多糖免疫机制研究进展

2024-07-15

多糖免疫机制研究进展（共6篇）

多糖免疫机制研究进展篇1

中草药多糖的免疫调节机制及其应用

在畜牧业的长期生产中,抗生素等药物的普遍使用产生的抗药性、药物残留,危害人类健康,破坏生态环境,使人们开始积极探寻能取代抗生素的.成分.中草药多糖是普遍存在于自然界植物、动物及微生物组织中的醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起组成的天然高分子化合物.

作者：张继东王志祥 Zhang Jidong Wang Zhixiang 作者单位：河南农业大学牧医工程学院刊名：饲料工业 ISTIC PKU英文刊名：FEED INDUSTRY年，卷(期)：27(6)分类号：S8关键词：

多糖免疫机制研究进展篇2

1 材料和方法

1.1 物药品及试剂

4月龄昆明种小鼠50只,雌雄性各半分笼饲养,由本院动物中心提供。丙二醛(MDA)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子(TNF-a)一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)购自南京建成生物工程研究所;云芝多糖(CVP)购自神华药业有限公司;脂多糖(LPS)美国Sigma公司产品;卡介苗(BCG),上海生物制品研究所。其余为国产分析纯生化试剂。

1.2 仪器设备

ZS83-1型内切式组织匀浆机(浙西机械厂),722S型分光光度计(上海第二光学仪器厂),酶标仪(热电上海仪器公司),RA-50半自动生化分析仪(美国Technicon公司)

1.3 方法

50只小鼠随机分为5组,每组10只,分空白对照组;病理模型组;云芝多糖保护组分高、中、低3组。造模第1天,除正常对照组外,其余各组小鼠经尾静脉注射2.5 mg BCG;云芝多糖低、中、高保护组每天分别按体重(100、200和300 mg/kg)云芝多糖灌胃1次,对照组和模型组用生理盐水同样处理,第12天用云芝多糖灌胃给药2 h后,模型组和云芝多糖各保护组从尾静脉注射7.5μg/只LPS。末次给药禁食不禁水16 h后,称取小鼠体重,眼球取血分离血清,测定ALT和AST。然后处死小鼠立即取出肝脏、胸腺称重,计算肝体指数(肝重/体重)、胸腺指数(胸腺重/体重×100%);肝脏称重剪碎,用冰PBS按1∶10稀释冰浴下匀浆,4 000 r/min离心5 min,取上清液用双缩脲法测肝匀浆中蛋白质含量,用PBS稀释成4 mg/m L蛋白,按试剂盒要求检测肝匀浆中MDA、GSH、NO和TNF-α的含量和SOD、GSH-Px和NOS的活性。

1.4 数据处理

所有数据以均数±标准差(±s)表示,应用SPSS11.0 for windows统计学软件进行分析。多个实验组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVN),两两比较采用q检验。取α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 云芝多糖对免疫性肝损伤小鼠肝体指数和胸腺指数的影响

免疫性肝损伤模型组肝体指数、胸腺指数,与空白对照组和CVP各保护组比较,肝损伤模型组各脏器指数存在明显差异,说明建立模型是成功的。CVP各保护组可降低免疫性肝损伤小鼠肝体指数和胸腺指数,与模型组比较(P<0.05)。结果见表1。

2.2 云芝多糖对免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性和肝脏MDA含量的影响

免疫性肝损伤模型组小鼠血清ALT和AST活性和MDA的含量显著升高,与对照组比较(P<0.01),说明制备免疫性肝损伤模型是成功的。ALT和AST是分别反应肝细胞膜损伤和线粒体膜损伤的重要指标,CVP各保护组可降低小鼠血清中ALT和AST的活性,但保护作用与CVP浓度有关,与模型组比较(P<0.05)。CVP保护组MDA明显降低,与模型组比较(P<0.01)。结果见表2。

注:1)与模型组比较,P<0.05;2)与模型组比较,P<0.01

2.3 云芝多糖对免疫性肝损伤小鼠SOD、GSH-Px活性及GSH含量的影响

免疫性肝损伤病理模型组SOD活性与空白对照组比较明显降低(P<0.05),与CVP各保护组比较无明显差异;CVP各保护组可提高GSH-Px活性,与病理模型组比较(P<0.01);免疫性肝损伤模型组GSH含量明显降低,不同浓度的CVP保护组可增加GSH的含量,与模型组比较有统计学意义(P<0.01),结果见表3。

注:1)与模型组比较,P<0.05;2)与模型组比较,P<0.01

2.4 云芝多糖对免疫性肝损伤小鼠NOS活性,NO及TNF-α含量的影响

免疫性肝损伤小鼠模型组NOS活性、NO和TNF-α含量与各组比较明显升高,对照组NOS活性与模型组比较降低,但无统计学意义,而NO及TNF-α含量明显降低与模型组比较(P<0.05)。CVP各保护组可降低NOS活性及NO和TNF-α含量,与模型组比较有统计学意义(P<0.05),结果见表4。

注:1)与模型组比较,P<0.05;2)与模型组比较,P<0.01

3 讨论

BCG与LPS被广泛应用于免疫性肝损伤的实验研究模型,BCG首先激活致敏T淋巴细胞,尤其是致敏肝内Kupffer细胞和巨噬细胞大量聚集于肝脏,当注射LPS攻击,使致敏状态的细胞释放大量炎性介质,如TNF-α、白细胞介素、NO和自由基等[4,5],其损伤机制类似于临床病毒性肝炎的病理生理过程,是筛选保肝药物的理想模型之一。本研究病理模型组肝体指数增大、胸腺指数变小,血清ALT、AST活性升高,肝脏MDA、NO、TNF-α含量和NOS活性增加;GSH含量及GSH-Px活性降低,证明BCG与LPS致小鼠免疫性肝损伤模型是成功的。其机制是BCG和LPS所致免疫性肝损伤分泌炎性因子使肝细胞出现炎性浸润,导致肝细胞肿胀引起肝体指数增大,胸腺指数变小,不同浓度的云芝多糖保护组能降低小鼠肝体指数、增加胸腺指数;与模型组比较(P<0.05),说明多糖云芝能抑制炎性介质的分泌。

