多糖结构修饰研究

多糖结构修饰研究（共6篇）

多糖结构修饰研究 篇1

异黄酮类化合物染料木素 (Genistein, 5, 7, 4′-三羟基异黄酮) , 又称金雀异黄素、染料木黄酮, 广泛分布于大豆、三叶草、葛根、槐花、槐角、染料木 (金雀花) 和广豆根等豆科植物中, 是大豆异黄酮中的一种主要活性因子, 是大豆异黄酮产品中最有效的功能成分。张萍等[1]对染料木素药理活性的综述指明染料木素具有明显的雌激素样作用、抗癌、防治骨质疏松、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化等生理活性, 所以广泛应用于制药、保健品等领域。近年来染料木素已逐渐成为国内外学者研究的热点。本文着重对其结构修饰进行了综述, 以促进染料木素进一步的研究和应用。

1 染料木素的烷基化、酯化及磺化

谭仁祥等[2]对染料木素的5、7和4′位进行了结构修饰, 制备了一系列染料木素衍生物 (图1) 。此外, 谭仁祥等[3]还在7位引入甲硝唑基团的基础上, 在另两个部位引入了烷基、溴代烷基、甲硝唑基团、乙酰基、乙酸乙酯基团, 制备出了对幽门螺旋杆菌有明显抑制作用, 且几乎没有毒性的衍生物。张丽娜等[4]对7-OH进行烷基化修饰, 使化合物的亲脂性增加, 在此基础上, 又引入了环状或非环状的碱性基团, 使抗癌活性增加。

佘戟等[5]首次合成了两种水溶性较好的染料木素的衍生物:染料木素-4′-硫酸酯钠和染料木素-7, 4′-二硫酸酯二钠 (图 2) , 并将它们和染料木素的抑制HL-60细胞生长和猪血小板聚集作用进行了比较, 发现两种改性衍生物的药理作用急剧降低和失活。

G表示染料木素;G1表示染料木素-4′-磺酸酯钠; G2表示染料木素-7, 4′二硫酸酯二钠

余燕影等[6]以染料木素和阿魏酸为起始原料, 首次合成得到两种新化合物: 染料木素-7-乙酰阿魏酸酯和染料木素-7, 4′-二乙酰阿魏酸酯 (图3) , 其目的通过这种结构修饰来改善染料木素的脂溶性, 提高其稳定性, 并通过引入阿魏酸这样具有较强药效作用的活性分子, 希望通过其间可能存在的协同作用来提高修饰物的选择性和药效作用。李先和等[7]的研究结果表明染料木素经阿魏酸酯化的修饰物比染料木素具有更强的清除DPPH·, ·OH自由基的能力, 且保护DNA免受羟基自由基损伤的能力与染料木素相当, 从而为寻求与自由基相关疾病新药的发现、食用功能因子的开发等奠定实验基础。

张尊听等[8]以染料木素为原料采用磺化反应合成了染料木素-3′-磺酸钠和染料木素-3′, 6-二磺酸钠两种水溶性衍生物 (图4) , 比较了他们与染料木素的抗脂质体过氧化作用。结果表明两种水溶性衍生物的抗脂质体过氧化作用均有所增强。

2 染料木素的磷酰化结构改造

陈晓岚等[9]采用改进的Atherton -Todd反应对染料木素进行磷酰化结构改造 (合成路线如图5所示) , 得到了4种新的磷酰化产物, 并通过ESI-MS, NMR进行了结构确认。结果发现磷酰化试剂对染料木素羟基的磷酰化具有较好的选择性, 反应主要发生在染料木素7位羟基。ESI-MS研究结果显示了磷酰化的染料木素确实能够和溶菌酶发生弱相互作用, 而且磷酰化产物的浓度对磷酰化产物与蛋白的弱相互作用有一定的影响。

3 染料木素糖苷的合成

胡昕[10] 采用相转移催化法合成了染料木素7, 4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷, 并对合成及纯化条件进行了探讨, 对产物进行了IR, 1H NMR, 13C NMR和MS结构表征, 为进一步研究其生物活性和药理作用提供必要的物质基础 (合成路线如图6) 。

宋国辉等[11]采用相转移催化法, 首次对染料木素进行了乳糖糖苷化修饰, 合成了染料木素7-O-β-D-吡喃乳糖苷 (4) 、染料木素7, 4′-二-O-β-D-吡喃乳糖苷 (5) 和染料木素4′-O-β-D-吡喃乳糖苷 (6) (合成路线如图7) 。经柱层析方法得到了两新化合物 (4) 和 (5) 并进行了结构表征。另一产物 (6) 经LC-MS检测证实存在, 因产率过低, 没能分离到足够多的单体以进行结构表征。刘蓉等[12]在此工作基础上, 也采用相转移催化法, 通过控制反应物的摩尔比选择性地合成了 (4) 、 (5) 和 (6) , 提高了产率, 并对产物进行了结构表征, 为进一步研究其生物活性和构效关系提供了必要的物质基础。

4 染料木素门尼希碱的合成

张萍等[13]利用染料木素A环C-8位H、C-6位H的活性与脂肪伯、仲胺及甲醛进行门尼希 (Mannich) 反应, 设计合成了6个Mannich碱衍生物, 并将Mannich碱与盐酸作用制备成盐酸盐, 不但提高了其水溶性, 而且不改变酚羟基的结构, 保持了5-OH和7-OH活性, 且不影响其他药效基团的引入 (Mannich碱衍生物及其盐酸盐的合成路线如图8中路线 (a为1～4, b为5～6) 。

路线a:化合物1:X=-CH3, Y=-CH3;化合物2:X=-H, Y=;

化合物3:X=-CH2CH2CH3, Y=-H;化合物4:X=-CH2CH2CH2CH3, Y=-H

路线b:化合物5:X=-H, Y=

;化合物6:X=-CH3, Y=-CH3

5 染料木素配合物的合成

李华[14]曾研究了染料木素铬配合物的合成, 并通过元素分析、质谱、差热—热重分析、红外和紫外光谱对配合物的组成及结构进行了表征。结果表明配合物的组成为CrL3·2H2O, 其中3个染料木素配体通过5—OH失去质子后的氧原子以及4位的羰基氧与铬离子配位成键, 形成了配位数为6的配位结构 (见图9) 。

樊娟等[15]曾研究了染料木素钐及镧配合物的合成, 并通过元素分析、质谱、差热—热重分析、红外和紫外光谱对配合物的组成及结构进行了表征。结果表明染料木素钐及镧配合物的组成分别为SmL2·OAc·4H2O和LaL2·OAc·8H2O。

6 染料木素分子印迹聚合物的合成

分子印迹技术是近年来集高分子合成、分子设计、分子识别、仿生生物工程等众多学科优势发展起来的一门边缘学科分支。分子印迹聚合物由于具有与天然抗体同样的识别性能和与高分子同样的抗腐蚀性能的双重优点, 因而广泛应用于生物工程、临床医学、环境监测、食品工业等众多领域。赵景婵等[16]是采用热聚合法, 以染料木素为模板分子, 丙烯酰胺为功能单体, 己二醇二甲基丙烯酸酣为交联剂, 偶氮二异丁腈为引发剂, 在甲醇和N, N-二甲基甲酰胺 (ψ1:ψ2=9:1) 混合溶剂中制备分子印迹聚合物, 并对聚合物进行表征。本实验制备了天然提取物染料木素的分子印迹聚合物, 研究了聚合物的吸附性能, 考察了吸附过程的动力学。研究结果表明, 该聚合物对染料木素具有特异的吸附性能。

