桦褐孔菌多糖

桦褐孔菌多糖（精选4篇）

桦褐孔菌多糖 篇1

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属多孔菌科(Polyporaceae)、褐卧孔菌属(Inonotus),是十分珍贵的药用真菌[1]。桦褐孔菌主要分布于寒冷的俄罗斯、北欧、波兰、日本北海道等地,中国黑龙江大小兴安岭和吉林长白山地区[2]。早在16~17世纪,俄罗斯、波兰、芬兰等民间就将桦褐孔菌做保健功能性食品利用[3,4,5]。桦褐孔菌的药效已被证明具有治疗各种消化系统癌症、心脏病、糖尿病[6,7],具有抗衰老和抑制HIV-1病毒的作用[8],已引起美国、日本、韩国等国研究者的广泛重视[9,10]。我国对桦褐孔菌活性成分研究目前已报道的有:桦褐孔菌素,桦褐孔菌醇和多种氧化三萜类化合物,多种羊毛甾醇型三萜类化合物等,但研究应用较多的为桦褐孔菌多糖成分。桦褐孔菌多糖是中药多糖的一种,无毒副作用,可预防和治疗多种疾病,具有抗肿瘤、降血糖、增强免疫力、防治病毒性传染病的功效,多糖的研究已经引起国内外广大药物研究开发者的重视[11,12,13]。多糖提取的方法很多,本研究对影响桦褐孔菌子实体水溶胞内多糖提取效果的各个因素进行了研究,单因素法筛选对多糖提取影响大的因子,正交试验优化提取条件,目的是建立一套能最大限度地提取桦褐孔菌胞内多糖的可行性工艺,研究结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

野生桦褐孔菌野生子实体采自吉林省长白山地区。

1.1.2 试剂

乙醇、氯仿、异戊醇、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、硫酸,以上试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 原材料的前期处理

野生桦褐孔菌子实体烘干粉碎,过120目筛,于60℃烘箱至恒重,作为实验原材料。

1.2.2 单因素试验

在其它浸提条件一致的情况下,分别选择不同时间(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h)、不同温度(60、70、80、90、100℃)、不同料水比(1:20、1:30、1:40、1:50、1:60)、不同提取次数(1次、2次、3次)、不同醇沉浓度(60%、70%、80%、90%)和不同醇沉温度(4、25℃)进行胞内多糖提取,并测定多糖收率。

1.2.3 提取方法

精确称取桦褐孔菌菌粉lg,根据实验要求加入1:40体积料水比的蒸馏水,于100℃温度下煮2.0h,提取2次,合并提取液,4℃、10 000 r/min离心15min,取上清,水浴蒸发浓缩至原体积的1/3,加终浓度为80%的无水乙醇,4℃静置12 h,10 000r/min离心15min,收集沉淀,60℃烘干至恒重,即得粗多糖。

1.2.4 还原糖含量测定

以葡萄糖为标准品,还原糖含量用DNS法测定。

1.2.5 多糖含量测定

总糖含量测定采用苯酚-硫酸法。

多糖含量=总糖含量-还原糖含量。

1.2.6 粗多糖提取率和多糖收率的计算

提取率(mg/g)=提取粗多糖(mg)/提取物干重(g);

多糖收率 (%)=多糖含量 (%)×多糖提取率。

1.2.7 热水浸提法正交试验设计

以桦褐孔菌多糖收率为指标,选用L9(33)正交表,以浸提温度、浸提时间、料水比为基本因素,设计正交试验,因素水平见表1。

1.2.8 数据统计分析

DPS v7.05统计软件进行Duncan新复极差方差分析与显著性测验。

2 结果与分析

2.1 温度对胞内多糖收率、提取率的影响

温度对提取的效果影响很大,结果见图1。随着温度的升高胞内多糖的提取率和多糖收率快速升高。当温度达80℃时其粗多糖提取率最大,为127mg/g,较60℃时提高了73.50%,多糖收率也达2.32%。温度超过80℃以上时,胞内多糖的提取率和收率平缓下降。