免疫性肝损伤产生的自由基攻击膜磷脂中的不饱和脂肪酸而损伤肝细胞膜和线粒体膜,导致膜通透性增加致使ALT、AST逸出,引起血清ALT、AST升高;不同浓度的云芝多糖保护组能降低小鼠血清ALT、AST活性与模型组比较(P<0.05),但降低ALT和AST活性与多糖浓度存在量效关系[6]。MDA是自由基代谢的终产物其含量可反映肝细胞损伤程度,不同浓度的云芝山药多糖保护组能降低小鼠肝脏MDA的含量,与模型组比较(P<0.01)。表明云芝多糖对小鼠免疫性肝损伤具有对抗和清除自由基作用。

GSH是生物体内重要的还原物质,可作为GSH-Px等的辅酶参与清除自由基,同时GSH也具有直接清自由基的作用[7]。免疫性肝损伤时加速模型组GSH的消耗,导致GSH明显降低,不同浓度的云芝多糖保护组能升高GSH的含量,与模型组比较(P<0.01),说明云芝多糖能直接清除自由基,或者是通过促进谷胱甘肽合成酶的合成,增加GSH的含量。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶,其作用机制是SOD催化2分子氧自基生成O2和H2O2;GSH-Px的作用是由GSH提供原当量催化H2O2或过氧化物(ROOH)生成水,从而清除自由基。本研究病理模型组与云芝多糖保护组SOD活性无明显差异,与对照组比较明显降低(P<0.05),说明BCG+LPS所致免疫性肝损伤可加速SOD的消耗。但多糖云芝保护组能提高GSH-Px活性,与模型组比较(P<0.01),说明免疫性肝损伤可加速GSH-Px的消耗,云芝多糖可通过提高GSH-Px活性清除自由基。

而肝内一氧化氮合酶主要为内皮型(e NOS)和诱导型(i NOS),i NOS主要分布在肝Kupffer细胞及肝内皮细胞,正常情况下不表达,在内毒素和炎性因子刺激下i NOS可催化L-精氨酸生成NO。NO和TNF-α在免疫性肝损伤中起到重要作用;NO对肝细胞具有双重作用,既有保护功能又有杀伤毒性与促进炎症的双重作用,生理浓度的NO对肝脏有保护作用;高浓度的NO可抑制肝细胞蛋白质的合成和损伤DNA结构;直接抑制线粒体呼吸,使肝细胞内能量代谢障碍而引起肝细胞凋亡和坏死[8],TNF-α是引起急慢性肝损伤的重因素之一,TNF-α本身具有细胞毒性作用,能激活T、B淋巴细胞,增加自然杀伤细胞的杀伤能力,直接或间接引起肝细胞的免疫性肝损伤。还可诱导TNF-α本身、L-1和L-6等细胞因子的分泌,介导肝细胞功能受损而加重肝损伤[8,9]。免疫性肝损伤模型组NOS活性及NO和TNF-α的含量明显升高,不同浓度的云芝多糖保护组能降低NOS活性及NO、TNF-α的含量,与模型组比较P<0.01。实验表明,CVP可通过抑制免疫性肝损伤的炎性浸润,降低肝体指数及血清中ALT和AST的活性;提高GSH-Px活性和GSH的含量,降低NOS活性,降低MDA、NO和TNF-α的含量,对免疫性肝损伤有较强的保护作用。

摘要：目的观察云芝多糖(CVP)对免疫性肝损伤的保护作用及其作用机制。方法昆明种小鼠随机分正常对照组;病理造模组;云芝多糖分低、中、高保护组。造模第1天,除正常对照组外,其余各组小鼠经尾静脉注射2.5 mg卡介苗(BCG);CVP低、中、高保护组,每天分别按体重(100、200、300)mg/kg云芝多糖灌胃1次,第12天用云芝多糖灌胃给药2h后,模型组和云芝多糖各保护组从尾静脉注射7.5μg/只LPS。16 h后称取小鼠体重,眼球取血分离血清,测定ALT和AST;处死小鼠立即取出肝脏、胸腺称重,计算肝体指数、胸腺指数。制备匀浆测定肝匀浆SOD、GSH-Px和NOS的活性和MDA、GSH、NO和TNF-α的含量。结果与模型组比较,CVP可降低肝体指数及血清中ALT和AST的活性(P<0.05,P<0.01);提高GSH-Px活性和GSH的含量(P<0.01),降低NOS活性,降低MDA、NO和TNF-α的含量(P<0.01)。结论 CVP可减轻免疫性肝损伤所致炎性浸润,提高抗氧化酶的活性和GSH的含量,加速自由基的清除,降低MDA、NO和TNF-α的含量,对免疫性肝损伤有保护作用。

关键词：云芝多糖,免疫性肝损伤,保护作用

参考文献

[1]徐增莱,汪琼,赵猛,等.淮山药多糖的免疫调节作用研究[J].时珍国医国药,2007,18(5):1040-1041.XU ZL,WANG Q,ZHAO M,et al.Test on the Immunity-mod-erating Function of Dioscorea oppostita Thunb.Polysaccharide[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2007,18(5):1040-1041.Chinese

[2]ZHAO GH,WANG Y,LI ZX,et al.The regulation of immune-function by polysaccharide from Chinese yam[J].Acta Nutr Sin,2002,24(2):187-188.

