNA按照Lipofectamine 2000试剂说明书常规转染48 h后行相关检测,以空质粒及无意乱序si RNA作为实验的阴性对照组。

1.2.3 ELISA检测细胞分泌IL-1、IL-6及TNF-α

将Hep G2及Hepa RG细胞以1×106个/孔密度接种于6孔板,按照上述方法转染质粒或si RNA,常规培养48 h后,吸取细胞培养基上清,离心去固体沉淀后按照ELISA试剂盒检测其中的IL-1、IL-6及TNF-α含量,并以转染空质粒及无意乱序si RNA组作为1,计算相对的蛋白含量绘图。相同实验重复3次。

1.2.4 蛋白免疫印迹法(Western blot)实验

收集肝脏组织并匀浆,收集LPS处理后或转染处理后的Hep G2及Hepa RG细胞,加入适量RIPA裂解液(每1×106个细胞加入100μl裂解液),获取细胞总蛋白液,加入SDS上样缓冲液100℃水浴解除蛋白交联。各组蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳,PVDF膜转膜并用脱脂奶粉封闭1 h,然后依次孵育一抗4℃过夜及辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗室温1 h后化学发光法显影,检测细胞中BRG1表达情况,以GAPDH作为内参。

1.2.5 免疫组织化学法

收集LPS处理后的小鼠肝脏加入多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片,并行HE染色及BRG1的免疫组织化学染色。在普通光学显微镜下观察肝细胞变化及BRG1的阳性细胞数和染色强弱。

1.3 统计学方法

采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS对小鼠肝炎模型中BRG1表达的影响

将LPS处理后及对照组的小鼠肝脏行HE染色及免疫组织化学染色,结果提示腹腔注射LPS(2.5mg/kg)可以显著诱导小鼠肝炎发生,表现为肝细胞坏死,肝细胞核浓聚,肝小叶组织结构破坏,同时伴随ALT及AST的水平明显升高;同时观察到LPS处理后肝细胞中的BRG1表达上升,BRG1在细胞核中浓聚。同时将肝组织裂解,Western blot实验同样提示肝细胞中的BRG1的表达升高(见图1)。

A:免疫组织化学下脂多糖处理后肝组织细胞的HE染色及BRG1染色表现;B:蛋白免疫印迹法下BRG1的表达;C:经过LPS处理(2.5 mg/kg)后小鼠肝脏ALT、AST值与处理前比较

2.2 LPS对体外培养肝细胞中的BRG1表达及促炎因子释放的影响

将LPS(100 ng/ml)处理后的Hep G2及Hepa RG细胞及细胞培养基上清分别行Western blot实验和ELISA实验检测,结果提示LPS可显著促进细胞中BRG1的表达,并且升高细胞培养基上清中的IL-1、IL-6及TNF-α含量。IL-1:Hep G2+LPS vs Hep G2,(13.541±0.140)vs(1.000±0.021),P<0.05;Hepa RG+LPS vs Hepa RG,(10.010±0.242)vs(1.000±0.112),P<0.05。IL-6:Hep G2+LPSvsHep G2,(9.431±0.262)vs(1.000±0.051),P<0.05;Hepa RG+LPS vs Hepa RG,(16.321±0.502)vs(1.000±0.050),P<0.05。TNF-α:Hep G2+LPS vs Hep G2,(15.231±0.153)vs(1.000±0.071),P<0.05;Hepa RG+LPS vs Hepa RG,(7.923±0.114)vs(1.000±0.020),P<0.05(见图2和表1)。

A:蛋白免疫印迹法下经过LPS处理后BRG1的表达;B:ELISA检测下促炎因子释放水平比较

(±s)

2.3 BRG1过表达对促炎因子释放的影响

将转染BRG1过表达质粒后的Hep G2及Hepa RG的细胞培养基上清行ELISA实验检测,结果提示BRG1过表达可显著促进促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的释放。IL-1:Hep G2+BRG1 vs Hep G2,(6.881±0.154)vs(1.000±0.022),P<0.05;Hepa RG+BRG1 vs Hepa RG,(6.313±0.211)vs(1.000±0.031),P<0.05。IL-6:Hep G2+BRG1 vs Hep G2,(6.010±0.263)vs(1.000±0.020),P<0.05;Hepa RG+BRG1 vs Hepa RG,(12.161±0.493)vs(1.000±0.010),P<0.05。TNF-α:Hep G2+BRG1 vs Hep G2,(9.134±0.122)vs(1.000±0.024),P<0.05;Hepa RG+BRG1 vs Hepa RG,(7.783±0.111)vs(1.002±0.014),P<0.05(见图3和表2)。