7 结 语

异黄酮化合物染料木素不仅来源广泛, 更重要的是其具有雌激素样作用、抗癌、防治骨质疏松、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化等丰富的生理活性, 所以广泛应用于制药、保健品等领域。如国内外已批准多种主含染料木素的异黄酮产品作为食用于人群。美国国家肿瘤研究中心于1996年已将染料木素列入肿瘤化学预防药物临床发展计划, 主要目标是乳腺癌和前列腺癌。1998年美国食品药品监督管理局同时批准两种主含染料木素 (150mg/粒) 胶囊的食品用于人群。另外还可用于女性养颜保健和预防血液疾病。因此, 以染料木素为先导化合物, 改造其化学结构, 寻找药理活性和生物利用度高的衍生物, 是当前该研究领域的一项重要课题。本文旨在通过对近年来染料木素结构修饰的综述, 以促进染料木素及其衍生物的进一步研究和应用, 开发出生理活性更高的染料木素衍生物, 以造福于人类。

摘要：异黄酮类化合物染料木素具有明显的雌激素样作用、抗癌、防治骨质疏松、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化等生理活性。近年来已逐渐成为国内外学者研究的热点。本文着重对染料木素的结构修饰进行了综述, 以促进其研究和应用。

关键词：染料木素,结构修饰,综述

多糖结构修饰研究 篇2

摘要连体修饰结构「ような」在以往的研究中多被视为「ようだ」的连体形，很少被单独论及。本文认为「ような」是从「ようだ」中分离出来的独立表现形式，「ような」具有使特征具现化的功能。并且「ような」结构欲成立，连体修饰成分和被修饰目标之间必须具有相似性，还要受到语用条件的制约。论文关键词：ような,连体修饰,语义条件,语用条件 井上(1993)认为「ような」是“个体参照性的特征描述”，并以与「この、その、あの」之间的关联性为中心进行了论述。森山(1995)将连体修饰成分和被修饰名词之间的关系分为“不一致关系”“不明关系”“包含关系”三种，并将各自对应的用法分为“比喻”、“推量”和“示例”。仅仅阐述了「ような」也有表示特征的情况。此外，森田以「ような」和「みたい」能够互换的情况为中心进行了考察，但事实上如（1）不可以互换的例子大量存在。

（1）a 別府に、別府から湯布院に行くような道がこう山沿いにずーっとあるじゃんね。（名大会話）

b *別府に、別府から湯布院に行くみたいな道が山沿いにずーっとあるじゃんね。

森山是从意义·用法的观点对「ような」进行考察的。本文从讲话者出于何种目的使用「ような」、听话者·读者会如何理解的观点进行分析。关于「ような」的分析

2.1 特征的具现化 形容词典型的功能就是表现属性。因此，提及表达事物属性，首先想到的就是形容词（日语里还包括形容动词）。

（2）きれいな人が好きです。（作例）

（3）それ、大きい病院にあるんじゃないの。（作例）

（2）中讲话者传达的信息是喜欢“漂亮的人”。同样，（3）中讲话者想要传达的信息的焦点在于“大医院”。「きれいな人」和「大きい病院」都表现程度，可是漂亮到什么程度、大到什么程度，（2）和（3）都没表达出来。下面使用了「ような」的（4）（5）的句子会有什么效果呢。

（4）花子のような人が好きです。（作例）

(5)A さん: 脳外科はたぶん、れーざーが相当普及しているんだよね。

B さん：どこの病院でもってわけにいかないでしょ、でも。

C さん：うーん、でも手術を行うような病院にはあるんじゃないの。（名大会話）

（4）中，讲话者喜欢的不是“花子”，而是“有花子所具有的属性的人”。这个属性可以是「きれい」，也可以是别的，任何一个具有这种属性的人都可以。即「花子のような人」是提出“花子”这一具体的个体、并表现其特征的表现形式。因此，若没有「ような」出现，其属性也就不会有所体现。

（6）*花子の人が好きだす。

（7）

花子が好きだす。

显然，(6)不成立的。（7）中“喜欢的人”也就仅限于“花子”.此时“花子”并不是用于来表现具体特征的。

另外，（4）（5）也有相似的说法。（5）中，讲话者所要传达的中心内容是“具有进行手术能力的医院”。即「手術を行う」是判断医院规模的指标之一，讲话者的中心意图就是具备那种程度的水准·规模。（5）中若除去「ような」意思就会发生变化。

（8）A さん: 脳外科はたぶん、れーざーが相当普及しているんだよね。

B さん：どこの病院でもってわけにいかないでしょ、でも。

C さん：うーん、でも手術を行う病院にはあるんじゃないの。

（8）中划线部分表达是完全正确的。但意思和（5）已经发生变化。（5）「手術を行うような病院」是「手術を行うくらいの規模·質を有する病院」的意思，所关注的是医院的规模或水准。与此相对，（8）中「手術を行う病院」可以理解为「通常業務として手術を行っている病院」，与医院的规模和水准无关。因此，「ような」有具现属性的功能。「ような」和形容词在表现属性这一点上是相同的，但是也有所区别。如下例所示，「ような」可以表达多个属性特征，而形容词则只能表示单一属性特征。

（9）社会保険庁の無責任な個人データの管理には心底、怒りを覚えます。

（10）五千万件の「宙に浮いた」年金記録のような個人データには

心底、怒りを覚えます。

（9）中「無責任な」只表示“不负责任”这一特征。与此相对（10）能够表示划线部分的连体修饰成分「五千万件の『宙に浮いた』年金記録」所具有的一切特性。关于「五千万件の『宙に浮いた』年金記録」人们的共同认识就是「でたらめ」、「無責任」、「杜撰」等负面印象。（10）中这些评价语虽然没有出现，但通过「五千万件の『宙に浮いた』年金記録」将这些意思全包含进去了。因此在（11）中，可以同表示这种意思的形容词·形容动词同时出现。

（11）五千万件の「宙に浮いた」年金記録のような、社会保険庁のでたらめ、杜撰、無責任な個人データの管理には心底、怒りを覚えます。（朝日新聞 2007・07・12）

2.2 「ような」和形容词 2.1 中已提到「ような」可以表多个特征。因此想要强调多个特性中的某一个的时候，就像（12）那样经常添加修饰语。

（12）花子のようなきれいな人が好きです。

（12）中「ような」节和形容动词「きれいだ」一起使用。安田（1997）认为这种情况下很强的“示例”的意思。由于是和表示特征的词共起，可以将「花子のような」视为“示例”，可这里并非单单的“示例”。