[3]宋雨鸿,刘强,陈育尧,等.红背叶根对小鼠免疫性肝损伤的保护作用[J].南方医科大学学报,2008,28(3):494-496.SONG YH,LIU Q,CHEN YY,et al.Protective effects of Hong-beiyegen against immunological liver injury in mice[J].Journal of Southern Medical University,2008,28(3):494-496.Chinese

[4]吴春明,曹家麟,朱小区,等.二草清肝汤治疗免疫性肝损伤大鼠的作用机制[J].山东医药,2008,48(27):38-40.WU CM,CAO JL,ZHU XQ,et al.Effects of Ercao Qinggan Soup against immunological liver injury in rats[J].Shandong Medical Journal,2008,48(27):38-40.Chinese

[5]毕明刚,周娟,许扬,等.岩黄连总碱提取物对小鼠免疫性肝损伤的改善作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2009,23(1):39-44.BI MG,ZHOU J,XU Y,et al.Improving effect of total alkaloids extract from Corydalis thalictrifolia Franch.on immune hepatic injury in mice[J].Chinese Journal of Pharmacology and Toxicolo-gy,2009,23(1):39-44.Chinese

[6]孙设宗,唐微,张红梅,等.山药多糖对小鼠CCL4肝损伤保护作用[J].郧阳医学院学报,2008,27(6):502-504.SUN SZ,TANG W,ZHANG HM,et al.Protective Effect of Yam Polysaccharide on CCL-4induced Liver Injury in Mice[J].Jour-nal of Yunyang Medical College,2008,27(6):502-504.Chinese

[7]舒红.还原型谷胱甘肽的临床应用[J].黑龙江医学,2007,31(11):840-841.SU H.Clinical applications of reduced glutathione[J].Heilongjiang Medical Journal,2007,31(11):840-841.Chinese

[8]胡成穆,姜辉,刘洪峰,等.金银花总黄酮对免疫性肝损伤小鼠的影响[J].安微医药,2008,12(4):295-297.HU CM,JIANG H,LIU HF,et al.Effects of LJTF on immuno-logical liver injury in mice[J].Anhui Medical and Pharmaceutical Journal,2008,12(4):295-297.Chinese

多糖免疫机制研究进展篇3

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

姬松茸多糖ABP-AW1由本实验室提取分离鉴定。最终确定其为组分均一的低分子量 (50 KDa) 多糖;HRP标记的山羊抗鼠Ig G2b, Ig G1抗体 (SBA公司) ;HRP标记羊抗小鼠Ig G抗体 (中杉金桥生物技术公司) 。

1.2 动物免疫

ICR小鼠按随机数字表法分为六组, 每组15只。分别为PBS免疫组、OVA免疫组 (OVA100μg/只) 、Alum免疫组 (OVA 100μg/只+Alum200μg/只) 、DT1剂量免疫组 (ABP-AW1 200μg/只+OVA 100μg/只) 、DT2剂量免疫组 (ABP-AW1100μg/只+OVA 100μg/只) 、DT3剂量免疫组 (ABP-AW1 50μg/只+OVA 100μg/只) 。各组分别于第1天和第15天背部皮下两点注射免疫小鼠, 二免后14 d取抗凝血, 分离血清, -20℃保存备用。取脾进行病理学观察。

1.3 免疫小鼠血清中抗OVA特异性抗体强度的测定

1.3.1抗血清的收集

二次免疫后14 d摘除眼球采集各组小鼠血液, 将血液存于1.5 m L离心管中, 室温存放2 h, 超速离心机离心, 4℃, 3000 rpm, 10 min。微量移液器取分离血清, 分装保存于-80℃冰箱备用。

1.3.2血清中抗OVA特异性抗体Ig G的测定

于96孔酶标板上, 每孔加入100μL包被液 (含50μg/m LOVA的0.05 M, p H 9.6的碳酸盐缓冲液) , 置37℃孵育1 h, 用洗涤缓冲液PBST洗涤 (重复3次, 每次间隔20 s) 。洗涤后每孔加封闭液200μL, 于37℃孵育1 h, 洗涤3次, 然后加1:200稀释倍数的待测血清100μL, 重复3孔, 37℃孵育1 h, 洗涤3次。每孔加1∶800的HRP标记的山羊抗小鼠Ig G抗体稀释液100μL, 37℃孵育0.5 h, 洗涤6次。每孔分别加入100μL TMB底物显色液, 37℃孵育15 min, 每孔加终止液 (2MH2SO4) 50μL终止反应, 用酶标仪于波长450 nm处测定OD值。

1.3.3血清中抗OVA特异性抗体Ig G亚类的测定

于96孔酶标板上, 每孔加入100μL包被液 (含50μg/m L OVA的0.05 M, p H 9.6的碳酸盐缓冲液) , 置37℃孵育1 h, 用洗涤缓冲液PBST洗涤 (重复3次, 每次间隔20 s) 。洗涤后每孔加封闭液200μL, 于37℃孵育1 h, 弃去反应孔内液体洗涤3次, 然后加1∶20稀释倍数的待测血清100μL, 重复3孔, 37℃孵育1 h, 洗涤3次。每孔加1∶5000的HRP标记的山羊抗小鼠 (Ig G1或Ig G2b) 抗体稀释液100μL, 37℃孵育0.5 h, 洗涤6次。每孔分别加入100μLTMB底物显色液, 37℃孵育15 min, 每孔加终止液 (2MH2SO4) 50μL终止反应, 用酶标仪于波长450 nm处测定OD值。

1.4 佐剂对小鼠的安全性评价

二免后14 d取眼球放血处死后, 用10%甲醛固定免疫鼠心、肝、脾、肺、肾和肠, HE染色, 进行病理学观察。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) , 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫小鼠血清中抗OVA特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig G2b含量分析