2.2 时间对胞内多糖收率、提取率的影响

时间对胞内多糖提取效果的影响见图2,粗多糖提取率随提取时间的延长逐渐升高。2.5h多糖收率达到最高,为2.09%。2.5h以上时,胞内多糖的收率下降并趋于平稳,而多糖提取率升高也趋缓。

2.3 料水比对胞内多糖收率、提取率的影响

料水比对提取效果的影响见图3,当料水比从1:20增加至1:40时,胞内多糖提取率、多糖收率达到最高水平,再增加料水比,多糖提取率和收率反而有所下降,尤其是多糖的收率下降较显著。

2.4 醇沉浓度对多糖收率、提取率的影响

不同乙醇浓度沉淀提取多糖结果见图4,随着混合液醇浓度的增加多糖提取率、收率也随之增加,醇浓度达80%时,胞内多糖提取率和多糖收率达到最高,再增加乙醇浓度多糖收率、提取率呈下降趋势。

2.5 提取次数对胞内多糖提取率的影响

从表2可知,前两次胞内多糖提取率较大,占总提取量的98.77%,第3次的提取率很低,因此,2次提取为适宜的提取次数。

2.6 醇沉温度对多糖提取率的影响

表3比较了25℃和4℃乙醇沉淀多糖的效果。在4℃条件下醇沉效果明显好于25℃,4℃乙醇沉淀提取率较25℃时提高了近20%。

2.7 桦褐孔菌胞内多糖收率的正交试验

实验结果见表4,处理5多糖收率最高达2.53%。各处理差异显著性分析表明,5%水平除1、3处理外,各处理差异较显著。1%处理5、6、8、9较其他处理差异极显著。

方差分析结果见表5,料水比 、提取温度对不同桦褐孔菌菌丝多糖提取率在1%、5%水平有极显著影响,提取时间在5%水平有显著影响。

正交实验的极差分析可知(表5),各因素对胞内多糖提取率影响的顺序为:A>B>C,影响最大的是A料水比,最小的是C提取时间。表6可知,胞内多糖提取条件的最优组合为A2B2C1,即料水比为1:40,温度80℃,提取时间1.5 h。

注:F0.05(2,18)=3.55,F0.01(2,18)=6.01;*表示P<0.05,**表示P<0.01。

3 讨论

桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌含有的重要生物活性物质,具有清除自由基和免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等活性。桦褐孔菌多糖的提取、纯化、分离的研究就显得尤为重要。近年来开展的研究较多,方法多样[14,15],但研究较多的方法目前以热水浸提法最为常见。本研究采用热水浸提法,就影响水提多糖的若干因素进行单因素和正交优化实验。浸提过程中料水比影响最大,其次是温度和浸提时间。本研究选择了料水比为1:40,此时胞内多糖提取率、多糖收率达到最大,再增加料水比对多糖提取无提高,同时也增加了浓缩体积的困难。温度对提取效果影响也很大,80℃时多糖提取率、收率都达到较高水平,此温度即可节省能源,又对浸提设备要求不高,可满足实际操作的大规模生产需求。提取时间是影响胞内多糖提取效果的另一重要因素,时间太短,多糖不能完全提取出来。2.5h提取的多糖提取率、收率最高,但提取时间太长,能耗大、效率低。研究通过优化正交组合有效地克服了此项不足,采用1.5h的复合条件就实现较高的多糖收率。

同时对影响较大的3个因子进行了L9(33)正交试验,对桦褐孔菌水提多糖的提取条件进行复合筛选,初步优化了桦褐孔菌子实体多糖的提取工艺,确定了提取多糖的最佳提取条件,使水溶性多糖收率高达2.53%,同时比常规提取法缩短了提取时间,降低了提取温度,提高了提取效率。