通过「花子のような」和“漂亮”的共起，在花子众多特征中选定“漂亮”这一特征作为焦点。

（13）是被修饰成分「美人」不本身就含有“漂亮”这一特征的情况。

（13）花子のような美人が好きです。（作例）

「美人」是含有“漂亮”这一特征的名词，因此同（12）有相同的表达效果。这类名词还有「美男」「若者」等。

2.3 使用「ような」结构的理由 本文认为使用「ような」结构的理由有如下两个。

一、

便于向听话者·读者传达自己所要表达的特征·属性。形容词所表达的特征是单一的、抽象的。为此，通过使用「ような」可以对其程度加以限定，更易于理解。

二、

有时候单靠形容词难以达到表达的目的。如（14）中，很难选出一个可取代连体修饰成分的形容词。

（14）苦虫をかみつぶしたような顔を見ると、会社での表情まで想像できた。（朝日新聞 2007．04．24）

因此，在形容词无法贴切表达的情况下，更倾向于使用「ような」这一连体修饰结构。「ような」的成立条件 上面已经提到「ような」具有具体体现某种特征的功能，但并非只要是表达特征就适用于任何情况。

「ような」的使用必须满足以下条件。

3.1 语义条件 连体修饰成分和表现目标必须具有特征上的相似性。

（15）11 月とか 12 月は、本当に地獄のような日々だから、まずいけどね。（名大会話）

（15）中连体修饰成分“地狱”和表现目标之间存在着共通的特征---痛苦等负面形象。这也是（15）成立的理由。

连体修饰成分和表现目标之间的关系多种多样。（16）就是表达程度的例子。

多糖结构修饰研究 篇3

1 芬太尼及其他的重点类似物

在研究4-苯胺基哌啶类合成镇痛药的基础上, 20世纪60年代初, Janssen[4]合成的一种起效快、强度高和作用时间适宜的麻醉性镇痛药芬太尼 (Fentenyl) , 其镇痛强度为吗啡的200倍左右, 属高效麻醉镇痛剂 (图1) 。

研究结果表明, 芬太尼是一个主要作用于中枢神经系统的μ型阿片受体的激动剂, 给药后能够产生全身麻醉镇痛药效, 但也导致流汗、呼吸急促、四肢无力等不良反应, 严重时会造成中枢神经系统紊乱, 瘫痪、甚至威胁生命安全。因此, 为了减少不良反应, 人们开展了芬太尼结构修饰的一系列研究工作。

自芬太尼类化合物的镇痛活性被发现后, 人们对其结构进行了多种改进, 以便更好地研究芬太尼类化合物的构效关系。近年来, 对强效麻醉性镇痛剂芬太尼的结构改变研究发现, 在芬太尼分子中哌啶环上3-位引入甲基[5,6,7] (图2) 或4-位引入某些极性基团[8,9] (图3) 均能导致镇痛活性显著提高。3-位引入甲基后, 使其分子形状更趋固定, 结构更接近于吗啡, 相当于吗啡“C”环的一部分[10]。3-甲基芬太尼、4-甲氧甲基芬太尼, 4-乙酰基芬太尼和4-甲氧羰基芬太尼的镇痛强度分别为芬太尼的19、15.9、19.3和34.4倍[11]。量子化学计算和光晶体结构研究认为, 这些基团引入后提高活性的主要原因是它们改变了分子的构象和活性部位的电子结构从而有利于与受体的结合[12,13,14,15]。

因此, 寻找高活性基团, 主要围绕着3-甲基芬太尼类和4-甲氧羰基芬太尼类化合物的1-位或者4-位取代酰胺基团进行结构修饰研究。

2 芬太尼类化合物1-位取代基结构修饰

不管是芬太尼、3-甲基芬太尼、4-甲氧羰基芬太尼, 还是3-甲基-4-甲氧羰基芬芬太尼, 其哌啶环1-位上的结构修饰, 具有非常重要的意义。构效关系研究已经表明, 1-位与氮原子相连的两个亚甲基后连接芳香环、不饱和基团及具有负电荷中心的基团, 对活性有重要的贡献[15]。因此, 对芬太尼类化合物的1-位结构修饰非常有意义。

2.1 3-甲基芬太尼类化合物1-位结构修饰

通过对3-甲基芬太尼1-位结构的修饰中发现, 1-位侧链基团的结构与镇痛活性以及麻醉活性的大小有密切关系。研究表明, 3-甲基芬太尼哌啶环上的氮原子与1-位取代基苯环间的距离以两个碳原子为最好, 大于或小于两个碳链, 均导致镇痛作用明显下降[5]。和在镇痛活性中的情况相类似, 1-位氮原子间隔两个碳原子连接一适宜活性基团显示出强效麻醉活性。

该基团为环状基团时以苯基活性最强 (3-甲基芬太尼) 。苯基被不同杂环基团取代除4-咪唑基和1, 3-二氧六环基取代化合物麻醉活性接近于3-甲基芬太尼外, 其余化合物的麻醉活性均显著降低。苯基被不同胺基取代为N-甲基苯胺基取代化合物具有与3-甲基芬太尼相当的强效麻醉活性。

20世纪70年代末, 由中科院上海药物所朱有成等在3-甲基芬太尼 (图4) 的1-β-位上引入一个羟基, 发现其麻醉镇痛活性显著增强[16]。实验数据证明, 在目前已知的3-甲基芬太尼类化合物中, 羟甲芬太尼的作用强度最强[17], 镇痛活性为芬太尼的28倍, 吗啡的6318倍[18]。其其顺顺式式异异构构体体在在小小白白鼠鼠上的镇痛效能是吗啡的7000倍 (ip, 热板法) [5]。羟基被酯化或被其他基团取代均导致麻醉活性降低。其中活性最强的巯基取代化合物的麻醉活性也仅为相应羟基化合物 (Hofentanyl) 的1/4。表明β-羟基对于产生强效麻醉活性有重要的作用[16]。

有趣的是, 苯基被某些取代乙烯基替代后也显示出很强的镇痛麻醉活性, 北京药物化学研究所朱国政[19]等曾对3-甲基芬太尼1-位侧链进行改变, 以取代乙烯基, 氰基替代1位侧链上的β-苯基, 发现1-位β-乙烯基引入芳环后活性较差, 而引入Cl、CH3这样的小集团可保持高镇痛强度, 与3-甲基芬太尼相当或接近。以氰基代替苯基镇痛活性下降。表明某些取代乙烯基是可替代1-β-苯基导致产生强效麻醉活性的一种有效结构。

对3-甲基芬太尼的l-苯乙基用不同直链烷烃进行取代, 结果表明碳链长度为2~8个碳原子的取代衍生物均有较强的镇痛活性, 为吗啡的2~l80倍。其中以5~6个碳原子长度的直链烷烃取代物镇痛活性为最强, 小鼠扭体试验的镇痛效能分别为吗啡的l67和126倍, 但都未超过3-甲基芬太尼的作用强度。这与在芬太尼系列及4-取代芬太尼系列中的情况是一致的[17], 见表1。

注:表中ED50值为小鼠i.v给药后意识消失的值

表2中所列的结构几乎都是3-甲基芬太尼类活性最强的。从表2和表3中可以看出: (1) 二苯羟乙基的活性与苯羟乙基相当, 但随亚甲基链的增加而减弱; (2) 1-位上的大基团似乎不影响活性; (3) 亚甲基β-位上含氧原子基团, 对活性的提高有较大的贡献; (4) 顺式异构体较反式异构体活性强, 约强1个数量级。