OVA免疫组血清中抗OVA特异性抗体Ig G的产生与PBS免疫组、DT免疫组2、Alum免疫组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;OVA免疫组血清中抗OVA特异性抗体Ig G2b的产生与PBS免疫组、DT免疫组2、DT免疫组3比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;OVA免疫组血清中抗OVA特异性抗体Ig G1的产生与其余各组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

2.2 ABP-AW1对OVA受免小鼠免疫器官的影响

结果:二免后14 d经病理学观察, 所有免疫小鼠未发现主要脏器肠、肝、脾、心、肺、肾等病理损伤及巨噬细胞渗入造成器官的损害。同时也观察到佐剂接种后2 d内, 小鼠体重出现下降与对照组小鼠无明显差异, 但2 d后小鼠体重逐渐恢复正常。

*与OVA组比较, P<0.05

3 讨论

目前, 疫苗佐剂主要以1926年发现的铝佐剂为主, 国外几种新型佐剂仅批准在局部地区用于特定疫苗生产, 如MF59佐剂在欧洲批准用于流感等疫苗[7]。然而目前使用的免疫佐剂主要刺激Th2类型的免疫应答。这种应答对需要Th1免疫应答的病毒和抗胞内寄生菌感染和癌细胞无作用。另外, 疫苗研究已趋向基因疫苗和亚单位化的研制, 传统的氢氧化铝佐剂和油乳佐剂由于其自身的缺陷很难适应新型疫苗的开发难以显著提高机体的免疫应答水平并适应新型疫苗的开发[8]。免疫佐剂种类决定免疫应答反应的类型, 不同免疫应答反应类型对疫苗的免疫保护性有显著的影响[9]。因此, 解决目前上述现实问题的重要途径是研制新型的人用疫苗佐剂, 这也成为当今免疫学和化学界的一个活跃的领域。

淋巴细胞在适应性免疫应答中主要是由T淋巴细胞和B淋巴细胞发挥着关键作用, 是免疫系统发挥作用的核心, 可分别通过介导细胞免疫和体液免疫执行特异性免疫应答。姬松茸多糖其所含成分多糖具有广泛的生物活性。课题组提取的低分子量 (50 KDa) 姬松茸多糖 (ABP-AW1) 先前的研究表明ABP-AW1免疫刺激活性效果显著, 为了进一步研究ABP-AW1的佐剂生物活性, 实验中笔者研究与免疫功能密切相关的免疫球蛋白表达的改变, 这些Ig G的种类和数量决定Th细胞活化后是向Th1还是向Th2方向分化, 并最终影响免疫应答类型。

机体体液免疫中最关键的免疫细胞-B细胞通过分泌抗体, 在体液免疫系统中发挥“指挥家”的作用, 它们担负着识别外来抗原的任务, 并使下游的效应细胞和分子发挥作用以清除外来抗原。佐剂通过T辅助细胞引起的B淋巴细胞的活性效应可以通过评价总Ig G抗体生成水平来实现。对Ig G1和Ig G2b抗体亚类的评价可以分别用于评价Th1和Th2免疫反应的类型, 为进一步证实体外实验中脾细胞产生细胞因子的特点是否能真实地反映小鼠体内发生Th1/Th2免疫应答的特点, 笔者检测了二免后14 d小鼠血清中总的Ig G抗体, 抗体亚型Ig G2b (Th1型) 和Ig G1 (Th2型) 的水平。从各实验组小鼠抗体效价水平分析, 在疫苗中加入铝胶佐剂对于提高小鼠血清中总Ig G和Ig G1效价能力上有显著的效果, 证实了铝胶佐剂在机体可以激发Th2型免疫应答的能力[10]。与铝胶组相比较, ABP-AW1免疫组相比有极显著提高, 两抗体效价则低于铝胶组。从抗体亚类Ig G2b效价水平上分析, 铝胶结合OVA抗原免疫组小鼠对这种Thl型抗体亚类均无显著作用, 也再一次验证了铝胶佐剂在机体可以激发Th2型免疫应答而无法有效激发Thl型免疫应答。相反, ABP-AW1表现出较强的增强Thl型抗体亚类的特性, 与铝胶组相比, 而ABP-AW1在较高剂量 (100μg) 添加时却能极显著提高亚类的产生, 表现出更强的诱导Th1型抗体亚类的能力。

在疫苗佐剂有效性被肯定的同时, 安全性是佐剂本身也正面临越来越严重的挑战。基于不同的理念, 人们创造或发现了大量的新型佐剂。但是, 由于佐剂本身容易引发局部或全身的副反应, 造成这些佐剂都或多或少在临床的使用上存在局限性。减少或替代佐剂中的毒性成分;多种分子佐剂的联合使用, 能更好的控制机体体内免疫系统的平衡, 是最大程度地降低佐剂毒副作用的理想方案。比单一分子佐剂的使用更有优势。如就同一类分子佐剂受体而言 (以TLRS为例) , 因其有多重形式, 每种具体类型的受体引发的免疫调节反应也存在很大差异[11,12]。

由特定的碳水化合物佐剂确定效能和/或毒性地位之差异, 碳水化合物对抗炎信号起到一个双向调节作用[13,14,15]。碳水化合物结构很少只与一个受体结合, 通常与四或更多个不同的免疫受体相结合, 甚至这也可能低估了大多数多聚体的碳水化合物结构可能结合的总的受体数量。碳水化合物佐剂触动的免疫受体在决定最终免疫反应结果是十分重要的。因此, 笔者推测ABP-AW1佐剂可与多个不同的免疫受体相结合, 通过结合与之相对应的位于细胞表面的受体, 向胞内传递复杂的信号, 信号经级联放大后, 控制和调节各类细胞因子的表达、分泌, 进而调节免疫反应的水平。本实验的安全性检测也显示, 所有接种鼠均表现正常, 生长发育良好, 未发现主要脏器出现抗原所致的继发性免疫病理损伤。