本研究优化了多糖的提取条件,为进一步大规模生产提供技术参数。但有关桦褐孔菌多糖的纯化、结构、组分、生物活性的研究还有待进一步开展。

桦褐孔菌多糖 篇2

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

桦褐孔菌子实体, 干燥、粉碎备用。SOD、MDA、CK、BUN和LDH试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 其余试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物

清洁级雄性昆明种小鼠, 体重20~22g, 在室温25℃、湿度50%条件下适应性饲养, 饲养方式采用立体笼式饲养, 给予标准饲料, 自由饮水。

2 实验方法

2.1 精致多糖的制备

取桦褐孔菌干燥子实体的粗粉, 用95%乙醇回流提取, 提取液减压回收溶剂, 得乙醇提取物。加水煎煮提取, 所得水提取液浓缩加乙醇至含醇量达80%, 静置、抽滤, 得粗多糖, 反复醇沉后, 沉淀用丙酮洗涤3次, 抽滤, 得精制多糖 (PS) 。

2.2 自由基清除率的测定

2.2.1 样品制备

称取10mg PS, 溶解于1mL无水乙醇中, 浓度为10mg mL。依次稀释为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg mL、0.0625mg/mL、0.0313mg/mL。

2.2.2 自由基清除率的测定

采用DPPH分析法评价抗氧化活性。517nm处测定吸光度。分别取50μLPS乙醇溶液于96well中, 每样4孔, 再分别加入200μLDPPH的乙醇溶液 (DPPH浓度为1.2×10-5mol L) , 混合均匀, 放置30min, 用酶标仪在517nm处测定其吸光度Ai。同时测200μL DPPH溶液+50μL乙醇混合后的吸光度A0和50μL样品液+200μL乙醇混合后的吸光度Aj, 按下式计算自由基清除率:

2.3 动物实验

将小鼠随机分为对照组、模型对照组、PS-L、PS-M、PS-H5组。后3组每天分别给予PS (100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg) , 剂量选择根据人体推荐剂量的10倍、20倍和30倍, 确定低中高3组剂量。对照组和模型对照组每天给予等剂量赋形剂。对照组不进行游泳训练, 模型对照组及PS给药组连续进行游泳训练10d, 每天30min, 第11天, 5组小鼠均进行1次尾部负荷体重5%的力竭性游泳, 最后下沉经10s后不能返回水面为力竭。力竭游泳结束后, 即刻进行颈动脉、肝脏采血, 分离血清, 测定血清CK、BUN、LDH含量, 测定肝脏SOD、MDA含量, 所有测定皆按试剂说明进行。

2.4 数据处理

采用Graphpad Prism软件, 测定值用x軃±s表示, 用“One-way ANOVA and Turkey’s multiple comparison tests”进行多组数据间对比。

3 结果

3.1 自由基清除率测定

测定不同浓度PS对DPPH自由基的清除率, PS随着浓度增加, 自由基清除率逐渐增高, 表明其清除能力与浓度有一定的量效关系, 但当PS增加到0.5mg/mL时, 清除率基本不变。结果如表1所示。

3.2 力竭游泳后各项指标

与对照组相比, 模型对照组小鼠游泳后, 抗氧化能力降低, 丙二醛、血清乳酸脱氢酶、尿素氮和肌酸激酶水平升高, 差异均有显著性意义 (P<0.05) 。与模型对照组相比, PS给药组小鼠抗氧化能力有所回升, 丙二醛、血清乳酸脱氢酶、尿素氮和肌酸激酶水平有所下降, 其中PS-M和PS-H给药组 (200mg/kg和300mg/kg) 5项指标改变与模型对照组比较具有显著性差异 (P<0.05) , 如表2所示。