2.2 4-甲氧羰基芬太尼类化合物1-位结构修饰

芬太尼类化合物哌啶环4-位引入个适当的极性基团能大大增强该类化合物的镇痛活性。如在4位上引入甲氧甲基、苯基、甲氧羰基, 乙酰氧基等。最令人兴奋的是, 4位引入甲氧羰基基团的芬太尼类化合物结构类型, 是迄今为止所发现的麻醉镇痛强度最强的结构类型, 其镇痛活性强度较之4-甲氧甲基对活性有更重要的作用[20]。

研究表明, 哌啶环位1-取代基中β位上基团的结构与性质对镇痛活性有显著影响。值得注意的是, 一系列取代烯丁基化合物显示了很

在1-β取代胺基乙基的化合物中, 取代基为脂肪烃的化合物未显示出镇痛活性, 而取代基为苯基时, 特别是N-甲基苯胺基化合物显示出强效活性。显然, 在取代芬太尼化合物中, 1-位侧链位置存在适宜活性基团对产生强效麻醉活性是必须的[23]。当苯胺基为其电子等排体的苯氧基取代, 镇痛活性显著降低其原因是由于氮原子与氧原子之间的电性差异, 还是由于苯环在空间的排布不同, 有待探讨。1-β-苯乙基的苯环以某些芳、杂或脂环取代仍能保持强效镇痛活性[21]。

如果在4-甲氧羰基芬太尼化合物1-位苯环的对位引入某些烷化基团后, 尽管仍然保持其吗啡样镇痛活性, 但其镇痛强度远远低于4-甲氧羰基芬太尼本身, 这说明一位苯环位置上的取代基的空间效应对镇痛活性有较大影响[22], 见表4。

从表4可以看出, 哌啶环1-位N上β亚甲基上直接连接烯烃、取代烯烃、芳香基 (六元或五元环) 活性较高, 比3-甲基芬太尼类化合物高, 其活性基团强弱程度几乎与3-甲基芬太尼类化合物相一致。

2.3 3-甲基-4-甲氧羰基芬太尼类化合物1-位结构修饰

3-甲基4-甲氧羰基芬太尼类化合物是一类镇痛活性强度与3-甲基芬太尼类和4-甲氧羰基芬太尼类相当的强效麻醉性镇痛剂。比较一组1-位取代基相同的3-甲基4-甲氧羰基基芬太尼类、3-甲基芬太尼类和4-甲氧羰基芬太尼类化合物的镇痛活性, 发现前者的构效关系更类似于3-甲基芬太尼类。二者1-位上的苯乙基被取代烯丁基替代后镇痛活性明显降低, 而被2-羟基-2-苯乙基替代后活性提高[24], 见表5。

表5数据表明, 3-甲基-4-甲氧羰基芬太尼类化合物与4-甲氧羰基芬太尼类化合物相比, 镇痛活性并没有提高。其顺式异构体的活性与4-甲氧羰基芬太尼类化合物相当, 而反式异构体的活性则与3-甲基芬太尼类化合物相当。

3 芬太尼类似物的高效活性基团总结

根据上述几个表的数据, 我们对芬太尼类似物的取代基高效活性基团做了初步总结 (图5) :

下面是已经合成过并具有高镇痛的基团:

多糖结构修饰研究 篇4

从结构上看,姜黄素是一类1,7-二(4-羟基-3-甲氧基)苯基-1,6-庚二烯-3,5-二酮类化合物(图1),研究人员对其结构的改造主要是集中在芳香环和连接桥链上,由此获得了一些具有靶向性、高活性的衍生物。本文主要对近年来姜黄素结构修饰及抗肿瘤作用的研究进展进行综述,旨在为其进一步开发姜黄素衍生物提供参考。

1 苯环的修饰

对姜黄素苯环的修饰主要包括将酚羟基成醚、成酯、增加或改变酚羟基的位置、去掉酚羟基或甲氧基以及在苯环上引入其他基团等修饰。

1.1 苯环的酚羟基成醚或酯

Shi等[3]将姜黄素的酚羟基修饰成甲氧基得到化合物2,对前列腺癌PC-3和LNCa P展现出了较强的抑制活性,其IC50分别为1.1m M和1.3m M。进一步研究发现,化合物2可能是通过雄激素的降解作用来发挥抗肿瘤活性。

除了成醚外,将酚羟基修饰成酯也能够提高抗肿瘤活性。Mishra等[4]将姜黄素的酚羟基修饰成不同的酯,其中化合物3~4通过下调与凋亡相关的蛋白Bcl-2等,诱导AK-5肿瘤细胞的凋亡。

1.2 苯环增加或改变酚羟基的位置、去掉酚羟基或甲氧基

Venkateswarlu等[5]合成了一系列的多羟基类姜黄素衍生物,活性测试发现,这类多羟基化合物具有较好的清除过氧基化合物和DPPH自由基的作用,如化合物5对道尔顿淋巴瘤有较强的抑制活性。

另外,Ishida等[6]研究发现,用氟原子代替姜黄素的酚羟基(化合物6)对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用。

1.3 苯环被甲基或杂环取代

Lin等[7]发现,将姜黄素的一个苯环用甲基取代后得到的化合物7也具有较强的抗肿瘤活性。但是,将苯环用五元杂环(化合物8~9)取代后降低了抗癌活性。

2 1,6-庚二烯-3,5-二酮连接的修饰

2.1 活性亚甲基的修饰

由于姜黄素的连接链是一个大共轭体系以及b-二酮的结构,因此姜黄素的亚甲基有较高的活性并有一定的酸性,能够被修饰。事实上,目前对姜黄素的修饰主要是集中在亚甲基上。

Ohtsu等[8]以姜黄素为先导化合物,主要是在C4位亚甲基引入一系列的取代基,其中以引入丙酸乙酯(化合物10)具有较强的抗前列腺癌的活性。但是将丙酸乙酯修饰成丙烯酸乙酯(化合物11)、丙烯氰(化合物12)等均降低了化合物抗前列腺癌的活性[7]。

11:R=CO2Et;12:R=CN

除了引入丙烯酸甲酯基能够提高姜黄素的抗肿瘤外,在姜黄素的C4位引入苯甲烯结构也能够显著提高抗癌活性,如化合物13~16对肺癌A549的抑制活性明显高于姜黄素,其GI50在0.35~0.55m M[9]。

此外,Youssef等[10]还合成了一系列的C4位亚甲基含脂肪环姜黄素衍生物,这些环己酮和环戊酮的衍生物对L1210均有良好的抑制活性,相比之下环戊酮衍生物的活性较环己酮衍生物的活性更好,其中化合物17(IC50=8.3μM)对L1210的抑制活性最强。

2.2 单羰基的修饰

将姜黄素连接链修饰成单羰基也是姜黄素结构修饰的一个研究热点,其中部分单羰基姜黄素衍生物也展现出了优秀的抗肿瘤活性。

Fuchs等[11]将姜黄素的2个羰基去掉一个后得到的单羰基衍生物对前列腺癌PC-3、LNCa P细胞和乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞的抑制活性均强于姜黄素,其中化合物18的活性最强,其对4种肿瘤细胞的IC50分别是2.1μM、0.5μM、0.4μM、0.6μM。Zhou等[12]以化合物18为先导化合物,将其一个苯环用环己烯取代得到了一系列的衍生物,这些衍生物(化合物19)只展现出了中等的抗前列腺癌活性。