摘要：目的:探讨姬松茸多糖 (ABP-AW1) 促进OVA抗原诱导Th1/Th2免疫反应的研究。方法:ICR小鼠随机分为PBS免疫组、OVA免疫组、DT免疫1、2、3组和Alum免疫组。第1次免疫后, 间隔2周再免疫第2次。采集二免2周后小鼠血液, 间接ELISA法测定Ig G及其亚类抗体水平, 取重要脏器HE染色观察ABP-AW1佐剂对主要脏器继发的损伤反应。结果:OVA免疫组血清中抗OVA特异性抗体Ig G的产生与PBS免疫组、DT免疫组2、Alum免疫组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;OVA免疫组血清中抗OVA特异性抗体Ig G2b的产生与PBS免疫组、DT免疫组2、DT免疫组3比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;OVA免疫组血清中抗OVA特异性抗体Ig G1的产生与其余各组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。未见主要脏器的损伤反应, 无继发性的免疫损伤。结论:ABP-AW1佐剂可同时促进OVA免疫小鼠Th1和Th2型免疫反应, 调节抗原刺激小鼠Th1/Th2失衡的作用, 具有不同于铝佐剂的Th1优势反应。

多糖抗肿瘤活性及其机制研究篇4

关键词：恶性肿瘤,多糖,活性机制

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病, 各国对它都展开了积极广泛的研究。肿瘤细胞是机体内的正常细胞在内外部因素长期共同作用下发生的一种过度增生异常分化的结果。机体免疫系统对异己肿瘤细胞有免疫监视的作用, 但仍有一部分肿瘤细胞通过免疫逃逸可以躲过机体卫士的监控, 有时微环境中的免疫细胞还会促进肿瘤的生长。因此, 肿瘤细胞与宿主的免疫监视是一种相生相克的复杂关系, 肿瘤形成与否, 取决于两者的较量。

现阶段恶性肿瘤的发病机制及防治研究虽已取得较大进步, 但肿瘤的形成是多因素、多阶段长期相互作用的结果, 机制复杂, 很多问题还有待研究解决。目前临床上主要应用肿瘤治疗的手段是放化疗, 有很大的副作用, 导致病人的生存质量明显下降, 整体治疗效果并不满意。因此寻求高效低毒的天然抗肿瘤药物显得尤为迫切。

多糖 (Polysaccharide) 是由10个及以上单糖通过糖苷键形成的多羟基醛酮类的高分子聚合物。多糖在细胞构建、生物合成、生命活动调控、免疫功能调节、物质运输、细胞转化、信号转导等过程起到举足轻重的作用。天然来源的多糖是一类重要的生物活性物质, 具有抗病毒、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等[1]多种功能, 且细胞毒性小、免疫原性低、安全性高, 已经成为开发癌症治疗药物的重要来源之一。

多糖的抗肿瘤活性主要在两方面发挥作用:一是激活免疫系统, 通过提高机体免疫力间接发挥抗肿瘤作用, 各种天然多糖能够激活B淋巴细胞, T淋巴细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞;二是对肿瘤细胞直接毒性, 通过改变细胞膜流动性, 调节细胞增殖、凋亡、血管生成等相关基因的表达抑制肿瘤细胞生长。目前, 已有多种天然活性多糖作为辅助治疗肿瘤的药物在临床应用, 如香菇多糖、云芝多糖等。本文以多糖对免疫功能的影响为重点, 从增强免疫活性和诱导肿瘤凋亡两个方面进行阐述。

1 多糖对免疫功能的影响

免疫系统在肿瘤发生发展中扮演了重要角色, 肿瘤的免疫治疗是目前肿瘤治疗的策略之一, 肿瘤免疫疗法的临床目标是通过利用免疫系统靶向肿瘤, 以提供被动或主动免疫对抗恶性肿瘤[2], 多糖对免疫功能的调节主要包括细胞免疫和体液免疫, 其中以细胞免疫为主导。

肿瘤细胞大多缺乏或者具有较弱的提供共刺激信号的能力, 对肿瘤抗原免疫应答反应之前, 首先要由抗原提呈细胞 (APC) 对其加工, 才能为免疫效应细胞所识别。APC包括树突状细胞 (Dendritic cells, DC) 、巨噬细胞和B淋巴细胞。

1.1 对抗原提呈细胞的影响

1.1.1 树突状细胞:

负责高效地摄取、加工处理和递呈抗原, 是公认功能最强的专职抗原递呈细胞 (Antigenpresentingcells, APC) , 未成熟DC具有较强的迁移能力, 成熟DC能有效激活初始型T淋巴细胞, 引起一系列的免疫应答。台湾灵芝多糖PS-F2体外能够刺激DC产生TNF-α、IL-6和IL-12等细胞因子, 刺激DC表达成熟标记物CD40、CD80、CD86和Ⅱ类MHC, 提高机体适应性免疫反应[3]。AbbiL等人研究发现, 蛋白键合的云芝多糖 (PSK) , 可以使树突状细胞 (DC) 的Toll样受体2 (TLR2) 上调, 使DC高表达其成熟标记物CD40、CD80、CD86和Ⅱ类MHC[4]。黄芪多糖[5]诱生DCs显著激发同种异体T淋巴细胞增殖, 诱生过的DCs负载肿瘤抗原后可诱导肿瘤特异性细胞杀伤性T细胞 (CTL) , 产生白血病细胞毒效应。