注:与对照组进行比较, #P<0.05;与模型对照组进行比较, *P<0.05。

4 讨论

目前有关抗氧化疲劳中药提取物的研究, 尤其是关于桦褐孔菌的研究在国内外尚未有报道, 对其与血糖、血乳酸、血尿素氮、总抗氧化力变化关系的研究也非常少。运动耐力的提高是抗疲劳宏观表现, 力竭游泳实验可以用于反映动物运动疲劳程度, 通过对游泳后小鼠相关血清指标的测定可以反映桦褐孔菌多糖抗小鼠运动疲劳的能力。研究表明桦褐孔菌多糖具有良好的清除自由基能力, 且随着浓度增加自由基清除率逐渐增高, 一定浓度后清除率基本不变。机体不正常的代谢骤然产生大量的氧自由基, 当氧自由基的数量超过体内抗氧化防御能力时, 必然导致运动性疲劳[2]。SOD、MDA、CK、BUN和LDH是体内蛋白质代谢相关产物, 是评价运动性疲劳强度的重要指标。本实验表明桦褐孔菌多糖能显著降低小鼠运动后MDA、CK、BUN和LDH含量, 升高SOD, 提高运动耐力, 具有良好的抗疲劳作用。

参考文献

[1]戴芳澜.中国真菌总汇[M].北京:科学出版社, 1979.

桦褐孔菌多糖 篇3

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组:

Wista大鼠6 0只, 体重1 6 0-1 8 0 g, 雌雄各半, 由佳木斯大学动物中心提供。随机抽取40只制备模型, 其余20只作为正常对照。

1.2 药物与试剂:

1.2.1 药物2、4、6-三硝基苯磺酸 (TNBS) :Sigma公司;桦褐孔菌多糖:由佳木斯大学药学院提供;5-氨基水杨酸:安徽联谊药业股份有限公司。

1.2.2 试剂IL-6、IL-10:上海沪洋生物。

1.3 方法:

1.3.1 溃疡性结肠炎大鼠模型制备

40只大鼠麻醉后灌肠, 灌肠深度约入直肠8cm处, 灌入TNBS原液100m L/kg和50%乙醇0.25m L, 另20只大鼠同体位, 等量的生理盐水灌肠做阴性对照。造模14d后, 取10只模型和10只阴性对照大鼠猝死, 取回盲部做病理验证模型成功。造模成功后将剩余30只模型组大鼠随机分成阴性对照组、阳性对照组 (即5-氨基水杨酸治疗组) 、桦褐孔菌治疗组, 每组10只;另10只阴性对照大鼠做正常对照组。

1.3.2 桦褐孔菌治疗及指标检测

阳性对照组5-氨基水杨酸2m L/次灌胃, 2次/日;桦褐孔菌组桦褐孔菌2m L灌胃治疗, 2次/日;阴性对照组生理盐水2m L/次灌胃, 2次/日;正常对照组生理盐水2m L灌胃治疗, 2次/日。治疗14d后, 大鼠内眦静脉采血, 血清学检测细胞因子IL-6、IL-10。

1.3.3 统计学方法

所有数据以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析, 统计结果显著性以P<0.05表示。

2 结果

细胞因子IL-6和IL-10水平变化:阴性对照组IL-6含量明显高于正常对照组、桦褐孔菌组、正常对照组 (P<0.05) ;阴性对照组IL-10含量明显低于正常对照组、桦褐孔菌组、阳性对照组 (P<0.05) 。见表1

注:*与正常对照组相比P<0.05, **与阴性对照组相比P<0.05

3 讨论

IL-6是由单核巨细胞产生的具有多种免疫学活性的细胞因子, 是参与UC的重要的炎症介质, UC患者血清中IL-6水平明显, 且其增高水平与病变范围和严重程度呈正相关。本实验中, 模型组大鼠血清IL-6的含量明显升高, 与报道一致。经桦褐孔菌治疗后, 大鼠血清中IL-6的含量明显降低, 能够证明桦褐孔菌能降低IL-6在血清中的含量, 减轻IL-6对肠粘膜的损伤作用, 使大鼠粘液血便的症状减轻。IL-10是具有抗炎性和提高免疫调节作用的细胞因子, IL-10可通过抑制嗜酸粒细胞表达而达到抗过敏作用, 也可通过抑制某些集落因子的合成达到抗炎的作用。在UC大鼠的血清中, IL-10的含量明显降低, 其抗炎、免疫的保护作用减弱。经桦褐孔菌治疗后, 其含量显著升高, 表明桦褐孔菌能有效的提高IL-10的含量, IL-10水平升高使其对肠粘膜保护作用增强, 因而减轻了毒素等其他有害物质对肠粘膜的损害, 使得症状好转。实验说明桦褐孔菌能够通过改变细胞因子的水平而调节其间的失衡状态而达到治疗作用。