Liang等[13]也是以化合物18为先导化合物,在C4位引入环戊烷或环己烷。其中环戊烷的衍生物对KB和Le La细胞有着较好的抑制作用,如化合物19(IC50<9.3μM)对KB的抑制作用最强,是姜黄素(IC50=35.9μM)的4倍。相比环戊烷,环己烷类化合物对HL-60和KB有着较强的抑制活性,其中化合物20对KB(IC50=6.7μM)的抑制作用最强,是姜黄素的5倍。Suarez等[14]也是以化合物18为先导化合物,将其羰基用丙二氰取代得到了化合物21,该化合物对多种肿瘤细胞均有较强的抑制活性,其中对NCI-ADR的抑制活性最强,其IC50值为2.97μM。

Tan等[15]则以化合物19为先导化合物,将环戊烷修饰成哌啶环或噻己烷。总的来说,环戊烷类化合物的抗肿瘤活性比环己环、哌啶环和噻己环类化合物的活性低;而哌啶环和噻己环类化合物对HL-60和K562的抑制活性又明显高于环己环类化合物,但是将环己环类化合物上的一个苯环用吡啶环取代后抗肿瘤活性显著增加了,其中化合物22对NB4、NB4-R1、HL-60、K562等的抑制活性最强,其IC50值分别是0.19μM、0.24μM、0.18μM、0.24μM。

Wei等[16]则基于杂环类似化合物能够提高抗肿瘤活性,合成了一系列的哌啶、吡喃和噻己环类的化合物,其中吡喃类化合物的抗肿瘤活性最强,如化合物23对PC-3、Panc-1和HT-29的抑制活性IC50分别是0.27μM、0.52μM、0.16μM。

Yadav等[17]则在姜黄素C4位引入哌啶环并将氮原子进行了甲基化,这种含有哌啶环的化合物比含有环戊烷或环己烷的化合物具有更强的抗乳腺癌活性,其中化合物24对乳腺癌MDA-MB-231的抑制活性最强,其EC50为0.3μM。Simoni等[18]也发现哌啶类化合物25对于Caco-2和SH-SY5Y有着较强的抑制活性,然而该化合物对正常的细胞也有较强的毒性。但是,在化合物25哌啶基的氮原子上引入一系列的具有神经保护的基团,能明显降低对正常细胞的毒害作用,并保留较强的抗肿瘤活性(化合物26。Makarov等[19]合成了一系列的苯环被噻吩环取代的哌啶磷酰胺类化合物,这些化合物也对多种肿瘤细胞有着较强的抑制活性,其中化合物27对Scov-3、Caov-3和A549的抑制活性最强,其IC50分别为8μM、10μM、4μM。Kalai等[20]也对哌啶氮进行衍生化,主要是将一系列的吡咯环引入到哌啶氮上,同时在苯环上用氟或三氟甲基进行取代。这些含吡咯环的化合物对A2780,MCF-7和H9c2均展现出了较好的抑制活性,其中化合物28对这3种肿瘤细胞的抑制活性最强。

Das等[21]则以化合物24为先导化合物,通过一系列的连接片段将2个化合物23的类似物进行拼接得到了一系列的二聚化合物29,这些化合物对HSC-2、HSC-3、HSC-4、HL-60均有较强的抑制活性,其中化合物29b的抑制活性最强,其IC50值分别为0.050μM、0.046μM、0.084μM和0.064μM。但是,在化合物29b的苯环上引入取代基降低了抗癌活性[22]。Hela等[23]则通过连接片段拼接了一系列的含碱性侧链(化合物30和31),以模仿抗乳腺癌药物他莫昔芬。这些碱性侧链的引入提高了化合物30(IC50=0.65μM)、31(IC50=0.49μM)对HCT-116的抑制活性,其活性至少是阳性药物5-氟尿嘧啶(IC50=3.56μM)的5倍。

Zhang等[24]则以姜黄素为先导化合物,将苯环上的酚羟基进行修饰,一系列的含氮杂环(咪唑、吲哚)被引入到了酚羟基上得到了一系列的衍生物。总的来说,这些含氮杂原子的引入(如化合物32)并没有增加抗肿瘤活性,反而丧失了对一些肿瘤细胞的抑制活性。但是将含氮的杂环改为酰胺后却能保留对多种肿瘤细胞的抑制活性,其中化合物33对多种肿瘤细胞的抑制活性甚至略高于先导化合物姜黄素。

Woo等[25]则将苯并咪唑环取代姜黄素的苯环,这些苯并咪唑化合物对MCF-7、SH-SY5Y、Hep G2和H460的抑制活性均强于姜黄素,其中化合物34对这4种肿瘤细胞的抑制活性最强,其IC50分别是1.9μM、4.6μM、3.7μM、7.2μM。但是与他莫昔芬相比这些化合物的抗肿瘤活性仍然较弱。

2.3 b-二酮的修饰

姜黄素具有b-二酮结构,酮基能够参与缩合等反应来构建一系列杂环化合物。Simoni等[26]将姜黄素的一个羰基用氨基取代,其中脂肪胺化合物35a、35c和35e展现了中等抗乳腺癌的活性,而含有芳香胺的衍生物(化合物35b和35d)却没有抗癌活性。当2个羰基被转化成异唑(化合物36,IC50=13.1μM)后,抗乳腺癌MCF-7的活性是姜黄素(IC50=29.3μM)的2倍。但是,当羰基被转化成肟衍生物时,却是含有苯环的肟(化合物37a,IC50=7.1μM)能够增强抗乳腺癌活性,而烷烃取代(化合物37b,IC50=36.3μM)却降低活性。

Ishida等将姜黄素的2个羰基与肼反应得到了咪唑类化合物38,该化合物对多种肿瘤细胞有着较强的抑制作用。此外,Qiu等[27]也以姜黄素为先导化合物,将b-二酮的2个羰基形成嘧啶环后增加抗肿瘤活性,其中化合物39展现出了最强的抗肿瘤活性,其抑制HT29和HCT-116的IC50值分别为7.1μM和6.2μM。

3 结语

本文对近年来姜黄素衍生物的研究进行总结,并初步阐述结构修饰对姜黄素抗肿瘤活性的影响,大致可以总结出以下几个规律:1)姜黄素的C4位酚羟基对抗肿瘤活性影响较大,将其修饰成醚、酯或用其他基团取代,能够增强抗肿瘤活性;2)姜黄素的C4亚甲基引入适当的取代基如苯甲烯基,能够提高抗肿瘤活性;3)姜黄素的b-二酮转化为单羰基后,包括含有杂环的单羰基或单羰基二聚物均能提高抗肿瘤活性;4)姜黄素的b-二酮结构也是一个抗肿瘤药效团,而该药效团能够被吡唑、嘧啶等杂环取代并保留抗肿瘤活性,对一些肿瘤细胞的抑制活性甚至有提高。

总之,对姜黄素进行结构修饰能够提高抗肿瘤活性,并取得一定的进展,但是目前报道的姜黄素衍生物抗癌效果与上市的抗癌药物相比仍然较弱。因此,进一步对姜黄素进行结构修饰以筛选出生物活性高效、专一的姜黄素衍生物值得研究。