1.1.2 巨噬细胞:

巨噬细胞作为APC启动免疫反应, 由它们分泌的细胞因子参与抗肿瘤的反应, 增强宿主防御能力。并作为效应细胞介导肿瘤细胞溶解。TakedaK等人发现用岩藻依聚糖刺激过的RAW264.7与S180共培养后, 通过核因子NF-κB依赖性信号传导途径产生大量具有细胞毒作用的NO抑制S-180的增殖[6]。云芝多糖 (PSK) 体外可以促进外周单核细胞和巨噬细胞的增殖, 增强免疫功能, 起到抗肿瘤的作用[7]。从五味子叶中提取的多糖给L5178Y淋巴癌细胞的荷瘤小鼠灌胃, 能升高血清TNF-α的分泌水平, 使荷瘤小鼠的存活率显著提高, 抑制肿瘤生长, 体外可增强巨噬细胞的吞噬能力, 并促进巨噬细胞分泌NO和TNF-α, 显著增强免疫系统的功能[8]。从真姬菇Hypsizygusmarmoreus (Peck) Bigelow中分离一种多糖蛋白复合物 (HM-3A) 可以刺激人体的单核-巨噬细胞成熟分泌细胞因子IFN-c和TNF-α, 从而抑制人髓性白血病U937细胞的生长[9]。

1.1.3 B淋巴细胞:

B淋巴细胞主要执行机体的体液免疫 (Humoralimmunity) , 抗原刺激后可分化为浆细胞, 浆细胞可以分泌免疫球蛋白。海洋真菌茎点霉YS4108菌丝中提取的多糖YCP, 使小鼠脾B淋巴细胞大量增殖, 产生IgM抗体。激活免疫系统产生强大的抗肿瘤作用[10]。葛淑芝[11]等人研究发现酵母多糖浓度为2.00g/L时鼠脾淋巴细胞的IL-2的分泌量高达15.6μg/L, CD3+、CD19+标记的细胞百分比大大升高, 表明酵母多糖可以大大增加T细胞和B细胞数量, 对机体细胞和体液免疫均有明显的增强。

1.2 对效应淋巴细胞的影响

效应淋巴细胞, 能特异的识别肿瘤抗原, 接受肿瘤抗原刺激, 并通过增殖分化分泌抗体、细胞因子, 直接或者间接杀伤肿瘤细胞, 主要包括T细胞、NK细胞。T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞, 后转移到胸腺中分化成熟。按照功能和表面标记可以分为细胞毒T细胞 (CTL) 、辅助T细胞 (Th1和Th2) 、调节性T细胞 (Treg) 和记忆T细胞 (Tm) , 其中与抗肿瘤密切相关的是细胞毒T细胞和辅助T细胞。

1.2.1 细胞毒性T细胞:

表型为CD8+, 是肿瘤免疫反应的主要杀伤细胞, 通过FAS途径和穿孔素颗粒酶途径起到杀伤肿瘤细胞作用。PSK可以通过TLR2受体提高CD8+T淋巴细胞杀伤活性, 从而起到抗肿瘤作用[12]。

1.2.2 辅助性T细胞 (Th) :

表型为CD4+, 分为Th1和Th2。Th1主要介导细胞免疫, 分泌IL-2、TNF-α, 促进CTL的增殖和CTL细胞毒作用, 放大免疫效应, 是机体抗肿瘤免疫的主要形式;Th-2细胞主要介导体液免疫, 体内主要参与超敏反应和自身免疫疾病, 分泌IL-4、IL-10。Th2细胞在肿瘤患者体内处于优势的分化状态, 其产生的细胞因子对Th1细胞增殖分化和细胞毒性T淋巴细胞的功能具有抑制作用, 会使机体免疫功能减弱, 使肿瘤发生免疫耐受、逃逸等。所以维持机体正常免疫功能的关键是Th1/Th2型细胞处于动态平衡。马齿苋多糖可以使荷瘤小鼠脾细胞分泌细胞因子的稳态失衡得到纠正, 促进荷瘤小鼠分泌IL-2, 刺激CTL的杀瘤活性, 起到抗肿瘤的作用[13]。在鼠脾细胞培养时发现用台湾灵芝多糖 (PS-F2) 处理后可以上调表达T-bet和干扰素 (IFN) -γ的T淋巴细胞数量;与卵白蛋白 (OVA) 抗原共同使用时能刺激OVA特异性抗体的产生, 诱导产生OVA特异性CTL, 提高机体适应性免疫反应[3]。PS-F2可以有效刺激Th0向Th1分化, 诱导Th1极化[14]。田头菇多糖 (APP) 联合应用化疗药环磷酰胺能调节Th1/Th2平衡, 纠正细胞因子的表达变化, 还能拮抗因环磷酰胺引起的白细胞减少, 促进免疫功能的恢复, 延长小鼠存活时间, 增强了小鼠抗肿瘤的能力[15]。黄芪多糖体外显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖, 促进细胞因子IL-2和IFN-r的分泌, 具有明显的量效关系[16];诱导脾DC的分化, 增强T淋巴细胞的免疫功能并通过IL-12介导的Th2细胞向Th1转移[17]。蛋白结合的云芝多糖PSK能刺激OVA特异性T细胞的增殖, 并诱导产生IFN-γ、IL-2和TNF-α[4]。槐耳多糖可以提高CD4+T细胞数量, 抑制肝癌细胞的生长[18]。

1.2.3 NK细胞:

NK细胞是体内一类重要的免疫细胞, 无需抗原预先致敏, 直接杀伤肿瘤细胞[19]。NK细胞经黄芪多糖作用48h后与HL-60细胞在不同效靶比 (5∶1、10∶1、20∶1) 条件下共培养, NK细胞杀伤敏感性增加显著[20]。光棘球海胆卵多糖 (SEP) 在体内可以通过TLR2和TLR4介导, 促进NK细胞的细胞毒作用, 具有抗肺癌的活性[21]。