2.4 BRG1沉默对促炎因子释放的影响

将转染BRG1特异性si RNA后的Hep G2及Hepa RG的细胞培养基上清行ELISA实验检测,结果提示BRG1沉默后可显著抑制促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的释放。IL-1:Hep G2+si BRG1 vs Hep G2,(0.161±0.030)vs(1.000±0.020),P<0.05;Hepa RG+si BRG1 vs Hepa RG,(0.163±0.014)vs(1.000±0.102),P<0.05。IL-6:Hep G2+si BRG1 vs Hep G2,(0.200±0.011)vs(1.000±0.051),P<0.05;Hepa RG+si BRG1 vs Hepa RG,(0.084±0.051)vs(1.002±0.050),P<0.05;TNF-α:Hep G2+si BRG1 vs Hep G2,(0.113±0.024)vs(1.000±0.071),P<0.05;Hepa RG+si BRG1 vs Hepa RG,(0.153±0.033)vs(1.001±0.020),P<0.05(见图4和表3)。

(±s)

(±s)

3 讨论

目前研究表明,炎症激活时,如在LPS刺激下,核因子κB(nuclear factorκB,NFκB)中的p65亚基可磷酸化进入细胞核,结合于炎症因子的启动子区域。而且BRG1自身也可与NFκB中的p65亚基相结合,那么是否BRG1也是通过类似的募集过程,参与炎症反应的动力学过程调控[5,6]。本研究提示LPS刺激下BRG1的表达水平在体内肝脏组织中及体外肝细胞中都有明显的升高,尤其在体内实验中发现,在LPS激活炎症的过程中,BRG1在细胞核中发生浓聚效应,有可能通过募集于促炎因子的核小体附近,重塑其染色质结构,增加细胞中IL-1、IL-6及TNF-α的释放。

BRG1是SWI/SNF复合体中的关键催化亚基,它通过对ATP水解为整个复合体供能使染色体结构发生改变,进而导致基因序列上启动子结合位点暴露、易化转移因子等转录调控蛋白的结合,从而参与调控目的基因的表达[7]。SWI/SNF催化亚基的降解,抑制其活性染色质重塑。现已有文献报导,BRG1在心肌发育、神经系统发育过程中有十分重要的作用,相关数据提示,抑制BRG1的表达将导致心肌发育以及中枢神经系发育障碍[8,9,10]。本研究发现,抑制细胞中BRG1的表达,能够显著下调促炎因子的分泌,而过表达BRG1相反可以促进IL-1、IL-6及TNF-α的分泌,这提示BRG1在LPS诱导的急性炎症过程中可能扮演着重要的角色。

综上所述,本研究发现,LPS诱导的小鼠急性肝炎中,BRG1的蛋白表达水平显著上升,并在细胞核中浓聚。而LPS作用于体外培养的肝细胞,也可明显促进细胞中BRG1的表达。同时肝脏细胞中过表达BRG1,可促进促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的释放。相对应的,BRG1沉默后可显著抑制肝细胞促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的释放。这提示BRG1在LPS诱导的急性炎症过程中可能扮演着重要的角色,干预其表达有望作为治疗急性炎症的潜在药物靶点。

参考文献

[1]AGALIOTI T,LOMVARDAS S,PAREKH B,et al.Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-beta promoter[J].Cell,2000,103(4):667-678.

[2]CHEN D,FANG F,YANG Y,et al.Brahma-related gene 1(Brg1)epigenetically regulates CAM activation during hypoxic pulmonary hypertension[J].Cardiovasc Res,2013,100(3):363-373.

[3]FANG F,CHEN D,YU L,et al.Proinflammatory stimuli engage Brahma related gene 1 and Brahma in endothelial injury[J].Circ Res,2013,113(8):986-996.

[4]CHAIYACHATI B H,JANI A,WAN Y,et al.BRG1-mediated immune tolerance:facilitation of Treg activation and partial independence of chromatin remodelling[J].EMBO J,2013,32(3):395-408.

[5]KAWAHARA T L,MICHISHITA E,ADLER A S,et al.SIRT6links histone H3 lysine 9 deacetylation to NF-kappa B-depen dent gene expression and organismal life span[J].Cell,2009,136(1):62-74.

[6]NATOLI G,CHIOCCA S.Nuclear ubiquitin ligases,NF-kappa B degradation,and the control of inflammation[J].Sci Signal,2008,1(1):1.