摘要：姜黄素是一种天然的多酚类物质,广泛分布在多种植物中,并具有多种生物活性。但是其存在自身抗肿瘤作用较弱、生物利用度低等缺点,使其临床应用受到了限制。基于此,研究人员对姜黄素进行了大量的结构修饰,以期改善其抗肿瘤活性和成药性。本研究主要对姜黄素的结构修饰及抗肿瘤作用研究进展进行综述,旨在为以后合成高效专一活性的姜黄素衍生物提供依据。

多糖结构修饰研究 篇5

由于植物中所含环烯醚萜化合物的种类有限,因此对其进行结构修饰,获得与天然产物母核结构相似的衍生物,是增加这类化合物数量的重要途径;同时,在原来的分子结构中引入新的助色基团,很可能改变其与底物发生交联反应后所呈现的颜色,从而拓宽“天然交联呈色染料”的色谱范围。

本文选取京尼平苷、马钱素和莫诺苷(结构式见图1)这3种天然环烯醚萜进行结构修饰,并考察它们在不同缓冲体系中与最简单的含伯氨基化合物一甲胺的呈色情况;在此基础上探讨环烯醚萜类化合物的结构与其所形成色素颜色的关系。

1 试验部分

1.1 试剂及仪器

京尼平苷、马钱素、莫诺苷由本实验室分别从栀子和山茱萸中提取[6],β-葡萄糖苷酶为Sigma公司产品,由上海生化试剂有限公司分装提供;

硅胶薄层板、PBS缓冲溶液(phosphate-buffered saline,pH=8.0)、醋酸缓冲溶液(ACE,pH=5.0)和甲胺盐酸盐由本实验室制备;

其它常用化学品均从成都化学试剂厂购买;

UV-vis,Tv-1901,由北京嘉润科技发展有限公司生产。

1.2 环烯醚萜的结构修饰

1.2.1 苯甲酰氯溶液的制备

将1.2g苯甲酸加入到10g二氯亚砜中,于冰水浴中干法搅拌反应12h,待冰融化后用50mL二氯甲烷萃取3次,用无水硫酸钠干燥(过夜),回收二氯甲烷,得到目标产物0.83g。其流程如图2所示。

1.2.2 天然环烯醚萜苷与苯甲酰氯的反应(以京尼平苷为例)

称取京尼平苷0.2g置于250mL的三角瓶中,用50mL二氯甲烷溶解,按京尼平苷:三乙胺:苯甲酰氯=1.0:1.1:1.1 (摩尔比)依次投料,于冰水浴中磁力搅拌反应,用TLC跟踪检测反应过程,反应完全后减压回收溶剂。产物加水溶解,用二氯甲烷萃取3次,每次50mL,合并有机层,用1.5mol/L盐酸溶液洗涤有机相以中和体系中的三乙胺,用无水硫酸钠干燥(30min),减压回收溶剂,流程见图3。

马钱素、莫诺苷分别按照上述方法与苯甲酰氯反应,得到各自的修饰产物(见图4)。

1.2.3 环烯醚萜苷的酶水解

一般来说,只有环烯醚萜苷元才能直接与含伯氨基化合物发生交联呈色反应,因此,3种环烯醚萜苷及其修饰产物都要经过酶水解以获得相应的苷元,其流程如图5所示[2]。

1.3 苷元及修饰产物与甲胺的呈色反应

1.3.1 在ACE缓冲溶液中的呈色反应

各称取京尼平、马钱素苷元、莫诺苷苷元及对应的结构修饰产物化合物a、化合物b、化合物c各15mg,分别溶于6支盛有5mL水的试管中,同时分别加入醋酸缓冲溶液(5mL,pH=5.0),在35℃恒温水浴槽中振荡20min后,分别加入20mg甲胺盐酸盐于上述试管当中,持续振荡,用UV-vis考察溶液在24h内的特征吸收波长变化情况。

水解所得到的6种苷元如图6所示。

1.3.2 在PBS缓冲溶液中的呈色反应

各称取京尼平、马钱素苷元、莫诺苷元及对应的结构修饰产物化合物a、化合物b、化合物c各15mg,分别溶于6支盛有5mL水的试管中,同时分别加入PBS缓冲溶液(5mL,pH=8.0),在35℃恒温水浴槽中振荡20min后,分别加入20mg甲胺盐酸盐与上述试管当中,持续振荡,用UV-vis考察溶液在24h内的特征吸收波长变化情况。

2 结果与讨论

2.1 关于环烯醚萜苷的结构修饰

自从合成染料问世以来,人们就开始对染料的颜色与其分子结构之间的内在联系进行研究,一般认为:当物质对波长大致在380～780nm范围内的光波产生吸收时才能呈现颜色,并且其分子结构中一般含有由多个共轭双键组成的共轭系统,这些共轭系统往往还带有供电子基团,成为一个发色体系。

鉴于苯甲酰基自身的反应特性,选取京尼平苷、马钱素和莫若苷这3种闭环环烯醚萜进行酰化反应,目的是在分子中引入一个π-π发色基团,从而考察天然环烯醚萜进行结构修饰后,与甲胺发生呈色反应时特征吸收波长的变化规律,并为扩充这类“天然交联呈色染料”的色谱范围探索新路。

2.2 苷元及修饰产物与甲胺的呈色结果

2.2.1 马钱素苷元及修饰产物与甲胺的呈色反应结果

马钱素苷元的特征吸收峰在入=239nm处(见图7中I)。马钱素苷元与甲胺在ACE中发生呈色反应时,0～40min内,反应液由无色变为浅黄色,同时入=239nm处的特征吸收峰呈明显的下降趋势,随着反应的进一步进行,在λ=280～300nm处有吸收,溶液的颜色发生了变化,由浅黄色变化至红褐色,5h后,在入=560nm处出现新的特征吸收峰(如图7中Ⅱ),溶液渐变为紫色,随着反应时间的增长,溶液颜色无明显变化,并生成最终的紫色水溶性色素;而在pH=8.0的PBS缓冲液中,反应液的颜色由浅黄色逐渐变深,并在入=430nm和入=650nm处有新的特征吸收(如图7中(Ⅲ),在5h后形成最终的黄绿色可溶性色素。

马钱素苷元的改性产物化合物b,在ACE中与甲胺反应时,反应体系的颜色也是逐渐发生变化的,最终色素的特征吸收波长为610nm,呈蓝色;在PBS中反应时,最终色素的2个特征吸收波长分别为465nm和670nm,呈绿色。2种色素的紫外可见光谱见图8。

2.2.2 京尼平及修饰产物与甲胺的呈色反应结果

京尼平及修饰产物与甲胺在不同pH值缓冲体系中呈色反应结果见表1。

2.2.3 莫诺苷苷元及修饰产物与甲胺的呈色反应结果

莫诺苷苷元及修饰产物与甲胺在不同pH值缓冲体系中的呈色反应结果见表2。

2.3 讨论

(1)将图7和图8综合进行分析,可以看出:化合物b是马钱素苷元与苯甲酰氯反应所生成的C-6位苯甲酰化了的衍生物。在同样的呈色反应体系中,与天然环烯醚萜母体相比,它们的特征吸收波长都变大,色素的颜色也不同。比如在PBS中,特征吸收波长由原来的430nm和650nm向长波方向移动至465nm和670nm,颜色也由橙黄色变为绿色。这是由于苯甲酰基这样的π-π共轭体系的引入,使得分子能量降低。化合物a、化合物c与原来的天然环烯醚萜母体相比,与甲胺呈色时,也表现出类似的规律。