2 对肿瘤的抑制作用

2.1 直接抑制肿瘤

多糖对肿瘤直接的细胞毒作用。经桑黄多糖[22]诱导HepG2 (Human hepatocellular carcinoma cells) 细胞通过减少钙网蛋白表达和激活P27kip1蛋白-细胞周期蛋白A/D1/E-CDK2途径阻滞在S期, 与对照相比桑黄多糖处理的小鼠 (200mg/kg) 的实体肿瘤的重量显著降低, 荷瘤小鼠的体重增加。

2.2 诱导细胞凋亡

地榆多糖SRP[23]、姬松茸多糖 (ABP) [24]可以破坏白血病细胞HL-60的线粒体膜电位, 引起细胞色素C释放入胞质中, 升高的Bax/Bcl-2的比率, 激活caspase-9和caspase-3, 经线粒体途径介导的信号转导诱导HL-60细胞的凋亡。

灵芝多糖GLP可以激活caspase-8, 上调caspase-3和Fas, 通过死亡受体途径对人结肠癌细胞株HCT-116有显著的抗癌活性[25]。石磊研究发现经南极海洋菌多糖PEP[26]处理后的乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞CHOP和caspase12基因的表达量增加, 表明内质网通路参与了该凋亡过程。褐藻多糖硫酸酯结合物[27]能耗竭细胞中还原型GSH, 导致ROS过度积累使线粒体损伤, 促使SMMC-7721细胞凋亡。

3 小结与展望

雪茶多糖对免疫功能的影响篇5

雪茶(Thamnolia vermicularis(Sw.)Ach),又称地衣,太白茶,为地衣类地茶科地茶属植物,全株呈白色或灰绿色,管状,长3~7cn,直径3~5mm。雪茶为耐寒植物,生长于海拔4000m以上的高山地区,在云南的迪庆、丽江、大理苍山等地区分布较广泛。雪茶全草入药,性苦、寒,具有清热、消暑、生津止渴、养心安神之功效,主治咽喉痛,腹痛、消化不良[2],对中暑、心中烦热、阴虚潮热、肺热咳嗽、神经衰弱、高血压及肥胖等也有一定疗效[2]。该植物在滇西北地区民间一直作为一种传统药物使用。为进一步观察雪茶的生物学活性和药理学作用,我们对雪茶多糖对免疫功能的影响进行了初步实验研究,现将实验结果报道如下。

1 实验材料

1.1 主要仪器与试剂

岛津UV-2600型紫外可见分光光度计,Bio Teck全自动酶标仪,LD大容量冷冻离心机。RPMI 1640培养液,刀豆蛋白A(Con A)、MTT等均为Sigma公司产品。其余试剂为国产分析纯。

1.2 动物

昆明种小白鼠,体重20±2g,由昆明医学院实验动物中心提供,动物合格证号:滇实动证第2003056号。

1.3 药物

雪茶多糖(Thamnolia vermicularis polysaccharide,TP),由大理学院生物化学实验室提供,为灰白色粉末。将TP用灭菌生理盐水制成5mg·m L-1,过滤除菌,置4℃备用。

2 实验方法[3]

2.1 TP对小鼠脏器/体重比值(胸腺指数和脾指数)的影响

取小鼠40只,随机分成4组,每组10只。TP低、中、高剂量组每天分别腹腔注射给药(见表1),对照组则给等量生理盐水(NS),连续14天。于末次给药后24h,称小鼠重,颈椎脱臼法处死小鼠,取出脾脏及胸腺,用滤纸吸干血迹后称重,计算胸腺指数和脾指数:脏器(mg)/体重(10g)。

2.2 TP对小鼠血液碳粒廓清速率的影响

取小鼠40只,分组给药同前,连续14天。于末次给药24h后称重,各鼠尾静脉注入印度墨汁,10g体重0.1m L,于注入墨汁后第2、10min,分别眼内眦静脉丛取血20μL,测定小鼠血液碳粒廓清速率,用半自动生化仪以600nm波长测光密度值(OD)。小鼠处死,取肝、脾脏,称重。计算吞噬指数α。α=K1/3×体重/(肝重+脾重);K=(lg OD1-lg OD2)/(t2-t1)。

2.3 TP对小鼠血清溶血素的影响(血凝法)

取小鼠40只,分组给药同前,连续14天。于给药的第10天各鼠腹腔注射0.2m L2%(v/v)绵羊红细胞悬液致敏(当日给药改为皮下注射)。免疫5天后,小鼠眼球取血,分离、收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释,置于微量血凝板内,每孔100μL,加入100μL0.5%(v/v)绵羊红细胞悬液,37℃温箱孵育3h,观察血球凝集程度。计算抗体积数:抗体积数=(S1+2,S2+S3……n Sn);式中1、2、3……n为对倍稀释的指数,S为凝集程度的级别。

2.4 TP对体外Con A诱导的小鼠淋巴细胞转化的影响(MTT法)

取小鼠40只,分组给药同前,连续14天。于末次给药24h后,处死小鼠,无菌取脾,制细胞悬液,数活细胞数,用RP-MI1640培养液调整细胞浓度为3×106个/m L。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1m L,其中一孔加75μL Con A液(相当于7.5μg/m L),另一孔作对照,置5%CO2,37℃孵箱中培养72h,然后用MTT法测定细胞活性,以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加Con A孔的光密度值减去不加Con A孔的光密度值表示。