参考文献

[1]陈义勇, 顾小红, 汤坚.桦褐孔菌多糖的抗肿瘤活性研究。食品与生物技术学报[J], 2011, 30 (1) :65-69.

[2]Jarosz A, Skorska M, Rzymow ska, etal.Effect of the extracts from fungus Inonotus obliquus on catalase level in Hela and Nocardia cells[J].Acta Biochem Polon, 1990, 37 (1) :149-152.

[3]Mizuno T, Zhuang C, Abe K, etal.Antiumor and hypoglycemic activities of polysaccharides from the scleritia and mycelia of Inonotus obliquus[J].Int J Med Mushrooms, 1999, 1 (4) :301-316.

[4]Babitskaia VG, Shcherba VV, Iknonikova NV, Melanin complex of the fungus Inontus[J].PriklBiokhim Microbiol, 2000, 36 (4) :439.

[5]王佐, 吴正祥, 杨九华, 杨枫, 吴强.IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β1和Foxp3在实验性结肠炎中的表达。胃肠病学和肝病学杂志[J], 2010, 19 (2) :141-144.

桦褐孔菌多糖 篇4

1 实验

1.1 原料、试剂及仪器

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)子实体(杭州百山祖生物科技有限公司);95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯,α-D-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、阿卡波糖(Acarbose)均为杭州普修生物科技有限公司。

主要实验仪器:RE-52AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;FZ102微型植物粉碎机,天津泰斯特仪器有限公司;UV-1100紫外分光光度计,上海市美谱达仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桦褐孔菌子实体的分步提取

1.2.1. 1 工艺流程见图1。

1.2.1. 2 原料制备

将桦褐孔菌子实体切成小块后用粉碎机粉碎,过60目筛,60℃热风干燥至恒重,备用。

1.2.1. 3 主要操作步骤

(1)取3.5 kg粗粉,加入8.5 kg 95%乙醇浸没,浸泡168 h,每天定时进行搅拌混匀。

(2)取适量上清液,三层纱布过滤,再抽滤,然后将滤液旋蒸至剩余少量;加石油醚萃取,得到有机相和水相,有机相旋蒸得到石油醚提取物;同理,在水相中用乙酸乙酯、正丁醇依次分步旋蒸萃取,最终上清液提取可得到石油醚提取物,乙酸乙酯提取物,正丁醇提取物。

(3)取适量滤渣,乙醇蒸发晾干至无味,加入蒸馏水没过滤渣进行煮沸。待水沸腾后计时2 h,结束后用纱布过滤,再抽滤。最后进行蒸发浓缩,即可得到粗多糖部分。

1.2.2 分步提取物降血糖活性研究

体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定

(1)配制p H为6.8的磷酸缓冲液磷酸缓冲液;

(2)PNPG溶液:准确称取PNPG粉末0.15 g,用磷酸缓冲液溶解,并定容至100 m L,得到浓度为5 mmol/L的标准底物溶液;