(2)同一结构的环烯醚萜,在不同的缓冲体系中(PBS,pH=8.0和ACE,pH=5.0)生成色素的颜色也有差别。综合图7、图8、表1和表2的数据进行分析,可以看出,一般来说,在PBS中发生呈色反应,其产物的λmax比在ACE中生成色素的λmax要大。

3 结论

(1)骨架相同而取代基不同的环烯醚萜与甲胺进行呈色反应,会生成不同颜色的可溶性色素;同一种环烯醚萜在不同的缓冲体系中(PBS,pH=8.0和ACE,pH=5.0)生成色素的颜色也不相同,一般来说在PBS中发生呈色反应,其产物的λmax比在ACE中生成色素的λmax要大。

(2)在马钱素苷元的结构中引入苯甲酰基π-π共轭体系后,在PBS中与甲胺进行呈色反应,生成色素的特征吸收波长由原来的430nm和650nm向长波方向移动至465nm和670nm,颜色也由橙黄色变为绿色;在ACE中进行呈色反应,生成色素的特征吸收波长从560nm变为610nm,颜色由紫色变为蓝色。产生红移现象的原因可能是新的助色基团的引入,使呈色基团的共轭体系变长,能量降低。

(3)与马钱素苷元一样,京尼平和莫诺苷苷元的修饰产物也表现出类似的性质。

摘要：选取马钱素、莫诺苷、京尼平苷3种天然环烯醚萜进行结构修饰,并考察修饰产物与最简单的含伯胺基化合物—甲胺的呈色反应性能。通过紫外-可见光谱(UV-vis)分析它们所形成色素的颜色与其结构之间的关系。结果 表明:(1)骨架相同而取代基不同的环烯醚萜与甲胺进行呈色反应,会生成不同颜色的可溶性色素;同一种环烯醚萜在不同的缓冲体系中(PBS,pH=8.0和ACE,pH=5.0)生成色素的颜色也不相同。(2)在马钱素苷元的结构中引入苯甲酰基π-π共轭体系后,在PBS中与甲胺进行呈色反应,生成色素的特征吸收波长从430nm和650nm变为465nm和670nm;在ACE中进行呈色反应,生成色素的特征吸收波长从560nm变为610nm。产生红移现象的原因可能是新的助色基团的引入,使呈色基团的共轭体系变长,能量降低。(3)与马钱素苷元一样,京尼平和莫诺苷苷元的修饰产物也表现出类似的性质。

关键词：环烯醚萜,结构修饰,甲胺,交联呈色染料,呈色性能

参考文献

[1]王洁雪,张宝芹,何大广,等.天然环烯醚萜与蛋白质纤维的染色、交联反应特征(Ⅰ)—4种天然环烯醚萜的制备及其对皮粉的染色一交联(鞣制)性能.中国皮革,2010,39(15):4-8

[2]林鹏.四种天然环烯醚萜化合物的制备及与含氨基化合物的呈色性能研究:[硕士学位论文].成都:西南民族大学,2009

[3]Zhang Baoqin,Xu Loujin,Ding Keiyi.Dyeing/cross-linking property of natural iridoids to protein fibers,PartⅠ:Preparation of four natural iridoids and their dyeing/cross-linking(tanning)property to hide powder[J].The Journal of the American Leather Chemists Association,2011,106(4):121-126.

[4]Zhang Baoqin,Xu Loujin,Ding Keyi.Dyeing/cross-Linking property of natural iridoids to protein fibers,PartⅡ:Color-forming rules and mechanism of methylamine and protein fibers dyed by four natural iridoids[J].The Journal of the American Leather Chemists Association,2011,106(10):303-308

[5]张宝芹.用于蛋白质纤维的新型活性染料的制备与应用研究:[硕士学位论文].成都:西南民族大学,2012

多糖结构修饰研究 篇6

1 材料与方法

1.1 供试材料

海金沙,采自湖南省株洲市石峰区青龙山。

1.2 分析方法

1.2.1 多糖含量测定

苯酚-硫酸法[7]

1.2.2 蛋白质含量的测定

考马斯亮蓝法[8]

1.3 试验方法

1.3.1 海金沙粗多糖的提取

野外采集新鲜海金沙草,洗净,晾干,60℃烘干并粉碎。称取145 g海金沙草,料液比为1:15左右,80℃热水煎煮2次,第一次1.0 h,第二次0.5 h,合并2次煎煮液并过滤,用旋转蒸发仪减压浓缩至终体积为900 mL左右。

1.3.2 多糖的分离纯化

1.3.2.1 Savage法去除蛋白质

取粗多糖50 mL,加入Savage试剂(正丁醇:氯仿=4:1,v/v)200 mL,剧烈摇晃10 min后,静置5 min,2000 r·min-1离心15 min。用注射器去除上层有机溶剂和杂质,将中层的多糖溶液吸出并移入100 mL烧杯中,去除下层少量蛋白质,反复7次。每步纯化操作后均测定纯化液中蛋白质及多糖含量[7],计算多糖回收率和蛋白质去除率。

1.3.2.2 TCA法去除蛋白质

考察TCA不同浓度 (1~5%,w/v)及配比(1∶1~1∶5)对多糖回收率与蛋白质去除率的影响,确定最佳TCA浓度和配比。将样品加入到TCA溶液后,剧烈摇晃10 min,静置5 min,2000 r·min-1离心15 min,测定上清液中蛋白质及多糖含量[7],计算多糖回收率和蛋白质去除率。

1.3.2.3 单宁法去除蛋白质

考察单宁不同浓度(1~5%)及配比(1∶1~1∶5)对多糖回收率与蛋白质去除率的影响,确定最佳单宁浓度和配比。样品加入单宁溶液后剧烈摇晃10 min,静置5 min,2 000 r·min-1离心15 min,测定上清液中蛋白质及多糖含量[7],计算多糖回收率和蛋白质去除率。

1.3.3 多糖回收率和蛋白质去除率

多糖回收率=undefined

式中:A0为处理之前多糖含量,A1为处理后多糖含量。

蛋白质去除率=undefined

式中:P0为处理之前蛋白质含量,P1为处理后蛋白质含量。

1.3.4 醇沉精制

TCA法纯化得到的约80 mL粗多糖经透析过夜后,加入到其9倍体积无水乙醇中,充分混匀,4℃醇沉过夜,2000 r·min-1离心15 min,去上清液,沉淀60℃干燥2 h,备用。

1.4 纯度与空间结构

1.4.1 紫外光谱检测多糖纯度

称取0.003 g多糖样品溶解于10 mL的0.2 mol·L-1NaOH中,于200~400 nm区间内扫描。以波长为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制多糖紫外扫描图谱。

1.4.2 刚果红结合实验

称取5.00 mg 已纯化的多糖样品,加入2 mL去离子水和2 mL 80 μmol·L-1刚果红试剂,逐渐加4 mol·L-1NaOH溶液,使溶液的碱浓度由0 mol·L-1增加到0.4 mol·L-1,然后紫外扫描,测定不同碱浓度条件下的最大光吸收波长[9],观察其空间结构变化。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖和蛋白质标准曲线