3 统计处理

用SPSS统计软件进行方差分析,结果用表示。P<0.05为差异有显著性。

4 实验结果

4.1 对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响

结果见表1。由表1可见,与对照组比较,脾脏指数有显著性差异(P<0.05),TP高剂量组的胸腺指数与对照组相比,有显著性差异(P<0.05),但TP中、低剂量对小鼠胸腺指数无明显影响(P>0.05)。

注:与对照组比较**P<0.01;*P<0.05。

4.2 对小鼠血液碳粒廓清速率的影响

结果如表2所示。从表2可见,与对照组相比,TP高、中剂量组的吞噬指数α均高于对照组(P<0.05),表明TP对小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能有促进作用,但TP低剂量组对小鼠单核巨噬细胞的吞噬指数α无明显影响(P>0.05)。

注:与对照组比较**P<0.01;*P<0.05。

4.3 对小鼠血清溶血素的影响

结果如表3所示。从表3可见,与对照组相比,TP高、中、低剂量组的抗体积数均显著高于对照组,差异显著(P<0.05)。表明TP对小鼠抗体的生成有明显的促进作用,且呈剂量效应关系。结果提示TP对小鼠体液免疫功能有促进作用。

注:与对照组比较**P<0.01;*P<0.05。

4.4 对脾淋巴细胞转化能力的影响

从表4可见,TP高、中、低剂量组对脾淋巴细胞转化能力均高于对照组,差异显著(P<0.05)。TP高、中剂量组的抗体积数均高于对照组,表明具有提高小鼠的血清溶血素水平的作用。TP低剂量组与对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。

注:与对照组比较**P<0.01;*P<0.05。

5 讨论

植物来源的多糖作为一种潜在的新药资源,其最大的特点是具有独特的生理活性和低毒副作用,因而在临床中有较广阔的应用前景,已引起医药学界的高度重视。目前已有百余种植物多糖被分离提取出来,其中部分已应用临床,如香菇多糖、云芝多糖、灰树花多糖、裂隙葡多糖、牛膝多糖等。但由于多糖的结构较复杂,其质量标准不易控制,有些多糖在天然产物中含量很低而不易分离,同时多糖的药理活性和多种因素有关,给多糖的研究和临床应用带来了一定的限制。我国雪茶资源较丰富,但对雪茶多糖的研究报道较少,特别是其高级结构与药理作用关系、其作用机制等方面,均有待更深入的研究。随着对雪茶多糖研究的不断深入,雪茶多糖将会有较好的临床实际应用前景。

参考文献

[1]朱欣婷.植物多糖的生物活性研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(28):12076-12077.

[2]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(下册)[M].北京:人民卫生出版社,1996:392-597.

多糖免疫机制研究进展篇6

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药品：

选择杭州九天动物保健品有限公司生产的保芝林(真菌多糖)【兽药字(2006) 110295165】和郑州德鑫兽药科技有限公司的复方黄芪多糖【兽药字(2005) 160415208】，产品主要成分见表1。

1.1.2 试验动物：

试验用的母猪为同一幢舍健康无疾病的后备母猪30头，日龄、体重相近;而保育猪是选同一幢舍内产期相近、胎次相当、健康水平良好的杜长大保育仔猪30头。试验所用的母猪各组之间的原始抗体平均数差异不显著(P>0.05), 试验所用保育仔猪各组之间的原始抗体平均数差异不显著(P>0.05)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组：

选择本猪场母猪舍健康水平良好的母猪30头，分3组，每组10头。保育舍健康水平良好的保育仔猪30头，分3组，每组10头。其中A组饲料中添加保芝林(真菌多糖)，B组饲料中添加复方黄芪多糖，C组不添加任何药物做空白对照组。

1.2.2 饲养管理：

后备母猪饲喂后备母猪专用饲料，在90 kg或180 d前实行自由采食，90 kg或180 d后至配种实行限饲与自由采食结合，日饲喂2.5 kg左右，分2～3次饲喂，并供给充足的清洁饮水，让骨骼、性器官充分发育，目的是达到不肥不瘦(八成膘)的种用体况;保育仔猪猪进行合理的并窝编群，并窝时采用原窝仔猪合住一起，这样避免了合群的干扰，此外还要为保育仔猪创造舒适的小环境，有阳光充足、温度适宜、清洁干燥的圈舍。由专人负责试验的饲养过程，观察记录，抽血送检。

1.3 试验设计

试验采用对照组单因子试验设计，母猪和保育猪各3组，每组10头，分别在饲料中添加保芝林(真菌多糖)、复方黄芪多糖、空白对照组不添加任何药物，在饲喂之前就需要抽血检验猪瘟的抗体滴度，即原始抗体水平。抗体滴度反映的是最大稀释后仍然能起阳性的反应，所以滴度数值越高(也就是稀释的倍数越大)就表明抗体的浓度越高，即抗体水平越高。

1.4 试验内容

1.4.1 后备母猪的试验：

(1)试验用猪：后备母猪。

(2)试验数量：30头后备母猪，每栏10头为一组，共3组(A.B.C)，每组按序号打耳标。

(3)在添加药物饲喂之前先抽血检验30头母猪的猪瘟原始抗体。

(4) A组：每吨饲料添加杭州九天保芝林(真菌多糖)600 g，连用10 d。

B组：每吨饲料添加郑州德鑫的复方黄芪多糖(50%黄芪多糖)600 g，连用10 d。

C组：空白对照组，饲喂未添加任何药物的饲料。

(5)添加药物的饲料饲喂一周后再接种猪瘟疫苗，并继续添加药物饲喂3 d。

(6)从接种疫苗当天至28 d后抽血复检猪瘟的抗体滴度。

1.4.2 保育仔猪的试验：

(1)实验用猪：保育仔猪(45～50 d猪瘟疫苗未二免)。