(3)α-葡萄糖苷酶溶液:用磷酸缓冲液将α-葡萄糖苷酶配置成1 U/m L的酶液。

(4)Na2CO3溶液的配置:准确称取Na2CO3粉末21.2 g,用蒸馏水定容至1000 m L,配置成0.2 mol/L的Na2CO3溶液,用于终止反应。

(5)配置一定浓度梯度的桦褐孔菌提取物溶液备用,如表1所示。

(6)取400μL提取物溶液于试管中,加入α-葡萄糖苷酶液20μL,于37℃条件下保温10 min,再加入PNPG溶液200μL启动反应,继续于37℃条件下保温30 min后加入4 m L Na2CO3终止酶反应过程。利用紫外分光光度计于405 nm处测定吸光值,以蒸馏水作为参比溶液,每组试验平行测定三次。样品吸光值记为A1;以磷酸缓冲液代替多糖溶液作为空白对照,测定吸光值记为A0;以磷酸缓冲液代替PNPG溶液,测定多糖溶液的本底吸光值,记为A2。

体外α-葡萄糖苷酶活性抑制率公式:抑制率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

2 结果与讨论

本实验的原理为α-葡萄糖苷酶能够作用于4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖(PNPG),并将其分解为对硝基酚(PNP)和葡萄糖(G)。PNP为黄绿色物质,并且在405 nm处有最大吸收峰,α-葡萄糖苷酶抑制剂能够抑制酶的活性,抑制剂存在时,分解PNPG产生PNP的量就会减少,并且随着抑制剂浓度增加,PNP的量会减少,继而测得的吸光值也会减小。所以,在一定时间内,可以通过测定PNP的含量变化,来计算抑制剂样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

利用不同有机溶剂和水对桦褐孔菌子实体粗粉进行提取,最终得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物和粗多糖部分。四种提取物及阿卡波糖进行体外α-葡萄糖苷酶活性测定,实验结果如下:

2.1 不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由图2~图5可得:石油醚提取物的IC50约为1.0 mg/m L;乙酸乙酯提取物的IC50约为0.6 mg/m L;正丁醇提取物的IC50约为0.98 mg/m L;粗多糖的IC50约为0.15 mg/m L。从图2~图5中可以看出,四种提取物的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的效果与浓度具有一定的相关性。在相同浓度下,各提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率为:粗多糖部分>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>石油醚提取物。综上,由实验结果可得,桦褐孔菌子实体提取物具有良好的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2.2 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果

阿卡波糖降血糖的作用机制为可在肠道内竞争性抑制葡萄糖苷水解酶的活性,进而能够减缓进餐后体内糖的吸收速度,降低饭后血糖的浓度,可在一定程度上治疗胰岛素依赖型或非依赖型糖尿病。

以阿卡波糖作为阳性对照,分别测定一定浓度阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率,结果见图6。由图6可得:阿卡波糖的IC50约为20 mg/m L。

结果表明四种不同溶剂提取物的IC50值都比阿卡波糖的IC50值低,说明四种不同溶剂提取物均具有良好的α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并且桦褐孔菌多糖部分相比其他部分对α-葡萄糖苷酶有更强的抑制效果。

3 结语

本实验中所涉及的粗多糖均未经分离纯化,因此各提取物虽均表现出降糖活性,但并不能明确说明是何种成分在起作用。因此在后续研究中,可以对粗多糖中各成分分别纯化并鉴定其结构以判断桦褐孔菌降糖药物的构效关系。其次,目前的工作仅限于体外活性实验,因此可以对经分离纯化的桦褐孔菌粗多糖进行动物活体实验,筛选出活性更明确的单体成分并进行结构鉴定。

参考文献

[1]钟秀宏,孙艳美,郑楷,等.桦褐孔菌多糖药理活性研究进展[J].上海中医药杂志,2016(01):94-97.

[2]姚雪松,弥春霞.药用真菌桦褐孔菌的研究进展[J].吉林农业,2016(01):80.

[3]顾今,杨开,叶帮伟,等.食(药)用菌抗糖尿病研究进展[J].中国食用菌,2010(01):7-10.

[4]高愿军,张家泉,王娟娟,等.桦褐孔菌多糖口服液降血糖作用研究[J].食品科技,2010(07):93-95+99.