以葡萄糖和蛋白质标样浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,利用origin 8.0绘制标准曲线并进行线性回归方程拟合,结果如图1A和1B。

由图1A可以得出,葡萄糖标准曲线为undefined=12.82x+0.90,R2=0.9948,由图1B可以得出,蛋白质标准曲线为undefined=0.007x+0.17,R2=0.9988。

2.2 蛋白质去除效果比较

2.2.1 Savage法去除蛋白质

考察Savage法对煎煮液中蛋白质去除率和多糖回收率的影响,结果如图2所示:

由图2可知,随着savage处理次数的增加,蛋白去除率也随之增加,但多糖回收率也随savage处理次数的增加而降低,综合考虑多糖回收率和蛋白质去除率,选择savage处理3次较好,在此条件下,多糖回收率为54.19%,蛋白质去除率为70.78%。

2.2.2 TCA法去除蛋白质

考察了TCA浓度与配比对煎煮液中蛋白质去除率与多糖回收率的影响,结果如图3,图4。

由图3可以看出,当TCA浓度为1%时,多糖回收率和蛋白质去除率分别为62.98%和87.15%,当TCA浓度增加到2%时,蛋白质去除率增加到89.68%,但多糖回收率仅为42.24%。综合考虑多糖回收率和蛋白质去除率,选择1%TCA最为合适。

由图4可以看出,当样品∶1%TCA=1∶3时,多糖回收率和蛋白质去除率相对较高,在此条件下,多糖回收率和蛋白质去除率分别为80.07%和94.86%。因此,最佳的配比为1∶3。

2.2.3 单宁法去除蛋白质

考察了单宁浓度与配比对煮液中蛋白质去除率与多糖回收率的影响,结果如图5,图6。

由图5可以看出,当单宁浓度为4%时,多糖回收率和蛋白质去除率分别为58.49%和91.41%。浓度继续增加时,蛋白质去除率和多糖回收率均呈下降趋势,综合考虑认为4%单宁浓度较好。

由图6可以看出,当样品∶4%单宁=1∶2时,蛋白质去除率和多糖回收率相对较高,分别为90.66%和62.01%,当配比继续增加时,蛋白质去除率变化较为缓慢,但多糖回收率急骤下降,综合考虑,选择样品∶4%单宁=1∶2时最好。

2.2.4 不同纯化方法蛋白质去除率和多糖回收率比较

分别在最佳条件进行蛋白质去除率和多糖回收率比较试验,结果如表1。

由表1可以看出,三种分离纯化方法中,以单宁法蛋白质去除率最高,但多糖回收率相对较低,而TCA法蛋白质去除率为(79.69±0.005)%,多糖回收率为(94.06±0.008)%,综合考虑蛋白质去除率和多糖回收率,选择TCA法进行多糖的纯化。

2.3 多糖纯度与空间结构研究

2.3.1 紫外光谱分析多糖纯度

将样品溶解后,于200~400 nm波长范围内进行紫外扫描,结果如图7。

由图7可知,样品在紫外波段内260 nm和280 nm处无显著吸吸,说明样品中蛋白质、氨基酸和核酸等杂质基本去除干净。

2.3.2 刚果红结合实验分析

按1.4.2方法描述进行刚果红结合实验,以刚果红结合后样品溶液吸光值为纵坐标,以NaOH浓度为横坐标作图,观察多糖构象变化,结果如图8。

从图8可以看出,样品在NaOH浓度较小时,紫外吸收移向长波,表明样品能与刚果红形成络合物,样品呈有规则的螺旋构象;NaOH浓度增大到一定程度,最大吸收波长下降,多糖的螺旋结构解体,变成无规则的线团形式,即样品在弱碱性范围内可形成有序的3股螺旋结构,在强碱性条件下,分子间的氢键被破坏,3股螺旋结构解体为单股,不能与刚果红形成络合物[9]。

3 结论与讨论

利用热水煎煮法提取得到了海金沙草粗多糖,用 sevage法、TCA法、单宁法进行纯化对比试验。Savage法脱蛋白是利用有机试剂使蛋白质变性成胶状物沉淀而脱除,不可避免的使多糖部分溶解,而且还存在去除蛋白质所需时间长、有机溶剂消耗多,不宜大规模使用。TCA法脱蛋白是应用TCA是一种强酸,使蛋白质变性沉淀而去除。单宁与蛋白质可以发生酸碱反应、氧化还原反应、疏水性结合等各种物理化学反应使蛋白质沉淀而除去。综合比较这三种方法的多糖回收率和蛋白质去除率,试验结果发现,以TCA法最好,当样品∶1%TCA=1∶3时,多糖回收率和蛋白质去除率分别为80.07%和94.86%,蛋白质去除率高,而多糖损失相对较少。试验研究还发现,纯化后多糖样品乙醇沉淀时可析出一部分醇溶性色素。纯化后多糖紫外扫描图谱发现,样品在260 nm和280 nm无明显吸收,说明样品中蛋白质,多肽和核酸基本去除。刚果红结合试验结果表明,低碱液浓度时,多糖可以形成螺旋空间结构,碱液浓度增加可破坏此空间结构,使多糖发生水解,形成无规则的线团形式。

摘要：为了获得纯化多糖并对其空间结构进行研究,用煎煮法从海金沙草中提取水溶性粗多糖,考察了Savage法、TCA法、单宁法等方法对提取液中蛋白质去除率和多糖回收率的影响,用乙醇沉淀法获得精制多糖,紫外光谱扫描分析多糖纯度,刚果红结合实验分析多糖空间构象。结果表明,以TCA法蛋白质去除率和多糖回收率较高。紫外扫描图谱显示,纯化多糖样品在260nm和280nm处无明显吸收,说明纯化多糖样品中蛋白质、多肽和核酸已基本除去,刚果红结合试验结果表明,在NaOH浓度较低时,多糖样品呈有规则的螺旋构像,NaOH浓度增大时,空间结构解体成无规则的线团结构。

关键词：海金沙,多糖,蛋白质去除率,多糖回收率

参考文献

[1]申利红,王建森,李雅,等.植物多糖的研究及应用进展[J].中国农学通报,2011,27(02):349～352.

[2]周启升,刘训理,段祖安.植物多糖的研究与开发应用进展[J].蚕业科学,2010,36(03):465～469.

[3]钟昕,周素梅,王强.药用真菌多糖研究进展[J].科技导报,2009,27(9):97～101.

[4]肖怀秋,李玉珍.海金沙草粗多糖提取工艺的响应面优化[J].氨基酸和生物资源,2011,(01):79～83.

[5]肖怀秋,李玉珍.海金沙草总黄酮提取工艺的响应面优化[J].氨基酸和生物资源,2010,(03):68～72+75.

[6]罗娅君,杨葵华.药用蕨类植物多糖研究进展[J].绵阳师范学院学报,2008,No.117(11):71～74.

[7]Dubois M,K.A.Grilles,J.K.Hamilton,et al.Colorimetricmethod for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry,1956:350～356.

[8]李凤玲,何金环,植物多糖的结构与分离纯化技术研究进展[J].中国农学通报,2008,No.172(10):276～279.