[7]WILSON B G,ROBERTS C W M.SWI/SNF nucleosome remodellers and cancer[J].Nature Reviews Cancer,2011,11(7):481-492.

[8]HANG C T,YANG J,HAN P,et al.Chromatin regulation by Brg1 underlies heart muscle development and disease[J].Nature,2010,466(7302):62-67.

[9]WEIDER M,K譈SPERT M,BISCHOF M,et al.Chromatin-remodeling factor Brg1 is required for schwann cell differentiation and myelination[J].Developmental Cell,2012,23(1):193-201.

脂多糖类 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级雌性健康BALB/c小鼠24只, 6周龄, 体重1 6~18g, 购自武汉生物制品研究所, 许可证号:SCXK (鄂) 2008-0003。

1.1.2 主要试剂及仪器

氢氧化铝 (天津双船化学试剂) ;脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS, 美国Sigma公司) ;卵清蛋白 (Albumin, Chicken Egg, OVA, 美国Sigma公司) ;抗类蛋白酶抗体 (北京博奥生物技术有限公司提供) ;p38MAPK抗体 (美国Epitomics公司) ;JSC-A型超声雾化器 (由辽宁鞍山市电子医疗仪器厂提供) ;Ultra Sensitive TM S-P超敏试剂盒 (福州迈新生物技术开发公司) ;图像采集系统 (咸宁学院中心实验室) 及Image-Pro Plus 6.0图像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组与动物模型的制备[5]

湖北科技学院中心实验室动物中心饲养1周后, BABL/c小鼠随机分为3组, A (哮喘组) 、B (0.1mg LPS+OVA组) 、C (对照组) , 每组8只。A、B两组小鼠均在第0, 7, 14天腹腔注射0.2ml OVA混悬液 (含OVA400mg+氢氧化铝20mg) 致敏, 第21天开始每天用1%OVA溶液雾化激发一次, 每次30分钟, 连续雾化激化5天。C组给予同等量生理盐水致敏和激发。B组小鼠在致敏阶段每隔2天腹腔注射1ml含0.1mg的LPS, 在激发阶段激发前1小时经腹腔注射相同剂量的LPS[6], A、C组给予等量生理盐水腹腔注射。末次激发24小时后, 处死小鼠并取右肺中叶以10%多聚甲醛固定24小时, 再进行常规的石蜡包埋、切片。

1.2.2 肺组织病理变化

石蜡切片HE染色, 每个组织块选取3张HE切片想在显微镜下观察肺组织病理变化。

1.2.3 肺组织Tryptase与p38MAPK免疫组化染色

采用SP法行肺组织Tryptase与p38MAPK免疫组化染色[4]。首先把肺组织切片行脱蜡、水化、抗原修复处理, 再严格按照Ultra Sensitive TM S-P超敏试剂盒说明书操作, 滴加内源性过氧化酶阻断剂, 室温下10分钟, 以阻断内源性过氧化酶的活性。滴加动物非免疫血清 (试剂B) , 室温下10分钟。分别滴加一抗 (p38MAPK或抗类胰蛋白酶抗体) , 4℃下过夜, 然后滴加二抗 (生物素标记的羊抗鼠/兔Ig G) , 室温下10分钟, 滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶 (试剂D) , 在室温下10分钟后, 用DAB溶液染色、苏木素复染返蓝, 经梯度酒精脱水干燥后, 二甲苯透明, 中性塑胶封固, 在显微镜下观察下所有切片, 每张切片随机化选取阳性 (呈棕色) 表达最强的5个高倍视野 (×400) , 应用图像分析软件 (即Imager-Pro Plus6.0) 测定每个视野内阳性部位的光密度值 (Optical Density, OD) , 求出每张切片的平均光密度值 (mean optical density, MOD) , 并以MOD值来表示阳性部位的蛋白表达水平。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS17.0进行分析, 以 (±s) 表示, 各组间差异采用方差分析, 多重组间比较时方差不齐者采用Dunnett's T3检验, 方差齐者采用S-N-K、LSD检验, 组间比较采用q检验, P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织HE染色

A组支气管黏膜下水肿, 管壁平滑肌肥大, 基底膜增厚, 黏膜皱襞增多, 气道、血管周围间质可见大量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。B组上述情况未减轻, 并出现肺泡腔及间质充血。C组气道周围无炎症细胞浸润, 肺泡壁结构完整 (见图1) 。

2.2 各组小鼠肺组织免疫组化染色结果

A、B、C三组小鼠肺组织类胰蛋白酶及p38MAPK阳性细胞MOD值见表1。B组小鼠肺组织中类胰蛋白酶及p38MAPK阳性细胞较A、C组多, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 主要见于血管及支气管周围、肺间质等部位。C组小鼠肺组织阳性表达较少, 仅少量表达在肺泡间隔。

图1各组小鼠肺组织病理学变化 (HE, ×400) A:哮喘组;B:0.1mg LPS+OVA组;C:对照组

与对照组比较, *P<0.005;与哮喘组比较, #P<0.005

3 讨论

肥大细胞与哮喘密切相关[7], 其分布在许多组织, 具有释放多种炎性介质和细胞因子的功能, 是Ⅰ型变态反应的初级效应细胞。在抗原等致病因素作用下肥大细胞被激活, 释放多种炎症介质和细胞因子而参与哮喘早期和晚期的整个病理生理过程。类胰蛋白酶是肥大细胞内特有的蛋白酶, 是肥大细胞内含量最丰富物质, 是肥大细胞脱颗粒的最优选指标[8], 具有增高气道对组胺的反应性、促进炎症细胞 (中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等) 聚集及刺激平滑肌细胞和成纤维细胞增殖的作用[3,9], 在哮喘炎症的发生、发展和气道重建中起到促进作用。He等研究表明, 类胰蛋白酶可促进中性粒细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞等多种炎症细胞的活化及浸润[10]。Molinari等研究表明, 在给致敏绵羊吸入类胰蛋白酶后, 发现能够明显增强其气管收缩和气道高反应性[11];Brown等则发现类胰蛋白酶能够促进成纤维细胞的增殖与平滑肌细胞的增生[12];本实验发现C组Tryptase阳性表达较少, 主要分布在肺泡间隔, 而哮喘组小鼠肺组织Tryptase阳性表达显著高于C组小鼠, 主要分布在血管及支气管周围、肺间质等部位, 表明哮喘小鼠气道存在肥大细胞脱颗粒过程。

临床实践证实, 细菌感染是微生物暴露和哮喘急性发作的常见原因。LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁成分, 细菌裂解后释放, 在周围环境普遍存在, 吸入脂多糖后, 可引起哮喘的发生和恶化, 但LPS跨膜信号转导途径至今尚不清楚[13]。Candrian SS等研究发现LPS引起支气管收缩与中性粒细胞募集可通过p38MAPK介导[14]。P38蛋白激酶是MAPK家族最重要的成员之一, 该激酶可被LPS、G+细菌壁成分、应激刺激等所激活, 激活的P38蛋白激酶可由细胞浆向细胞核转位。肥大细胞是气道炎症的主要原发效应细胞, 有研究表明抑制p38 MAPK可以抑制肥大细胞的向抗原方向的定向迁移, 还可以对哮喘小鼠肺组织肥大细胞募集和活化有一定的抑制作用[5]。本实验观察到, B组哮喘小鼠肺组织类胰蛋白酶和p38MAPK表达表达水平明显增高, 此外与A组相比, B组小鼠肺组织病理变化加重。以上提示LPS可明显加重哮喘气道炎症, 部分机制可能是通过影响肥大细胞活化及p38MAPK信号通路实现的。

摘要：目的:探讨脂多糖 (LPS) 对哮喘小鼠肥大细胞活化及p38蛋白激酶 (p38MAPK) 表达的影响。方法:将24只BALB/c小鼠随机分为3组:A (哮喘组) 、B (0.1mg LPS+OVA组) 、C (对照组) , 每组8只, 采用免疫佐剂 (氢氧化铝) 与卵清蛋白 (OVA) 腹腔注射致敏及用1%OVA生理盐水雾化激发的方法制备哮喘小鼠模型。采用免疫组织化学染色SP法半定量测定肺组织中类胰蛋白酶及p38MAPK表达的情况, HE染色观察肺组织病理变化。结果:与A组相比, B组小鼠肺组织类胰蛋白酶及p38MAPK的MOD显著升高 (P<0.05) ;光镜下, A组支气管黏膜下水肿, 管壁平滑肌肥大, 基底膜增厚, 黏膜皱襞增多, 气道、血管周围间质可见大量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。B组上述情况未减轻, 并出现肺泡腔及间质充血。C组气道周围无炎症细胞浸润, 肺泡壁结构完整。结论:LPS可明显加重哮喘气道炎症, 表明部分机制可能是通过影响肥大细胞活化及p38MAPK信号通路实现的。